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La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'antiboitiques nouveaux qui sont la distamycine et ses constituants, et la distacyne., ¯par culture dlune nouvelle espèce de Streptomyces, le "S. distallicus",dans des conditions appropriées.
Elle vise également ces nouveaux antibiotiques, en particulier tels qu'obtenus par ce procédé., qui sont doués
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d'une activité antibactérienne et/ou fongicide. Ces antibiow tiques sont notamment applicables au traitement de plantes atteintes de maladies causées par des micro-organisrre z sensi- bles aux antibiotiques en question.
Les antibiotiques préparés par le procédé objet de la présente invention ne sont pas 'décrits parmi les antibio- tiques connus. Les compositions contenant ces antibiotiques
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"¯ # ' - . ' ' nouveaux sont intéressantes par suite de leur grande activité vis-à-vis de plusieurs champignons'3t sahizomyaétes pathogènes.
Ces antibiotiques nouveaux sont produits par une @
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espèce ¯nouvelle de -Streptomyces (dont la souche a été iso- lée par la demanderesse à partir d'un échantillon de sol prélevé en Campanie, province de Naples), dans divers milieux de culture appropriés à la croissance du microorganisme pro- ducteur et à la production des antibiotiques par ce même miaroorganisme,
D'après la description qui suit,-il apparaît que
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la souche isolée par la. demanderesse ne oorreepond à aucune des espèces cataloguées-dans lè Manuel de Bergey, ou par Waksman-Leohevèlier dans ItA?t1nomytes and their Antibiotios"5 en 1953.
Cette espèce nouvelle a été appelée t'streptomyaes dist3.11ioas ". , Le microorganisme producteur présente les càracté- riS%i4Uea suivantes: AU microscope optique, hyphes longs, plutôt droits, peu ramifiés. Sur agar-agir-levure, hyphes longs et droits avec vertioilles' d!hyphes courts, d,xoits, sympodi- que s . Sur agar-agar-p'omme'de -terre, agar-agar-c9tte et asar-asar-axparagine, il-se forme'un'mycélium végétatif,,qui présente d'un côté une couleur passant du jaune-miel au brun en vieillissant, tandis'que le coté opposé varie du brun clair au brun noisette.
Le'mycélium aérien est rare sur-ces milieux de culture, il présente une apparence poudreuse et satinée et
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une couleur blanche grisâtre les premiers jours de croissance, et par'la suite une couleur légèrement gris-crème; sur agar- agar-asparagine, il présente une légère nuance violet-brun,
Sur agar-agar-amidon et agar-agar-Czapek le mycélium végétatif varie de l'incolore au jaune miel, le côté opposé étant jaune; sur Czapek le mycélium aérien est blanc grisâtre; sur agar-agar-amidon il est légèrement lie-de-vin, toujours poudreux et satiné.
Dans le bouillon de viande et le bouillon peptone- glucose, le mycélium végétatif est abondant, presque complè- tement immergé sous forme de flocons; sur bouillon de viande il croit aussi à la surface, sous forme annulaire, un coté étant jaune miel tandis que le côté opposé a une couleur jaune.
Le mycélium aérien est absent. Sur-gélatine il se produit une croissance abondante, le mycélium végétatif étant brun-miel et le verso brun jaune;.le mycélium aérien varie du blanc grisâtre au gris ; existe un pigment noir-brun diffus. Il ne se produit pas de pigmentation sur d'autres substrats. Il liquéfie fortement la gélatine au bout de 25 jours et hydrolyse considérablement l'amidon. Le milieu de culture le plus appro- prié à une bonne croissance du mycélium et à une activité antibiotique élevée en proportion, est constitué par : des hydrates de carbone, des substances azotées et des sels.
Comme source d'hydratesde carbone, on peut utiliser: le glucose, le saccharose, le maltose, l'amidon et aussi les hydrates de carbone présents dans la liqueur de macération de mais. Comme source d'azote, on peut utiliser: la liqueur de macération de mais, la farine de soja et les sels d'ammonium.
