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PROCEDE POUR LA PREPARATION D'UN'ANTIBIOTIQUE.
L'invention a trait à un procédé pour la préparation d'un nouvel antibiotique. Plus particulièrement elle a trait à un nouvel antibiotique sous des forces variées et aux procédés pour fabriquer cet antibiotique par fermentation aussi bien que par concentration et/ou par purification de ce produit, pour isoler celui-ci et pour fabriquer des sels de cet antibiotique.
L'invention s'applique à la préparation de l'antibiotique et de ses sels sous forme de solution aussi bien que sous forme de concentré et sous forme cristallisée pureo
L'antibiotique suivant l'invention est fabriqué par la culture, dans des conditions contrôlées,d'une espèce non décrite jusqu'ici de Strep- tomyces isolé d'un échantillon naturel obtenu à North Charleston, dans la Caroline du Nord et désigné ci-après sous le nom de Stneptomy oes sp. WC 3628.
Une culture de l'organisme vivant a été déposée et constitue un élément de la collection des sulfures de base de la New Jersey Agricultural Experiment Station, New Brunswick, NoJo, où elle a été désignée sous le nom de Strepto- myces spo, Waksman Collection 3628.
Pour isoler et caractériser le micro-organisme, une :partie de l'échantillon naturel (1 go approximativement') est diluée dans de l'eau stérile, puis est déposée dans un flacon contenant',dans de l'eau distillée; sucrose, 1%, acide citrique, 12% ; (NH4)2HPO4, 0,04%; KCl, 0,008 %, MgC12.
6H2O,O,O418% ; Mncl2.6H2O,O,OO36 %; FeC13.6H2O, O,OO23 %; ZnC12, O,OO21 %; CoC12.6H2O, 0,0004 %; galactose, 1,0%; et agar, 1,5 %; l'échantillon est alors soumis à une incubation à 26 C. pendant 10 jours. Une colonie de Strep- tomyces isolés nouvellement et choisis dans les organismes sur les plaques de dépôt, lorsqu'ils ont été essayés par un prélèvement vis-à-vis des bacté- ries, à été reconnu comme présentant une certaine activité vis-à-wis des Mi-
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crocancus pyogaES suivant les variétés aureus, Aerobacillus polymyxa et Streptococcus i'aecaliso
Dans la description qui va suivre de colonies de l'organisme après 6 jours d'incubation à 26 C dans différents milieux d'agar,
les couleurs désignées sont basées sur la nomenclature de Ridgway "Color Standards and Color Nomenclature ", Washington, D.C. 19120 ,[Dans un milieu de levure et de boeuf, consistant en :
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de levure, 0,3; extrait de boeuf, 0,15 %; peptone, 0,6 ; dextrose, 0,1 %; extraitagar, 1,5 % et eau distillée.] La croissance est bonne. Le mycélium aé- rien et les spores sont de couleur chamois à un gris de fumée pâle. Les co- lonies sont convexes et opaques avec bords lacérés. La sporulation est den- se; le mycélium aérien présente des protubérances courtes et irrégulières.
La couleur du revers est d'un chamois fauve. Le pigment diffusible par l'a- gar est de couleur chamois roseo Le mycélium végétal a un diamètre de 0,5 -
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0,7 micron. Le mycelium aérienam diamètre de 0,7 à 1y0 micron. Les spo- res ont un diamètre de 0,5 x 1.0 - 1,5 microns.
[Dans un milieu Szapek-Dox, consistant en : s NaNO , 0,3 % ; KH 2': 0,1 Ka, 0,05 i3 SC4a7HZC, , C5 i3 FeS0.7H2p, 0, 001 3 glucose, 4, agafi, 1, 5 %; et eau distilLée ) Les colonies sont circulaires, finement granuleuses, faiblement convexes avec des bords lacérés. Les spores sont de couleur chamois rose pâle et la colonie inversée est d'un jaune de primu- line. Il n'y a pas de production d'exopigment.
[Dans un milieu de Sabouraud consistant en : neopeptone, 1,0 %; dextrose, 4,0 %; agar, 1,5%; et eau distillée] . Les colonies sont circu- laires, finement granuleuses, faiblement convexes avec des bords lacérés.
Les spores sont d'une couleur allant du brun-rouille au chamois rose pâle et la colonie inversée est de couleur sépia chaude. Les pigments diffusibles par l'agar ont la couleur de l'argile.
