<B>Procédé pour la</B> préparation <B>d'un</B> antibiotique L'invention a trait à un procédé pour la préparation d'un nouvel antibiotique par la culture d'une espèce non décrite jusqu'ici de Streptomyces isolé d'un échantillon naturel ob tenu à North Charleston, dans la Caroline du Nord et désigné ci-après sous le nom de Strep tomyces sp. WC 3628. Une culture de l'orga nisme vivant a été déposée et constitue un élé ment de la collection des cultures de base de la New Jersey Agricultural Experiment Station, New Brunswick, N. J., où elle a été désignée sous le nom de Streptomyces sp., Waksman Collection 3628.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on cultive le Streptomyces sp. WC 3628 dans des conditions aérobies dans un mi lieu nutritif aqueux contenant du carbone et de l'azote assimilables, puis en ce que l'on extrait l'antibiotique du bouillon de fermentation.
Pour isoler et caractériser le mïcro-orga- nisme, une partie de l'échantillon naturel (1 g approximativement) a été diluée dans de l'eau stérile, puis déposée dans un flacon contenant dans de l'eau distillée : saccharose, 1 % ;
acide citrique, 0,12 % <I>;</I> (NHI),HP04, 0,04 % <I>;</I> KCL, 0,008 0/0 ; MgCl.,. 6H.,0, 0,0418 % ; MnCI., <I>.</I> <I>6H.,0,</I> 0,0036 0/0 ; FeCI; <I>.</I> 6H;,,0, 0,0023 0/0 ;
ZnCl,,, 0,0021 0/0 ; COCI., <I>.</I> 6H;,0, 0,0004 % ; galactose, 1,0 0/0, et agar, 1,5% ; l'échantillon a été alors soumis à une incubation à 260 C, pendant 10 jours.
Les Streptomyces isolés dudit échantillon, ensemencés sur une plaque d'agar et incubés ont été essayés vis-à-vis des bactéries et reconnus comme présentant une certaine ac tivité vis-à-vis des Micrococcus pyogenes sui vant les variétés aureus, Aerobacillus poly- myxa et Streptococcus faecalis.
Dans la description qui va suivre de colo nies de l'organisme après 6 jours d'incubation à 26o C dans différents milieux d'agar, les cou leurs désignées sont basées sur la nomenclature de Ridgway Colon Standards and Color No menclature Washington, D. C., 1912.
A. Dans un milieu consistant en : extrait de levure, 0,3 0/0 ; extrait de boeuf, 0,15 % ;
peptone, 0,6 % ; dextrose, 0,1 % ; agar, 1,5 % et eau distillée : la croissance est bonne. Le mycelium aérien et les spores sont de couleur chamois à un gris de fumée pâle. Les colonies sont convexes et opaques avec bords lacérés.
La sporulation est dense ; le mycélium aérien présente des protubérances courtes et irrégulières. La couleur du revers est d'un cha mois fauve. Le pigment diffusible par l'agar est de couleur chamois rose. Le mycelium végétal a un diamètre de 0,5 - 0,7 micron. Le mycelium aérien a un diamètre de 0,7 à 1,0 micron. Les spores ont un diamètre de 0,5 X 1,0 - 1,5 mi crons.
B. Dans un milieu Czapek-Dox, consis- tant en <I>:</I> NaN03, 0,3 % ; KH2P04, 0,1 /o ;
KCI, 0,05 % <I>;</I> MgS04. 7H20, 0,05 0/0 <I>;</I> FeS04 <I>.</I> 7H2, 0,001 % ; glucose, 4,0 % ; agar, 1,5 0/0, et eau distillée : les colonies sont circulaires, finement granuleuses, faiblement convexes avec des bords lacérés.
Les spores sont de couleur chamois rose pâle et la colonie inversée est d'un jaune de primuline. Il n'y a pas de production d'exopigment.
C. Dans un milieu de Sabouraud consis- tant en : néopeptone, 1,0 0/0 ; dextrose, 4,0 % ; agar, 1,5 0/0, et eau distillée : les colonies sont circulaires, finement granuleuses, faiblement convexes avec des bords lacérés. Les spores sont d'une couleur allant du brun-rouille au chamois rose pâle et la colonie inversée est de couleur sépia chaude. Les pigments diffusibles par l'agar ont la couleur de l'argile.
D. Dans un milieu consistant en : infu- son de soja (ayant bouilli 30 minutes puis fil- trée) 2 % ; dextrose, 0,2 % ; chlorure de so- dium, 0,5 0/0 ; agar, 2,0 0/0, et eau distillée (ré glée à un<I>pH 7</I> avant la stérilisation) : les colo nies sont circulaires, finement granuleuses, opa ques, convexes, avec des bords lacérés. Les spores sont de couleur allant du blanc au gris de fumée pâle.