De plus, on ajoute NaCl, CaCO3, K2HOP4, MgSO4, SO4 etc. Le pH du bouillon est d'environ 6,6. On peut con- @uire la fermentation dans un Erlenmeyer de 300 cm3, dans des conditions de bonne aération et à 28 C. L'activité maxi-
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mum se produit entre 100.et 120 heures, avec un pH d'environ 7,6.
On peutaussi effectuer la culture du microorganisme, en conduisant une fermentation immergée qui comporte une agita- tion et une aération, ainsi qu'il est bien connu de l'homme de l'art.
Pour obtenir une bonne croissance des cultures, on peut utiliser un bouillon de culture contenant une ou plu- sieurs sources de carbone et d'azote assimilables et des sels, comme indiqué plus hau t.
La présente invention a aussi pour objet l'extraction des antibiotiques produits par le microrganisme cultivé dans les conditions mentionnées ci-dessus.
Les exemples suivants indiquent quelques détails expérimentaux de cette partie de la présente inven tion; de façon générale, pour extraire les produits actifs des cultures, on traite le mycélium, séparé de la liqueur de culture, par divers solvants, par exemple les alcools méthylique, éthylique et butylique normal. Parmi ceux-ci, il est préférable dtutili- ser l'alcool butylique; on conduit généralement l'extraction en agitant le mycélium avec des fractions successives du sol- vant ; on sépare les extraits par centrifugation ou filtration, on les lave à l'eau et on les évapore sous vide. Du concentré huileux ainsi obtenu, on tire un précipité jaune ou brun-jaune, en traitant par l'éther, puis on sèche. Ce produit (distamycine) présente le spectre d'absorption d'ultra-violet qui caractérise un polymère conjugué.
On trouve les maxima du spectre ultra- violet à 235, 290, 305, 318, 333, 350, 380 et 405 mp. Les maxima à 318, 333 et 350 mu sont caractéristiques d'un chromo- phore du type penta-ène. Avec l'acide sulfurique concentré, le produit donne une couleur violet foncé. Il contient de l'azote,
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Le produit est soluble dans les alcools inférieurs, l'éthylcellosolve, la pyridine et les autres bases aliphati- ques ou aromatiques, ou- dans l'acide acétique glacis!. Il est partiellement soluble dans le chloroforme, les acides et les alcalis dilués, il est insoluble dans l'éther. Il est instable à chaud, particulièrement en milieu acide et alcalin, et sta- ble en solution dans le méthanol.
Rf chromatographique: Butanol aqueux : 0,15 ; eau saturée de butanol : 0,3 ; butanol-pyridine-eau (1:0,6:1) :
0,6 ; butanol-acide acétique-eau (2:1:1) :0,73 ; chlorure d'ammonium à 3%: 0,04 ; acétone à 60%: 0,8 ; benzène-acide acétique-eau (2:2:1) : 0,00 (détection par bio-autographies sur Candida albicans).
Le spectre d'absorption d'infra-rouge montre un maximum à 2,9 avec des points d'inflexion à 3,00 et 3,05 , deux maxima nets à 6,04 et 6,33 avec des points d'inflexion à 6,10, 6,42, 6,52 et 6,58 , une raie moins évidente à 5.82 , une raie de forte absorption entre.6,8 et 7,3 .
Les produits tirés des cultures de Streptomyces distallicus suivant le procédé décrit ci-dessus ou un autre procédé équivalent, ou aussi au moyen d'un.solvant différent du butanol, par exemple un autre alcool, le chloroforme, l'acétone, une solution de bases aliphatiques, aromatiques ou hétérocycliques, présentent tous une aotion inhibitrice remarquable sur divers champignons et bactéries pathogènes.