[pans un milieu d'une infusion de soja consistant en : de soja (ayant bouilli 30 minutes puis filtrée) 2%; dextrose, O,2 %; chlo- rure de sodium, 0,5 %; agar, 2,0 %; et eau distillée (réglée à un pH 7 avant
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la stérilisation)j. Les colonies sont circulaires, finement granuleuses, opa- ques, convexes, avec des bords lacérés. Les spores sont de couleur allant du blanc au gris de fumée pâle. La colonie inversée est d'un brun de minerai au centre avec ses bords extérieurs d'un chamois ardent. Il n'y a pas pro-
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duction d'exopigmento [Dans un milieu de Henrici,- consistant en : hydrolysat de caséine, 0,5 %; glycérine, 0, 5 egi K2HP04' 9 C 2i MgS0.7H 0.0,2 %; FeSO .?H 0, 0,2% agar, 1, 5 ; et eau distilîée] 4. Les colonies sont circulaires, opaques, rehaussées avec des bords lacérés.
Les colonies sont blanches avec une cou- ronne rehaussée qui est d'un gris-souris atténué. La colonie inversée est d'un brun de clou de girofle avec un bord circulaire qui est d'un brun noirâtre
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nO 3. L'exopigment est d'un brun chamois.
La description ci-dessus de l'organisme utilisé pour obtenir l'an- tibiotique conforme à l'invention est uniquement illustrative, et il doit être bien entendu que l'invention n'est pas limitée à l'emploi de cet orga- nisme ou à des organismes répondant pleinement à cette description, mais comprend, entre autres, des variantes préparées à partir de l'organisme décrit à l'aide d'agents différents, tels que des rayons X, des rayons ultra- violets et des composés azotés.
Le micro-organisme est susceptible d'assimiler les sources sui- vantes de carbone dans un milieu de base contenant (NE ) 50 comme source d'azote g rhamnose, xylose, glucose, galactose, fructose, mannose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, glycerol, mannitol, dextrine, inuline, amidon, inositol et tartrate d'ammoniumo Les composés suivants de carbone supportent pauvrement la croissance g arabinose, sorbitol, citrate de sodium. La crois- sance n'est pas supportée par aucun des composés suivants de carbone : dul- citol, salicine, acétate de sodium, formate d'ammonium et oxalate d'ammonium.
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Dans un milieu de base contenant de l'amidon comme source de car- bone, les sources suivantes d'azote supportent la croissance : sulfate d'am- monium, nitrate de sodium, nitrite de sodium et asparagine; la tyrosine sup- porte mal la croissance ; et l'acétamide ne supporte pas la croissance.
Le micro-organisme est également identifié par sa faculté de se
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développer à 260C. et 3'7 Ca sur du boeuf en levure, de la farine de soja et de l'agajs de Sabouraud. Il ne produit pas l'indol et ne réduit pa;s le nitrate, mais liquéfie la gélatine avec formation d'un pigment brun et pro- voque l'acidification du lait de tournesol. L'antibiotique préparé suivant l'invention a été trouvé présentant un large spectre antibiotique, dans des essais in vitro vis-à-vis d'une grande variété d'organismes.
Ainsi, parmi les organismes dont la propagation est arrêtée par la présence de l'antibio-
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tique, il faut citer les Micrococcus pyogenes avec les variétés aureus,,StrepT tococcus pyogènes, Streptococcus faecalis, Diplococcus pneumonie type ze diplococcus pneumoniae type 3, Bacillus subtilis, Clostridum septicum, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Salmonella typho-
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sa, Salmonella schottmulleri., Shigeliaa dysènteriae, Shigella sonnei, Proteus vulgaris, Pseudomonas aerugniosa et ycobacterium tuberculosis variété bovis BOG.
Lorsqu'il se trouve sous une forme cristallisée pure, l'antibiotique conforme à l'invention présente un degré élevé d'activité, comparable à celle du chloramphénicol lorsqu'il est essayé vis-à-vis du Meningopneumonitis vi- rus et environ 4 fois l'activité du chloramphénicol lorsqu'il est essayé vis-à-vis du Rickettsia rickettsio De plus, à raison de sa solubilité dans l'huile, l'antibiotique conforme à l'invention convient spécilament en vue de son emploi dans des prescriptions variées à base d'huile et à action dif-
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fériée.
