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PROCEDE DE RECUPERATION DE LA PENICILLINE.
La présente invention se rapporte à un procédé nouveau et perfectionné de récupération de la pénicilline sous forme de sels utilisables en thérapeutique à partir de solutions au sein de solvants contenant de la pénicilline ou de l'acide pénicillique. Elle se rapporte plus particulièrement à un procédé nouveau et perfectionné de récupération de la pénicilline sous la forme de sels thérapeutiquement actifs, FSENSILEMENT insolubles ou au plus très légèrement solubles dans les milieux aqueux, par un procédé perfectionné supprimant l'une des opérations de récupération considérée actuellement comme essentielle dans la récupération de la pénicilline à partir de ses solutions aqueusesa ou à partir des solutions aqueuses d'acide pénicillique.
Les sels de pénicilline sensiblement insolubles et utilisables en thérapeutique que l'on recueille des solutions,, de préférence des solutions d'acide pénicillique dans un solvant organique, sont CAUX qui ont été décrits dans le brevet aux Etats Unis d'améfrique, n 2.627.491 du 3 février 1953. Ce sont en général des sels de pénicilline avec certaine alcoylène diamines substituées que l'on peut généralement représenter par les formu- les générales suivantes ;
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R. NH(OH2) nNIî2 R. NH(CH2)ri HoRl R.R,N(OH2) nNIi2 dans lesquelles R et R1 peuvent représenter des radicaux aliphatiques, aro-
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matiques, alicycliques ou hétêrocydliques9 avec ou sans substituants nuclé- aires.
Dans laportion alcoylène de ces diamines n représente un nombre supérieur à 1, de préférence compris entre 2 et 12.
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On a constaté que ces diamines sont intéressantes pour sépa- rer la pénicilline de ses solutions aqueuses par formation de sels avec la pénicilline et que les sels obtenus sont thérapeutiquement actifs et généra- lement à peu près insolubles dans l'eau ou au plus très peu solubles dans les milieux aqueux.
Parmi les sels de pénicilline très peu solubles dans l'eau des alcoylène diamines mono- et di-substituées, certains sont décrits dans le susdit brevet comme étant plus convenables que d'autres,, et le présent procédé nouveau concerne en particulier la récupération de ces sels de pé- nicilline très peu solubles dans l'eau. D'une manière générale, ce sont des sels de pénicilline d'alcoylène diamines mobo- et di-substituées de for- mule R.NH.
(CH) n.NH.R1 dans laquelle R représente un radical alcoyle à quatre atomes dé carbone au moins, cyclopentyle, cyclohexyle, pyridyl-alcoyle inférieur, thiophène-alcoyle inférieur, furane-alcoyle inférieur, quinolyl- alcoyle inférieur, phényle, naphtyle, diphénylméthyle, phényl-alcoyle infé- rieur, pipéronyle, halophényl-alcoyle inférieur, nitrophényl-alcoyle infé- rieur, hydroxyphényl-alcoyle inférieur, aminophényl-alcoyle inférieur, al- coxyphényl(inf)-alcoyle inférieur, alcoylphényl(inf.)-alcoyle inférieur, et alcoxy, hydroxyphényl-alcoyle inférieur, et R1 représente un radical tel que l'hydrogène, un groupe alcoyle, cyclopentyle, cyclohexyle, pyridyl- alcoyle inférieur, thiophène-alcoyle inférieur, furane-alcoyle inférieur,
quinolyl-alcoyle inférieur, phényle, naphtyle, diphényl-méthyle, phényl- alcoyle inférieur, pypéronyle, halophényl-alcoyle inférieur, nitrophényl- alcoyle inférieur, hydroxyphényl-alcoyle inférieur, aminophényl-alcoyle inférieur, alcoxyphényl(inf.)-alcoyle inférieur, alcoylphényl (infa)-alcoyle inférieur et alcoxy, hydroxyphényl-alcoyle inférieur, n étant un nombre entier compris entre 2 et 12 incluse
Parmi les sels particuliers sensiblement insolubles dans l'eau dont la récupération à partir de solutions de pénicilline ou d'acide péni- cillique fait l'objet principal de l'invention, on peut mentionner les sels obtenus avec la N.N'-dibenzylétbylène diamine, la N.N'-dibenzhydryléthylée diamine, la N.N'-di(alpha-Méthylbenayl)
éthyléne diamine et la N.N'-dibéta- phényléthylène diamine. Les sels de la pénicilline et des diamines substi- tuées contenant des substituants nucléaires telles que la N.N'-dihydroxy- benzyl-éthylène diamine, la N.N'-dihalobenzyléthyléne diamine et la N.N'- dialcoxy(inf.)benzyl-éthylène diamine sont également des exemples de sels à activité thérapeutique de la pénicilline, sensiblement insolubles dans l'eau ou très peu solubles dans l'eau, que l'on peut recueillir à partir des solutions de pénicilline ou d'acide pénicillique conformément au présent procédéo
Un des sels de la pénicilline sensiblement insolubles dans l'eau les plus intéressants du point de vue médical est le sel de la péni- cilline et de la N.N'-dibenzyléthyléne diamine, plus particulièrement le sel de dipénicilline de cette amine.
