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" PERFECTIONNEMENTS RELATIFS AU PROCEDE DE RECUPERATION
DES ANTIBIOTIQUES TETRACYCLINE, CHLOROTETRACYCLINE ET
BROMOTETRACYCLINE, A PARTIR DE SOLUTIONS AQUEUSES DE CEUX-CI".-
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La présente invention a pour objet un procédé de récupération des antibiotiques tétracycline, chlorotétracy- cline et bromotétracycline, à partir de solutions aqueuses de ceux-ci contenant des impuretés provenant du mélange de fermentation
On peut préparer les antibiotiques chlorotétracy- cline, tétracycline et bromotétracycline, par la culture de microorganismes, Darticulièrement de diverses souches de Streptomyces aureofaciens, y compris les mutants naturels et artificiels. Les caractéristiques des microorganismes sont telles que leur classification est parfois difficile.
Lies- pèce S. auréofaciens a une gamme de propriétés si étendue qu'à l'examen hâtif certaines variantes pourraient être con- sidérées d'abord comme appartenant à d'autres espèces, mais après une étude plus soignée on trouve qu'elles ont des caractéristiques qui sont identiques à celles de souches connues de S. auréofaciens, et qu'elles peuvent donc à bon droit être classées dans cette espèce .
La présente invention a pour objet un procédé de séparation et de récupération des antibiotiques chloro- tétracycline, tétracycline et bromotétracycline, même s'ils sont produits par une souche de microorganismes à laquelle tel ou tel mycologue a pu donner une classification différen te .
Antérieurement, on séparait les antibiotiques de solutions aqueuses les contenant, en lesextrayant par un solvant organique; ou bien en les¯ faisant précipiter sous forme de sel avec un acide, sous forme de matière! neutre, ou sous forme de sel avec une base, par un choix
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approprié des concentrations et des acides et bases utilisés, -et par ajustement du pH. On séparait aussi ces antibiotiques d'une solution aqueuse en ajoutant un véhicule organique qui provoque la séparation de l'antibiotique sous forme de sel avec le véhicule, ou bien qui le rend plus soluble dans les solvants organiques; des véhicules organiques préféren- tiels sont les dérivés organiques anioniques de l'acide aul- furique,répondant à la formule type générale R-On-SO2OH dans laquelle n est 0 ou 1, et 2 est un groupe organique hydro- phobe.
Le poids moléculaire de,ces dérivés n'est générale- ment pas inférieur à 200 environ et il est assez petit pour que le dérivé soit au moins partiellement soluble -dans l'eau; les groupes hydrophobes préférentiels sont ceux qui, lors- qu'ils se lient à l'hydrogène pour former un composé R-H, ont une solubilité dans l'eau inférieure à 2% environ et de préférence inférieure à 1/4% environ . Des dérivés appropriée de ce genre sont les sulfosuccinates dialkyliques à chaîne 'longue, les sulfates d'alkyle 'et les sulfonates d'alkyle substitués. Ces composés se trouvent généralement dans le commerce sous forme de sels, tels que le sel de sodium.
Dans les procédés antérieurs pour récupérer ces antibiotiques par diverses opérations de précipitation, extraction ou séparation, les impuretés provenant du mélange de fermentation suivant l'antibiotique, et tendent à préci- piter avec lui ou à s'extraire avec lui pour former un pro- duit impur. Les produits pharmaceutiques finis doivent avoir une couleur claire et être exempts d'impuretés. En outre, ces impuretés solubilisent l'antibiotique, de sorte que l'on. obtient des rendements faibles en matières purifiées .
Un pigment organique foncé, de caractéristiques chimiques inconnues, a une tendance prononcée à,s'associer
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aux antibiotiques durant leur séparation et leur purifica- tion. De très petites quantités de cette matière altèrent la couleur jaune clair des cristaux d'antibiotique pur en leur donnant une nuance brunâtre. Cet obscurcissement peut être causé par une proportion si faible des impuretés colorée que le pouvoir de l'antibiotique n'est pas affecté d'une fa- çon appréciable,. mais cependant, la cpuleur montre que la matière est moins acceptable du point,de vue pharmaceutique.