En particulier, le produit obtenu par extraction au butanol (distamycine), et qui présente les caractéristiques mentionnées plus haut, est actif sur le S. lutea, le B. subtilis, le
Mycobacterium tuberculosis souche 607, l'Actinomyces bostrômi,
1'0. albicans, le Tric. mentagrophytes, le Sab. gypseuse l'Epid, floccosum, le Deb. Hudeloi (voir ci-dessous).
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Des produits du type distamycine, on peut tirer, par divers procédés, des produits différents doués d'une remarquable activité antibiotique. Ces composés nouveaux peu- vent être déjà présents dans le produit brut, ou bien être formés par une modification du même produit. On peut obtenir un composé très actif en filtrant une solution méthanolique de distamycine par une colonne d'alumine; ce produit nouveau a été appelé "distramycine A", son spectre ultra-violet pré- sente des maxima à 304 et 240 m : le produit traité par l'acide sulfurique concentré donne une couleur lie de vin.
Il est insoluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éther, les alcalis dilués ; il est très faiblement soluble dans le mélange méthanol-éther 1:3 .
La distamycine A est plus active que les produits dont on la tire. Elle présente une activité inhibitrice parti- culière sur certains schizomycètes et sur l'Aotin, bostro- mi, 1'0. albicans, le Tric. mentagrophytes, le Sab. gypseus, le Gl. graphii, l'Epid. floccosum, le Deb. Hudeloy (voir ci-dessous).
On peut obtenir d'autres produits actifs par des frac- tionnements à l'aide de solvants appropriés (chloroforme, alcools, mélanges alcool-éther). Par exemple, si l'on précipite par l'éther, en proportions appropriées, une solution d'un produit de distamycine dans le méthanol, on obtient deux pro- duits nouveaux : la distamycine B, insoluble dans le mélange méthanol-éther, dont le spectre ultra-violet présente des maxima à 230, 318, 333, 350, 380, 405 mu; avec l'acide sulfu- rique concentré, elle donne une couleur violette;
la distamy- cine C, soluble dans le mélange méthanol-éther, et dont le spectre d'absorption d'ultra-violet est caractérisé par un aximum important à 236 m et par une absorption plus faible à 300-350 mu, en comparaison des autres produits.
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Ce produit, avec l'acide suif crique concentré, donne une couleur lie-de-vin. Il est presque complètement soluble dans le chloroforme et les alcalis dilués, en donnait 'une couleur jaune. Tous les composés obtenus par ces frac- tionnements ou par d'autres comportant une extraction par' sol- vants (alcools, chloroforme, acétone, etc...), suivie ou non d'une précipitation, présentent une activité antibactérienne et fongicide égale ou supérieure à celle de la distamycine.
Etant donné leurs propriétés, la distamycine, ou les distamycines A, B et C, apparaissent différentes de tous les autres produits fongicides dérivés du métabolisme des actionnmycèts et qui ont été isolés ou suffisamment caracté- risés jusqu'à présent. En particulier, elles sont différentes de la fungichromine et de la philipine, substances qui con- tiennent un chromophore du type penta-ène.
De la liqueur-mère éthérée dé précipitation de la distamyoine, on tire un autre produit doué d'une activité fongicide, que la demanderesse appelle "distaoyne". On peut purifier ce produit en le cristallisant par l'acétone aqueuse; c'est und substance cristalline jaune, insoluble dans l'eau, mais soluble dans de nombreux solvants organiques; point de fusion 154-156 C; (Ó )5 = -17 (dans le méthanol).
Le spectre ultra-violet de la distacyne présente des maxima à 255 m (E1% = 640) et 340 m (E1% = 470) et donne des résultats d'analyse correspondant à la composition C22H25O6N.
Les spectres d'absorption d'ultra-violet des anti- biotiques ici décrits sont reportés sur les graphiques du dessin ci-joint, sur lequel A est la courbe de la distarnycine, B là courbe de la distacyne, et A', A", A'" sont les courbes respectives des fractions A, B et C de la distamycine.
