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PROCEDE DE RECUPERATION DE TRYPSINE CRISTALLINE A PARTIR DE MELANGES DE
TISSUS CONTENANT DES ENZYMES ET DES SOLVANTS ORGANIQUES.
La présente invention concerne la préparation de trypsine cris- talline à partir de glandes de pancréas et elle a trait, en particulier, à la préparation de trypsine sous forme cristalline approprié à l'usage médical à partir de mélanges de tissus contenant des enzymes et de solvants organiques, tels que les résidus de pancréas restant après l'extraction de l'insuline.-
On sait que les glandes de pancréas de mammifères contiennent à la fois de l'insuline et des enzymes protéolytiques comprenant la trypsine.
Les préparations d'enzymes, telles que la pancréatine qui est constituée par un mélange d'enzymes amorpheset qui est utilisée dans une grande mesure dans les industries des,textiles et du tannage, ont été obtenues à partir de glandes de pancréas fraîches il y a de nombreuses années. On a aussi préparé des en- zymes cristallines pures à l'échelle du laboratoire à partir de glandes de pancréas fraîches.
Lorsqu'on prépare de l'insuline à partir de glandes de pancré- as fraîches, la pratique usuelle consiste à utiliser un solvant organique mis- cible à l'eau acidifié pour l'insuline, tel que les alcools .inférieurs et les cétones. Les solvants préférés sont le méthanol, l'éthanol et l'acétone. L' éthanol ou un solvant organique analogue est dilué à l'eau et acidifié pour préparer le solvant d'extraction. Afin de maintenir les enzymes inactives et insolubilisées de façon à empêcher la destruction de l'insuline ou la conta- mination de l'extrait d'insuline, il est préférable que le solvant d'extraction contienne d'environ 50% à environ 85% de solvant organique et qu'il soit à un pH au-dessous de 4.
Pendant de nombreuses années, on a pensé que les fortes concen- trations de solvant organique et/ou les faibles pH utilisés dans l'extraction
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de l'insuline détruisaient les enzymes protéolytiques et les résidus de glan- des de pancréas restant après l'extraction de l'insuline'étaient mis au rebut.
Cependant, on a récemment utilisé ces résidus comme source de préparation d'en- zymes analogues à la pancréatine. A cette fin, on a pensé qu'il était suffisant de réduire la concentration de solvant organique à moins d'environ 20% en vo- lume, tout en extrayant les enzymes dans un solvant aqueux. Cependant, jusqu'à présent on n'a pas trouvé de moyen pour préparer de la trypsine cristalline à partir de mélanges de tissu contenant des enzymes et de solvant organique, tels que les résidus de glandes de pancréas produits dans l'extraction de l'insuline.
La présente invention crée un procédé de production de trypsine cristalline à partir de mélanges de tissu contenant des enzymes et de solvant organique en réduisant la concentration de solvant organique du mélange à une valeur critiquement faible tout en extrayant les enzymes protéolytiques du tissu dans un solvant d'extraction aqueux de volume total limité et en traitant ensui- te l'extrait séparé tout d'abord pour éliminer les impuretés et ensuite pour récupérer la trypsine sous une forme cristalline appropriée à son utilisation en médecine.
Le présent procédé de récupération de trypsine cristalline à partir de mélange de tissu contenant des enzymes et de solvant organique est caractérisée en ce que la concentration de solvant organique dans ledit mélange est réduite à 4% ou moins en volume, après quoi la trypsine cristalline est récupérée.
Une importante caractéristique de l'invention réside ainsi dans la réduction de la concentration du solvant organique contenu dans le mélange à 4% ou moins en volume. On constate que cette caractéristique a des effets sur- prenants.
Bien qu'il soit connu dans la technique de réduire la concentra- tion de solvant organique à 20% ou moins pour récupérer des mélanges d'enzymes brutes à partir de mélanges de tissus contenant des enzymes et de solvant orga- nique, on a trouvé que cette réduction n'est pas suffisante pour obtenir l'effet selon la présente invention.
Il est surprenant que la réduction de concentration, telle que spécifiée ici, non seulement facilite l'extraction d'enzymes, mais rende aussi possible de régler la cristallisation de la trypsine au cours de l'opération de cristallisation subséquente.
Il est possible que cela soit dû au fait que chaque enzyme pa- rait être un complexe de composés chimiques en étroite relation, de solubilités variables,et que d'une certaine manière la présence de solvant organique dans l'extrait contrariait la récupération des enzymes sous la forme cristalline.