Il est très désirable d'éliminer ces impuretés pour préparer un produit plus acceptable -
L'étude de l'absorption d'ultra-violet de ltanti-. biotique brut indique que' ces impuretés absorbent fortement à des longueurs d'onde de 460 millimicrons,.bande dans la- quelle les antibiotiques purs présentent une absorption très faible. L'absorption à cette longueur d'onde constitue une méthode commode ! * pour mesurer la ' quantité de ces impure- tés colorées.
A cet'effet,' on utilise comme étalon le chif- fre d'extinction pour une longueur d'onde de 460 millimi- crons, donné par une solution à 1% de l'échantillon dans l'eau, dans une cellule ayant un trajet de rayons de 1 cm.
On peut définir le chiffre comme suit:
E1%, 460 m 1cm = log 1/I/Io expression dans laquelle:
Io = énergie des rayons incidents
I = énergie des rayons émergents.
Ce coefficient d'extinction pour la chlorotétracycline pu- rifiée est de 0,16. Un chiffre inférieur à 0,30 est généra- leinent acceptable pour l'usage pharmaceutique .
On a trouvé maintenant qu'en ajoutant un agent de chélation métallique lourd dont le pH pour le calcium
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est dtau moins 7, on enlève ou on sépare beaucoup des impu retés qui sans cela précipiteraient ou stextraieraient en même temps que les antibiotiques produits par le S. auréo- faciens ou leurs sels, ou qui les feraient rester en solu- tion, et on obtient ainsi dans tous les processus de récu- pération ci-dessus des produits de puretés grandement amélio-, rée .
Quand un ion métallique se combine avec un donneur, d'électrons, on dit que la substance résultante est un'com- plexe, ou un composé de coordination, Si la substance qui se combine avec le métal contient deux ou plusieurs groupes donneurs, de sorte qu'il se forme un ou plusieurs cycles, la structure résultante est un composé chélaté, et le donneur est un agent de chélation . [Marte Il , Arthur E., Calvin, ¯ Melvin, Chemistry of the Metal Chelate Coinpounds" ( Chimie des composés chélatés métalliques); Prentice-Hall Inc., New York, 1952, page 1].
Pour être utile lorsqu'il s'agit d'éliminer les impuretés des antibiotiques chlorotétracycline, tétracycline et bromotétracycline et de récupérer ceux-ci, l'agent de chélation doit avoir une affinité plus forte que ces anti- biotiques vis-à-vis des impuretés . L'affinité pour les ions calcium est un bon indice de l'efficacité dans les systèmes de récupération envisagée .
L'affinité pour les métaux peut stexprimer par une constante dtéquilibre. Une constante d'équilibre pour la formation d'un composé chélaté métallique par interaction d'un métal avec l'agent de chélation du type:
M + nKe = MKe n est donnée par l'équation :
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= (14Ke n ) (iVITCK-e-F
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dans laquelle ( ) représente les activités
MKe = composé chélaté n métallique formé ici = ion métallique
Ke = anion chélaté n = nombre de ligands liés au métal Le logarithme de cette constante, que l'on peut écrire pKca + 2 pour le clacium bivalent, est une méthode commode pour indiquer la force;'des divers agents de chélation.
