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Cette invention concerne un nouveau procédé de production de la riboflavine, et plus particulièrement la production de la riboflavine par le développement du micro-organisme Asbhya gossypii sur un nouveau typ3 de milieu de nutritif.
Le champignon Asbhya gossypii est un organisme bien connu, que l'on a déjà employé pour obtenir la riboflavine. Mais le procédé antérieur qui employait ce micro-organisme n'a donné que des rendements d'environ 300
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à 400 gaas/ ct3 . On a constaté que, si l'on utilise des milieux nutritifs nouveaux pour développer l'Asbhya gossypii dans les procédés déjà connus employant cet organisme, on peut obtenir des rendements très supérieurs aux
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renâements¯précédentso En particulier le nouveau procédé de l'invention permet d'obtenir couramment" des rendements 4 à 5 fois plus élevés que les ren- dements antérieurs. Chose surprenante, ces rendements élevés sont obtenus . sur des milieux ne comprenant pas les-composants criticables que l'on jugeait habituellement nécessaires jusqu'ici.
En d'autres termes, non seulement le procédé nouveau de cette invention fournit des rendements fortement accrus, mais encore il emploie un milieu de fermentation avantageusement simplifié.
Dans les procédés précédents qui développaient l'Asbhya gossypii sur des milieux liquides, le milieu nutritif comprenait toujours une source de protéine, qui était habituellement entièrement ou en partie d'origine animale, et une source d'hydrates de carbone. On a trouvé que l'on peut employer un milieu simplifié, à peu près exempt d'hydrates de carbone, peur
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développer l'Asbhya gossypii et obtenir des render#ntsélevés de riboflavine.
On a constaté également que, si on le désire, le milieu exempt d'hydrate s de carbone peut également être à peu près exempt de substances protéinées d' origine animale. Il est souvent désavantageux d'employer dans les milieux de
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fermentation des substances protéinées d'origj"lp animale +elles que les pettones, l'extrait de boeuf et les déchets d'abattoir arche que ces produits sont généralement plus onéreux que les matil:J.L<::;
' jjrouéinées d'origine végétale, et parce que leur emploi .ans le milieu de fermentation donne frêqueia- ment des résultats non constants du fait de la co position variable de ces substances protéinéesanimale Se
Les principes nutritifs contenus dans les milieux nutritifs du nouveau procédé de cette invention comprennent une substance protéinée
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et un lipide assimilables (métabolisables)o On peut citer parmi les sources de protéines satisfaisantes la liqueur de macération de mais, la farine de graine de soja, la farine de graine de coton, la farine de graine de lin,
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la liqueur de déchets d'abattoirs, et des préparations de pEptones. Le lipide peut d- 113me trie d'origine animale ou végétale ou être composé par un mélange.
Le lipide préféré est l'huile de lard qui est évidemment d'origine animale. Mais on peut également employer avec des résultats excellents des lipides tels que l'huile de mais, l'huile de graine de soja, l'huile de coco, l'huile d'olive et autresglycérides des acides gras.
Le concentration de produits nutritifs dans les nouveaux milieux employés dans le nouveau procédé de cette invention peut varier largement. Les produits nutritifs peuvent représenter par exemple 0,5 à 10 % du milieu nutritif. La concentration nutritive du milieu doit être assez élevée pour permettre un bon développement de l'Asbhya gossypii, sinon on obtient des rendements relativement faibles en riboflavine. Mais d'-autre part, si la concentration nutritive est trop forte, la viscosité du milieu devient mauvaise, et il est plus difficile d'isoler le ,produit.
La concentration nu-
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tritive optinum varie quelque peu avec la cOI....-ositim "..acte des produits nu- tritifs. Si par exemple la substance protéinée est exclusivement d'origine végétale, la concentration optimum totale des produits nutritifs est habituellement de 4 à 6 % en poids; mais si la source de protéine comprend à la fois des substances d'origine animale et végétale, la concentration totale optimum des produits nutritifs est la plupart du temps comprise entre 5 % et 8 % en poids.