Tour mieux caractériser le procédé de l'invention, on ajoutera que le filtrat des cultures de Streptomyces
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distallicus montre une activité inhibitrice sur les schizo- mycètes et les champignons. L'activité antibiotique du filtrat est proportionnelle à la production de distamycine par le microorganisme.
On indique ci-dessous le spectre antibiotique de la distamycine et de*ses dérives, afin de démontrer leur activité contre plusieurs bactéries.
Spectre d'activité de la distamycine et des fractions A, B et C que l'on peut en tirer.
Dose inhibitrice minimum, en g/cm3; dilution dans du bouillon de levure :
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<tb> Souches <SEP> Distamy- <SEP> Fraction <SEP> A <SEP> Fraction <SEP> B <SEP> Fraction <SEP> C
<tb>
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¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ cine ¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯
EMI8.3
<tb> Staph. <SEP> 114 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 50
<tb>
<tb> S.lutea <SEP> 50 <SEP> <10 <SEP> 50 <SEP> + <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb> B.subtilis <SEP> 50 <SEP> <10 <SEP> 50 <SEP> 50
<tb>
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Tycob.607 . 7 50 + 50 >50 50
EMI8.5
<tb> E. <SEP> Coli <SEP> > <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> >50 <SEP> > <SEP> 50 <SEP>
<tb>
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Ps.aeruginosa ¯-50 >50 qi50 >50 Actin.bostrami A - 10 10 + 10 a- 10 0.
alibicans < 10 + 10 < 10 + 10 Tr.mentagroph5rtes 10 10 10 + 10
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<tb> Sab.gypseus <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP>
<tb>
<tb> G1. <SEP> graphii <SEP> 50 <SEP> + <SEP> la <SEP> 50 <SEP> 50
<tb>
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Epid.floCCOSL1!Il < 10 <10 < 10 C 10 Deb.hudeloi + 10 + 10 + 10 + 10
La distacyne à une dose de 100 g/cm3 dans une' cul- ture Sabouraud sur agar-agar exerce une action inhibitrice sur l'Epydermophyton floccosum, le Tricophyton mentagrophytes,
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-1-1- Glenospora graphii, le Sabourandites gypse us, et une ction sub-inhibitrice sur le Pseudomonas aeruginosa et 'le arcina lutea.
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Les exemples suivants illustreront mieux la pré- sente invention, mais il est entendu qu'elle n'est pas limitée par les substances et proportions particulières citées dans ces exemples.
EXEMPLE 1.
A 3000 cm3 d'un milieu stérile comprenant 2 % de dex- trose, 2% de liqueur de macération de maïs, 1% de Ca CO3,
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O3;î de (NH4)2S04 ' 0,3% de NaCl, on ajoute une suspension de spores correspondant au lavage d'une kolle, On poursuit la fermentation pendant 40 heures avec une vitesse d'agita- tion de 150-250 t/mn et un débit d'air de 1 à 2 litres par minute et par litre de milieu de culture.
On utilise 300 cm3 de mycélium végétatif pour inocu- ler 6000 cm3 d'un milieu de culture stérile similaire, pour le stade de production. On prolonge ce stade pendant 85-100 heures; vitesse d'agitation 350-400 t/mn; débit d'air, 1 litre par minute et par litre de milieu.de culture.
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2X?llLiB% 2.
A 17 litres d'.une culture obtenue par fermentation immergée comme dans l'exemple 1, on ajoute une substance coo- pérante et on filtre le tout. On agite pendant 1 heure le mé- lange de mycélium et de substance coopérante avec 2500 litres- de butanol. On répète ce traitement à deux reprises.