Les acides aminopôlyc,arboxyliques qui forment des composés ché- latés stables solubles dans l'eau sont extrêmement utiles ; la valeur est de, préférence d'environ 7 pour assurer que les agents de chélation soient plus,forts que l'effet e chéla- tion des antibiotiques, et en conséquence, que cet)agent en- lève les impuretés des antibiotiques, en donnant ls anti- biotiques sous une forme relativement pure: Parmi ces acides
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aminopolycarbokyliqués qui se trouvent actuellement dans le commerce figurent :
L'acide éthylêediaininé-tétra-acét.que 22'22'Él& L'acide triméthylènediamine-tétra-acétiquo (HOOCCH2)2N'-CH2-CH2-CH2-N(CH2COàH)2 L'acide trinitrilotriacétique N(CH2COOH)3
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L'acide Nt-(2-hydroxyéthyl)-éthylénediamine-N,Nt-tri- acétique
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L'acide 1,2-diamino-cyclohexane-N,N,Nt,Nt-tétra- acétique
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L'acide dipropylène-1,2-triamine-penta-acétique
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L'acide 1,3-d1alnino-2-propanol-tétra-acétique (HOOCCH2)2CH2CH(OH)dH2N(HCO L'éther b.s(NßN-carboyméthyl-2-aminoéthyique) ( HOOCCHZ ) 2NGH2ca2PCH2cH2N (QH2COO) 2 Le bis ,L2-(IN-carboxméthyl)-amixioéthoxy-éthane (HOOCCH2)2N-CH2GH20CH2GHzOCHzCH2-N(CH2COOH)2 L'acide 2-aninoéthylphosphonique-N,mN-diacétique H30P-CH2CH2-NH(CH2CQOH)2
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L'acide aminobarbiturique-N,
N-diacétique
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( acide Uramil-N,N'-diacétique)
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L'acide 1,2-propylènediamine-tétra-acétique
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(HOOCCHz)zNCH(CH3)CHzN(CHzCOOH)z
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L'acide diéthylènetriamine-penta-acétique
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(HOOCCH2)2NCHZ-N-CHZCHZ-N(CHZCUOH)2 t
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CHCOOH
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Bien qu'on ne s'appuie pas nécessairement là-des- sus pour donner une téhorie des interactions mises en jeu, les résultats obtenus par l'addition de ces agents de chéla- tion aux solutions contenant des antibiotiques concordent avec la théorie diaprés laquelle les antibiotiques forment des complexes avec les métaux polyvalents et les impuretés.
Les antibiotiques sont eux-mêmes des agents de chélation, et forment ainsi des composés chélatés avec les impuretés. Quand il y a un agent de chélation ayant une plus forte affinité pour les impuretés, l'antibiotique se libère des impuretés, et il est plus.facile à obtenir sous une forme pure. L'usa- ge des agents de chélation est donc avantageux dans tout procédé où l'on sépare d'une phase aqueuse les antibiotiques chlorotétracyclihe, tétracycline et bromotétracycline.
La quantité préférentielle de l'agent de chélation varie, bien entendu, avec la concentration des impuretés qu'il s'agit de séparer et le procédé'.utilisée Fréquement, avec 0,1 à 1% sur la base du poids par volume de solution,. on enlève suffisamment les impuretés gênantes pour pouvoir obtenir une qualité pharmaceutiquement acceptable à partir d'un filtratde mélange initial. De'la'forme récupérée .alors, on peut convertir l'antibiotique en toute forme pharmaceuti- quement désirable, sans qu'il soit nécessaire de procéder à une recristallisation ou manipulation intermédiaire .
Une quantité moindre de l'agent de chélation peut donner un pro- duit suffisamment pur, de sorte qu'une',seule recristallisa- tion peut assurer à la fois la purification finale et la conversion en une forme désirée de l'antibiotique, et accroî- tre ainsi les rendements tirés finalement du bouillon . Une quantité plus faible est utile, mais pas autant, à moins que la quantité d'impuretés ne soit petite .
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Les agents de chélation donnent des résultats particulièrement utiles dans l'intervalle du pH 2 au pH 10 environ. La partie inférieure de cet intervalle est préfé- rable pour la chlorotétracycline, car la chlorotétracycline a tendance à se dégrader pendant des opérations conduites au-dessus du pH 8 environ. La tétracycline est pus stable que la chlorotétracycline dans l'intervalle de pH de 8 à 10, et en conséquence en peut la raffiner plus utilement dans cet intervalle .
L'intervalle de pH de 5 à 8 environ est normale- ment un intervalle de travail préférentiel. Les agents de chélation sont particulièrement utiles quand on les utilise conjointement avec des véhicules organiques, particulière- ment les dérivés organiques anioniques de l'acide sulfurique mentionnés antérieurement. De préférence, on ajoute ltagent de chéla.tion avant le véhicule, car: l'agent de chélation doit enlever les impuretés qui autrement précipiteraient avec le véhicule et les conditions d'équilibre s'établi- raient plus lentement si l'on redissolvait des impuretés qui avaient auparavant été précipitées ou séparées.