La portion aminique de ce sel de di- pénicilline est représentée par la formule :
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Dans la description qui suit, la préparation de ce sel peut être considérée comme illustrative de la préparation d'un quelconque des autres sels de la pénicilline décrits dans le brevet sus indiqué, attendu que ce sel, ainsi que sa récupération à partir des solutions de pénicilline eu d'acide pénicillique telles que les bouillons de pénicilline, peuvent être considérés comme typiques du procédé.
Toutefois; le présent procédé est également applicable à la récupération d'autres sels quelcon- ques diaminiques de la pénicilline, thérapeutiquement actifs., très peu solubles dans l'eau ou sensiblement insolubles dans l'eau et, en donnant le sel de dibenzyléthylène diamine-dipénicilline à titre d'illustration du présent procédé dans la description qui suit, la ¯denanderesse n'a nul-
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lement l'intention de se limiter à la récupération de ce seul sel. L'invention est également applicable à la récupération de tous les autres sels très peu solubles ou sensiblement insolubles dans l'eau décrits dans le brevet indiqué.
Dans la description qui suit, quand on se réfère à un sel sensiblement insoluble dans l'eau de la pénicilline, on comprend dans cette expression les sels d'alcoylène diamine substituée de la pénicilline, comme on l'a dit.
Pour recueillir la pénicilline conformément au présent procé- dé, on part de préférence d'une solution d'acide pénicillique dans un sol-
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vant organique non-polaire immi seible à l'eau tel que l' acé,tate d'a7 l'aeétate d±sopfopyleylacétate de n-butyle,1a chloroforme;t-éi:!i3r étJ:V-liq1;le;la méthyl- isobutyl-cétone, etc. On peut facilement obtenir une solution d'acide pé- nicillique dans un solvant organique non-polaire par extraction d'une solu- tion aqueuse de pénicilline telle que la liqueur de fermentation de Penicil- lium notatum ou Pénicillium chrysogenum, qui constituent les bouillons de l'industrie des antibiotiques.
La solution aqueuse de pénicilline extraite à l'aide d'un sol- vant non-polaire organique peut avoir été préalablement soumise à une puri- fication préliminaire, par exemple par adsorption du composé actif sur un agent adsorbant tel que du carbone activé et élution de l'adsorbat. La source particulière de matière contenant la pénicilline d'où l'on extrait l'acide pénicillique et le procédé particulier d'extraction donnant une so- lution d'acide pénicillique dans un solvant organique non-polaire immiscible à l'eau ne font pas partie de l'invention.
Le procédé ordinaire connu de récupération de la pénicilline présente de nombreux inconvénients. L'opération est longue et compliquée, attendu qu'elle exige trois opérations d'extraction, deux à l'aide de solvants organiques et une à l'aide d'une solution aqueuse tamponnée, avant qu'on puisse isoler et recueillir le sel de la pénicilline. C'est là, du point de vue chimique industriel, un gros inconvénient, car il y a immobi- lisation d'une installation de valeur pendant un temps très long, ce qui réduite la capacité de production de l'installation.
Les faibles rendements dus à l'obligation de procéder à ces trois extractions constituent d'autres inconvénients. On sais que l'acide pénicillique est extrêmement instable en solution aqueuse acide, en particulier aux valeurs de pH les plus acides. Pour éviter une décomposition excessive de la matière active, on s'est efforcé d'éviter l'acidification de la solution aqueuse avant le moment où elle est amenée en contact avec le solvant organique (habituellement l'acétate d'amyle); pour l'extraction en contre=courant, ce qui réduit le temps de séjour des solutions acidifiées.