La colonie inversée est d'un brun de minerai au centre avec ses bords exté rieurs d'un chamois ardent. Il n'y a pas produc tion d'exopigment.
E. Dans un milieu de Henrici, consistant en : hydrolysat de caséine, 0,5 % ; glycérine, 0,5%; K2HP04, 0,29/o; M9S04. 7H20, 0,2 0/0 ; FeS04. 7H20, 0,2 % ;
agar, 1,5 0/0, et eau distillée : les colonies sont circulaires, opa ques, rehaussées avec des bords lacérés. Les colonies sont blanches avec une couronne re haussée qui est d'un gris-souris atténué. La co lonie inversée est d'un brun de clou de girofle avec un bord circulaire qui est d'un brun noi râtre No 3. L'exopigment est d'un brun cha mois.
Le procédé selon l'invention peut aussi être exécuté en employant les mutants produits à partir de l'organisme décrit à l'aide d'agents de mutation, tels que des rayons X, des rayons ultraviolets et des composés azotés.
Le micro-organisme est susceptible d'assi miler les sources suivantes de carbone dans un milieu de base contenant (NH4)2S04 comme source d'azote : rhamnose, xylose, glucose, ga lactose, fructose, mannose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, glycérol, mannitol, dextrine, inuline, amidon, inositol et tartrate d'ammo nium. Les composés suivants de carbone ne permettent qu'une faible croissance : arabinose, sorbitol, citrate de sodium.
La croissance n'est possible avec aucun des composés suivants de carbone : dulcitol, salicine, acétate de sodium, formate d'ammonium et oxylate d'ammonium.
Dans un milieu de base contenant de l'ami don comme source de carbone, les sources sui vantes d'azote permettent la croissance : sul fate d'ammonium, nitrate de sodium, nitrite de sodium et asparagine ; la tyrosine convient mal à la croissance, et l'acétamide ne convient pas.
Le micro-organisme est également identifié par sa faculté de se développer à 26o C et 370 C sur un milieu à base d'extrait de boeuf, d'extrait de levure, de farine de soja et d'agar de Sabouraud. Il ne produit pas l'indol et ne réduit pas le nitrate, mais liquéfie la gélatine avec formation d'un pigment brun et provoque l'acidification du lait de tournesol. L'antibioti que préparé suivant l'invention a été trouvé comme présentant un large spectre antibiotique, dans des essais<I>in vitro</I> vis-à-vis d'une grande variété d'organismes.
Ainsi, parmi les organis mes dont la propagation est arrêtée par la pré sence de l'antibiotique, il faut citer les Micro- coccus pyogenes avec les variétés aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faeca- lis, Diplococcus pneumoniae type 2, Diplo- coccus pneumoniae type 3, Bacillus subtilis,
Clostridum septicum, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Salmo nella typhosa, Salmonella schottmülleri, Shi- gella dysenteriae, Shigella sonnei, Proteus vul- garis,
Pseudomonas aerugniose et Mycobacte- rium tuberculosis variétés bovis BCG.
Lorsqu'il se trouve sous une forme cristallisée pure, l'antibiotique présente un degré élevé d'activité, comparable à celle du chloramphénicol lorsqu'il est essayé vis-à-vis du Meningopneumonitis virus et environ 4 fois l'activité du chloramphé- nicol lorsqu'il est essayé vis-à-vis du Rickettsia rickettsi. De plus, à raison de sa solubilité dans l'huile, l'antibiotique préparé conformément à l'invention convient spécialement en vue de son emploi dans des prescriptions variées à base d'huile et à action différée.
Les chiffres suivants montrent le pouvoir de bouillons contenant l'antibiotique et obtenus dans la mise en aeuvre pratique de l'invention, ce pouvoir étant calculé en unités de dilution (ce qui, dans ce mémoire, désigne l'inverse de la dilution la plus élevée du bouillon qui inhibe complètement le développement d'un organisme d'essai, cet organisme étant le Micrococcus pyo- genes var. aureus 209P, sauf indication con traire).
Dans ces essais, la fermentation a pu se produire pendant les périodes spécifiées dans un milieu nutritif de farine de soja (réglé à <I>pH 7</I> après stérilisation) consistant en : farine de soja, 3 % ; dextrose,<I>2</I> %<I>;</I> COCl2. 6H20, 0,0005 %, et CaC03, 0,1 @/o, dans de l'eau distillée, et les unités, de dilution ont alors été déterminées vis-à-vis de l'organisme d'essai choisi.