Les chiffres suivants montrent le pouvoir de bouillons contenant l'antibiotique et obtenus dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, ce pouvoir étant calculé en unités de dilution (ce qui, suivant l'emploi dans ce mémoire, est l'inverse de la dilution la plus élevée du bouillon qui mouille complètement le développement d'un organisme d'essai,'-cet orga-
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nisme étant le Mierococczs pyogènes var. aureus 209 P sauf indication con- traire ). Dans ces essais, la fermentation à pu se produire pendant les pério- des spécifiées dans un milieu nutritif de farine de soja (réglé à pH 7 après
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stérilisation) consistant en : farine de soja, 3#; dextrose, 2 %; CoCl .6H 0, 0,0005 %; et CaGO z, dans de l'eau distillée; et les unités de dilution ont alors été déterminées vis-à-vis de l'organisme d'essai choisi.
Unités de dilution.
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Miorocossus pyogenes Klebsiella vara aureus 209P pneumoniae 8..(.
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<tb>
4 <SEP> jours <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> - <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> 7 <SEP> jours
<tb>
<tb>
<tb> Echantillon
<tb> pasteurisé
<tb>
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neutre 315 342 < 25 62 25 25 .
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<tb>
Echantillon
<tb> pasteurisé
<tb> acide <SEP> 125 <SEP> 342 <SEP> <25 <SEP> 44 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb>
pH de fermentation au bout de 4 jours : 7,9, pH de fermentation au bout de 7'jours; 7,7.
L'antibiotique préparé suivant l'invention est fabriqué de préférence en submergeant la culture aérée de l'organisme pour obtenir des bouil-
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lons (fermentation sur une large échelle) ayant un pouvoir allant jusqu'à environ 2000 ou plus du/m, mais peut également être préparé par une culture de surface avec une aération produite en exposant simplement la surface à une arrivée d'air stérile. Dans l'un et l'autre des cas, des sources de carbone pour l'énergie et d'azote pour le développement sont incluses dans les mi- lieux nutritifs.
Comme matière constituant une source d'énergie on peut uti- liser -. un hydrate de carbone tel que l'amidon, l'amidon soluble, le dextrose, be sucrose et le maltose; un alcool de sucre (par exemple le glycérol); ou un lipide, tel que (1) un acide gras, (2) une graisse ou (3) un mélange de ces matières. A titre d'exemple de graisses, on peut citer ; l'huile prove- nant dsu lard, l'huile de soja, l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile d'arachide l'huile de coco, l'huile de grains, l'huile de ricin, l'huile de sésame, l'huile brute de palme, le suif provenant du mouton, l'huile de spermaceti, l'huile d'olive, la tristéarine, la tripalmitine, la trioléine et la trilaurine; comme acides gras on peut citer à titre d'exemple les aci- des acétique, propionique, butyrique, stéarique, palmitique, oléique, lauri- que, linoléique et myristique.
De préférence, comme substances formant une source d'énergie, on choisit les hydrates de carbone, particulièrement le dextrose.
Les sources de facteurs azotés provoquant un développement sont celles utilisées normalement dans des procédés de ce genre. Elles peuvent être des substances organiques naturelles (par exemple de la farine de soja, une liqueur provenant d'une infusion de grains, un extrait de viande, de la caséine, un extrait de poisson, un gâteau de foie et/ou des produits so- lubles de distillation), ou des substances synthétiques, telles que des ni- trates inorganiques ou des composés d'ammonium. Une liqueur provenant d'une infusion de grains constitue, à raison de la large variété de substances qu'elle contient, un produit d'addition de valeur pour le milieu de fermen- tation., Les milieux utilisés dans le procédé mis en oeuvre suivant l'inven- tion peuvent contenir des précurseurs en sus des constituants nutritifs, pour obtenir d'autres produits de valeur.
Par exemple, une source assimila- ble de cobalt peut être incluse là où l'on désire des cobalamines (vitamine B12 et produits analogues à la vitamine B12) et ces sous-produts sont ensuite récupérés par des procédés conventionnels. Ou encore des précurseurs de sté- roides, tels que la progesterone ou le composé S de Reichstein ou l'acétate S, peuvent être ajoutés pour obtenir un stéroïde- oxydé à la position Il.. Com- me dans la plupart des procédés de fermentation, le procédé conforme à l'in- vention est mis en oeuvre de façon désirée en utilisant un milieu liquide con- tenant des constituants minéraux augmentant le développement de l'organisme, par exemple des sources de potassium, de calcium, de magnésium, de soufre, de fer, ou des traces d'autres éléments, et du phosphate.
