Claims (1)
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La demanderesse a trouvé qu'une souche convenable d'ergot (Cla- viceps purpurea Fr. Tul.) pouvait être cultivée in vitro, sur un milieu nutritif approprié et dans des conditions déterminées, de telle façon qu'el- le produise de l'ergotamine, de l'ergotaminine et de l'ergobasine en quan- tités propres â être isolées à l'état pur et cristallin à l'échelle de la- boratoire. Cette invention est d'importance essentielle, car elle est apte à rendre la production de ces alcaloïdes, si importants pour la médecine, indépendante dé la provenance naturelle de l'ergot et de son obtention arti- ficielle en agriculture.
The Applicant has found that a suitable strain of ergot (Claviceps purpurea Fr. Tul.) Can be cultivated in vitro, on an appropriate nutrient medium and under specified conditions, so that it produces ergotamine, ergotaminine and ergobasin in amounts suitable for isolation in the pure and crystalline state on a laboratory scale. This invention is of essential importance, since it is able to make the production of these alkaloids, so important for medicine, independent of the natural origin of ergot and of its artificial production in agriculture.
On a relevé à maintes reprises, dans la littérature, des mémoires sur la culture saprophytique de l'ergot, selon lesquels la présence d'alca- loïdes de l'ergot a été prouvée aussi bien dans le mycélium que dans le mi- lieu de culture. Cette preuve a été apportée par des réactions de colora- tion, parmi lesquelles c'est principalement la réaction à la p-diméthyla- mino-benzaldéhyde selon van Urk (Pharm. Weekblad 66,437, 1929) qui a été employée. Toutefois cette réaction'n'est pas spécifique, car l'indole et nombre de ses dérivés donnent aussi avec ce réactif une coloration rouge violet (Ehrlich, Pharm. Zentralhalle 1918 , 114) qui peut faire croire à tort à la présence d'alcaloïdes de l'ergot.
We have repeatedly noted in the literature, papers on the saprophytic culture of ergot, according to which the presence of ergot alkaloids has been proven both in the mycelium and in the medium of. culture. This proof has been provided by color reactions, of which it is mainly the p-dimethylaminobenzaldehyde reaction according to van Urk (Pharm. Weekblad 66,437, 1929) which has been employed. However, this reaction is not specific, because indole and a number of its derivatives also give with this reagent a red-violet color (Ehrlich, Pharm. Zentralhalle 1918, 114) which can lead to the wrong belief in the presence of alkaloids. ergot.
On sait que de nombreux micro- organismes sont capables de produire de l'indole ou des composés indoliques dans un milieu nutritif. C'est pourquoi un test de van Urk positif , donné par des extraits totaux, ne permet pas de conclusions formelles quant à la présence d'alcaloïdes de l'ergot.
It is known that many microorganisms are capable of producing indole or indole compounds in a nutrient medium. This is why a positive van Urk test, given by total extracts, does not allow formal conclusions as to the presence of ergot alkaloids.
Très souvent cependant, la présence d'alcaloïdes de l'ergot dans les cultures saprophytiques décrites dans la littérature a été étudiée non seulement au moyen des réactions coloration mais aussi par des tests physiologiques (par exemple, l'action sur l'utérus). Néanmoins, cette épreu- ve effectuée avec une substance complexe, telle que des extraits de culture ou de mycélium, n'est pas spécifique, elle non plus, car d'autres substances, par exemple l'histamine, provoquent aussi une coontraction utérine plus ou moins forte.
Very often however, the presence of ergot alkaloids in the saprophytic cultures described in the literature has been investigated not only by means of staining reactions but also by physiological tests (eg, action on the uterus). However, this test, carried out with a complex substance, such as extracts from culture or mycelium, is not specific either, since other substances, for example histamine, also cause a more uterine co-contraction. or less strong.
Les tentatives décrites dans la littérature et visant â cultiver l'ergot in nitro de telle sorte qu'il produise des alcaloïdes en quantités propres à une exploitation au laboratoire ont, jusqu'à présent, échoué ; preuve certaine en est que l'ergot dont on extrait les substances actives provient jusqu'ici uniquement de la production artificielle en agriculture ou de la cueillette, là où il se rencontre à l'état sauvage.
Attempts described in the literature to cultivate ergot in nitro such that it produces alkaloids in quantities suitable for laboratory use have heretofore failed; There is certain proof of this that the ergot from which the active substances are extracted has so far only come from artificial production in agriculture or from picking, where it occurs in the wild.
Due brève étude donne le tableau suivant des essais décrits dans la littérature ;
A.McCrean (Am.J.of Botany 18, 50,1931; USP 2, 056,360) déclare être parvenu pour la première fois â produire de l'ergotoxine, de l'histamine et de la tyramine par culture saprophytique de l'ergot. Cette affirmation s'appuie sur le résultat de tests physiologiques ("cock'a comb test",, "ocytocic test" et "bloodpressor test"), sans que les substances mentionnées aient été isolées.
This brief study gives the following table of tests described in the literature;
A.McCrean (Am.J. of Botany 18, 50,1931; USP 2, 056,360) declares to have succeeded for the first time in producing ergotoxin, histamine and tyramine by saprophytic culture of ergot . This statement is based on the results of physiological tests ("cock'a comb test" ,, "oxytocic test" and "bloodpressor test"), without the substances mentioned having been isolated.
R. Jaretsky (Arch.Pharm. 273, 348, 1935) signale une culture sa- prophytique d'ergot sur un milieu nutritifs convenable, qui a donné un résultat positif â l'épreuve de la cornutine (p-diméthylamino-benzaldéhyde) ainsi qu'au test biologique selon Broom et Clark; J. de Tempe (Diss, Amsterdam 1945) décrit une formation d'alcaloïdes par le Claviceps purpurea en cultu- re saprophytique ; toutefois,là encore, la conclusion se fonde uniquement sur la coloration rouge obtenue dans la réaction de van Urk.
R. Jaretsky (Arch.Pharm. 273, 348, 1935) reports a sapophytic culture of ergot on a suitable nutrient medium, which gave a positive result in the cornutin (p-dimethylamino-benzaldehyde) test as well. than biological test according to Broom and Clark; J. de Tempe (Diss, Amsterdam 1945) describes alkaloid formation by Claviceps purpurea in saprophytic culture; however, again, the conclusion is based only on the red coloration obtained in the van Urk reaction.
E. Burlet, J. Meyer et M. Chaduc (Thérapie Fr.7 144, 1952 relatent des essais de culture saprophytique de l'ergot sur un milieu nutritif
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artificiel particulier dont la composition n'est pas indiquée. Se basant sur un résultat positif obtenu dans la réaction de coloration selon Freudweiler, avec la vanilline et l'acide sulfurique (A. Goris, a. Liot, M.M Janot. An. Goris, Pharmacie Galénique, Paris, 2. 1231, 1949, et sur le résultat positif du test biologique effectué sur l'utérus de cobaye, les auteurs considèrent la présence d'alcaloïdes comme établie. S. K.Sim et H.W. Youghen (J.Am.Pharm. Ass. 40. 434, 1951) indiquent qu'ils ont pu prouver la présence d'alcaloïdes de l'ergot en traces dans le mycélium de Claviceps cultivé in vitro.
E. Burlet, J. Meyer and M. Chaduc (Therapy Fr. 7,144, 1952 report trials of saprophytic culture of ergot on a nutrient medium
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particular artificial whose composition is not indicated. Based on a positive result obtained in the coloring reaction according to Freudweiler, with vanillin and sulfuric acid (A. Goris, a. Liot, MM Janot. An. Goris, Pharmacie Galénie, Paris, 2. 1231, 1949, and on the positive result of the biological test carried out on the guinea pig uterus, the authors consider the presence of alkaloids to be established. SKSim and HW Youghen (J.Am.Pharm. Ass. 40. 434, 1951) indicate that they were able to prove the presence of ergot alkaloids in traces in the mycelium of Claviceps cultured in vitro.