EMI0003.0026
<I>Unités <SEP> de <SEP> dilution</I>
<tb> Micrococcus
<tb> pyogenes <SEP> Klesbsiella
<tb> var. <SEP> aureus <SEP> pneumoniae <SEP> B.C.G.
<tb> 209P
<tb> 4 <SEP> jours <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> 7 <SEP> jours
<tb> Echantillon <SEP> pasteurisé <SEP> neutre <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 315 <SEP> 342 <SEP> 25 <SEP> 62 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb> Echantillon <SEP> pasteurisé <SEP> acide <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 125 <SEP> 342 <SEP> 25 <SEP> 44 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb> <I>pH</I> <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> au <SEP> bout <SEP> de <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> : <SEP> 7,9
<tb> <I>pH</I> <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> au <SEP> bout <SEP> de <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> :
<SEP> 7,7 L'antibiotique est fabriqué de préférence en submergeant la culture aérée de l'organisme pour obtenir des bouillons (fermentation sur une large échelle) ayant un pouvoir allant jus qu'à environ 2000 u. d. ou plus, mais peut éga lement être préparé par une culture de surface avec une aération produite en exposant simple ment la surface à une arrivée d'air stérile. Dans l'un et l'autre des cas, des sources de carbone pour l'énergie et d'azote pour le développement sont incluses dans les milieux nutritifs.
Comme matière constituant une source d'énergie, on peut utiliser : un hydrate de carbone tel que l'amidon, l'amidon soluble, le dextrose, le su- crose et le maltose ; un alcool de sucre (par exemple le glycérol) ou un lipide, tel que (1) un acide gras, (2) une graisse, ou (3) un mé lange de ces matières.
A titre d'exemples de graisses, on peut citer : l'huile provenant du lard, l'huile de soja, l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile d'arachide, l'huile de coco, l'huile de grains, l'huile de ricin, l'huile de sésame, l'huile brute de palme, le suif provenant du mouton, l'huile de spermaceti, l'huile d'olive, la tristéarine, la tripalmitine, la trioléine et la tri- laurine ;
comme acides gras, on peut citer, à titre d'exemples, les acides acétique, propioni- que, butyrique, stéarique, palmitique, oléique, laurique, linoléique et myristique. De préfé rence, comme substance formant une source d'énergie, on choisit les hydrates de carbone, particulièrement le dextrose.
Les sources de facteurs azotés provoquant un développement sont celles utilisées normale ment dans des procédés de ce genre. Elles peu vent être des substances organiques naturelles (par exemple de la farine de soja, une liqueur provenant d'une infusion de grains, un extrait de viande, de la caséine, un extrait de poisson, un gâteau de foie et/ou des produits solubles de distillation), ou des substances synthétiques, tel les que des nitrates inorganiques ou des com- posés d'ammonium. Une liqueur provenant d'une infusion de grains constitue, à raison de la large variété de substances qu'elle contient, un produit d'addition de valeur pour le milieu de fermentation.
Les milieux utilisés dans le procédé suivant l'invention peuvent contenir des précurseurs en sus des constituants nutri tifs, pour obtenir d'autres produits de valeur. Par exemple, une source assimilable de cobalt peut être incluse là où l'on désire des cobal- amines (vitamine B 12 et produits analogues à la vitamine B 12), et ces sous-produits sont ensuite récupérés par des procédés convention nels. Ou encore des précurseurs de stéroïdes, tels que la progestérone ou le composé S de Reichstein ou l'acétate S, peuvent être ajoutés pour obtenir un stéroïde oxydé à la position 11.
Comme dans la plupart des procédés de fermentation, le procédé selon l'invention est d'ordinaire mis en oeuvre en utilisant un milieu liquide contenant des constituants minéraux augmentant le développement de l'organisme, par exemple des sources de potassium, de cal cium, de magnésium, de soufre, de fer, ou des traces d'autres éléments, et du phosphate. Ces constituants sont ajoutés au milieu à moins qu'ils n'y soient déjà présents comme un cons tituant (par exemple une impureté) de la ma tière brute formant source de carbone ou d'azote (par exemple la liqueur provenant de l'infusion de grains).