Ces constituants sont ajoutés de façon désirée au milieu à moins qu'ils n'y soient déjà présents comme un constituant (par exemple une impureté) de la matière brute formant sour- ce de carbone ou d'azpte (par exemple la liqueur provenant de l'infusion de grains
Dans la fermentation à grande échelle par culture aérée submergée, le pH du milieu est réglé de préférence si cela est nécessaire à environ 7 (bien qu'un pH d'environ 5 à environ 9 puisse être utilisé) par l'addition d'agents-tampons, le pH tendant à devenir légèrement alcalin (pH d'environ 7.508.5) pendant le processus de la fermentation. On peut utiliser des tem- pératures de fermentation allant d'environ 20 Go à environ 40 C., avec une préférence pour une température d'environ 25 C.
L'agitation peut être ef- fectuée par une agitation mécanique de 100 révolutions par minute ou plus, avec une aération à une vitesse superficielle allant jusqu'à environ 3 mètres par minute ou plus.
Une fermentation sur une petite échelle, pour une recherche en laboratoire ou pour la production de substances à inoculer pour des fermen- tations plus étendues, peut être effectuée dans des flacons secoués et bou- chés par du coton. Ainsi, 250 mlo d'un agent nutritif aqueux contenant : farine de soja, 3 %, dextrose, 2%; CoCl2.6H 0, 0,0005 %; et CaCO,O,1 %, sont versés dans un flacon d'Erlenmeyer d'un litre, strilisés suivant la manière,usuelle (c'est-à-dire à l'autoclave), puis réglés à un pH 7,0 avec
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NaOH 12N. Le milieu est alors inoculé avec la cultureà développer sur un plan d'agar (ou une infusion de boeuf en levure ou de soja) de Streptomyces sp.
WC 3628, et l'inculation se produit pendant 48-96 heures sur une base animée d'un mouvement de va-et-vient oscillant à la cadence de 140 courses d'un pouce par minute. On peut utiliser d'autres milieux, tels que des mi- lieux aqueux contenant : (A) extrait de boeuf, 0,15%; extrait de levure,
0,15%; peptone, O,5%; dextrose, K2HPO4, chlorure de sodium, 0,35 %; KH2PO4, 0,368 %; 1%; 0,132 %; (B) ceralose; 1%; peptone, 0,03 extrait de boeuf,
6,5%; %; extrait de levure, (C) et 1%. dextrose, 4%, peptone, butanel,
L'antibiotique conforme à l'invention peut être obtenu sous une forme cristallisée à partir d'un bouillon de fermentation filtré par :
(1) épuisement avec un solvant organique sensiblement non miscible dans l'eau, tel que benzène, chloroforme, acétate d'amyle, acétate d'éthyle, butanel, alcool amylique, trichloréthylène et éther, à un pH de préférence d'environ
6.6 ou plus élevé ; (2) par distillation du solvant organique dans le vide en présence d'eau, en obtenant une fraction d'huile insoluble dans l'eau et une fraction soluble dans l'eau; par séchage par congélation de la frac- tion soluble dans l'eau, et par recristallisation de cette fraction dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques, tel que l'i- sopropanol, un mélange de benzène et d'éther de pétrole, du méthhnol aqueux, de l'éthanol ou de l'acétone.
Le produit est incolore et se sépare sous for- me de prismes ou d'aiguilles; les cristaux ne sont pas hydratés et, après sé- chage à 100 C dans le vide, ne sont pas hygroscopiques.
L'antibiotique cristallisé (base libre) ainsi obtenu est très soluble dans le chloroforme,l'acétate d'éthyle, l'acide acétique glacial, l'acétate d'amyle, le butanol, le benzène et l'acétone; à un degré moindre il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'éther éthylique et l'isopropa- nol. La base libre est intimement insoluble dans l'eau froide ou chaude ou dans l'éther de pétrole, mais se dissout aisément dans une solution acide aqueuse (par exemple l'acide acétique 0,05N ou l'acide chlorhydrique .),, et elle est insoluble dans un alcali aqueux.