Ces inter- valles de pH sont en partie inférieurs a ceux habituelle- ment recommandés pour les agents de chélation et en fait couvrent une partie de 1.'intervalle que l'on considérait précédemment comme en dehors de l'intervalle efficace pour les agents de chélation .
Quand on sépare avec un véhicule, il est préfé- rable du'il y ait de 1 à 3 moles environ du véhicule par mole d'antibiotique. Les agents de chélation et la véhicule peuvent tous deux être ajoutés sous forme de sels avec des aminés, avec l'ammoniac ou avec des métaux alcalins, ou sous forme des acides, car toutes ces f ormes donnent effectivement
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les ions libres de l'agent de chélation et du véhicule en solution, et ce sont ces ions qui semblent entrer en inter- action avec l'antibiotique et les impuretés pour donner les meilleurs résultats.
Les pH exacts, les te pératures et con- centrations exactes, les solvants et les conditions de tra- vail s'influencent bien. entendu mutuellement et varient sur un intervalle considérable
Bien que l'invention ne soit pas ainsi limitée, elle est illustrée par les' exemples précis suivants: EXEMPLE 1. -
Acide Ethylènediamine-tétra-acétique et acide di-2-étliyl- hexylsulfosuccinique- .-
On acidifie au pH 1,5 une portion de 2,7 litres de 'mélange de fermentation de chlorotétracycline , en ajou- tant' de l'acide sulfurique à. 25%.
On filtre le mélange,et on'délaie le tourteau dans 1,4 litre dteau, on ajuste au pH 1,5 avec de l'acide sulfurique , et on chauffe à 65 C pendant 10 minutes .On filtre la bouillie et on refroidit le filtrat à la température ordinaire. Les filtrats réunis mesurent 4 litres, on lois traite par 8 g d'une préparation commerciale contenant 80% en poids de sel tétrasodique de - l'acide éthylènediamine-tétra-acetique. ("Versene"). Après avoir agité pendant 10 minutes , on ajoute 18 cm3 d'une solution aqueuse à 75% de di-2-éthylhexylsulfosuccinate de sodium. On agite le mélange pendant 10 minutes et on ajuste alors le pH à 5,0 avec un'caustique dilué.
Après avoir agité pendant 10 minutes encore, on laisse déposer pendant 2 heu- res le précipité jaune clair du sel de chlorotétracycline de l'acide di-2-éthylhexylsulfosuccinique. On décante lteau qui surnage; et on centrifuge la phase inférieure pour éli- miner le reste de l'eau libre. On mélange le solide centri- fugé avec 20 cm3 de 2-éthoxyéthanol et on ajuste le pH à
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1,9 avec de l'acide sulfurique aqueux à 25%. Après avoir agi. té pendant 15 minutes, on ajoute 2g de chlorure de sodium et on centrifuge le mélange. La phase moins dense de saumur mesure 92 cm3 , On dilue la phase organique dense avec 20cm3 de 2-éthoxyéthanol et on filtre. On traite le filtrat par 2 g de chlorure de sodium et 2 cm3 d'acide chlorhydrique 6 N.
On agite le mélange pendant une nuit et on filtre les cristaux de chlohydrate de chlorotétracycline , on les lave avec une petite quantité de 2-éthoxy-éthanol, puis avec de l'éthanol, et on sèche . Le chlorhydrate de chlorotétracy- cline obtenu pèse 2,5 g et a un pouvoir de 972 microgrammes par mg. Les essais indiquent qu'il convient pour l'usage direct en thérapeutique sans autre purification.
On fait une expérience de contrôle de la même manière, sauf que l'on supprime le sel de sodium de l'acide éthylène-diamine-tétra-acétique, et on obtient un précipité brun foncé du sel de chlorotétracycline de l'acide di-2-éthyl hexylsulfosuccinique, et les opérations ultérieures donnent 2,7 g de chlorhydrate de chlorotétracycline brunâtre, ti- trant 810 microgrammes par mg.