Dans la fermentation à grande échelle par culture aérée submergée, le<I>pH</I> du milieu est réglé de préférence, si cela est nécessaire, à environ 7 (bien qu'un<I>pH</I> d'environ 5 à environ 9 puisse être utilisé) par l'addition d'agents- tampons, le<I>pH</I> tendant à devenir légèrement alcalin<I>(pH</I> d'environ 7,5 - 8,5) pendant le pro cessus de la fermentation. On peut utiliser des températures de fermentation allant d'environ 200 C à environ 400 C, avec une préférence pour une température d'environ 25() C. L'agi tation peut être effectuée par une agitation mé canique de 100 révolutions par minute ou plus, avec une aération à une vitesse superficielle allant jusqu'à environ 3 m par minute ou plus.
Une fermentation sur une petite échelle, pour une recherche en laboratoire ou pour la production de substances à inoculer pour des fermentations plus étendues, peut être effectuée dans des flacons secoués et bouchés par du co ton. Ainsi, 250 ml d'un agent nutritif aqueux contenant : farine de soja, 3 0/0 ; dextrose, 2 % ;
COCh <I>.</I> 6H20, 0,0005 1%, et CaC03, 0,10/0, sont versés dans un flacon d'Erlen- meyer d'un litre, stérilisés suivant la manière usuelle (c'est-à-dire à l'autoclave), puis réglés à un<I>pH</I> 7,0 avec NaOH 12N.
Le milieu est alors inoculé avec la culture à développer sur un plant d'agar (ou une infusion de baeuf et de levure ou de soja) de Streptomyces sp. <I>WC</I> 3628, et l'incubation se prodûit pendant 48-96 heures sur une base animée d'un mouvement de va-et-vient oscillant à la cadence de 140 cour ses de 2,5 cm par minute.
On peut utiliser d'autres milieux, tels que des milieux aqueux contenant : (A) extrait de baeuf, 0,15 0/0 ; ex trait de levure, 0,15 0,/o ; peptone, 0,5 0l0 ; dex- trose, 0,5 0/0 ; chlorure de sodium, 0,35 % ; K,HPO,I, 0,368 0/0 ; KHZPOP 0,132 0/0 ;
(B) cérélose, 1 0/0 ; peptone, 1 0/0 ; extrait de b#uf, 0,03 0/0 ; extrait de levure, 0,5 % ; et (C) dextrose, 4 % ; peptone, 1 0/0.
L'antibiotique produit conformément à l'invention peut être obtenu sous une forme cristallisée à partir d'un bouillon de fermenta tion filtré par : (1) épuisement avec un solvant organique sensiblement non miscible dans l'eau, tel que benzène, chloroforme, acétate d'amyle, acétate d'éthyle, butanol, alcool amylique, tri chloréthylène et éther, à un<I>pH</I> de préférence d'environ 6,6 ou plus élevé ;
(2) par distillation du solvant organique dans le vide en présence d'eau, en obtenant une fraction d'huile insolu ble dans l'eau et une fraction soluble dans l'eau ; par séchage par congélation de la frac tion soluble dans l'eau ; et par recristallisation de cette fraction dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques, tel que l'isopropanol, un mélange de benzène et d'éther de pétrole, du méthanol aqueux, de l'éthanol ou de l'acétone. Le produit est in colore et se sépare sous forme de prismes ou d'aiguilles ; les cristaux ne sont pas hydratés et, après séchage à 1000 C dans le vide, ne sont pas hygroscopiques.
L'antibiotique cristallisé (base libre) ainsi obtenu est très soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acide acétique glacial, l'acé tate d'amyle, le butanol, le benzène et l'acé tone ; à un degré moindre, il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'éther éthylique et l'iso- propanol. La base libre est intimement insolu ble dans l'eau froide ou chaude ou dans l'éther de pétrole, mais se dissout aisément dans une solution acide aqueuse (par exemple l'acide acétique 0,05N ou l'acide chlorhydrique), et elle est insoluble dans un alcali aqueux.
Les cristaux séchés dans le vide (base libre) fondent à 207 - 2090 C dans un tube capillaire ouvert dans un bain d'huile. La température de fusion en portant au rouge est 220 - 222o C, après ramollissement à 215o C. Le pouvoir ro tatoire spécifique de la base libre est (a) r, _ - 57 3 (éthanol absolu, c=0,5), (c@)rI_ - 53 3 (acide acétique 0,05N, c = 0,3).
Ci-après sont donnés les résultats d'analyse obtenus en utilisant la base libre cristallisée sé chée dans le vide à 100 C.
,3N0,,; Calculé pour C4A, C, 59,48<I>; H,</I> 8,68<I>; N,</I> 1,65 ; 2 (méthoxyle) 7,31.
Trouvé C, 59,24 ;<I>H,</I> 8,64 ;<I>N,</I> 1,76 ; méthoxyle, 7,33.