Les cristaux séchés dans le vide (base libre) fondent à 207-209 C. dans un tube capillaire ouvert dans un bain d'huile. La température de fusion en portant au rouge est 220-222 c., après ramollissement à 215 C.
Le pouvoir rotatoire spécifique de la base libre est : (Ó)22=-57 ¯3 (éthanol absolu, c=0.5) (Ó)22=-53 ¯3 (acide acétique 0.05 N, c=0.3).
Ci-après sont donnés les résultats d'analyse obtenus en utilisant la base libre cristallisée séchée dans le vide à 100 C.
Calculés pour C42H73No16:C, 5948; H, 8,68; N, 1,65;2 (methoxyle), 7,31 Trouvé : C,59,24; H, 8,64 ;N, 1,76; méthoxyle, 7,33
La matière cristallisée ne contient aucune quantité susceptible d'être détectée d'halogène ou de soufre.
Dans une solution acide aqueuse (acide acétique 0.05 N), (1) elle donne un précipité avec de l'acide phospho- tungstique, l'acide picrique, le méthylorange et l'acide de Reinecke; (2) elle ne donne aucun précipité avec l'azotate d'argent ou une solution de chlorure de mercure, (3) elle ne réduit pas le réactif de Fehling ou de Tol- lens, (4) elle réduit le permanganate de potassium à la température ambiante (5) elle consomme de l'eau de brome pour former une solution trouble, (6) elle ne donne aucune couleur avec une solution de chlorure ferrique et (7), par addition d'un volume égal d'acide chlorhydrique (concentré), elle donne une couleur pourpre qui disparaît lentement pour devenir bronzée.
Le con- centrat, (c'est-à-dire la fraction soluble dans l'eau obtenue par épuisement à l'éther du filtrat du bouillon, suivi par une évaporation de l'éther en la présence d'eau) peut être également cristallisé après purification par ad- sorption. C'est ainsi que le concentrat dans 10% d'acétone dans du benzène
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est adsorbé sur une colonne de gel de silice, et la colonne est développée par élution avec des mélanges de soloants d'acétone et de benzène contenant une proportion d'acétone augmentant progressivement. La matière active, qui se trouve sur une bande simple, sort de 'la colonne avec 30 % d'acétone dans du benzène (80 % de l'activité totale adsorbée sont ainsi récupérés).
Le résidu restant après avoir déterminé l'évaporation du solvant hors de l'éluat est aisément cristallisé avec de l'isopropanol (point de fusion 207- 209 C).
Des sels d'addition acides de la base libre ( sels d'acide miné-
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ral tels que l'bydrocblorure, le sulfate, le phosphate; et des sels d'acide organique tels que le citrate, le tartrate, le gluconate et le sulfonate de p-toluène) peuvent être préparés en utilisant des procédés standards,
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des sels solubles dans l'eau et':::.Jbtenus au moyen d'acides susceptibles d'être acceptés en pharmacologie étant préférés.
Ainsi l'hydrochlorure peut être préparé par l'un des procédés suivants : (a) En faisant passer du chlorure d'hydrogène sec sans une solution d'éther de la base libre, (b) En dissolvant la base libre dans du méthanol absolu, en ajou-
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tant un équivalent du ch1'"'are d'hydrogène méthanolique, en enlevant le sol- vant par évaporation par un courant de dioxyde de carbone et en lavant le résidu plusieurs fois avec de l'éther sec.
(a) En dissolvant, la base libre dans de l'éther absolu, en ajou- tant une solution de chlorure d'hydrogène méthanolique goutte à goutte jus- qu'au moment où la précipitation est complète, en séparant le précipité par centrifugation et en lavant plusieurs fois avec de l'éther sec.
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L'hydrochlorure amorphe (point de fusion zoo dans un tube capillaire ouvert dans un bain d'huile) est très soluble dans le méthanol, l'éthanol et l'acétone, soluble dans l'eau et insoluble dans l'éther éthyli-
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que et l'hexane. Son pouvoir rotatoire spécifique est (0( )= - 54 ! 3 (méthanol absolu, c = 0,6).
Les caractéristiques additionnelles de la base libre cristallisée sont indiquées ci-après Distribution de Graig
Après dissolution dans un mélange d'éther éthylique et de 2 % de
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NaH Pt7 aqueux (pH 405) et après passage à travers un système de distribution d'un tube de Craig de 24, des essais biologiques et l'absorption dans l'ul- tra-violet maximum à 240 montrent une pointe pour le tube 6 avec des ré- cupérations supérieures à 95 %; et il n'y a pas d'indication de la présence d'un autre constituant.