Le procédé ordinaire exige deux extractions séparées de l'acide pénicillique libre et, en particulier dans la seconde opération d'extraction, c'est-à- dire celle où l'on recueille l'acide pénicillique de la solution aqueuse tamponnée au moyen d'un solvant organique, la perte de pénicilline par décomposition est très importante. Même quand on s'efforce de réduire la durée de contact au cours de laquelle le solvant organique d'extraction et la solution tampon aqueuse sont en contact, ces pertes de pénicilline constituent un sérieux inconvénient dans les procédés ordinaires de récupération.
On a trouvé selon l'invention qu'il était possible de simplifier le procédé de récupération en supprimant l'une des opérations d'extractions précédemment nécessaires dans les procédés ordinaires de récupération de la pénicilline. En réduisant le nombre des opérations nécessaires, non seulement on réduit considérablement le coût des opérations de récupération et les frais d'investissement, mais encore on augmente le reniement global du procédé de récupération du produit final vendable. La durée nécessaire au traitement du bouillon de culture ou autre solution étendue de pénicilline et à la récupération d'un sel cristallisé de cet antibiotique est diminuée, ce qui permet une utilisation plus économique de l'installation dont on dispose.
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Conformément au présent procédé simplifié, on part avec une solution d'acide pénicillique dans un solvant organique non-polaire immis- cible à l'eau tel que l'acétate d'amyle, un mélange d'acétates d'amyle, un mélange d'acétates d'amyle avec des alcools amyliques, de l'acétate d'iso- propyle,de l'acétate de n-butyle, du chloroforme, de l'éther éthylique, de la méthyl-isobutyl-cétone, ou un autre solvant organique utilisable pour extraire la pénicilline sous forme d'acide pénicillique d'une de ses solutions étendues. Cette solution dans un solvant organique est ordinairement obtenue au premier stade opératoire dans les procédés ordinair es actuellement en usage de récupération de la;pénicilline, par exemple suivant le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 2.530.883 du 21 Novembre 1950.
Le premier stade dans le présent procédé, comporte la conversion de la pénicilline présente sous forme d'acide pénicillique dans cette solution au sein d'un solvant organique à l'état de sel de pénicilline très soluble dans l'eau, ce qui permet une récupération presque quantitative du produit actif par épuisement de la solution organique à l'aide d'un liquide aqueux. La séparation des impuretés du sel de pénicilline, bien qu'impor- tante, n'est pas absolument essentielle au cours de ce stade et il est inutile que le sel de pénicilline préparé assure une séparation très nette de la pénicilline des impuretés auxquelles elle est associée.
L'amine qui peut être utilisée pour extraire la pénicilline de sa solution organique par réaction avec l'acide pénicillique pour former un sel de pénicilline très soluble dans l'eau doit être une amine soluble dans le solvant organique et dont le sel de pénicilline soit très soluble dans l'eau. Parmi les amines répondant à ces exigences et dont les sels de pénicilline présentent les rapports convenables de répartition entre le solvant organique et l'eau, on peut mentionner comme particulièrement avantageuses les alcoylamines solubles dans les solvants organiques, dans lesquelles le ou les substituants attachés à l'azote ont généralement une longueur ne dépassant pas 4 atomes de carbone.
Parmi les amines particulières qui se sont montrées satisfaisantes, on peut mentionner la monoétha-
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nolamine, la monoisopropanolamine, la monobutylamine, la diéthanolamine, la diisopropylaminê, la diôthyléthanolabine, la triéthylamine, l' aminoéthylé- thanolamine et l'amine cyclique morpholine.-
L'amine peut être introduite sous la forme d'une solution aqueuse s'écoulant en contre-courant du courant de solution d'acide pénicillique dans un solvant organique du type précédemment décrit.
Toutefois, il est préférable que l'amine soitintroduite sous la forme d'une solution dans le solvant organique, et que l'eau nécessaire à l'extraction de la pénicilline sous la forme de son sel d'amine soluble dans l'eau soit introduite séparément et, si on le veut, en contre-courant du sens d'éconlement de l'amine, Ces deux opérations peuvent naturellement être effectuées dans une installation d'extraction centrifuge à contre-courant industriellement disponible, par exemple du type Podbielniak.