La preuve a été faite par la réaction de van Urk. L'épreuve ayant été jugée positive par suite''de l'apparition d'une couleur rouge pourpre, on doit admettre avec certitude que les composés qui ont provoqué cette coloration n'étaient pas des alcaloïdes de l'ergot car ceux-ci donnent avec le réactif de van Urk une coloration bleue. Les auteurs eux-mêmes décrivent la réaction comme suit : "Tous les extraits provenant des matières à base de tissu mycélial soumises aux essais ont donné une couleur pourpre qui indiquait la présence d'alcaloïdes de 1-'ergot ou de composés similaires possédant un moyen d'indole".
The proof was made by the reaction of van Urk. The test having been judged positive as a result of the appearance of a red-purple color, it must be admitted with certainty that the compounds which caused this coloration were not ergot alkaloids because these give blue color with van Urk's reagent. The authors themselves describe the reaction as follows: "All extracts from the mycelial tissue materials tested gave a purple color which indicated the presence of 1-ergot alkaloids or similar compounds possessing a means. indole ".
L'essai selon van Urk a été complété par des tests biologiques dont les indications cependant n'autorisent pas non plus des conclusions certaines. Des auteurs japonais ont découvert un procédé grâce auquel ils ont réussi à produire des alcaloïdes in vitro au moyen d'une- souche déterminée de Claviceps (Claviceps purpurea parriesta katagiril) qui ne provient pas du seigle, mais d'autres graminées. Il semble en effet qu'on soit parvenu pour la première fois, au cours de ce travail, à isoler des cultures de ce champignon un alcaloïde cristallisé en quantités de laboratoire. Cet alcaloïde inconnu jusqu'iéi à reçu lw nom d'agroclavine. Dans une publication récente (J.of the-Agricultural Chem. Soc. of Japan 25. 458, 1952), les auteurs japonais M. Abe, T. Yamano, Y. Kozu et M.
The test according to van Urk was supplemented by biological tests, the indications of which, however, do not allow certain conclusions either. Japanese authors have discovered a process by which they have successfully produced alkaloids in vitro using a specific strain of Claviceps (Claviceps purpurea parriesta katagiril) which is not derived from rye, but from other grasses. In fact, it seems that in the course of this work we have succeeded for the first time in isolating cultures of this fungus, an alkaloid crystallized in laboratory quantities. This previously unknown alkaloid received the name of agroclavin. In a recent publication (J. of the-Agricultural Chem. Soc. Of Japan 25. 458, 1952), the Japanese authors M. Abe, T. Yamano, Y. Kozu and M.
Kusumoto relatent qu'ils ont créé un milieu nutritif artificiel contenant de la mannite comme source de carbone et du succinate d'ammonium comme source d'azote, et l'on ensemencé avec une souche de Claviceps qui croît à l'état naturel au Japon, en parasite de la graminée Elymus Mollis Tri.; ils ont pur isoler, comme alcaloïdes, de l'ergocryptinine, de l'agroclavine, des traces d'argocryptine et d'ergobasine ainsi qu'un alcaloïde nouveau, soluble dans l'eau et qu'ils ont appelé élymoclavine.
Kusumoto report that they created an artificial nutrient medium containing mannite as a carbon source and ammonium succinate as a nitrogen source, and it is inoculated with a strain of Claviceps that grows naturally in Japan. , as a parasite of the grass Elymus Mollis Tri .; they were able to isolate, as alkaloids, ergocryptinine, agroclavine, traces of argocryptine and ergobasine as well as a new alkaloid, soluble in water and which they called elymoclavine.
Il ressort de ces publications que, mis à part les deux travaux mentionnés en dernier lieu; jamais on n'a pu obtenir des substances cristallisées à partir de cultures saprophytiques de l'ergot. Les deux derniers mémoires décrivent uniquement la séparation d'ergocryptine et d'ergocryptinine, à côté d'autres alcaloïdes inconnus jusqu'ici.
It emerges from these publications that, apart from the two works mentioned last; it has never been possible to obtain crystallized substances from saprophytic cultures of ergot. The last two papers only describe the separation of ergocryptine and ergocryptinine, alongside other previously unknown alkaloids.
En revanche, jamais encore, jusqu'à ce jour, on n'était parvenu à obtenir. à partir de cultures d'ergot in rvitro, l'ergotamine, cet alcaloïde si important pour l'obstétrique, la gynécologie et la médecine interne.
On the other hand, never yet, until this day, had one succeeded in obtaining. from cultures of ergot in rvitro, ergotamine, this alkaloid so important for obstetrics, gynecology and internal medicine.
Comme il apparaîtra dans la suite, la demanderesse a trouvé qu'il était possible, avec une couche appropriée de Claviceps purpurea, de cultiver le champignon in vitro, sur un milieu nutritif convenable et en maintenant des conditions déterminées, de telle manière qu'il produise l'ergotamine et d'autres alcaloïdes de l'ergot, comme, par exemple, l'ergotaminine et l'ergobasine, en quantités propres à être isolées au laboratoire à l'état pur et cristallisé.
As will appear in the following, the Applicant has found that it is possible, with a suitable layer of Claviceps purpurea, to cultivate the fungus in vitro, on a suitable nutrient medium and while maintaining certain conditions, in such a way that it produces ergotamine and other ergot alkaloids, such as, for example, ergotaminine and ergobasin, in amounts suitable for laboratory isolation in pure and crystallized form.
Des recherches approfondies ont montré que le poids de mycélium des cultures ainsi que la teneur en alcaloïdes du mycélium formé dépendaient de la concentration des ions de zinc et de fer dans la solution
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nutritive. Toutes les cultures sans fer et toutes les cultures sans zinc présentent un faible poids de mycélium et ne donnent pas d'alcaloïdes.
Extensive research has shown that the mycelium weight of the cultures as well as the alkaloid content of the mycelium formed depends on the concentration of zinc and iron ions in the solution.
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nutritious. All cultures without iron and all cultures without zinc show a low mycelium weight and do not give alkaloids.
Pour une teneur constante de la solution nutritive en fer, le poids de mycélium augmente, pour des valeurs croissantes de la teneur en zinc, jusqu'à la valeur de 12.10-6 molécule-gramme de ZnS04, 7 H20 par litre ; de cette valeur il n'y a plus d'augmentation de poids. Pour une teneur en zinc qui va en croissant jusqu'à la même concentration, la teneur du mycélium en alcaloïdes décroît. Entre les concentrations extrêmes de 0,75.
For a constant iron content of the nutrient solution, the weight of mycelium increases, for increasing values of the zinc content, up to the value of 12.10-6 gram-molecules of ZnSO4, 7 H20 per liter; from this value there is no further increase in weight. For a zinc content which increases to the same concentration, the alkaloid content of the mycelium decreases. Between the extreme concentrations of 0.75.
10-5 et 12.10-5 molécule-gramme de FeS04, 7 H20 par litre, l'élévation de la concentration en fer, pour une concentration constante en zinc. ne se traduit par une- croissance ni du poids du mycélium, ni de la teneur en alcaloïdes, sauf si la teneur en zinc est inférieure à 12.10-6 molécule-gramme de ZnS04, 7 H20 par litre. Si la concentration en FeS04, 7 H20 est portée à 48.10-5 molécule-gramme par litre, un léger arrêt de croissance est décelable tandis que la teneur en alcaloïdes ne diminue pas. Les tableaux 1 et 2 illustrent ces relations. Le poids de mycélium y est indiqué en mg et la teneur en alcaloïdes en pourcents de mycélium sec tel qu'on en obtient dans des charges de 10 cm3 chacune après une durée d'expérience de 21 jours.