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Absorption dans 1-'mLtra-,eiolet : Calculée dans 2 % de NaH2PO 4' la courbe de l'absorption dans l'ultra-violet montre un maximum à 24-1'? E 1% cmo = 158; et calculée dans du méthanol, un maximum
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a 240 mfL, E#5 cive =157 est observé.
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Etude polarogrm2Maue
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<tb> Cône. <SEP> Electrolvte <SEP> PH <SEP> pH <SEP> E <SEP> 1/2 <SEP> vs. <SEP> SCE
<tb>
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0,1% a a7lI IiCImNIea3 5,5 (i maxo) -1,09 (E max.) 0>,l% G.IM L!Gl-NeOH + 0,01 % de gélatine 3,1 -0,99 0,05% 2% NaH2PO 4 aqueux 4, 6 2, 0 -1, 07 0,05 2 % NaH2P04 aqueux +0,02% de gélatine 4,6 1,6 -0,85
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Absorption dans 7.'infra roue Le 'spectre d'absorption dans 1'infra-rouge a été observé comme le bouillon de Nujol des cristaux;
et la figure 1 est un graphique des indications ainsi obtenues et résumées dans le tableau ci- dessous.
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- (cm=1) (cmo-l) F (cmo-1),
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<tb> 3,45 <SEP> 2899 <SEP> 8, <SEP> 62 <SEP> 1160 <SEP> 10,78 <SEP> 928
<tb>
<tb> 5,76 <SEP> 1736 <SEP> 8,86 <SEP> 1129 <SEP> 10, <SEP> 95 <SEP> 913
<tb>
<tb> 5,88 <SEP> 1701 <SEP> 9,01 <SEP> 1110 <SEP> 11,46 <SEP> 873
<tb>
<tb> 6,11 <SEP> 1637 <SEP> 9,13 <SEP> 1095 <SEP> 11,61 <SEP> 861
<tb> 6,83 <SEP> 1464 <SEP> 9,30 <SEP> 1075 <SEP> 11,90 <SEP> 840
<tb>
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7,01 1427 9 ,443 1060 12,18 821
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<tb> 7, <SEP> 24 <SEP> 1381 <SEP> 9, <SEP> 67 <SEP> 1034 <SEP> 12,42 <SEP> 805
<tb>
<tb> 7, <SEP> 66 <SEP> 1305 <SEP> 9,89 <SEP> 1011 <SEP> 12,80 <SEP> 781
<tb> 7,87 <SEP> 1271 <SEP> 10,,Il <SEP> 989 <SEP> 13,48 <SEP> 742
<tb>
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8, 8 1238 io, 40 962 14,51 689
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<tb> 8,38 <SEP> 1193 <SEP> 10,
59 <SEP> 944
<tb>
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La manière de se comporter de Jlantibiotique préparé suivant l'invention sous la forme d'une base cristallisée., lorsqu'il est soumis à une chromatographie sur un papier montant à 26 C., en utilisant une culture
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de Micrococcus pyogènes var. aureus comme organisme d'ess,. est indiquée ci-dessous. La position de l'antibiotique (RF) est indiquée dans chaque cas par une zone distincte d'inhibition lorsque l'antibiotique est placé dans un agent d'agar ensemencé avec l'organisme d'essaio
Détermination de Rf
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<tb> Système <SEP> Durée <SEP> en <SEP> heures <SEP> RF
<tb>
<tb> du <SEP> développement
<tb>
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A.
Benzène s eau acide acétique = 1:9:0.5 4 Eif3
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<tb> Bo <SEP> n-Butanol <SEP> : <SEP> eau <SEP> acide <SEP> acétique <SEP> = <SEP> 4:5:1 <SEP> 16 <SEP> 0,90
<tb>
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0. Acide acétique 0, 2N 4 0, 80
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<tb> Do <SEP> Eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> n-butanol <SEP> 4 <SEP> 0,95
<tb>
Ci-après sont donnés des exemples illustratifs montrant le procédé par lequel l'antibiotique conforme à l'invention peut être préparé.
Ces exemples sont uniquement illustratifs et ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention.