EXEMPLE 2.- '
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Acide éthylènediamine-tétra-acétique et séparation alcaline,.,
On prépare un échantillon de 4,0 litres d'un fil- trat de mélange de fermentation acidifié préparé -comme dans l'exemple 1 et contenant 6,24 g de chlorotétracycline au titrage. En agitant, on ajoute 28 cm3 dtune solution aqueuse à 43% du sel tétrasodique de l'acide éthylène-diamine-tétra- acétique, et on ajuste le pH de la solution à 8,4 avec de la soude caustique 15 N.
Il se forme un précipité jaune clair contenant'la chlorotétracycline formée, que l'on filtre en utilisant 6 g de terre d'infusoires comme adjuvant de filtra- tion .On extrait successivement le tourteau avec trois por-
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tions de 20 cm3 de 2-éthoxyéthanol ajusté au pH 2,0 avec de l'acide sulfurique dilué . On réunit les extraits clairs, on les traite par 3,0 g de chlorure de sodium et on ajuste au pH 0,8 avec de l'acide chlorhydrique 12 N. La cristallisa- tion du chlorhydrate de chlorotétracycline se produit et el- le est complète après 24 heures d'agitation. On filtre le chlorhydrate de chlorotétracycline jaune d'or, on le lave avec de petites quantités de 2-éthoxyéthanol et dtéthanol et on sèche.
On obtient un rendement de 4,05 g.de produit titrant 960 microgrammes par mg. Ce produit peut servir di- rectement dans des préparations pharmaceutiques sans autre purification .
EXEMPLE 3.-
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Acide éthylènediamine-tétr4-ac±tµque et tétradécylsulfate,,n
On prend une portion de 4,0 litres d'un filtrat de mélange de fermentation: acidifié préparé comme dans ltex-
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emple 1, on l'agita et'on la traTCB'p#12 g d'une prépara- tion commerciale brute contenant 80r du sel' tétrasodique de l'acide éthylènediamine-tétra-acètique . On ajuste le pH à
3,5 avec du caustique aqueux. En agitant on ajoute 24 g d'une solution aqueuse à 50% de tétradécylsulfate de sodium ( Cette matière se vend aux Etats-Unis sous la marque commère ciale Tergitol 4 et c'est une qualité commerciale de 2-méthyl 7-éthylundécyl-4-sulfate).
Après avoir agité pendant 40 minutes, on arrête l'agitation, et on laisse déposer le précipité floculant jaune clair de tétradécylsulfate de chlorotétracycline, on le décante et on sépare les solides par centrifugation. On dis.sout les solides humides dans 38 cm3 de 2-éthoxyéthanol, et on traite par 3,0 g de chlorure de sodium. Après agita- tion on ajuste le pH à 2 avec de l'acide sulfurique à 25%.
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Quand on ajoute 2,5 cm3 d'acide chlorhydrique 12 N et que l'on continue à agiter, on provoque la cristallisation du chlorhydrate de chlorotétracycline. Après avoir agité une nuit, on sépare le produit de la liqueur-mère, on le lave au 2-éthoxyéthanol et on sèche . On obtient un rendement de
6,95 g titrant 700 microgrammes par mg .
EXEMPLE 4.-
Acide éthylènediamine-tétra-acétique et extraction par sol- vant . -
A une portion de 5,0 litres de filtrat de mélange de fermentation acidifié (990 microgrammes par cm3) obtenu comme dans l'exemple 1, on ajoute 15,0 g d'une qualité com- merciale d'éthylènediamine-tétra-acétate tétrasodique. On a- gite le mélange et an ajuste le pH à 4,10 avec de la soude cuastique. Tout en continuant dtagiter, on ajoute 100 cm3 de chloroforme contenant 8,25 g de di(2-éthylhexyl) sulfo- succininate de sodium. Après 40 minutes d'agitation, on cen- triuge tout le mélange. Le volume d'extrait chloroformé re- cueilli est de 106 cm'.