10-5 and 12.10-5 gram-molecule of FeSO4, 7 H2O per liter, the increase in iron concentration, for a constant zinc concentration. does not result in growth of either the weight of the mycelium or the alkaloid content, unless the zinc content is less than 12.10-6 gram-molecules of ZnSO4.7H20 per liter. If the FeSO4.7H20 concentration is increased to 48.10-5 gram-molecules per liter, a slight growth arrest is detectable while the alkaloid content does not decrease. Tables 1 and 2 illustrate these relationships. The weight of mycelium is indicated therein in mg and the alkaloid content in percent of dry mycelium as obtained in loads of 10 cm3 each after an experiment period of 21 days.
TABLEAU I.
TABLE I.
Poids de mycélium en mg
En haut de chaque colonne est indiquée la concentration en zinc, exprimée en millionièmes de molécule-gramme de ZnS04, 7 H20, tandis que le nombre inscrit au début de chaque ligne indique la concentration en fer exprimée en cent-millièmes de molécule-gramme de FeSO, 7 H20.
EMI4.1
Mycelium weight in mg
At the top of each column is indicated the zinc concentration, expressed in millionths of a gram-molecule of ZnS04.7H20, while the number at the beginning of each row indicates the iron concentration expressed in hundred-thousandths of a gram-molecule of FeSO, 7 H2O.
EMI4.1
0 1.5 6 12 2± ±l 96 192
EMI4.2
<tb>
<tb> 0 <SEP> 66 <SEP> 71 <SEP> 70 <SEP> 73 <SEP> 69 <SEP> 85 <SEP> 74 <SEP> 89
<tb> 0,75 <SEP> 68 <SEP> 101 <SEP> 221 <SEP> 238 <SEP> 260 <SEP> 280 <SEP> 279 <SEP> 288
<tb> 3 <SEP> 79 <SEP> 118 <SEP> 265 <SEP> 252 <SEP> 220 <SEP> 276 <SEP> 240 <SEP> 251
<tb> 12 <SEP> 72 <SEP> 161 <SEP> 263 <SEP> 252 <SEP> 249 <SEP> 289 <SEP> 278 <SEP> 297
<tb> 48 <SEP> 62 <SEP> 135 <SEP> 156 <SEP> 199 <SEP> 215 <SEP> 221 <SEP> 189 <SEP> 206
<tb>
TABLEAU 2.
0 1.5 6 12 2 ± ± l 96 192
EMI4.2
<tb>
<tb> 0 <SEP> 66 <SEP> 71 <SEP> 70 <SEP> 73 <SEP> 69 <SEP> 85 <SEP> 74 <SEP> 89
<tb> 0.75 <SEP> 68 <SEP> 101 <SEP> 221 <SEP> 238 <SEP> 260 <SEP> 280 <SEP> 279 <SEP> 288
<tb> 3 <SEP> 79 <SEP> 118 <SEP> 265 <SEP> 252 <SEP> 220 <SEP> 276 <SEP> 240 <SEP> 251
<tb> 12 <SEP> 72 <SEP> 161 <SEP> 263 <SEP> 252 <SEP> 249 <SEP> 289 <SEP> 278 <SEP> 297
<tb> 48 <SEP> 62 <SEP> 135 <SEP> 156 <SEP> 199 <SEP> 215 <SEP> 221 <SEP> 189 <SEP> 206
<tb>
TABLE 2.
Teneur en alcaloïdes du mycélium sec en pourcents.
Alkaloid content of dry mycelium in percent.
Les nombres indiqués en tête des lignes et des colonnes ont la même signification que dans le tableau 1.
EMI4.3
<tb>
<tb>
The numbers shown at the head of the rows and columns have the same meaning as in Table 1.
EMI4.3
<tb>
<tb>
0 <SEP> 1.5 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 96 <SEP> 192 <SEP>
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
EMI4.4
0 , 75 0 0 0,04 o,17 0.18 0,13 0,13 0,11
EMI4.5
<tb>
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,09 <SEP> 0,18 <SEP> 0,19 <SEP> 0,11 <SEP> 0,20 <SEP> 0.17
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
<tb>
<tb> 0 <SEP> 1.5 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 96 <SEP> 192 <SEP> (suite)
<tb> 12 <SEP> 0 <SEP> 0,15 <SEP> 0,16 <SEP> 0,20 <SEP> 0,17 <SEP> 0,17 <SEP> 0,22 <SEP> 0,17
<tb> 48 <SEP> 0 <SEP> 0,05 <SEP> 0 <SEP> 0,20 <SEP> 0,19 <SEP> 0,19 <SEP> 0,23 <SEP> 0,16
<tb>
Il ressort de ces tableaux que la concentration optimum en fer se place entre 0.75.10-5 et 12.10-5 molécule-gramme de FeS04, 7 H2o et la concentration optimum en zinc entre 1,2.
0 <SEP> 1.5 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 96 <SEP> 192 <SEP>
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
EMI4.4
0.75 0 0 0.04 o, 17 0.18 0.13 0.13 0.11
EMI4.5
<tb>
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0.09 <SEP> 0.18 <SEP> 0.19 <SEP> 0.11 <SEP> 0.20 <SEP> 0.17
<tb>
<Desc / Clms Page number 5>
EMI5.1
<tb>
<tb> 0 <SEP> 1.5 <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 96 <SEP> 192 <SEP> (continued)
<tb> 12 <SEP> 0 <SEP> 0.15 <SEP> 0.16 <SEP> 0.20 <SEP> 0.17 <SEP> 0.17 <SEP> 0.22 <SEP> 0.17
<tb> 48 <SEP> 0 <SEP> 0.05 <SEP> 0 <SEP> 0.20 <SEP> 0.19 <SEP> 0.19 <SEP> 0.23 <SEP> 0.16
<tb>
It emerges from these tables that the optimum iron concentration is between 0.75.10-5 and 12.10-5 gram-molecule of FeS04.7H2o and the optimum zinc concentration between 1.2.
10-5 et 19,2,10-5 molécule-gramme de ZnS04, 7 H2O par litre de solution nutritive.
10-5 and 19,2,10-5 gram-molecules of ZnSO4.7 H2O per liter of nutrient solution.
En pratique, le procédé s'exécute, par exemple, de la façon suivante :
Le milieu nutritif, dont la composition exacte est indiquée plus bas, est stérilisé puis ensemencé avec des spores de Claviceps purpurea Fr.
In practice, the process is carried out, for example, as follows:
The nutrient medium, the exact composition of which is indicated below, is sterilized and then inoculated with spores of Claviceps purpurea Fr.
Tul. et mis à l'incubation. Le voile de mycélium qui s'est formé au bout de quelque temps présente, en règle générale, une couleur brun violet foncé ; on le recueille, on le sèche et on le traite pour en extraire les alcaloïdes. On soumet aussi à l'extraction le filtrat du liquide de culture, qui donne également de l'ergotamine pure et de petites quantités d'ergotaminine et d'ergobasine. L'extraction des alcaloïdes, tant du mycélium que du liquide nutratif, peut être conduite, par exemple, comme suit : on enlève tout d'abord les constituants gras au moyen d'un solvant organique qui ne dissout pas les alcaloïdes puis on met en pâte la substance qui les contient avec:une solution de carbonate de sodium, ce qui a pour effet de mettre en liberté les alcaloïdes deleurs composés salins.
Tul. and set to incubation. The veil of mycelium which has formed after some time is usually dark purple-brown in color; it is collected, dried and treated to extract the alkaloids. The filtrate is also extracted from the culture liquid, which also gives pure ergotamine and small amounts of ergotaminine and ergobasin. The extraction of the alkaloids, both from the mycelium and from the nutrient liquid, can be carried out, for example, as follows: first of all the fatty constituents are removed by means of an organic solvent which does not dissolve the alkaloids then one puts in paste the substance that contains them with: a solution of sodium carbonate, which has the effect of releasing the alkaloids from their saline compounds.