La matière cristallisée ne contient aucune quantité susceptible d'être détectée d'halogène ou de soufre. Dans une solution acide aqueuse (acide acétique 0,05N), (1) elle-donne un pré cipité avec de l'acide phosphotungstique, l'acide picrique, le méthylorange et l'acide de Reinecke ; (2) elle ne donne aucun précipité avec l'azotate d'argent ou une solution de chlo rure de mercure ; (3) elle ne réduit pas le ré actif de Fehlings ou de Tollens ; (4) elle réduit le permanganate de potassium à la température ambiante ; (5) elle consomme de l'eau de brome pour former une solution trouble ;
(6) elle ne donne aucune couleur avec une solution de chlorure ferrique ; et (7), par addition d'un vo- lume égal d'acide chlorhydrique (concentré), elle donne une couleur pourpre qui disparaît lentement pour devenir bronzée. Le concentrat (c'est-à-dire la fraction soluble dans l'eau ob tenue par épuisement à l'éther du filtrat du bouillon, suivi par une évaporation .de l'éther en la présence d'eau) peut être également cristal lisé après purification par adsorption.
C'est ainsi que le concentrat dans 10 /o d'acétone dans du benzène est adsorbé sur une colonne de gel de silice, et la colonne est développée par élution avec des mélanges de solvants d'acétone et de benzène contenant une propor tion d'acétone augmentant progressivement.
La matière active, qui se trouve sur une bande sim- ple, sort de la colonne avec 30'% d'acétone dans du benzène (80 % de l'activité totale ad- sorbée sont ainsi récupérés).
Le résidu restant après avoir déterminé l'évaporation du solvant hors de l'éluat est aisément cristallisé avec de l'isopropanol (point de fusion 207-2090 C).
Des sels d'addition acides de la base libre (sels d'acide minéral tels que l'hydrochlorure, le sulfate, le phosphate ; et des sels d'acide or ganique tels que le citrate, le tartrate, le gluco- nate et le sulfonate de p-toluène) peuvent être préparés en utilisant des moyens standards, des sels solubles dans l'eau et obtenus au moyen d'acides susceptibles d'êtré acceptés en phar macologie étant préférés.
Ainsi, l'hydrochlorure peut être préparé par l'un des moyens suivants (a) En faisant passer de l'acide chlorhydrique sec dans une solution d'éther de la base libre ; (b) En dissolvant la base libre dans du métha nol absolu, en ajoutant un équivalent d'acide chlorhydrique méthanolique, en en levant le solvant par évaporation par un courant de dioxyde de carbone et en lavant le résidu plusieurs fois avec de l'éther sec ; (c) En dissolvant la base libre dans de l'éther absolu, en ajoutant une solution d'acide chlorhydrique méthanolique goutte à goutte jusqu'au moment où la précipitation est complète, en séparant le précipité par cen trifugation et en lavant plusieurs fois avec de l'éther sec.
L'hydrochlorure amorphe (point de fusion 157 - 1590 C dans un tube capillaire ouvert dans un bain d'huile) est très soluble dans le méthanol, l'éthanol et l'acétone, soluble dans l'eau et insoluble dans l'éther éthylique et l'hexane. Son pouvoir rotatoire spécifique est (a) D = - 540 30 (méthanol absolu, c = 0,6).
Les caractéristiques additionnelles de la base libre cristallisée sont indiquées ci-après Distribution <I>de</I> Craig Après dissolution dans un mélange d'éther éthylique et de 2 % de NaH2P04 aqueux (pH 4,5) et après passage à travers un système de distribution d'un tube de Craig de 24,
des es sais biologiques et l'absorption dans l'ultra violet maximum à 240 mR montrent une pointe pour le tube 6 avec des récupérations supérieu res à 95 0/0, et il n'y a pas d'indication de la présence d'un autre constituant.
<I>Absorption dans l'ultra-violet</I> Calculée dans 2 % de NaH2P04, la courbe de l'absorption dans l'ultra-violet montre un maximum à 241 m#t, E i '/o cm = 158 ; et cal culée dans du méthanol, un maximum à 240 m#i, E i V@ = 157, est observé.
EMI0006.0029
<I>Etude <SEP> polarographique</I>
<tb> '/potentiel <SEP> d'onde
<tb> Conc. <SEP> Electrolyte <SEP> pH <SEP> pH <SEP> avec <SEP> électrode
<tb> au <SEP> calomel <SEP> standard
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> O,1M <SEP> LiCl-MeOH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5,5 <SEP> (i <SEP> max.) <SEP> -1,09 <SEP> (E <SEP> max.)