On réunit les extraits au butanol, on les lave avec H2O et on concentre jusqu'à consistance huileuse, puis on traite par l'éther. On obtient 8,9 g d'un produit brun jaune (distamycine). On laisse reposer les liqueurs-mères éthérées pendant 5-6 jours. On recueille le précipité cristallin et on le cristallise par l'acétone à 75%; point de fusion 154-156 C (distacyne).
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EXEMPLE 3.
On dissout 1,0 g. de distamycine dans du méthanol (70 cm3), et on sépare d'un'léger résidu par filtration.
On filtre la solution jaune orange sur une colonne contenant 100 g d'alumine acidifiée suivant Wieland, et on lave au méthanol. On conduit l'élution avec le même solvant.
On prend la première quantité de 100 om3 recueillie après l'apparition d'une couleur jaune dans l'effluent, on la sèche par évaporation, et elle donne 0,2 g de distamyoine.A.
EXEMPLE 4.
On agite pendant 30 minutes 1,0 g de distamycine avec 2 portions successives de 50 cm3 de méthanol. On obtient une dissolution presque complète (résidu 50 mg). On concentre les extraits jusqu'à 25 em3, on les sépare d'un léger préci- pité (25 mg) et on traite par 3 volumes d'éther. On sèche le précipité (distamycine B). Le rendement est de 0,4 g.
On évapore complètement les liqueurs-mères éthériées et on le.s reprend par l'éther. On recueille le produit résiduel et,on le sèche, il donne 0,33 g (distamyoine C).
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The present invention relates to a process for the preparation of new antibiotics which are distamycin and its constituents, and distacyne., By culturing a new species of Streptomyces, “S. distallicus”, under appropriate conditions.
It is also aimed at these new antibiotics, in particular as obtained by this process., Which are endowed with
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antibacterial and / or fungicidal activity. These antibiotics are particularly applicable to the treatment of plants affected by diseases caused by microorganisms sensitive to the antibiotics in question.
The antibiotics prepared by the process which is the subject of the present invention are not described among the known antibiotics. Compositions containing these antibiotics
EMI2.2
The new "¯ # '-.' 'Are of interest because of their high activity against several pathogenic sahizomal fungi.
These new antibiotics are produced by a @
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¯new species of -Streptomyces (the strain of which was isolated by the applicant from a soil sample taken in Campania, province of Naples), in various culture media suitable for the growth of the producing microorganism and the production of antibiotics by this same microorganism,
From the following description, it appears that
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the strain isolated by. Applicant does not correspond to any of the species cataloged in the Manuel de Bergey, or by Waksman-Leohevèlier in ItA? t1nomytes and their Antibiotios "5 in 1953.
This new species has been called t'streptomyaes dist3.11ioas ". The producing microorganism presents the following càractéiS% i4Uea: Under an optical microscope, long hyphae, rather straight, little branched. On agar-act-yeast, long hyphae and straight with vertioils 'of short hyphae, d, xoits, sympodi- s. On agar-agar-apple' of earth, agar-agar-c9tte and asar-asar-axparagine, it-forms 'a' vegetative mycelium, which on one side has a color changing from honey-yellow to brown with age, while the opposite side varies from light brown to hazelnut brown.
The aerial mycelium is rare on these culture media, it presents a powdery and satin appearance and
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a greyish white color the first days of growth, and a slightly creamy gray color thereafter; on agar-agar-asparagine, it has a slight purple-brown shade,
On agar-agar-starch and agar-agar-Czapek the vegetative mycelium varies from colorless to honey yellow, the opposite side being yellow; on Czapek the aerial mycelium is greyish white; on agar-agar-starch it is slightly wine-colored, always powdery and satiny.
In meat broth and peptone-glucose broth the vegetative mycelium is abundant, almost completely submerged in the form of flakes; on meat broth it also grows on the surface, in annular form, one side being honey yellow while the opposite side has a yellow color.