Après extraction par un solvant organique tel que l'éther, par exemple, on retire les bases de leur solution dans l'éther au moyen d'un acide, par exemple l'acide tartrique, on purifie l'extrait aqueux en l'agitant avec un solvant organique, on rend alcaline toute la solution aqueuse en la traitant par du bicarbonate de sodium, par exemple, et on reprend les alcaloïdes par un solvant organique non miscible à l'eau. La séparation et la purification des bases ainsi obtenues à l'état brut peut être effectuée, par exemple, par chromatographie sur de l'alumine. Les alcaloïdes de l'ergot qu'on a obtenus par ce procédé, l'ergotamine, l'ergotaminine et l'ergobasine, correspondent par toutes leurs propriétés aux substances isolées de l'ergot de provenance na- turelle.
After extraction with an organic solvent such as ether, for example, the bases are removed from their solution in ether by means of an acid, for example tartaric acid, the aqueous extract is purified by stirring with an organic solvent, the whole aqueous solution is made alkaline by treating it with sodium bicarbonate, for example, and the alkaloids are taken up with an organic solvent immiscible with water. The separation and purification of the bases thus obtained in the crude state can be carried out, for example, by chromatography on alumina. The ergot alkaloids which have been obtained by this process, ergotamine, ergotaminine and ergobasine, correspond in all their properties to substances isolated from ergot of natural origin.
Exemple 1.
Example 1.
L'exemple suivant décrit la culture in vitro de l'ergot et la séparation de ses substances actives. Pour préparer le milieu nutritif, on dissout d'abord
EMI5.2
<tb>
<tb> 1,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> Ca(N03)2,
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> MgSO4,
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> KHPO,
<tb> 0,125 <SEP> g <SEP> de <SEP> KCL.
<tb>
The following example describes the in vitro cultivation of ergot and the separation of its active substances. To prepare the nutrient medium, we first dissolve
EMI5.2
<tb>
<tb> 1.00 <SEP> g <SEP> of <SEP> Ca (N03) 2,
<tb> 0.25 <SEP> g <SEP> of <SEP> MgSO4,
<tb> 0.25 <SEP> g <SEP> from <SEP> KHPO,
<tb> 0.125 <SEP> g <SEP> of <SEP> KCL.
<tb>
100,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> saccharose,
<tb> 10,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> L(+)-asparagine,
<tb> 0,01 <SEP> g <SEP> de <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> cystéine,
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> 0,0001 <SEP> g <SEP> d'aneurine <SEP> et
<tb> 0,000001 <SEP> g <SEP> de <SEP> biotine <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> â
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée,
<tb>
et on ajoute à cette solution 0,30 cm3 d'une liqueur ayant la composition suivante :
100.00 <SEP> g <SEP> of <SEP> sucrose,
<tb> 10.00 <SEP> g <SEP> from <SEP> L (+) - asparagine,
<tb> 0.01 <SEP> g <SEP> of <SEP> hydrochloride <SEP> of <SEP> cysteine,
<tb>
<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> 0.0001 <SEP> g <SEP> of aneurine <SEP> and
<tb> 0.000001 <SEP> g <SEP> of <SEP> biotin <SEP> in <SEP> the <SEP> complement <SEP> â
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> of distilled <SEP> water,
<tb>
and to this solution is added 0.30 cm3 of a liquor having the following composition:
EMI6.2
<tb>
<tb> 42,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> FeSO4, <SEP> 7H2O,
<tb> 2,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> MnS04, <SEP> 7H2O,
<tb> 0,50 <SEP> g <SEP> de <SEP> KI,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> NiC12, <SEP> 6H2O,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> Coc12, <SEP> 6H2o,
<tb> 0,20 <SEP> g <SEP> de <SEP> 3TiO2So3. <SEP> 5H20,
<tb> 0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> ZnS04, <SEP> 7H2O,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CusO4,5H2o,
<tb> 0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> Be(NO3)2,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> H3BO3,
<tb> 1,00 <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> H2S04 <SEP> concentré, <SEP> le <SEP> tout <SEP> complété <SEP> à
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> avec <SEP> de <SEP> l'eau <SEP> distillée.
<tb>
EMI6.2
<tb>
<tb> 42.00 <SEP> g <SEP> of <SEP> FeSO4, <SEP> 7H2O,
<tb> 2.00 <SEP> g <SEP> of <SEP> MnS04, <SEP> 7H2O,
<tb> 0.50 <SEP> g <SEP> of <SEP> KI,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> NiC12, <SEP> 6H2O,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> Coc12, <SEP> 6H2o,
<tb> 0.20 <SEP> g <SEP> of <SEP> 3TiO2So3. <SEP> 5:20,
<tb> 0.10 <SEP> g <SEP> of <SEP> ZnS04, <SEP> 7H2O,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> CusO4,5H2o,
<tb> 0.10 <SEP> g <SEP> of <SEP> Be (NO3) 2,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> H3BO3,
<tb> 1.00 <SEP> cm3 <SEP> of <SEP> H2S04 <SEP> concentrated, <SEP> the <SEP> all <SEP> completed <SEP> to
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> with <SEP> of <SEP> distilled <SEP> water.
<tb>
Le milieu nutritif prêt à l'emploi a un pH de 4,6; on le stérilise en autoclave à une température de 107 durant 20 minutes. En ensemence 10 cm3 de la solution nutritive ainsi préparée avec deux gouttes d'une suspension de conidies de la souche voulue de Claviceps purpurea et on laisse reposer la culture dans un endroit sombre, à température et humidité constantes, par exemple à 24 et à une humidité de 60 à 65%. Après 26 jours il s'est formé un voile compact de mycélium, de couleur violet foncé, et la solution nutritive montre un pH de 4,8 et une faible coloration rouge brun.
The ready-to-use nutrient medium has a pH of 4.6; it is sterilized in an autoclave at a temperature of 107 for 20 minutes. Inoculate 10 cm3 of the nutrient solution thus prepared with two drops of a suspension of conidia of the desired strain of Claviceps purpurea and the culture is left to stand in a dark place, at constant temperature and humidity, for example at 24 and at a humidity 60 to 65%. After 26 days a compact veil of mycelium has formed, dark purple in color, and the nutrient solution shows a pH of 4.8 and a weak red-brown color.
Après récolte et dessiccation, le mycélium pèse 250 mg. La présence des alcaloïdes se prouve comme suit ; on rend alcalins le liquide de culture et le mycélium séché, on extrait les bases à l'éther et on agite l'extrait éthéré avec une solution d'acide tartrique à 1%. On traite la solution aqueuse des tartrates par le réactif de van Urk (p-diméthyl-amino-benzaldéhy- de en solution sulfurique) et on fait apparaître la coloration par irradiation à la lampe de quartz (M.j. Smith, U.S. public Health Reports 45, 1466, 1930 ;voir essai F. Schlemmer, F.H.A. Wirth et H. Peters, Arch. Pharm. 274, 16, 1936. L'intensité de la coloration bleue correspond à une teneur en alcaloïdes de 0,1% dàns le mycélium sec et 0,0076 mg par cm3 de la solution de culture (calcul basé sur un poids moléculaire de 600).
After harvest and desiccation, the mycelium weighs 250 mg. The presence of alkaloids is proved as follows; the culture liquid and the dried mycelium are made alkaline, the bases are extracted with ether and the ethereal extract is stirred with a 1% tartaric acid solution. The aqueous solution of the tartrates is treated with van Urk's reagent (p-dimethyl-amino-benzaldehyde in sulfuric solution) and the coloration is shown by irradiation with a quartz lamp (Mj Smith, US public Health Reports 45, 1466, 1930; see test F. Schlemmer, FHA Wirth and H. Peters, Arch. Pharm. 274, 16, 1936. The intensity of the blue coloration corresponds to an alkaloid content of 0.1% in the dry mycelium and 0.0076 mg per cm3 of the culture solution (calculation based on a molecular weight of 600).
Pour isoler les substances actives d'une plus grande quantité de mycélium et du liquide de culture correspondant, on procède par exemple de la façon suivante :
On agite durant une demi-heure 260 g de mycélium séché avec 2,6 litres d'éther de pétrole, pour éliminer les matières grasses ; esso- re et on agite encore à deux reprises avec 1,3 litre d'éther de pétrole.