On sèche l'extrait sur 20 g de sulfate de magné- sium à 4 C pendant 2 heures. On concentre l'extrait sous vi- de, jusqu'à 15 cm3 environ. Au concentré chloroformé, on a- joute 35 cm3 de 2-éthoxyéthanol, 1,5 cm3 d'eau et 1,5 g de chlorhydrate de triéthylammonium. On ajuste le pH à 0,7 avec
1,8 cm3 d'acide chlorhydrique concentré. Après vieillisse- ment dtune nuit, et en appliquant une agitation vigoureuse, on filtre le chlorhydrate de chlorotétracycline formé, on le lave avec de petites quantités de 2-éthoxyéthanol, d'eau et d'éthanol, puis on sèche sous vide On obtient un rendement de 3,54 g et une puissance de 815 microgrammes par mg avec lcm E1% 460 n = 0,770.
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On répète ce processus, mais en supprimant l'ad- dition de l'acide éthylènediamine-tétra-acétique. On obtient un rendement de 2,65 g et une puissance de 890 microgrammes par mg, avec E1%1cm 460m = 1,44 .
EXEMPLE 5. -
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Acide TT-(2-hydroxyéthyl)-éthylènediamine-N,N',N'-triacétique et acide di-(2,éthyrlhexyl)sulfosuccinique.- On ajoute de la soude caustique à une portion de 3,5 litres de filtrat acidifié de bouillon de fermentation de chlorotétracycline, pour élever le pH à 3,0. A cette so-
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lution, on ajoute lors 10,5 g d'acide N-(2-hydroxyéthyl)-é- thylènediamine-N,N' -,N'-triacétique. On agite ensuite le mé- lange pendant .13 I:1i.n1Lt.e.s.- guis on ajoute 13 g de di-(2-étliyl. hexyl)-sulfosucci,Wàte de somiDm.
On élève le pH du mélange à 7,0 avec de la soude caustique, et, on continue à agiter pen- dant 40,minutes..On laisse déposer pendant 3 heures le sel de chlorotétracycline de l'acide di-(2-éthylhexyl)-sulfo- succinique, on décante la solution et on centrifuge les so- lides. On a joute au précipité humide 20 cm3 de 2-éthoxyétha-
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no1, et de l'acide sulfurique aqueux à 25% jusqu'au pH 2,0.
On continue d'agiter pendant 15 minutes, puis on ajoute 3 g de chlorure de sodium et énsuite on agite encore pendant 15 minutes. On centrifuge le mélange, on sépare la couche de 2-éthoxy-éthanol, on filtre la couche, on lave le filtre ave'
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20 cm de 2-étho.yéthanol, et on réunit le filtrat et les liqueurs de lavage. On y ajoute 0,5 g de chlorure de sodium et de l'acide chlorhydrique aqueux concentré jusqu'à un pH de 0,5. On laisse vieillir le mélange réactionnel pendant 36 heures à la température ordinaire en agitant vigoureuse- ment. On sépare le chlorhydrate de chlorotétracycline formé,
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on le lave au 2-éthoxy-éthanol, à l'eau et à l'éthanol anhy- dre.
Après séchage à 56 C, on obtient 4,35 g de chlorhydra- te de chlorotétracycline, titrant 965 microgrammes par mg, avec un coefficient d'extinction de 0,487.
EXEMPLE 6. - 'Tétracycline avec acide éthylènediamine-tétra-acétique sans véhicule.-
On prend 5 litres de mélange de fermentation de tétracycline titrant 5770 microgrammes par cm3, on ajuste au pH 1,8 avec de l'acide sulfurique, on agite pendant une heure à la température ordinaire, on ajoute de la terre d'in- fusoires et on filtre. On lave le tourteau sur le filtre avec
2,0 litres d'eau ajustée au pH 2,0 par de l'acide sulfurique.