The aerial mycelium is absent. Over-gelatin abundant growth occurs, the vegetative mycelium being honey-brown and the reverse side yellow-brown; the aerial mycelium varies from greyish white to gray; there is a diffuse black-brown pigment. Pigmentation does not occur on other substrates. It strongly liquefies the gelatin after 25 days and considerably hydrolyzes the starch. The culture medium most suitable for a good growth of the mycelium and a high antibiotic activity in proportion, consists of: carbohydrates, nitrogenous substances and salts.
As a source of carbohydrates, it is possible to use: glucose, sucrose, maltose, starch and also the carbohydrates present in the corn maceration liquor. As a source of nitrogen, the following can be used: corn maceration liquor, soybean flour and ammonium salts.
In addition, NaCl, CaCO3, K2HOP4, MgSO4, SO4 etc. are added. The pH of the broth is approximately 6.6. The fermentation can be carried out in a 300 cm3 Erlenmeyer flask, under good aeration conditions and at 28 C. The maximum activity
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mum occurs between 100. and 120 hours, with a pH of about 7.6.
The culture of the microorganism can also be carried out by carrying out an immersed fermentation which includes agitation and aeration, as is well known to those skilled in the art.
To achieve good crop growth, a culture broth containing one or more sources of assimilable carbon and nitrogen and salts can be used as described above.
A subject of the present invention is also the extraction of the antibiotics produced by the microrganism cultivated under the conditions mentioned above.
The following examples indicate some experimental details of this part of the present invention; in general, in order to extract the active products from the cultures, the mycelium, separated from the culture liquor, is treated with various solvents, for example methyl, ethyl and normal butyl alcohols. Among them, it is preferable to use butyl alcohol; the extraction is generally carried out by stirring the mycelium with successive fractions of the solvent; the extracts are separated by centrifugation or filtration, washed with water and evaporated in vacuo. From the oily concentrate thus obtained, a yellow or brown-yellow precipitate is obtained, while treating with ether, then dried. This product (distamycin) has the ultra-violet absorption spectrum which characterizes a conjugated polymer.
The ultraviolet spectrum maxima are found at 235, 290, 305, 318, 333, 350, 380 and 405 mp. The maxima at 318, 333 and 350 mu are characteristic of a pentaene chromophore. With concentrated sulfuric acid the product gives a dark purple color. It contains nitrogen,
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The product is soluble in lower alcohols, ethylcellosolve, pyridine and other aliphatic or aromatic bases, or in acetic acid glacis !. It is partially soluble in chloroform, dilute acids and alkalis, it is insoluble in ether. It is unstable under hot conditions, particularly in acidic and alkaline media, and stable in solution in methanol.
Chromatographic Rf: Aqueous butanol: 0.15; water saturated with butanol: 0.3; butanol-pyridine-water (1: 0.6: 1):
0.6; butanol-acetic acid-water (2: 1: 1): 0.73; 3% ammonium chloride: 0.04; 60% acetone: 0.8; benzene-acetic acid-water (2: 2: 1): 0.00 (detection by bioautography on Candida albicans).
The infrared absorption spectrum shows a maximum at 2.9 with inflection points at 3.00 and 3.05, two net maxima at 6.04 and 6.33 with inflection points at 6.10, 6.42, 6.52 and 6.58, a less obvious line at 5.82, a high absorption line between 6.8 and 7.3.
The products obtained from cultures of Streptomyces distallicus according to the method described above or another equivalent method, or also by means of a solvent other than butanol, for example another alcohol, chloroform, acetone, a solution of Aliphatic, aromatic or heterocyclic bases all exhibit remarkable inhibitory action on various pathogenic fungi and bacteria.
In particular, the product obtained by extraction with butanol (distamycin), and which has the characteristics mentioned above, is active on S. lutea, B. subtilis,
Mycobacterium tuberculosis strain 607, Actinomyces bostrômi,
1'0. albicans, Tric. mentagrophytes, the Sab. gypsum Epid, floccosum, Deb. Hudeloi (see below).