<Desc/Clms Page number 7>
To isolate the active substances from a larger quantity of mycelium and the corresponding culture liquid, the following procedure is carried out, for example:
260 g of dried mycelium are stirred for half an hour with 2.6 liters of petroleum ether, to remove the fat; It is filtered off and stirred twice more with 1.3 liters of petroleum ether.
<Desc / Clms Page number 7>
La matière dégraissée est ensuite mise en pâte avec 260 cm3 d'une solution à 5% de carbonate de sodium et traitée sur la machine à agiter du- rant une demi-heure chaque fois, d'abord par 2,6 1, puis, à deux reprises. encore par 1,3 1 d'éther. On réunit les extraits ainsi obtenue et on leur enlève les alcaloïdes en les traitant par 1,3 1 puis quatre fois encore par 0,65 1 d'une solution aqueuse d'acide tartrique à 1%. On réunit les solutions tartriques et on les agite à trois reprises avec 300 cm3 d'éther pour enle- ver des impuretés à réaction neutre ou acide.
The degreased material is then pulped with 260 cm3 of a 5% sodium carbonate solution and treated on the stirring machine for half an hour each time, first with 2.6 l, then, twice. again with 1.3 l of ether. The extracts thus obtained are combined and the alkaloids are removed from them by treating them with 1.3 l and then four more times with 0.65 l of a 1% aqueous solution of tartaric acid. The tartaric solutions are combined and stirred three times with 300 cm 3 of ether to remove impurities with a neutral or acid reaction.
Chaque solution éthérée est ensuite lavée deux fois avec 100 cm3 d'une solution d'acide tartrique à 1% et l'on ajoute ces eaux de lavage à la solution principale des tartrates, On rend alcaline cette solution par du bicarbonate de sodium et on extrait les alcaloïdes insolubles dans l'eau en agitant la solution alcaline avec- 500 cm3 puis trois fois avec- 250 êm3 d'éther. Les solutions éthérées sont réunies, séchées sur du sulfate de sodium et évaporées à siccité sous pres- sion réduite. ii reete un résidu constitué par 0,31 g d'alcaloïdes bruts.
Each ethereal solution is then washed twice with 100 cm3 of a 1% tartaric acid solution and these washing waters are added to the main tartrate solution. This solution is made alkaline with sodium bicarbonate and extracts the water-insoluble alkaloids by stirring the alkaline solution with- 500 cm3 and then three times with- 250 m3 of ether. The ethereal solutions are combined, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness under reduced pressure. It gives off a residue consisting of 0.31 g of crude alkaloids.
Pour purifier ce résidu, on le dissout dans du chloroforme conte- nant 1% d'alcool et on filtre la solution à travers une colonne de 31 g d'a- lumine préparée selon Brockmann. Les fractions qui présentent une fluores- cence bleue à la lumière ultra-violette contiennent les alcaloïdes: on les recueille isolément et on évapore le dissolvant. Le résidu de la zone bleue à progression rapide pèse 0,039 g. On le reprend par 0,5 cm3 de méthanol, dans lequel l'alcaloïde cristallise aussitôt. On recueille 0,030 g d'ergota- minine.
To purify this residue, it is dissolved in chloroform containing 1% alcohol and the solution is filtered through a 31 g column of lumina prepared according to Brockmann. The fractions which fluoresce blue in ultraviolet light contain the alkaloids: they are collected in isolation and the solvent evaporated. The rapidly growing blue zone residue weighs 0.039 g. It is taken up in 0.5 cm3 of methanol, in which the alkaloid immediately crystallizes. 0.030 g of ergotamine is collected.
Une seconde cristallisation dans le méthanol, où le composé est très peu soluble, donne des plaquettes cristallines triangulaires, qui fon- dentà 240 avec décomposition et accusentun pouvoir rotatoire spécifique Ó = + 367 (+ 3 ) (c = 0,5 dans le chloroforme), Pour l'analyse élémentaire, on sèche la substance à 100 sous un vide poussé. Les résultats de l'analyse sont les suivants :
EMI7.1
<tb>
<tb> C33H35P5N5 <SEP> calculé <SEP> C <SEP> 68,12 <SEP> H <SEP> 6,07 <SEP> N <SEP> 12.05%
<tb> trouvé <SEP> 68,07 <SEP> 6,12 <SEP> Il,94%
<tb>
Le résidu d'évaporation de la zone à progression lente pèse 0,137 g.
A second crystallization in methanol, where the compound is very slightly soluble, gives triangular crystalline platelets, which melt at 240 with decomposition and show a specific optical rotation Ó = + 367 (+ 3) (c = 0.5 in chloroform ), For elemental analysis, the substance is dried at 100 in a high vacuum. The results of the analysis are as follows:
EMI7.1
<tb>
<tb> C33H35P5N5 <SEP> calculated <SEP> C <SEP> 68.12 <SEP> H <SEP> 6.07 <SEP> N <SEP> 12.05%
<tb> found <SEP> 68.07 <SEP> 6.12 <SEP> Il, 94%
<tb>
The evaporation residue from the slow progressing zone weighs 0.137 g.
Quand on le reprend par 0,5 cm3 d'acétone à 90%; l'alcaloïde cristallise en prismes polyédriques à forte réfraction, coupés droit et fondant à 1800 avec décomposition ; sont caractéristiques de l'ergota- mine. On recueille ainsi 0,133 g d'ergotamine. A la dessiccation à 80 sous un vide poussé, les cristaux subissent une perte de poids de 20%, qui correspond à une teneur en solvant de cristallisation de 2 molécules d'acétone et 2 molécules d'eau, suivant la formule C33H3505N5,2 CH3COCH3, 2 H20.
When taken up in 0.5 cm3 of 90% acetone; the alkaloid crystallizes in polyhedral prisms with strong refraction, cut straight and melting at 1800 with decomposition; are characteristic of ergotamine. In this way 0.133 g of ergotamine is collected. On drying at 80 under a high vacuum, the crystals undergo a weight loss of 20%, which corresponds to a crystallization solvent content of 2 molecules of acetone and 2 molecules of water, according to the formula C33H3505N5,2 CH3COCH3 , 2 H2O.
La substance séchée comme ci-dessus a un pouvoir rotatoire spécifique Ó 20 = - 160 (C = 0,6 dans le chloroforme). Pour l'analyse, on sèche
D le produit à 100 sous un vide poussé et en éliminant l'humidité Les résultats de l'analyse sont les suivants
EMI7.2
<tb>
<tb> C33H35P5N5 <SEP> calculé <SEP> C <SEP> 6812, <SEP> H <SEP> 6,07 <SEP> N <SEP> 12,05 <SEP> % <SEP>
<tb> trouvé <SEP> 68,27 <SEP> 6,08 <SEP> Il,97%
<tb>
L'alcaloïde correspond aussi d'une façon parfaite à l'ergotamine authentique par toutes ses autres propriétés, par exemple par sa solubilité dans divers solvants organiques, la coloration bleue dans la réaction de Keller, etc...
The substance dried as above has a specific optical rotation Ó 20 = - 160 (C = 0.6 in chloroform). For analysis, we dry
D the product at 100 under high vacuum and removing moisture The results of the analysis are as follows
EMI7.2
<tb>
<tb> C33H35P5N5 <SEP> calculated <SEP> C <SEP> 6812, <SEP> H <SEP> 6.07 <SEP> N <SEP> 12.05 <SEP>% <SEP>
<tb> found <SEP> 68.27 <SEP> 6.08 <SEP> Il, 97%
<tb>
The alkaloid also corresponds perfectly to genuine ergotamine in all its other properties, for example by its solubility in various organic solvents, the blue coloration in the Keller reaction, etc.