En outre, l'enseignement de la technique antérieure ne donne aucune réponse à la question de savoir comment régler ou contrôler la cris- tallisation des enzymes à partir d'un mélange de tissus contenant des enzymes et des solvants organiques.
Selon les chercheurs antérieurs, la cristallisation est commencée en elle-même à partir de glandes fraîches de pancréas et ces chercheurs antérieurs se sont trouvés, en conséquence, en face des problèmes que pose un mélange contenant des solvants organiques tel qu'il est traité selon la présente invention.
L'enseignement de réduire la concentration à 20% au-dessous en vue de n'obtenir que des mélanges bruts d'enzymes n'aide aucunement à établir un procédé qui règle la cristallisation de trypsine à partir de mélanges de solvants organiques et de tissus contenant des enzymes.
On croit qu'un résultat de l'utilisation de volumes limités dans l'opération d'extraction est de réduire au minimum l'extraction de non- taminés inertes ou, il est possible, d'enzymes partiellement dénaturées; qui
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contrariaient la cristallisation de trypsine. De préférence, on n'utilise pas plus de 14 parties en poids de solvant d'extraction pour chaque partie de produits de tissus solides contenus dans le mélange. Pour la commodité de la manipulation et pour permettre le pompage du mélange d'extraction, qui affec- te la forme d'une bouillie, le mélange d'extraction contient de préférence au moins environ 6 parties en poids de liquide pour chaque partie, de produit so- lide.
Des résultats optima sont obtenus lorsque le mélange d'extraction contient en- tre environ 9 et 11 parties en poids du solvant d'extraction pour chaque partie . des produits solides.
La bouillie préparée pour l'opération d'extraction d'enzymes ayant le rapport préféré de produit liquide à produits solides et ayant la concentra- tion désirée de solvant organique dans la partie liquide peut être formée d'un certain nombre de manières. Cependant, la simple dilution du mélange avec suf- fisamment d'eau pour réduire la concentration de solvant organique au moins à 4% nécessiterait l'utilisation de volumes excessivement grands d'eau et on préfère en conséquence former le mélange d'extraction d'enzymes d'une ma- nière qui comprend l'élimination d'une partie du solvant organique du mélange.
Des rendements très améliorés en enzymes et en particulier en trypsine peuvent être obtenus en réduisant la concentration du solvant orga- nique à moins de 4% et des résultats optima sont obtenus aux environs de 1% ou moins.
L'enseignement de la présente invention peut être appliqué en pratique de diverses manières.
Suivant une forme de réalisation, la réduction de la concentra- tion du solvant organique peut être obtenue par distillation sous pression ré- duite.
Dans une autre réalisation, la réduction de la concentration peut être obtenue par dilution par paliers,dans laquelle la dilution finale produit une concentration-de solvant organique inférieure à 4% et, selon une troisième réalisation, la réduction et la concentration du solvant organique peut être obtenue en lavant les tissus portant les enzymes avec suffisamment d'eau pour produire une concentration de solvant de 15 à 25% en volume, en évacuant l'eau de lavage et en ajoutant ensuite suffisamment d'eau pour rédui- re la concentration de solvant organique à moins de 4% en volume.
Au cours de l'opération de réduction de la concentration de solvant organique, une partie importante des enzymes est extraite dans la par- tie liquide du mélange. L'extraction d'enzymes peut être complétée après la formation de la bouillie contenant de 6 à 14 parties de liquide pour chaque partie de solide du tissu avec la partie liquide ne contenant pas plus de 4% en volume de solvant organique en agitant la bouillie se trouvant dans 1' appareillage d'extraction, qui est maintenue à un pH inférieur à 6,5 ou de préférence inférieur à 4, puis à une température suffisamment basse pour empécher l'activation et la destruction des enzymes.
Le tissu soumis à l'extraction peut ensuite être séparé du liquide contenant les enzymes par centrifugeage ou filtrage et le liquide peut être de nouveau traité pour préparer la trypsine cristalline.
Pour illustrer l'invention en détail, on donne les exemples suivants.
Exemple 1.
Les enzymes furent récupérées à partir de résidus de pancréas de boeuf exempts d'insuline par le mode opératoire suivant: Les résidus contenaient environ 70% de liquide et 30% de solides en poids, la
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partie liquide était 65% d'éthanol en volume acidifié au pH 2,85 avec de l'aci- de phosphorique. 450 kg. de ces résidus furent mis en suspension dans 1500 li- tres d'eau de conduite qui contenait 2200 cm3 de H2S04 concentré. On peut faire varier l'addition d'eau, sans sortir du cadre de l'invention, en ajoutant entre 6 et 20 parties et de préférence environ 10 parties d'eau par partie de solides de tissus contenus dans le mélange.