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From the products of the distamycin type, different products endowed with remarkable antibiotic activity can be obtained by various methods. These new compounds can already be present in the crude product, or else be formed by a modification of the same product. A very active compound can be obtained by filtering a methanolic solution of distamycin through an alumina column; this new product was called "distramycin A", its ultraviolet spectrum shows maxima at 304 and 240 m: the product treated with concentrated sulfuric acid gives a wine color.
It is insoluble in chloroform, ethyl acetate, acetone, ether, dilute alkalis; it is very slightly soluble in a methanol-ether mixture 1: 3.
Distamycin A is more active than the products from which it is obtained. It has a particular inhibitory activity on certain schizomycetes and on Aotin, bostroma, 1'0. albicans, Tric. mentagrophytes, the Sab. gypseus, Gl. graphii, Epid. floccosum, the Deb. Hudeloy (see below).
Other active products can be obtained by fractionation using suitable solvents (chloroform, alcohols, alcohol-ether mixtures). For example, if a solution of a distamycin product in methanol is precipitated with ether in appropriate proportions, two new products are obtained: distamycin B, insoluble in a methanol-ether mixture, of which the ultra-violet spectrum shows maxima at 230, 318, 333, 350, 380, 405 mu; with concentrated sulfuric acid it gives a violet color;
distamycin C, soluble in a methanol-ether mixture, and whose ultraviolet absorption spectrum is characterized by a large aximum at 236 m and by a lower absorption at 300-350 mu, in comparison with others products.
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This product, together with concentrated cricic tallow acid, gives a wine-red color. It is almost completely soluble in chloroform and dilute alkalis, giving it a yellow color. All the compounds obtained by these fractionations or by others comprising extraction with solvents (alcohols, chloroform, acetone, etc.), whether or not followed by precipitation, exhibit equal antibacterial and fungicidal activity. or greater than that of distamycin.
In view of their properties, distamycin, or distamycins A, B and C, appear to be different from all other fungicidal products derived from the metabolism of action mycetes and which have been isolated or sufficiently characterized so far. In particular, they are different from fungichromine and philipine, substances which contain a pentaene-type chromophore.
Another product endowed with fungicidal activity, which the Applicant calls "distaoyne", is obtained from the ethereal mother liquor for precipitation of distamyoin. This product can be purified by crystallizing it from aqueous acetone; it is a yellow crystalline substance, insoluble in water, but soluble in many organic solvents; melting point 154-156 C; (Ó) 5 = -17 (in methanol).
The ultra-violet spectrum of distacyne shows maxima at 255 m (E1% = 640) and 340 m (E1% = 470) and gives analysis results corresponding to the composition C22H25O6N.
The ultraviolet absorption spectra of the antibiotics described herein are plotted on the graphs of the accompanying drawing, where A is the curve for distarnycin, B is the curve for distacyne, and A ', A " , A '"are the respective curves of fractions A, B and C of distamycin.
To better characterize the process of the invention, it will be added that the filtrate of the cultures of Streptomyces
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distallicus shows inhibitory activity against schizomycetes and fungi. The antibiotic activity of the filtrate is proportional to the production of distamycin by the microorganism.
The antibiotic spectrum of distamycin and its derivatives is indicated below, in order to demonstrate their activity against several bacteria.
Spectrum of activity of distamycin and of fractions A, B and C which can be obtained therefrom.