L'usage d'une amine soluble dans le solvant organique et for- mant avec de l'acide pénicillique un sel dont le rapport de répartition solvant/eau soit tel qu'il puisse être facilement extrait du solvant organique dans l'eau, permet d'obtenir divers avantages nets. Il est possible d'apporter l'amine sous forme d'une solution dans un solvant organique dans lequel l'acide pénicillique est dissous, l'eau nécessaire à l'extraction du sel aminique de la pénicilline étant introduite séparément dans l'appareil d'extraction. Ceci permet de réduire la quantité d'eau fournie, de sorte qu'il est plus facile d'obtenir une solution aqueuse du sel aminique de la pénicilline d'une concentration en pénicilline plus élevée.
Il est également possible de régler le rapport de l'eau à la solution de pénicilline beaucoup plus facilement et efficacement que ne le permettaient les procédés actuellement disponibles. Attendu que l'eau est introduite dans l'opération finale de séparation sous la forme d'eau ordinaire et non une solution alcaline comme c'est le cas dans les procédés actuels comportant l'usage de solutions alcalines tampon telles que des solutions de phosphates de sodium, il ne se produit pas, dans le présent procédé, de contact
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nuisible de la pénicilline,avec un liquide aqueux de pH élevé, susceptible de provoquer la destruction d'une très forte proportion de la péni-cilline active.
On convertit ensuite le sel d'amine de la pénicilline soluble dans l'eau ainsi produit en un,sel de pénicilline plus insoluble, de préfé..- rence un sel très peu soluble ou sensiblement insoluble dans l'eau d'amine et de pénicilline formé par réaction d'une amine du type précédemment dé- crit avec le sel soluble dans l'eau de la pénicilline, conformément au pro- cédé du brevet n 2.627.491 ci-dessus mentionné. Le sel insoluble d'amine et de la pénicilline précipite avec un rendement sensiblement quantitatif et l'on recueille ainsi la matière active. La pénicilline est ainsi débar- rassée dans une très grande proportion des impuretés auxquelles elle est associée dans le bouillon de fermentation.
La réaction entre la solution aqueuse du sel d'amine de la pénicilline très soluble dans l'eau et une alcoylène diamine substituée du type précédemment indiqué et représentée par les formules :
R. NH.(CH2) n.NH2
R. NH. (CH2)n.NHR1 ou R. R N(CH2) NH2 dans lesquelles R, R1 ET A ont les significations précédemment, données, peut être effectuée Sans une cuve de mélange simple en amenant simplement en contact les deux réactifs dans un milieu réactionnel aqueux. On recueille le sel actif de pénicilline à l'état très pur,en principe exempt d'impureTéS NATURELLEEMTN associées avec la pénicilline dans le bouillon de culture.
La purification ne comporte pas de diminution de rendement et on n'observe pas de pertes appréciables par destruction ou désactivation de la pénicilline.
Voici un exemple du traitement de récupération de la pénicilline conduit conformément au présent procédé perfectionné.
Exemple
On épuise 5.000 litres d'un bouillon de fermentation de la pénicilline titrant 500 unités de pénicilline par centimètre cube dans un appareil centrifuge d'extraction par solvant du type Pldbielnisk, à un pH de 2, au moyen de 1000 litres de "Pentacétate", solvant fabriqué par la "Sharples Solvents Corporation" et formé essentiellement d'un mélange d'acétates d'amyle pouvant ou non contenir en supplément un mélange d'alcools amyliques. Cet épuisement est effectué conformément aux opérations courantes de récupération de la pénicilline.
L'extrait riuhe à l'acétate d'amyle d'acide pénicillique est-. alors envoyé d'une manière continue dans un second appareil d'extraction centrifuge par solvant du type Podbielniak. On ajoute une solution à 5% de triéthylamine dans le "Pentacétate" à la solution organique d'acide pénicillique par un débit-mètre, et on envoie de l'eau en contre-courant dans l'appareil centrifuge d'extraction suivant un rapport de 1 partie d'eau pour 18 parties de la solution de pénicilline dans l'acétate d'amyle. On maintient le pH de l'effluent aqueux riche sensiblement à 7,2,par réglage du débit de la triéthylamine dans l'appareil d'extraction de Podbielniak,
et on remet en circuit une quantité suffisante-de l'extrait aqueux dans le tuyau amenant la solution dans l'acétate d'amyle de l'acide pénicillique pour constituer 25 à 30% de la charge.
Après réaction de la solution dans l'acétate d'amyle de l'acide pénicillique avec la triéthylamine dans l'appareil d'extraction centrifuge par solvant, avec alimentation d'eau en contre-courant dans le rapport indiqué, on obtient 65 litres d'une solution aqueuse du sel de triéthylamine de la pénicilline, 4'une puissance de 34.000 unités par centimètre cube, déterminée par essai iodo métrique.