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> 0,1M <SEP> <B>LiCl-MeOH</B>
<tb> -I- <SEP> 0,01 <SEP> % <SEP> de <SEP> gélatine <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,1 <SEP> -0,99
<tb> <B><I>0,05010</I></B> <SEP> 2'% <SEP> NaH2P04 <SEP> aqueux <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 4,6 <SEP> 2,0 <SEP> -1,07
<tb> <B><I>0,05010</I></B> <SEP> 2 <SEP> % <SEP> NaH2P04 <SEP> aqueux
<tb> -I- <SEP> 0,02 <SEP> a/o <SEP> de <SEP> gélatine <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 4,6 <SEP> 1,6 <SEP> -0,85 <I>Absorption dans l'infrarouge</I> Le spectre d'absorption dans l'infrarouge a été observé comme le bouillon de Nujol des cristaux, et la figure unique du dessin annexé est un graphique des indications ainsi obtenues et résumées dans le tableau ci-dessous, l'abs cisse indiquant la fréquence en cm-' et l'or donnée le pourcentage de transmission.
EMI0006.0031
<B>(cm-,)</B> <SEP> @(<B>0</B> <SEP> (cm-') <SEP> @(0 <SEP> (cm-')
<tb> 3,45 <SEP> 2899 <SEP> 8,62 <SEP> 1160 <SEP> 10,78 <SEP> 928
<tb> 5,76 <SEP> 1736 <SEP> 8,86 <SEP> 1129 <SEP> 10,95 <SEP> 9<B>1</B>3
<tb> 5,88 <SEP> 1701 <SEP> 9,01 <SEP> 1110 <SEP> 11,46 <SEP> 873
<tb> 6,11 <SEP> 1637 <SEP> 9,13 <SEP> 1095 <SEP> 11,61 <SEP> 861
<tb> 6,83 <SEP> 1464 <SEP> 9,30 <SEP> 1075 <SEP> 11,90 <SEP> 840
<tb> 7,01 <SEP> 1427 <SEP> 9,43 <SEP> 1060 <SEP> 12,18 <SEP> 821
<tb> 7,24 <SEP> 1381 <SEP> 9,67 <SEP> 1034 <SEP> 12,42 <SEP> 805
<tb> 7,66 <SEP> 1305 <SEP> 9,89 <SEP> 1011 <SEP> 12,80 <SEP> 781
<tb> 7,87 <SEP> 1271 <SEP> 10,11 <SEP> 989 <SEP> 13,48 <SEP> 742
<tb> 8,08 <SEP> 1238 <SEP> 10,40 <SEP> 962 <SEP> 14,51 <SEP> 689
<tb> 8,38 <SEP> 1193 <SEP> 10,
59 <SEP> 944 La manière de se comporter de l'antibioti que préparé suivant l'invention sous la forme d'une base cristallisée, lorsqu'il est soumis à une chromatographie sur un papier montant à 26,) C, en utilisant une culture de Micrococcus pyogenes var. aureus comme organisme d'essai est indiquée ci-dessous. La position de l'antibio tique (Rf) est indiquée dans chaque cas par une zone distincte d'inhibition lorsque l'antibiotique est placé dans un agent d'agar ensemencé avec l'organisme d'essai.
EMI0007.0008
<I>Détermination <SEP> de <SEP> Rf</I>
<tb> Durée <SEP> en <SEP> heures
<tb> Système <SEP> du <SEP> développement <SEP> RF
<tb> A. <SEP> Benzène <SEP> : <SEP> eau <SEP> : <SEP> acide <SEP> acétique <SEP> = <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 9 <SEP> : <SEP> 0,5 <SEP> 4 <SEP> 0,80
<tb> B. <SEP> n-Butanol <SEP> : <SEP> eau: <SEP> acide <SEP> acétique <SEP> = <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 16 <SEP> 0,90
<tb> C. <SEP> Acide <SEP> acétique <SEP> 0,2N <SEP> 4 <SEP> 0,80
<tb> <U>D. <SEP> Eau <SEP> sat</U>u<U>rée <SEP> d</U>e <SEP> n-Butanol <SEP> 4 <SEP> 0,95 Ci-après sont donnés des exemples illus trant l'invention.