Le filtrat de mélange de fermentation acide, et la liqueur , de lavage, donnent un volume global de 5,78 litres titrant 4350 microgrammes par cm3 (récupération 88%). On ajuste une portion de 1,92 litre au pH 8,3 avec de la soude, on agite une heure, on ajoute de la terre d'infusoires, puis: on fil- tre. Un délaie le tourteau dans 145 cm3 d'eau au pH. 1,7 pen- dant deux heures, on filtre et on lave le tourteau avec 45 cm3 d'eau. On réunit l'extrait aqueux acide et la liquer de lavage, pour donner un volume de 203 cm3, titrant 28.800 microgrammes par cm3. On ajuste l'extrait acide au pH 5,5 avec de la soude, on agite pendant une heure, on fait vieil- lir une nuit à froid et on filtre. On lave le tourteau avec 25 cm3 d'eau.
On obtient de la tétracycline (neutre) pasant 7,10 g et titrant 758 microgrammes par cm3, E=3,38 (récupé- ration 57%).
On fait une répétition de l'opération ci-dessus en utilisant une portion de 1,92 litre du filtrat acide de' mélange de fermentation, sauf que l'on ajoute à l'extrait aqueux acide 4 g d'éthylènediamine-tétra-acétate de sodium!
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avant d'élever le pH à 5,5. On obtient un rendement de 6,15 g de tétracycline (neutre) titrant 887 microgrammes par cm3, E=3,14 (récupération totale 58%).
EXEMPLE 7. -
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Bromctétracycline avec acide éth¯ylénediarnine-tétra-aeétique et acide di-(2-éthylhexyl)sulfosuccinique.-
On acidifie au pH 1,8 avec de l'acide sulfurique à 25%.trois litres de bouillon de fermentation contenant de la bromotétracycline. On ajoute de la terre d'infusoires et on filtre la bouillie. On délaie le tourteau avec un litre d'eau chaude (40 C), on acidifie au pH 1,5 et on refiltre. Le@ filtrats réunis représentent un volume de 3,8 litres, on les concentre sous vide à 25 C jusgu'à 1 litre.
On ajuste le pH à 3,5 par addition de 4,0 g de @tétrasodique de l'acide
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éthylènediami1e-té:tra'"1acétique' (Versene) à 80% et 2 'cm3 de soude ION., On,agit lente'tnent la solution et op ajoute 3 gl d'une solution à 75y de di-(2-éthylhexyl)sulfpsuccinatë de sodium. Il se forme un précipité. On agite -le mélange pendant une heure encore, puis on arrête. Après avoir , laissé' déposer pendant 2 heures,, on décante -le liquide, qui surnage. On cen- trifuge le précipité, et on*jette le reste de la phase aqueu- se mécaniquement libre. On ajoute au précipité 10 cm3 de 2-éthoxyéthanol. On ajuste le pH à 2,2 avec de l'acide sulfu- rique, en appliquant une vigoureuse agitation.
En continu- ant l'agitation, on ajoute 1,5 g de bromure de sodium. Au bout de 15 minutes, on arrête l'agitation. On centrifuge le mélange réactionnel. On obtient deux phases liquides. On jet te la phase aqueuse usée. La phase 2-éthoxyéthanol contient la majeure partie de la bromotétracycline; on dilue cette phase avec 5 cm3 de 2-éthoxyéthanol et on filtre. A l'ex- trait filtré, on ajoute 0,5 g de bromure de sodium et on
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ajuste le pH à 0,5 avec 1,0 cm3 d'acide bromhydrique. On agi- te le mélange réactionnel pendant 30 heures. Un filtre le bromhydrate de bromotétracycline brut et on le lave avec de petites quantités de 2-éthoxyéthanol, d'eau et d'éthanol.
On sèche le produit à 56 C. On obtient Lui rendement de 1,8 g.
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Titrage : 890 microgranulles par p.
' J'f i,lil> 1 G. - Tétracycline avec acide éthylèl1ediamine-tétra-acétique et acide di-(2-étllhexyl)suLfosuccinique.- On ajuste au pH 1,4 au Moyen d'acide sulfurique. concentré deux litres de mélange de fermentation de tétracy- cline contenant Il {:; d'activité au titrage microbiologique, on agite pendant 2 heures et on filtre. On ajuste le filtrat au pH 3,4 avec due solution de soude. On ajoute 20 g d'é-
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thy1ènediamine-tétra-D.cÓtate de sodium, on continue d'agiter dix minutes, puis on ajoute 30 g d'une solution à 75% de di-2-éthylhexylsulfosuccinate de sodium; après dix minutes d'agitation, on ajuste le pH à 6,5 et on continue d'agiter pendant une heure.