Après que la suspension eut été préparée, en utilisant un agitateur du type à turbine, la bouillie fut pompée dans l'appareil de distillation. La distillation fut faite dans un appareil du type à pot sous vide à une température moyenne de 15 à 20 C et au maximum 30 C. 650 litres de liquide et environ 30% d'éthanol fu- rent retirés au cours de cette opération. La concentration en alcool du concen- tré se trouvant dans l'appareil de distillation était d'environ 1 %. Le concentré fut ensuite dilué avec 250 litres d'eau de conduite afin d'atteindre une consis- tance permettant de le faire circuler.
Le liquide dilué fut ensuite ramené à son réservoir d'origine et refroidi à 4 C. L'extraction fut effectuée avec deux circulations de trente minites à travers une pompe comportant une turbine à trois aubes. La suspension fut agitée lentement avec un agitateur du type à turbine pendant 15 minutes en- tre et après les cycles de circulation. Cette action permet aux particules grasses de s'agglutiner avant une nouvelle extraction et la progression. Les particules de graisse coagulées furent retirées pendant ces opérations par écumage.
La séparation fut effectuée dans une centrifugeuse Bird du type cylindrique. Le tissu provenant de la première centrifugation fut mis en suspen- sion dans 850 litres d'eau de conduite contenant 340 cm3 de H2SO4. Le lavage fut effectué par une circulation de 30 minutes à travers la pompe du type à turbine. La suspension obtenue fut alors centrifugée et le liquide sortant fut ajouté à celui obtenu de la première séparation.
La trypsine cristalline est séparée de l'extrait combiné prove- nant du tissu par précipitation fractionnée avec addition de sulfate d'ammo- niumo Au cours de la première opération, des substances inertes sont précipitées et séparées de l'extrait par centrifugeage et filtrage. Ensuite, la concentra- tion de sulfate d'ammonium est augmentée pour précipiter le trypsinogène et les autres pro-enzymes. Le trypsinogène est ensuite isolé et épuré par recristalli- sation répétée de la même manière comme lorsque de la trypsine cristalline est produite à partir de glandes de pancréas fraîches.
Exemple 2.
Le mode opératoire de l'exemple 1 fut suivi essentiellement sauf que l'on remplaça les résidus de pancréas de boeuf par des résidus de pancréas de porc. En raison des plus fortes teneurs en graisse et en matière lipoïdale contenues dans les glandes de pancréas de porc (en moyenne 30 à 40% comparati- vement aux 5 à 10% des glandes de pancréas de boeuf), des précautions particuliè- res furent prises pour empêcher la graisse de s'opposer à la récupération de la trypsine cristalline. Après l'opération de distillation, la bouillie fut réfrigé- rée à 0 C environ et maintenue à cette température pendant les opérations d' extraction à la pompe et de centrifugeage pour favoriser la coagulation et la séparation des particules de graisse.
Une autre modification au mode opératoire consistait à faire passer le produit centrifugé dans une petite cuve d'écumage immédiatement après la séparation des résidus usés. Le produit centrifugé fut maintenu dans cette cuve d'écumage assez longtemps pour permettre aux particules de graisse, qui s' étaient de nouveau agglutinées par la centrifugation, de s'élever à la surfa- ce et d'être retirées par-écumage. De cette manière, on obtint un extrait sen- siblement exempt de graisse.
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Exemple 3.
Des résidus de pancréas exempts d'insuline furent mis en suspension dans 4 volumes d'eau à un pH 1,8 acidifiée à l'acide chlorhydrique. Le pH fut ensuite réglé de nouveau à 1 à l'acide chlorhydrique. La concentration d'éthanol fut alors diminuée à 3% par distillation sous pression réduite. L9extrac- tion des enzymes fut ensuite complétée en faisant passer la bouillie dans une cuve dans laquelle elle fut soumise à l'extraction pendant une période de la.8 heures à 3 C et à un pH de 1,8.
Le tissu fut alors séparé par centrifugeage et mis au rebut.
Du sulfate d'ammonium fut ajouté au produit centrifugé jusqu'à ce qu'une con- centration de 0,4 fut atteinte. On laissa la suspension résultante se reposer à 5 C pendant 48 heures.