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Les matières protéinées utilisées dans les nouveaux milieux de culture de cette invention, peuvent représenter 20 à 80 % en poids de l'ensemble des produits nutritifs, la vapeur optimum étant fonction de la source particulière de protéines employéeso Avec des matières protéinées végétales, on obtient habituellement les meilleurs résultats dans des milieux dans lesquels la matière protéinée représente 40 % à 60 % de 1'ensenble des produits nutritifs. Dans des milieux dens lesquels la matière protéinée est un mélange de protéines d'origine animale et d'origine végétale, on obtient les meilleurs résultats lorsque cette ma:tière protéinée représente 60 % à 70 % de l'ensemble des produits nutritifs.
Etant donné que les principaux produits nutritifs des nouveaux milieux comprennent une matière protéinée et un lipide, ce qui précède montre que le lipide assimilable peut constituer de même environ 20 % à 80% en poids de l'ensemble des produits nutritifs.
En plus de la source de protéines et le lipide, les milieux utilisés dans le nouveau procédé de cette invention peuvent contenir de petites quantités d'autres substances qui sont connues pour stimuler la croissance de l'Asbhya gossypii dans certaines conditions. On peut citer parmi ces substances des vitamines, des sels minéraux tels que le carbonate de calcium et le phosphate de monopotassium, et certains éléments à l'état de traces tels que le manganèse, le fer, le cuivre et le zinc. Quand on emploie la liqueur de macération de mais, dans les nouveaux milieux de cette invention, elle présente l'avantage de contenir suffisamment de vitamines et de substances minérales, grâce à quoi d'autres additions ne sont plus nécessaires.
Mais si l'on emploie un milieu ne contenant que des sources de protéines autres que la liqueur de macération de mais, on constate qu'il est généralement avantageux de compléter le' milieu par des vitamines telles que la biotine, et la thiamine, et par des substances minérales telles que celles indiquées plus hauto
Les opérations de fermentation du nouveau procédé de cette invention sont à peu près identiques à celles qu'on utilise dans les procédés antérieurs de production de la riboflavine. Par exemple, le brevet n 2,445.128 du 13 juillet 1948 des Etats-Unis d'Amérique, décrit un procédé de fermentation que l'on peut employer d'une façon très satisfaisante dans le nouveau procédé de cette invention.
Le procédé habituel consiste à préparer un milieu nutritif stérile, à inoculer ce milieu à l'aide d'Asbhya gosypii, à entretenir le milieu inoculé à une température comprise entre 20 et 40 G environ et de préférence à une température d'environ 26 C, jusqu'à ce que la concentration deriboflavine atteigne le niveau désiré, puis à extraite la riboflavine du milieu par 1!..un quelconque des procédés bien connus qui conviennent dans ce but.
On peut conduire la fermentation à un pH quelconque voisin de la neutralité,par exemple entre 6,0 et 8,0 La zone préférable du pH est comprise entre 6,5 et 7,5 environ. En règle générale, le réglage du pH présente très peu de difficultés. Si le réglage est fait avant le début de la fermentation., il est habituellement nécessaire de le régler de nouveau. Le champignon Asbhya gossypii a besoin d'oxygène pour se développer de façon satisfaisante et produire de la riboflavine. Il faut donc aérer le milieu pendant la fermentation. Si la fermentation est effectuée dans des flacons agitateurs ou autres récipients analogues, il est bon généralement que la surface du milieu exposée à l'atmosphère et exprimée en cn2, soit au moins égale au volume du milieu exprimé en cm3.
Quand la fermentation s'effectue dans des réservoirs qui sont aérés de la façon habituelle, il est bon en. général que le débit d'air exprimé en 1/min. soit au moins égal au quart du volume du milieu exprimé en litres. Des débits d'air plus élevés sont avantageux et l'on constatera dans ae nombreux cas qu'il est désirable que le débit d'air en 1/min. soit égal au volume du milieu en litres Dans de nombreux cas, l'aération est suffisante pour maintenir le milieu dans un état d'agitation suffisant. Mais il faut dans certaines circonstan-
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ces adopter un brassage mécanique pour entretenir une dispersion satisfai- sante du champignon dansle milieu.