Pour obtenir la fraction des alcaloïdes solubles dans l'eau, on sature par du chlorure de sodium solide la solution aqueuse de bicarbonate, dont on a auparavant extrait les alcaloïdes insolubles dans l'eau, c'est-à-dire l'ergotamine et l'ergotaminine, on rend la solution alcaline
<Desc/Clms Page number 8>
avec 10 g de soude caustique et on la traite par 2 1 puis à deux reprises en- core par 11 d'ther. on sèche les extraits éthérés sur du sulfate de sodium et on évapore le dissolvant, ce qui laisse un résidu de 90 mg, avec une te- neur en alcaloïdes de 29 mg d'après la détermination colorimétrique (cal- cul basé sur un poids moléculaire de 600). On reprend le résidu par peu de méthanol et on essore 50 mg d'impuretés grasses non dissoutes et qui ne sont pas des alcaloïdes.
To obtain the fraction of water-soluble alkaloids, the aqueous solution of bicarbonate is saturated with solid sodium chloride, from which the water-insoluble alkaloids, i.e. ergotamine, and ergotaminine, we make the solution alkaline
<Desc / Clms Page number 8>
with 10 g of caustic soda and treated with 2 liters and then twice more with 11 ether. the ethereal extracts are dried over sodium sulfate and the solvent evaporated, leaving a residue of 90 mg, with an alkaloid content of 29 mg according to the colorimetric determination (calculation based on molecular weight of 600). The residue is taken up in a little methanol and 50 mg of undissolved fatty impurities which are not alkaloids are filtered off.
On évapore le filtrat à siccité, on dissout le ré- sidu dans du chloroforme contenant 1% d'alcool et on purifie la solution par chromatographie sur une petite colonne d'alumine. Après élution et évapora- tion, on reprend le résidu par 0,2 cm3 de chloroforme, dans lequel cristal- lise un composé d'addition peu soluble de chloroforme et d'ergobasine. on recueille 6 mg d'ergobasine. Par recristallisation dans le benzène, on ob- tient des aiguilles blanches fondant é 159-162 . La substance correspond également à l'ergobasine authentique par toutes ses autres propriétés.
The filtrate is evaporated to dryness, the residue is dissolved in chloroform containing 1% alcohol and the solution is purified by chromatography on a small column of alumina. After elution and evaporation, the residue is taken up in 0.2 cm 3 of chloroform, in which a sparingly soluble addition compound of chloroform and ergobasin crystallizes. 6 mg of ergobasin are collected. Recrystallization from benzene gives white needles melting 159-162. The substance also corresponds to genuine ergobasin by all of its other properties.
Après essorage du mycélium, dans l'essai décrit ci-dessus, il reste 7 1 de filtrat de la culture, de pH 4,8; on amène cette solution au pH 8,0 en la traitant par une solution 2 normale de bicarbonate de sodium et on 1'.agite deux fois avec 1,4 1 d'éther. On réunit les liqueurs éthérées et on leur enlève les alcaloïdes en agitant à deux reprises avec 400 cm3 d'une solution aqueuse à 1% d'acide tartrique, on rend alcalin l'extrait aqueux au moyen de carbonate'de sodium et on le traite par 250 cm3 puis à trois reprises par 100 cm3 de chloroforme. Après séchage sur du sulfate de sodium, la solution, chloroformique laisse un résidu d'évaporation de 60 mg.
After draining the mycelium, in the test described above, 7 l of culture filtrate remain, of pH 4.8; This solution is brought to pH 8.0 by treating it with normal sodium bicarbonate solution 2 and stirred twice with 1.4 L of ether. The ethereal liquors are combined and the alkaloids removed by stirring twice with 400 cm3 of a 1% aqueous solution of tartaric acid, the aqueous extract is made alkaline with sodium carbonate and treated. per 250 cm3 and then three times per 100 cm3 of chloroform. After drying over sodium sulfate, the chloroform solution leaves an evaporation residue of 60 mg.
La détermination colorimétrique des alcaloïdes selon la méthode de van UrkSmith indique une teneur de 56 mg (calcul basé sur un poids moléculaire de 600).
Colorimetric determination of alkaloids according to the van UrkSmith method indicates a content of 56 mg (calculation based on a molecular weight of 600).
Pour séparer et purifier les alcaloïdes contenus dans ce mélange, on dissout le résidu dans du chloroforme contenant 1% d'alcool et on u chromatographie la solution sur de l'alumine. Il se forme--deux couches distinctes, présentant une fluorescence bleue à la lumière ultra-violette.
To separate and purify the alkaloids contained in this mixture, the residue is dissolved in chloroform containing 1% alcohol and the solution is chromatographed on alumina. It forms - two distinct layers, exhibiting blue fluorescence in ultraviolet light.
La résidu d'évaporation de la zone à progression rapide pèse 32 mg. Quand on le reprend par 0.4 cm3 de méthanol, il se dépose 20 mg d'un alcaloïde très peu soluble. Le point de fusion, 235-240 avea décomposition ainsi que le pouvoir rotatoire spécifique de + 365 (3 dans le chloroforme montrent qu'il s'agit d'ergotaminine. L'alcaloïde correspond également à l'ergotamine authentique par toutes ses autres propriétés.
The evaporation residue from the rapidly advancing zone weighs 32 mg. When it is taken up in 0.4 cm3 of methanol, 20 mg of a very poorly soluble alkaloid is deposited. The melting point, 235-240 with decomposition as well as the specific optical rotation power of + 365 (3 in chloroform show that it is ergotaminine. The alkaloid also corresponds to authentic ergotamine by all its other properties. .
Après élution de la zone à progression lente, on évapore le dissolvant :le résidu pèse 13 mg. Quand on le reprend par 0,1 cm3 d'acétone à 90% les prismes polyédriques coupés droit et caractéristiques de l'ergotamine cristallisent. On en recueille 10 mg. Le point de fusion de 1800 avec décomposition, le pouvoir rotatoire spécifique de -160 dans le chloroforme, ainsi que toutes les autres propriétés, correspondent à celles de l'ergotamine authentique.
After elution from the slowly advancing zone, the solvent is evaporated: the residue weighs 13 mg. When it is taken up with 0.1 cm3 of 90% acetone, the straight cut polyhedral prisms characteristic of ergotamine crystallize. 10 mg are collected. The melting point of 1800 with decomposition, the specific optical rotation of -160 in chloroform, as well as all other properties, correspond to those of genuine ergotamine.
Pour isoler les alcaloïdes solubles dans l'eau, on sature de chlorure de sodium l'eau-mère carbonatée, on la rend alcaline avec 10 g de soude caustique et on l'agite d'abord avec 500 cm3, puis encore trois fois avec 100 cm3 d'un mélange 3 : 1 de chloroforme et d'alcool isopropylique Après séchage sur du sulfate de sodium. le résidu d'évaporation p se 6 mg. On le dissout dans du chloroforme contenant 1% d'alcool et on purifie la solution par chromatographie sur de l'alumine. On obtient ainsi 1 mg d'alcaloïde peu soluble dans le chloroforme ; comportement à la chromatographie et à la cristallisation prouve qu'il s'agit d'ergobasine.
To isolate the water-soluble alkaloids, the carbonated mother liquor is saturated with sodium chloride, made alkaline with 10 g of caustic soda and stirred first with 500 cm3, then three more times with 100 cm3 of a 3: 1 mixture of chloroform and isopropyl alcohol After drying over sodium sulfate. the evaporation residue p is 6 mg. It is dissolved in chloroform containing 1% alcohol and the solution is purified by chromatography on alumina. This gives 1 mg of alkaloid which is sparingly soluble in chloroform; behavior in chromatography and crystallization proves that it is ergobasin.
EXEMPLE 2. -
Pour préparer la solution nutritive, on dissout tout d'abord :
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb> 1,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> Ca(N03)2,
<tb> 0.25 <SEP> g <SEP> de <SEP> MgSO.