Un centrifuge la:.bouillie et on mélange
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les'solides avec 30 cm3 de 2-éthoxyéthanol et 2,5 cm3 d'acide' chlorhydrique concentré pour donnera un pH de 3,2. On ajoute 2 cm3 de solution saturée de chlorure de sodium et on centri- fuge le mélange. On dissout le précipité dans 10 cm3 de
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2-éthoxyéthanol pouù donner un volume totale de 56 cl3. A celui-ci, on ajoute 112 cm3 de chloroforme et on extrait à trois reprises la solution résultante au moyen de 40 cm3 d'une solution à 1% de borate de sodium, ce mélange d'ex- traction étant ajusté au pH 9,8 avec de la triéthylamine.
Une quantité considérable d'impuretés de couleur foncée ex- traient dans les phases aqueuses. On mélange la phase chlo- roforme avec 30 cm3 d'une solution saturée de bicarbonate de
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sodium et on ajuste au pH 10,5 avec de la soude. Quand on centrifuge, on trouve très peu de couleur dans la phase a- queuse. On ajuste alors le même mélange au pH 11,0. Quand on centrifuge à nouveau, on observe très peu d'extraction de couleur; et quand on ajuste la phase aqueuse séparée au pH 7, on n'observe aucune précipitation, ce qui suggère qu'il n'y a pas de quantités appréciables de tétracycline. On lave a- lors la phase chloroforme en extrayant par trois portions de 30 cm3 d'acide chlorhydrique aqueux 0,1 N. Ces extraits sont de couleur jauneclair.
Finalement,, on extrait la phase à chloroforme par 30 cm3 d'eau et/quatre reprises par 25 cm3 d'une solution à, 1% de borate de sodium, le tout au pH 10,2.
Quand on ajuste au pH 5,6, ces dernières phases aqueuses al-
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' câlines réunies, il apparaît W:' ,nY'Éc:Lpité jaugez. 01 agite . le mélange pendant une heure, on filtre,'on rince le produit avec un peu d'eau et 'on sèche sous vide 'en,dessous ,de 45 .
On obtient 6,75 g de tétracycline (neutre') solide jaune ti- trant 756 microgrammes -par mg.
EXEMPLE, 9.- Tétracycline avec acide dodécylbenzènesulfonique et acide éthy
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-lènediamine-tétra-acétique--
On ajuste au pH 1,5 au moyen d'acide sulfurique 18 N, une portion de 600 cm3 demélahge de fermentation de tétracycline, on agite pendant 1/2 h, on mélange avec'12 g de terre d'infusoires, on chauffe à 55 C, et on filtre immédi- atement. On rince le tourteau avec 120 cm3 d'eau et on fil- tre à nouveau les filtrats béunis après une nuit de repos au réfrigérateur.
On ajuste le pH à 2,9, on ajoute 16 g d'é-
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thylènediamine-tétra-acétate de sodium en agitant, puis , on ajoute 7 g de sel de sodium de l'acide dodécylbenzènesulfo-
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nique brut ("UltraiietIK). On continue d'agiter pendant une heure. On ajuste le pH à 6,5 et on continue d'agiter pendant
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une heare encore, pendant laquelle on ajoute 50 g de chloru- re de sodium. On centrifuge la bouillie, on sépare les soli- des et on les sèche sous vide, oh obtient de la tétracycline (neutre). Les solides sèches sous vide représentent 68% de l'activité¯ du mélange de fermentation et ont une pureté de
23%.
REVENDICATIONS. -
1.- Procédé de récupération des antibiotiques tétracycline, chlorotétracycline et bromotétracycline à par- tir de solutions aqueuses de ceux-ci contenant des impuretés dues au mélange de fermentation, caractérisé en' ce qu'on ajoute à la solution un agent de chélation métal- lique lourd, dont le pH pour le calcium est d'au moins'? en- viron, et on récupère l'antibiotique dans la solution.