<I>Exemple 1</I> <I>Préparation de l'ensemencement</I> <I>Stade I :</I> Des cultures de Streptomyces sp. WC 3628 sur agar incliné à base d'infusion de levure et de boeuf ou de soja sont utilisées pour ensemencer des flacons de 500 ml, cha cun contenant 100 ml du milieu de germina tion suivant : farine de soja, 1,5 0/0 ; glucose, 2 0/0 ; chlorure de sodium, 0,1 % ;
carbonate de calcium, 0,5 % ; CoCl2. 6H20, 0,0005 0/0 ; et eau de ville, quantité suffisante pour faire 100 ml. Le milieu est réglé à un<I>pH</I> 6,8 - 7,2 avec NaOH 12N avant la stérilisation dans un autoclave pendant 30 minutes à 121G, C.
Les flacons sont ensuite ensemencés et soumis à une incubation à 250 C pendant 72 heures sur une base animée d'un mouvement de va-et- vient ayant une longueur de 5 cm et faisant 120 déplacements par minute.
<I>Stade II :</I> Utilisant les flacons soumis pen dant 72 heures au stade I, un prélèvement sté rile de 15 ml est transféré dans deux flacons d'un litre secoués par un bras latéral, chacun contenant 300 ml du même milieu de germi nation que celui utilisé dans le stade I. Les fla cons sont ensuite soumis à une incubation à 250 C pendant 48 heures sur une base animée d'un mouvement de va-et-vient dans les mêmes conditions que celles décrites pour le stade I.
<I>Fermentation</I> A 10 litres d'un milieu de fermentation consistant en : farine de soja, 3,0 % ; cérélose, 2,2 0/0 ; chlorure de sodium, 0,1 0/0 ; carbo nate de calcium, 0,25 0/0 ; chlorure de cobalt, 0,0005 % ; huile de lard, 0,4 0/0 ;
et eau de ville, quantité suffisante, dans un récipient d'acier sans tache de 18,9 litres, qui a été sté rilisé à la vapeur pendant 15 minutes à 121 C, on ajoute le contenu de l'un des fla cons du stade II obtenu comme décrit ci-des sus. On laisse alors la fermentation se produire à 250 C avec une agitation mécanique à 300 révolutions par minute, et une aération à une cadence de 28,3 litres/minute (vitesse superfi cielle : 61 centimètres/minute).
Une pression positive est maintenue dans le récipient à 0,35 kg/cm2, avec addition d'huile de lard ou d'huile à bas point d'inflammation en quantité suffisante comme agent antimousse. Après 84 heures de fermentation, le bouillon est réglé à un<I>pH 2-3</I> avec H2S04 (concentré), puis est filtré en utilisant le Hyflo (un adjuvant de filtration). Le bouillon filtré est épuisé deux fois avec 1/4 de volume d'éther éthylique à un <I>pH</I> 6,6. On fait alors évaporer l'éther dans le vide en présence d'eau pour obtenir (1) une petite quantité d'une huile insoluble dans l'eau et (2) une fraction soluble dans l'eau.
Lorsque l'huile insoluble dans l'eau est épuisée avec l'éther de pétrole, il se forme un précipité ayant un pouvoir de 2500 u. d. La fraction soluble dans l'eau, après avoir été séchée par congélation et recristallisée dans de l'isopropa- nol chaud (60o C), fournit un produit pur ayant un pouvoir d'environ 7-10 000 u. d.
<I>Exemple 2</I> <I>Préparation de l'ensemencement</I> Stade <I>1 :</I> Le processus est le même que celui utilisé dans le stade I de l'exemple I. <I>Stade 11 :</I> Un flacon traité pendant 72 heu res dans le stade I est utilisé pour ensemencer une bouteille aérée de 18,9 litres contenant 12 litres du même milieu de germination (le mi lieu ayant été stérilisé à la vapeur à 1210 C avant l'ensemencement) que celui utilisé dans le stade I. Le milieu est réglé à un<I>pH</I> 6,8-7,2 avec NaOH 12N, puis est stérilisé à la vapeur pendant 1 heure 1/2 à 121 C.
On laisse alors se produire l'incubation à 250 C pendant 48 heures, avec une aération à une cadence de 1 litre par litre de milieu par minute.
<I>Fermentation</I> A 189 litres d'un milieu de fermentation consistant en farine de soja, 3,0 0/0 ; cérélose, 2,2 0/0 ; chlorure de sodium, 0,1 0/0 ; carbo- nate de calcium, 0,25 % ; chlorure de cobalt, 0,0005 0/0 ; huile de lard, 0,4 0/0, et eau de ville, quantité suffisante dans un récipient d'acier au carbone de 380 litres, on ajoute le contenu d'une bouteille du stade II obtenu comme décrit, ci-dessus.