Exemple 1 Préparation de l'ensemencement Stade I infusion de levure de boeuf ou de soja et plants d'agar de Strep-
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tonyces spo WC 3628 sont utilisés pour ensemencer des flacons de 500 mi., chacun contenant 100 m7.a du milieu de germination suivant : farine de soja, 15%p glucose, 2%; chlorure de sodium; 0,1 ; carbonate de calcium; 0, 5;; CoCl o6F (?9 0.005e-, et eau de ville quantité suffisante pour faire 100 ml.
Le milieu est régié un pH 6.8-7.2 avec NaOH 12N avant la stérilisation dans un autoclave pendant 30 minutes à 121 C. Les flacons sont ensuite en- semencés et soumis à une incubation à 25 C. pendant 72 heures sur une base animée d'un mouvement de va-et-vient ayant une largeur de 2 pouces et faisant 120 déplacements par minute.
Stade II. Utilisant les flacons soumis pendant 72 heures au stade I ; un pré- lèvement stérile de 15 ml. est transféré dans deux flacons d'un litre secoués par un bras latéral, chacun contenant 300 mlo du même milieu de germination que celui utilisé dans le stade I.
Les flacons sont ensuite soumis à une
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incubation à 25 C. pendant 48 heures sur une base animée d'un mouvement de va-et-vient dans les mêmes conditions que celles décrites pour le stade Io Fermentation :
A 10 litres d'un milieu de fermentation consistant en :farine de soja, 3,0 %; cerelose; 2,2%J chlorure de sodium; 0.1%; carbonate de calcium, 0,25 %; chlorure de cobalt, 0,0005 %; huile de lard; 0,4%; et eau de ville quantité suffisante, dans un récipient d'acier sans tache de 18,9 litres, qui a été stérilisé à la vapeur pendant 15 minutes à 121 C., on ajoute le contenu de l'un des flacons du stade II obtenu comme décrit ci-dessus.
On laisse alors la fermentation se produire à 25 C. avec une agitation mécanique à 300 révolutions par minute, et une aération à une cadence de 28,3 litres/mi- nute (vitesse superficielle - 61 centimètres/minutes). Une pression positive est maintenue dans le récipient à 0,35 kg/cm2, avec addition d'huile de lard ou d'huile brûlant à une température basse en quantité suffisante comme agent anti-bouillonnant.
Après 84 heures de fermentation, le bouillon est réglé.à un pH 2-3 avec H SO (concentré); puis est filtré en utilisant le Hyflo (un adjuvant de filtration) Le bouillon filtré est épuisé deux fois avec 1/4 de volume d'éther éthylique à un pH 6060 On fait alors évaporer l'éther dans le vide en présence d'eau pour obtenir (1) une petite quantité d'une huble insoluble dans l'eau et (2) une fraction soluble dans l'eau..
Lorsque l'huile insoluble dans l'eau est épuisée avec l'éther de pétrole, il se for- me un précipité ayant un pouvoir de 2500 duo/mgo La fraction soluble dans l'eau, après avoir été séchée par congélation et recristallisée dans de l'i- sopropanol chaud (60 C), fournit un produit par ayant un pouvoir d'environ 7-10000 du./mg.
Exemple 2 Préparation de l'ensemencement.
Stade I Le procédé est le même que celui utilisé dans le stade I de l'exemple I.
Stade II Un flacon traité pendant 72 heures dans le stade I est utilisé pour ensemencer une bouteille aérée de 18,9 litres contenant 12 litres du même milieu de germinaison (le milieu ayant été stérilisé à la vapeur à 121 C. avant l'ensemencement) que celui utilisé dans le stade I. Le milieu est ré- glé à un pH 6.8-7.2 avec NaOH 12N, puis est stérilisé à la vapeur pendant 1 heure 1/2 à 121 C.
On laisse alors se produire l'incubation à 25 C. pendant 48 heures, avec une aération à une cadence de 1 litre par litre de milieu par minuteo Fermentation A 189 litres d'un milieu de fermentation consistant en farine de soja; 3, 0% cerelose, 2,2 %; chlorure de sodium; 0,1%; carbonate de cal- cium; 0,25 %; chlorure de cobalt, 0,0005 %; l'huile de lard, 0,4 %; et eau de ville en quantité suffisante dans un récipient d'acier au carbone de 380 litres, on ajoute le contenu d'une bouteille du stade II obtenu comme décrit ci-dessus. On laisse alors la fermentation se produire à 25 C. avec agitation mécanique à 120 révolutions par minute et aération à une cadence de 368 li- tres/minute (vitesse superficielle = 31 cms./sec.).