La suspension fut ensuite filtrée et le précipité contenant la fraction de protéine animale fut évacué.
Du sulfate d'ammonium fut ajouté au produit filtré jusqu'à 0,7 de saturation et on laissa la suspension résultante se déposer pendant 48 heures à 5 C.
On sépara le précipité d'enzymes brut et la matière surnageante fut éliminée.
Le gâteau brut à 0,7 de saturation fut retravaillé en le dissol- vant dans 10 volumes d'eau distillée et le refractionnant par les opérations au sulfate d'ammonium à 0,4 et 0,7 de saturation à 5 C.Le gâteau à 0,7 de saturation obtenu par ces opérations peut être retravaillé de nouveau en le dissolvant dans 3 volumes d'eau distillée et en le refractionnant par des opérations de saturation au sulfate d9ammonium à 0,4 et 0,7 de saturation à 25 C.
Le gâteau à 0,7 de saturation ainsi obtenu fut dissous dans 1,5 volumes d'eau distillée à 25 C. La solution de sulfate d'ammonium saturée fut ajoutée à une saturation 0,25. Le pH fut réglé à 5 avec 5 N NaOH. La solution fut inoculée avec une petite quantité de cristaux chymotrypsinogènes et lais- sée reposée à 25 C jusque ce que la cristallisation de chymotrypsinogène fut complète, 48 à 72 heures étant usuellement nécessaires. La suspension fut ensuite filtrée.
Le pH du produit filtré fut réglé, après la séparation du chymotryp-- sinogène brut à 3 avec 5 N H2SO4.D u sulfate d'ammonium fut ajouté à cette solu- tion jusqu'à 0,7 de saturation.
La suspension fut filtrée et le filtrat éliminé. Le précipité obtenu fut dis- sous dans 3 volumes d'eau distillée et retravaillé par saturation à 0,4 et 0,7 au sulfate d'ammonium à 25 C.
Le précipité saturé à 0,7 fut dissous dans 1,5 volume de tampon au borate au pH 9 à 10 C. Le pH de la solution fut réglé à 7 avec 5 N NaOH. On ajouta du sul- fate de magnésium saturé jusqu'à 0,5 de saturation. La solution fut maintenue à 5 C jusque ce que la cristallisation de la trypsine fut complète, quelques jours étant usuellement nécessaires. La suspension de cristallisation fut sé- parée par filtrage et le produit filtré fut éliminé. Le gâteau de trypsine cris- talline fut ensuite maintenu à -5 C ou mis en suspension dans 10 volumes d'eau et lyophilisé.
Exemple 4.
Le mode opératoire suivant peut être utilisé pour récupérer de la trypsine cristalline à partir de résidus de glandes de pancréas exempts d' insuline contenant de 30 à 50% en poids de produits solides et ayant une partie liquide acidifiée au-dessous du pH 4 et contenant environ 60 à 70% en volume d'éthanol. On met 450 kg. de ces résidus en suspension dans 675 li- tres d'eau. On mélange complètement la bouillie et on sépare la masse de l'eau des produits solides par centrifugeage. On élimine l'eau de lavage.
On met les résidus lavés en suspension dans 1350 litres d'eau. On extrait les enzymes contenues dans les produits solides dans la partie liquide de la bouillie en faisant circuler cette dernière à travers une pompe à turbine pendant 30 à 60
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minutes, soit en continua soit avec une période intermédiaire de 5 à 15 mi- nutes de repos dans une cuve avec agitation générale. A titre de variante, l'extraction est effectuée en faisant passer la bouillie à une cuve d'extrac- tion comportant une chemise dans laquelle circule de la saumure et qui est équipée d9un agitateur, puis on maintient la bouillie dans cette cuve pen- dant 12 à 48 heures, tout en maintenant sa température entre -1 C et +2 C.
On sépare les résidus usés de la partie liquide de la bouillie par eentrifu- geage. On maintient l'extrait séparé à une température comprise entre-1 à +2 C pour continuer le traitement. On traite l'extrait ainsi obtenu avec du sulfate d'ammonium de la manière décrite à l'exemple 1 pour obtenir un gâ- teau d'enzymes brut sensiblement exempt de contaminants inertes et le gâteau est de nouveau travaillé pour obtenir la trypsine cristalline.