Minimum inhibitory dose, in g / cm3; dilution in yeast broth:
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<tb> Strains <SEP> Distamy- <SEP> Fraction <SEP> A <SEP> Fraction <SEP> B <SEP> Fraction <SEP> C
<tb>
EMI8.2
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯
EMI8.3
<tb> Staph. <SEP> 114 <SEP>> <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP>> <SEP> 50 <SEP> 50
<tb>
<tb> S.lutea <SEP> 50 <SEP> <10 <SEP> 50 <SEP> + <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb> B.subtilis <SEP> 50 <SEP> <10 <SEP> 50 <SEP> 50
<tb>
EMI8.4
Tycob.607. 7 50 + 50> 50 50
EMI8.5
<tb> E. <SEP> Coli <SEP>> <SEP> 50 <SEP>> <SEP> 50 <SEP>> 50 <SEP>> <SEP> 50 <SEP>
<tb>
EMI8.6
Ps.aeruginosa ¯-50> 50 qi50> 50 Actin.bostrami A - 10 10 + 10 a- 10 0.
alibicans <10 + 10 <10 + 10 Tr.mentagroph5rtes 10 10 10 + 10
EMI8.7
<tb> Sab.gypseus <SEP> <<SEP> 10 <SEP> <<SEP> 10 <SEP> <<SEP> 10 <SEP> <<SEP> 10 <SEP>
<tb>
<tb> G1. <SEP> graphii <SEP> 50 <SEP> + <SEP> the <SEP> 50 <SEP> 50
<tb>
EMI8.8
Epid.floCCOSL1! Il <10 <10 <10 C 10 Deb.hudeloi + 10 + 10 + 10 + 10
Distacyne at a dose of 100 g / cm3 in a Sabouraud culture on agar-agar exerts an inhibitory action on Epydermophyton floccosum, Tricophyton mentagrophytes,
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-1-1- Glenospora graphii, Sabourandites gypsum us, and a subinhibitory action on Pseudomonas aeruginosa and arcina lutea.
<Desc / Clms Page number 9>
The following examples will better illustrate the present invention, but it is understood that it is not limited by the particular substances and proportions recited in these examples.
EXAMPLE 1.
At 3000 cm3 of a sterile medium comprising 2% dextrose, 2% corn maceration liquor, 1% Ca CO3,
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O3: 1 of (NH4) 2SO4 '0.3% NaCl, a spore suspension is added corresponding to the washing of a kolle. The fermentation is continued for 40 hours with a stirring speed of 150-250 t / min and an air flow rate of 1 to 2 liters per minute and per liter of culture medium.
300 cc of vegetative mycelium is used to inoculate 6000 cc of a similar sterile culture medium for the production stage. This stage is continued for 85-100 hours; stirring speed 350-400 rpm; air flow rate, 1 liter per minute per liter of culture medium.
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2X? LlLiB% 2.
To 17 liters of a culture obtained by submerged fermentation as in Example 1, a co-operative substance is added and the whole is filtered. The mixture of mycelium and co-operating substance is stirred for 1 hour with 2500 liters of butanol. This treatment is repeated twice.
The extracts are combined with butanol, washed with H2O and concentrated to oily consistency, then treated with ether. 8.9 g of a yellow-brown product (distamycin) are obtained. The ethereal mother liquors are left to stand for 5-6 days. The crystalline precipitate is collected and crystallized from 75% acetone; mp 154-156 C (distacyne).
<Desc / Clms Page number 10>
EXAMPLE 3.
1.0 g is dissolved. of distamycin in methanol (70 cm 3), and a slight residue is filtered off.
The yellow-orange solution is filtered through a column containing 100 g of Wieland acidified alumina, and washed with methanol. The elution is carried out with the same solvent.
The first quantity of 100 om 3 collected after the appearance of a yellow color in the effluent is taken, it is dried by evaporation, and it gives 0.2 g of distamyoin.
EXAMPLE 4.
1.0 g of distamycin is stirred for 30 minutes with 2 successive portions of 50 cm3 of methanol. Almost complete dissolution is obtained (residue 50 mg). The extracts are concentrated to 25 em3, separated in a slight precipitate (25 mg) and treated with 3 volumes of ether. The precipitate is dried (distamycin B). The yield is 0.4 g.
The ethereal mother liquors are completely evaporated and they are taken up in ether. The residual product is collected and dried to give 0.33 g (distamyoin C).