Une pression positive est maintenue dans le récipient à 0,70 kgocmo2, avec addition d'huile de lard et d'huile brûlant à une température basse en quantité suffisante comme agent anti-bouillonnant.
Après une fermentation de 84 heures, le bouillon est réglé à pH 2-3 avec H@SO, (concentré), puis est filtré en utilisant un adjuvant de fil- tration (Hyflo). Le bouillon filtré est alors traité comme dans l'exemplel pour obtenir le concentrat et l'antibiotique cristallisé. ± Suivant une alternative, l'antibiotique cristallisé peut être obtenu du bouillon filtré comme suit : environ 2630 litres du bouillon filtré sont neutralisés à un pH d'environ 7 et sont épuisés avec de l'acétate d'amyle dans un système à con- tre-courant à deux stades (volume de réduction 4:1). La solution résultante d'acétate d'amyle (681 litres) est épuisée d'une manière analogue avec de l'eau à un pH 2.0-2.5 (volume de réduction 4:1).
La solution aqueuse (170 litres)
<Desc/Clms Page number 9>
est alors épuisée par agitation avec environ 35 litres de benzène neutre (pH environ 7.0-7.50. Après concentration à environ 4.5 litres, l'extrait au benzène est épuisé avec un volume égal d'eau à un pH d'environ 2. 0-2.5 et la solution aqueuse résultante est neutralisée pour fournir une base cris- tallisée qui est isolée par filtration. Lors du séchage, on obtient 144 g. d'une base ayant un pouvoir de 5000 du/mg.
La neutralisation de l'extrait l'eau de l'acétate d'amyle et de l'extrait à l'eau du benzène consommé fournit approximativement 20 g d'antibiotique cristallisée La recristalli- sation de l'antibiotique par dissolution des cristaux dans de l'isopropanol chaud aqueux à 70%, puis l'addition d'eau jusqu'à la production d'un état nua- geux, fournissent 114 go d'antibiotique purifié ayant un pouvoir de 7000 du /mg.]
Sous la forme d'un tableau sont indiqués ci-après les résultats de la fermentation obtenus au cours des fermentations des exemples I et 2 Préparation Préparation Préparation de de 10 litres (1) de 10 litres (2) 189 litre SI! aureus So aureus S. aureus.
EMI9.1
<tb> heures <SEP> pH <SEP> Dilounités/mlo <SEP> ph <SEP> Dil.unités/ml. <SEP> heures <SEP> pH <SEP> Dil.
<SEP> unités/ml.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
0 <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> --- <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP> @
<tb>
<tb>
<tb> 36 <SEP> 7, <SEP> 480 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 560 <SEP> 48 <SEP> 6,5 <SEP> 35
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 60 <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> 560 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 400 <SEP> 72 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 70
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 84 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 560 <SEP> 7,3 <SEP> 480 <SEP> 84 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 140
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Filtrat <SEP> 7, <SEP> 7 <SEP> 560 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 560 <SEP> 140
<tb>
(bouillon de 84 heures).
L'antibiotique conforme à l'invention peut être utilisé pour le traitement d'infections variées sur les hommes et sur les animaux, entre autres, des infections par les micro-organismes dont la-liste a été dressée précédemment en se rapportant à son spectre antibiotique. L'antibiotique peut être utilisé en soi en étant incorporé dans l'une quelconque des prépa- rations usuelles ou sous forme de dosages, pour être administré par 1a bou- che,par voie parentérale ou de façon locale. L'antibiotique peut être éga- lement administré concurremment (ou en mélange dans une préparration appro- priée ) avec d'autres antibiotiques variés (par exemple la néomycine) ou des agents chimiothérapeutiques (par exemple la N-hydroxy-2-pyridinethione).
L'invention peut être mise en oeuvre avec des modifications diverses tout en restant dans le même esprito
REVENDICATIONS.
1. Procédé pour la préparation d'un antibiotique, caractérisé en ce,qu'on cultive le Streptomyces spo WC 3628 dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote jusqu'à ce qu'une quantité suffisante d'antibiotique soit produite, puis on récupère l'antibiotique du bouillon de fermentation.