Exemple 5
2700 go de pancréas de boeuf furent soumis à l'extraction pour obtenir l'insuline et le tissu retiré par centrifugeage après l'extraction contenait environ 50% en poids de la solution d'extradant à l'alcool. Le poids du tissu était d'environ 1800 g.
Les solides de tissu pancréatique retirés furent ajoutés à 6000 cm3 d'eau froide et la température fut maintenue en agitant à 5 C pendant 10 heures. Le pH du mélange d'extraction était 2,4 sans l'addition de nou- vel acide. Les solides du tissu furent retirés par centrifugeage et resou- mis à l'extraction dans 3000 cm3 d'eau froide pendant une période de 2 heu- res, puis les éléments insolubles pancréatiques furent retirés comme pré- cédemment. Le premier et le second extractants furent alors combinés. Les extractants aqueux combinés contenant les proenzymes pancréatiques furent filtrés jusqu'à ce qu'ils soient clairs et les pro-enzymes furent précipités par l'ad- dition d'une quantité suffisante de sulfate d'ammonium pour produire une con- centration à 0,8 de saturation dans la solution.
Les proenzymes protéolytiques précipitées furent retirées par filtrage et remises en solution, puis de nou- veau épurées et activées pour récupérer la trypsine cristalline en bons rende- ments.
Exemple 6
2700 gr. de pancréas de boeuf congelé furent soumis à l'extrac- tion de façon analoguepour récupérer l'insuline, comme à l'exemple 5. Les solides de tissu pancréatique retirés contenant les pro-enzymes furent ajoutés à 4000 cm3 d'eau et la bouillie ainsi formée fut soumise à distillation dans le vide à une température de 30 C pour élim@iner l'alcool. Après avoir éliminé environ 1000 cm3 d'eau par distillation, la matière fut retirée de l'appareil de distillation et refroidie à 5 C, puis agitée vigoureusement pendant 3 heu- res.
Les produits solides pancréatiques furent ensuite retirés par centrifu- geage et de nouveau soumis à l'extraction dans 3000 cm3 d'eau froide en ajou- tant suffisanment d'acide pour maintenir le il à 2,4, puis en agitant pendant 2 heures à une température de 5 C.
Les extraits combinés furent traités après retrait des extraits de tissu en suspension de nouveau, comme à l'exemple 5, pour récupérer la trypsine cris- talline .
Exemple 7
Dans 1 exemple précédent, la trypsine est obtenue sous la forme cristalline. Parfois, il est désirable de procéder à des opérations d'épura- tion supplémentaire en plus de celles décrites pour préparer un produit cris- tallin pur ayant une grande stabilité et une force standardisée. En se ré- férant particulièrement au mode opératoire décrit à l'exemple 3, il arrive, après que le gâteau de trypsinogène a été dissous dans la solution de tam- pon de borate et que la solution de sulfate de magnésium a été ajoutée, qu'une gélatinisation notable apparaît dans la solution au repos ou que la
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solution peut être d'une couleur forcée ou d'un aspect trouble.
Si l'une quel- conque de ces conditions se présente. il est-désirable de soumettre la solu- tion au filtrage avant de la traiter pour la cristallisation de la trypsine.
De même,, après la cristallisation.. le produit cristallin peut paraître gommeux ou gélatineuxLorsque ceci se produit, la solution"cristalline séparée doit être centrifugée en utilisant une cuve à masse. Le précipité provenant de la centrifugation doit ensuite être mis en suspension dans une quantité minimum de solution de tampon au borate de pH 9. Cette suspension doit ensuite être filtrée et le gâteau filtré doit être séché autant que possible. Le gâteau de filtre sec ainsi obtenu peut être emmagasiné indéfiniment à -5 C.
Le procédé de la présente invention a été illustré dans ce qui précède par des exemples dans lesquels la matière première était des glandes de pancréas à partir desquellesl'insuline avait été extraite.C'est là éga- lement la matière la plus économique que l'on puisse utiliser actuellement, mais on voit que le procédé sera applicable en lui-même dans tous autres trai- tements dans lesquels on obtient un mélange de tissus contenant de la trypsi- ne, tels par exemple que des résidus provenant d'autres traitements dans les- quels on obtient un mélange de tissus contenant de la trypsine, et de solvants organiques., puis il peut aussi être appliqué en combinaison avec du tissu frais qui a reçu une addition de solvant organique à une fin ou à une autre,par exemple pour la conservation.
Bien que dans ce qui précède l'invention ait été décrite avec beaucoup de détails pour illustrer certains modes de réalisation, il est bien évident que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.