<tb>
EMI9.2
0,25 ci de KH2P 0',
EMI9.3
<tb>
<tb> 0,125 <SEP> g <SEP> de <SEP> KCl,
<tb>
EMI9.4
0,03336 g de Fe50';
EXAMPLE 2. -
To prepare the nutrient solution, we first dissolve:
<Desc / Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb> 1.00 <SEP> g <SEP> of <SEP> Ca (N03) 2,
<tb> 0.25 <SEP> g <SEP> of <SEP> MgSO.
<tb>
EMI9.2
0.25 ci of KH2P 0 ',
EMI9.3
<tb>
<tb> 0.125 <SEP> g <SEP> of <SEP> KCl,
<tb>
EMI9.4
0.03336 g of Fe50 ';
7 H20,
EMI9.5
<tb>
<tb> 0,003444 <SEP> g <SEP> de <SEP> ZnS04, <SEP> 7 <SEP> H2O,
<tb> 100,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> saccharose,
<tb> 10,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> L(+)-asparagine,
<tb> 0,01 <SEP> g <SEP> de <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> cystéine,
<tb> 0,0001 <SEP> g <SEP> d'aneurine <SEP> et
<tb> 0,000001 <SEP> g <SEP> de <SEP> biotine <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée
<tb>
On ajoute à cette solution 0,30 cm3 d'une solution ayant la composition suivante :
EMI9.6
<tb>
<tb> 2, <SEP> 00 <SEP> g <SEP> de <SEP> MnS04, <SEP> 7 <SEP> H20,
<tb> 0,50 <SEP> g <SEP> de <SEP> KI,
<tb> 0. <SEP> 05 <SEP> g <SEP> de <SEP> NiCL2, <SEP> 6 <SEP> H20,
<tb>
EMI9.7
0,05 g de ÉiOCl2ob H20.
7 H20,
EMI9.5
<tb>
<tb> 0.003444 <SEP> g <SEP> of <SEP> ZnS04, <SEP> 7 <SEP> H2O,
<tb> 100.00 <SEP> g <SEP> of <SEP> sucrose,
<tb> 10.00 <SEP> g <SEP> from <SEP> L (+) - asparagine,
<tb> 0.01 <SEP> g <SEP> of <SEP> hydrochloride <SEP> of <SEP> cysteine,
<tb> 0.0001 <SEP> g <SEP> of aneurine <SEP> and
<tb> 0.000001 <SEP> g <SEP> of <SEP> biotin <SEP> in <SEP> the <SEP> complement <SEP> to
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> of distilled <SEP> water
<tb>
0.30 cm3 of a solution having the following composition is added to this solution:
EMI9.6
<tb>
<tb> 2, <SEP> 00 <SEP> g <SEP> of <SEP> MnS04, <SEP> 7 <SEP> H20,
<tb> 0.50 <SEP> g <SEP> of <SEP> KI,
<tb> 0. <SEP> 05 <SEP> g <SEP> of <SEP> NiCL2, <SEP> 6 <SEP> H20,
<tb>
EMI9.7
0.05 g of EiOCl2ob H2O.
0,20 g de 3T102503.5 H20, 0.05 g de CUS04, 5 H0,
EMI9.8
<tb>
<tb> 0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> BeN03)2,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> H3B03 <SEP> et
<tb> 1. <SEP> 00 <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> H2SO4 <SEP> concentré <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
0.20 g of 3T102503.5 H20, 0.05 g of CUS04, 5 H0,
EMI9.8
<tb>
<tb> 0.10 <SEP> g <SEP> of <SEP> BeN03) 2,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> H3B03 <SEP> and
<tb> 1. <SEP> 00 <SEP> cm3 <SEP> of <SEP> H2SO4 <SEP> concentrated <SEP> in <SEP> the <SEP> complement <SEP> to
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> of distilled <SEP> water.
<tb>
La solution nutritive prête à l'emploi a un pH de 5,0. On l'utilise de la même manière que celle de l'exemple 1. Le mycélium obtenu à partir d'un litre de solution de culture pèse 25,2 g et contient 0,504 g d'alcaloïdes (poids déterminé par la méthode colorimétrique).
The ready-to-use nutrient solution has a pH of 5.0. It is used in the same manner as that of Example 1. The mycelium obtained from one liter of culture solution weighs 25.2 g and contains 0.504 g of alkaloids (weight determined by the colorimetric method).
EXEMPLE 3. -
Pour préparer la solution nutritive, on dissout tout d'abord
EMI9.9
<tb>
<tb> 1,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> Ga(N03)
<tb>
EMI9.10
0, 25 g de MgSO4@
EMI9.11
<tb>
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> KH2P04,
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb> 0,125 <SEP> g <SEP> de <SEP> KCl,
<tb>
EMI10.2
0,13344 g de FeS04q 7 H20,
EMI10.3
<tb>
<tb> 0,013776 <SEP> g <SEP> de- <SEP> ZnS04, <SEP> 7 <SEP> H20,
<tb> 100,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> saccharose,
<tb> 10,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> L(+)-asparagine,
<tb> 0,01 <SEP> g <SEP> de <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> cystéine,
<tb> 0.0001 <SEP> g <SEP> d'aneurine <SEP> et
<tb> 0,000001 <SEP> g <SEP> de <SEP> biotine <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
EXAMPLE 3. -
To prepare the nutrient solution, first dissolve
EMI9.9
<tb>
<tb> 1.00 <SEP> g <SEP> de <SEP> Ga (N03)
<tb>
EMI9.10
0.25 g of MgSO4 @
EMI9.11
<tb>
<tb> 0.25 <SEP> g <SEP> of <SEP> KH2P04,
<tb>
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb>
<tb> 0.125 <SEP> g <SEP> of <SEP> KCl,
<tb>
EMI10.2
0.13344 g of FeS04q 7 H20,
EMI10.3
<tb>
<tb> 0.013776 <SEP> g <SEP> de- <SEP> ZnS04, <SEP> 7 <SEP> H20,
<tb> 100.00 <SEP> g <SEP> of <SEP> sucrose,
<tb> 10.00 <SEP> g <SEP> from <SEP> L (+) - asparagine,
<tb> 0.01 <SEP> g <SEP> of <SEP> hydrochloride <SEP> of <SEP> cysteine,
<tb> 0.0001 <SEP> g <SEP> of aneurine <SEP> and
<tb> 0.000001 <SEP> g <SEP> of <SEP> biotin <SEP> in <SEP> the <SEP> complement <SEP> to
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> of distilled <SEP> water.
<tb>
On ajoute à cette solution 0,30 cm3 d'une solution ayant la composition suivante :
EMI10.4
<tb>
<tb> 2,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> MnSO4,7 <SEP> H20,
<tb> 0,50 <SEP> g <SEP> de <SEP> KI
<tb> 0. <SEP> 05 <SEP> g <SEP> de <SEP> NiCL2,6 <SEP> H2O,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CoC12.6 <SEP> H20.
<tb>
0.30 cm3 of a solution having the following composition is added to this solution:
EMI10.4
<tb>
<tb> 2.00 <SEP> g <SEP> of <SEP> MnSO4,7 <SEP> H20,
<tb> 0.50 <SEP> g <SEP> from <SEP> KI
<tb> 0. <SEP> 05 <SEP> g <SEP> of <SEP> NiCL2,6 <SEP> H2O,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> CoC12.6 <SEP> H20.
<tb>
0. <SEP> 20 <SEP> g <SEP> de <SEP> 3TiO2SO3,5 <SEP> H2O.
<tb>
0. <SEP> 20 <SEP> g <SEP> of <SEP> 3TiO2SO3,5 <SEP> H2O.
<tb>
0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CuSO4.5 <SEP> H20.
<tb>
0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> CuSO4.5 <SEP> H20.
<tb>
0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> Be(N03)2.
<tb>
0.10 <SEP> g <SEP> of <SEP> Be (N03) 2.
<tb>
0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> H3B03 <SEP> et
<tb> 1.00 <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> H2S04 <SEP> concentré <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> H3B03 <SEP> and
<tb> 1.00 <SEP> cm3 <SEP> of <SEP> H2S04 <SEP> concentrated <SEP> in <SEP> the <SEP> complement <SEP> to
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> of distilled <SEP> water.