On pèse une solution de diacétate de dibenzyléthylène diamine de concentration 1,25 N en quantité suffisante
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pour fournir la quantité théorique d'amine nécessaire à la réaction avec la pénicilline pour former la dibenzyléthylène diamine dipénicilline, plus un excès d'environ 10%, Quand on prépare le gel de dibenzyléthylène-diamine de la pénicilline, il est commode d'utiliser, par exemple, 1,48 litre de la solution 1,25 N de diacétate de dibenzyléthylène-diamine par milliard d'unités de puissance.
L'extrait riche du sel de triéthylamine de la pénicilline est traité au moyen de carbone activé dit "Nuchar" dans la proportion de 2 à 5 g. de carbone décolorant par litre d'extrait. On le filtre alors sur un filtre microbiologique dans une cuve stérile. On ajoute alors une quantité d'acétone à peu près égale aux deux-tiers du volume de la solution et on chauffe le mélange à 30 C. en agitant. On peut mettre de la formamide au lieu d'acétone.
On ajoute alors la solùtion de diacétate de dibenzyléthylènediamine de concentration 1,25 N précédemment pesée et il se forme dans le mélange réactionnel le sol cristallisé de dibenzyléthylène diamine de la pénicilline. On règle le pH du mélange réactionnel à 6,5 par addition d'une petite quantité d'acide acétique glacial. On peut aussi ajouter l'acide acétique à la solution de diacétate de dibenzyléthylène diamine avant d'ajouter celle-ci à la sotion de pénicilline.
On refroidit alors la bouillie de cristaux à environ 10 c. et on filtre à l'aide d'un filtre à aspiration ou d'une centrifugeuse du type à panier. On lave le gâteau du filtre à plusieurs reprises, d'abord au moyen d'acétone aqueuse d'une concentration de 50%, puis au moyen d'acétone pureo On sèche alors le produit sous une pression inférieure à la pression atmosphérique et on le chauffe à une température de 50 à 60 C. Le produit cristallisé ainsi obtenu titre 1.190 unités d'activité par milligramme et la quantité recueillie est sensiblement 70 à 80% de l'activité présente à l'origine dans le bouillon de fermentation.
Le produit est un sel de pénicilline cristallisé sensiblement pur de grande activité et qui est utilisable en thérapeutie dans tous les cas d'application de la pénicilline. Comme il est dit dans le susdit brevet n 2.627.491, la dibenzyl- éthylène diamine, dipénicilline possède de nombreux avantages pour ce qui concerne le maintien du taux de pénicilline dans le sang pendant une période prolongée, comparativement aux pénicillines dont on disposait antérieurement.
Dans l'exemple précédent, on a cité à titre d'exemple de mise en oeuvre du procédé l'usage de la triéthylamine pour former un extrait aqueux de sel de triéthylamine de la pénicilline suivant le premier stade du présent procédé. On peut également utiliser diverses autres amines, comme on l'a dit, et en particulier la manoéthanolamine, la monoisopropano- lamine, la monobutylamine, la déthanolamine, la diisopropylamine, la diéthyléthanolamine, l'amino-éthanolamine et la morpholine.
De même, dans la réaction de l'amine formant un sel sensiblement insoluble de pénicilline au cours du premier stade, au lieu de dibenzyl-éthylène diamine (ou d'un de ses sels), on peut utiliser l'une quelconque des amines précédemment indiquées, qui sont décrites dans le susdit brevet N 2.627.451. On obtient ainsi de très bons résultats avec les amines telles que la N.N'dibenzhydryléthylène diamine, N.N'-di-béta-phénylthyléne diamine, N.N'dihydroxybenzyléthylène diamine, N.N'-dihalobenzyléthyléne diamine et les N.N'-dibenzyl-0thylénediamines dans lesquelles les noyaux aromatiques sont substitués par un ou plusieurs groupes alcoxy, le radical alcoyle étant un radical alcoyle inférieur.
D'autres exemples d'amines appropriées et préférées sont la NON' difurfuryl-éthylène diamine, la N.N'-bis-(3.5.5-triméthyl-hexyl)-xéthyléne diamine et la N.N'-di(alpha-méthylbenzyl) éthylène diamine.
Le présent procédé de récupération de la pénicilline tel qu'il a été décrit est susceptible de variantes sans qu'on s'écarte pour autant de son cadre et de son esprit.