On laisse alors la fer mentation se produire à 250 C avec agitation mécanique à 120 révolutions par minute et aération à une cadence de 368 litres/minute (vitesse superficielle : 31 cm/sec.). Une pres sion positive est maintenue dans le récipient à 0,70 kg/cm2, avec addition d'huile de lard et d'huile à bas point d'inflammation en quantité suffisante comme agent antimousse. Après une fermentation de 84 heures, le bouillon est réglé <I>à pH 2 - 3</I> avec H2SO-1 (concentré), puis est filtré en utilisant un adjuvant de filtration ( Hyflo )
. Le bouillon filtré est alors traité comme dans l'exemple 1 pour obtenir le con- centrat et l'antibiotique cristallisé.
Suivant une alternative, l'antibiotique cris tallisé peut être obtenu du bouillon filtré comme suit : environ 2630 litres du bouillon filtré sont neutralisés à un<I>pH</I> d'environ 7 et sont épuisés avec de l'acétate d'amyle dans un système à contre-courant à deux stades (vo lume de réduction 4 : 1). La solution résul tante d'acétate d'amyle (681 litres) est épuisée d'une manière analogue avec de l'eau à un <I>pH</I> 2,0 - 2,5 (volume de réduction 4 : 1). La solution aqueuse (170 litres) est alors épuisée par agitation avec environ 35 litres de benzène neutre<I>(pH</I> environ 7,0 - 7,5).
Après concen tration à environ 4,5 litres, l'extrait au benzène est épuisé avec un volume égal d'eau à un<I>pH</I> d'environ 2,0 - 2,5 et la solution aqueuse ré sultante est neutralisée pour fournir une base cristallisée qui est isolée par filtration. Lors du séchage, on obtient 144 g d'une base ayant un pouvoir de 5000 u. d. La neutralisation de l'ex trait à l'eau de l'acétate d'amyle et de l'extrait à l'eau du benzène consommé fournit approxi mativement 20 g d'antibiotique cristallisé. La recristallisation de l'antibiotique par dissolu tion des cristaux dans de l'isopropanol chaud aqueux à 70 0/0, puis l'addition d'eau jusqu'à la production d'un état nuageux, fournissent 114 g d'antibiotique purifié ayant un pouvoir de 7000 u. d.
Sous la forme d'un tableau sont indiqués ci-après les résultats de la fermentation obtenus au cours des fermentations des exemples 1 et 2
EMI0008.0032
Préparation <SEP> Préparation <SEP> Préparation
<tb> de <SEP> 10 <SEP> litres <SEP> (1) <SEP> de <SEP> 10 <SEP> litres <SEP> (2) <SEP> de <SEP> 189 <SEP> litres
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> S. <SEP> aureus <SEP> S. <SEP> aureus
<tb> Heures <SEP> pH <SEP> Dil. <SEP> Unités <SEP> dil. <SEP> _ <SEP> pH <SEP> Dil. <SEP> Unités <SEP> dil. <SEP> Heures <SEP> pH <SEP> Dil.
<SEP> Unités <SEP> dil.
<tb> 0 <SEP> 7,4 <SEP> - <SEP> 7,3 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 7,2 <SEP> 36 <SEP> 7,5 <SEP> 480 <SEP> 7,5 <SEP> 560 <SEP> 48 <SEP> 6,5 <SEP> 35
<tb> 60 <SEP> 7,4 <SEP> 560 <SEP> 7,5 <SEP> 400 <SEP> 72 <SEP> 6,7 <SEP> 70
<tb> 84 <SEP> 7,5 <SEP> 560 <SEP> 7,3 <SEP> 480 <SEP> 84 <SEP> 6,6 <SEP> 140
<tb> Filtrat <SEP> 7,7 <SEP> 560 <SEP> 7,5 <SEP> 560 <SEP> 140
<tb> (Bouillon <SEP> de <SEP> 84 <SEP> heures) L'antibiotique obtenu conformément à l'in vention peut être utilisé pour le traitement d'in fections variées sur les hommes et sur les ani maux, entre autres,
des infections par les micro-organismes dont la liste a été dressée précédemment en se rapportant à son spectre antibiotique. L'antibiotique peut être utilisé en soi en étant incorporé dans l'une quelconque des préparations usuelles ou sous forme de do sages, pour être administré par la bouche, par voie parentérale ou de façon locale. L'antibio tique peut être également administré concur remment (ou en mélange dans une préparation appropriée) avec d'autres antibiotiques variés (par exemple la néomycine) ou des agents chimiothérapeutiques (par exemple la N- hydroxy-2-pyridinethione).