<tb>
La solution nutritive prête à l'emploi à un pH de 4.9. On 1'utilise de la même manière que celle de l'exemple 1. Le mycélium obtenu à partir d'un litre de solution de culture pèse 22. 1 g et contient 0,la.20 g d'alcaloides (poids déterminé par la méthode colorimétrique).
The ready-to-use nutrient solution at a pH of 4.9. It is used in the same manner as that of Example 1. The mycelium obtained from one liter of culture solution weighs 22. 1 g and contains 0.10 g of alkaloids (weight determined by the colorimetric method).
EXEMPLE 4. -
Pour préparer la solution nutritive, on dissout tout d'abord
EMI10.5
<tb>
<tb> 1. <SEP> 00 <SEP> g <SEP> de <SEP> Ca(N03)2,
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> MgS04,
<tb> 0,25 <SEP> g <SEP> de <SEP> KH2PO4
<tb> 0. <SEP> 125 <SEP> g <SEP> de <SEP> KCL
<tb> 0,03336 <SEP> g <SEP> de <SEP> FESO4,7 <SEP> H20,
<tb> 0,027552 <SEP> g <SEP> de <SEP> ZnSO4.7 <SEP> H2O,
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> 100,00 <SEP> g <SEP> de <SEP> saccharose,
<tb> 10.00 <SEP> g <SEP> de <SEP> L(+)-asparagine,
<tb> 0.01 <SEP> g <SEP> de <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> cystéine,
<tb> 0,0001 <SEP> g <SEP> d'aneurine <SEP> et
<tb> 0.000001 <SEP> g <SEP> de <SEP> biotine <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
EXAMPLE 4. -
To prepare the nutrient solution, first dissolve
EMI10.5
<tb>
<tb> 1. <SEP> 00 <SEP> g <SEP> of <SEP> Ca (N03) 2,
<tb> 0.25 <SEP> g <SEP> of <SEP> MgS04,
<tb> 0.25 <SEP> g <SEP> from <SEP> KH2PO4
<tb> 0. <SEP> 125 <SEP> g <SEP> of <SEP> KCL
<tb> 0.03336 <SEP> g <SEP> of <SEP> FESO4,7 <SEP> H20,
<tb> 0.027552 <SEP> g <SEP> of <SEP> ZnSO4.7 <SEP> H2O,
<tb>
<Desc / Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> 100.00 <SEP> g <SEP> of <SEP> sucrose,
<tb> 10.00 <SEP> g <SEP> from <SEP> L (+) - asparagine,
<tb> 0.01 <SEP> g <SEP> of <SEP> hydrochloride <SEP> of <SEP> cysteine,
<tb> 0.0001 <SEP> g <SEP> of aneurine <SEP> and
<tb> 0.000001 <SEP> g <SEP> of <SEP> biotin <SEP> in <SEP> the <SEP> complement <SEP> to
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> of distilled <SEP> water.
<tb>
On ajoute à cette solution 0,30 cm3 d'une solution ayant la composition suivante :
EMI11.2
2, 00 g de InSO, ? H20,
EMI11.3
<tb>
<tb> 0,50 <SEP> g <SEP> de <SEP> kl,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> de <SEP> NiCL2,6 <SEP> H20,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CoCl2.6 <SEP> H2O,
<tb> 0,20 <SEP> g <SEP> de <SEP> 3TiO2SO3.5 <SEP> H2O,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> CuS04,5 <SEP> H20,
<tb> 0,10 <SEP> g <SEP> de <SEP> Be(N03)2,
<tb> 0,05 <SEP> g <SEP> de <SEP> H3B03 <SEP> et
<tb> 1.00 <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> H2SO4 <SEP> concentré <SEP> dans <SEP> le <SEP> complément <SEP> à
<tb> 1000,00 <SEP> cm3 <SEP> d'eau <SEP> distillée.
<tb>
0.30 cm3 of a solution having the following composition is added to this solution:
EMI11.2
2.00 g of InSO,? H20,
EMI11.3
<tb>
<tb> 0.50 <SEP> g <SEP> from <SEP> kl,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> NiCL2,6 <SEP> H20,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> CoCl2.6 <SEP> H2O,
<tb> 0.20 <SEP> g <SEP> of <SEP> 3TiO2SO3.5 <SEP> H2O,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> CuS04.5 <SEP> H20,
<tb> 0.10 <SEP> g <SEP> of <SEP> Be (N03) 2,
<tb> 0.05 <SEP> g <SEP> of <SEP> H3B03 <SEP> and
<tb> 1.00 <SEP> cm3 <SEP> of <SEP> H2SO4 <SEP> concentrated <SEP> in <SEP> the <SEP> complement <SEP> to
<tb> 1000.00 <SEP> cm3 <SEP> of distilled <SEP> water.
<tb>
La solution nutritive prête à l'emploi a un pH de 5,0. On l'utilise de la même manière que celle de l'exemple 1. Le mycélium obtenu à partir d'un litre de solution de culture pèse 27,8 g et contient 0,612 g d'alcaloïdes (poids déterminé par la méthode colorimétrique).
The ready-to-use nutrient solution has a pH of 5.0. It is used in the same manner as that of Example 1. The mycelium obtained from one liter of culture solution weighs 27.8 g and contains 0.612 g of alkaloids (weight determined by the colorimetric method).
RESUME.
ABSTRACT.
La présente invention comprend notamment :
1. - Un procédé permettant de produire de l'ergotamine, de l'ergotaminine et de l'ergobasine par culture saprophytique in vitro de l'ergot (Clavicep purpurea) et séparation des alcaloïdes formés, procédé qui consiste à ensemencer un milieu nutritif convenahle avec des spores d'une souche appropriée de Claviceps purpurea et mettre la culture à l'incubation, à séparer du liquide de culture le mycélium ainsi formé et débarrasser l'un et l'autre des matières grasses par un solvant organique convenable, à rendre alcaline la matière contenant les alcaloïdes et extraire ceux-ci.au moyen d'un solvant organique approprié,non miscible à l'eau, à enlever ensuite les bases de l'extrait au moyen d'un acide convenable, par exemple l'acide tartrique, après quoi on effectue une nouvelle purification,
The present invention comprises in particular:
1. - A process for producing ergotamine, ergotaminine and ergobasin by in vitro saprophytic culture of ergot (Clavicep purpurea) and separation of the alkaloids formed, a process which consists in inoculating a suitable nutrient medium with spores of a suitable strain of Claviceps purpurea and incubate the culture, to separate the mycelium thus formed from the culture liquid and to free both of the fat with a suitable organic solvent, to make alkaline the material containing the alkaloids and extracting them by means of a suitable organic solvent, immiscible with water, then removing the bases from the extract by means of a suitable acid, for example acid tartaric, after which a new purification is carried out,
on rend alcaline la solution aqueuse, on en extrait les bases par un solvant organique non miscible à l'eau, on évapore le solvant, on sépare les alcaloïdes en individus distincts par des méthodes appropriées, par exemple, par chro- matographie,. et on fait cristalliser les alcaloïdes dans des solvants convenables.
<Desc/Clms Page number 12>
the aqueous solution is made alkaline, the bases are extracted therefrom with an organic solvent immiscible with water, the solvent is evaporated off, the alkaloids are separated into distinct individuals by suitable methods, for example by chromatography ,. and the alkaloids are crystallized from suitable solvents.
<Desc / Clms Page number 12>
2. - Un mode d'exécution du procédé spécifié sous 1 , suivant lequel on utilise un milieu nutritif contenant entre 3,444 et 55,1 mg de ZnS04,7 H20 et entre 2,085 et 133,44 mg de FeSO4,7 H20 par litre.
2. - An embodiment of the process specified under 1, according to which a nutrient medium is used containing between 3.444 and 55.1 mg of ZnSO4.7 H20 and between 2.085 and 133.44 mg of FeSO4.7 H20 per liter.