Lorsque la fermentation s'est poursuivie pendant un certain temps, on constate que la production de riboflavire à atteint une valeur tele, qu'il n'est pas avantageux de prolonger davantage la fermentation.
Cette péricde de fermentation est très variable, et peut descendre jusqu'à
60 h ou au contraire atteindre 160 ho En règle générale, on obtient les meilleurs résultats en arrêtant la fermentation entre 90 et 130 h environ.
On peut extraire la riboflavine de la bière de fermentation par l'un. quelconque des procédés bien connuso Un excellent procédé consis- te à ajouter un agent réducteur pour réduire la riboflavine à sa forme insoluble et extraire le précipité ainsi obtenue On peut ensuite oxyder la substance réduite en l'exposant à l'atmosphère ou bien par tout autre pro- cédé convenable pour la faire passer à la forme soluble.
On illustrera plus particulièrement l'invention par les exem- ples particuliers suivants, dans lesquels toutes les proportions sont des proportions pondérales sauf indication contraire.,
EXEMPLE I.
On prépare un milieu d'inoculation en plaçant une cuillerée d' une boue d'Asbhya gossypii (culture N Y1056 du Northern Regional Research
Laboratory) dans un flacon contenant 25 cm3 d'un milieu comprenant dans de l'eau ordinaire 2,5 % de liqueur de macération de mais, 2 % de cérélose, et 0,5 % de peptone, le pH étant réglé à 6,7 avec NaOH. On laisse incuber le flacon contenant le milieu d'inculation sur un. agitateur à. mouvement alternatif pendent 48 h.
On prépare tous les milieux de fermentation en mélangeant la matière protéinée; on utilise divers hydrates de carbone en vue de comparaisons, et enfin on ajoute de l'eau. On règle le pH à 6,7 avec une solu- tion décinormale de soude caustique, on ajoute le lipide assimilable, puis on chauffe à 120 C pendant 20 min. pour stériliser.,
Les fermentations sont effectuées dans des flacons de 250 cm3 dont chacun contient 25 cm3 de milieu de fermentation. On inocule aseptiquement les flacons stériles, contenant 25 cm3 de milieu avec 1 cm3 de milieu d'inoculation et on les laisse incuber à 25,5 - 26 ,5 C pendant 5 jours sur un agitateur rotatif tournant à environ 180 t/min.
Dans une série de douze essais de deux flacons chacun, effectués avec un milieu de culture comprenant 1 % de liqueur d'abattoir, 2 % de liqueur de macération de mais (en poids par volume) et 2 % par volume d'huile de lard, le-reste étant de l'eau ordinaire, on a obtenuune production moyenne de 5 jours qui était de 949 gammas/cm3 de riboflavine.
Le rendement minimum de ces essais a été de 790 gammas/cm3 et le rendement maximum de 1160 gammas/cm3 Dans des essais comparatifs effectués avec un milieu identique sauf qu'on avait ajouté 0,5% de cérélose (en poids/vo- lume) le rendement maximum de riboflavine n'a été que de 890 gammas/cm3 et le rendement minimum de 605 gammas/cm3, le rendement moyen étant de 728 garmas/ cm3 En d'autres termes, l'emploi d'un milieu à peu près exempt d'hydrates de carbone a donné une augmentation d'environ 30 % du rendement.
EXEMPLE 2.
A l'aide d'une boue de sporulation d'Asbhya gossypii (culture N Y1056 du Northem Régional Research Laboratory) on prépare plusieurs suspensions que 1'on applique sur des plaquettes d'agar-agaro Au bout de 4 à 7 jours d'incubation, on enlève les colonies les plus vivement pigmentées, et on les développe par des dilutions et transferts successifs, jusqu'à ce qu'on obtienne un type de culture isolé produisant de façon constante une souche vivement pigmentée. A l'aide d'une boue de sporulation de cette souche on prépare des supensions que l'on soumet au rayonnement du
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mélange ultra-violet.
On applique ensuite les suspensions sur des plaquettes d' agar-agar. On cultive les colonies les plus vivement pigmentées en procédant'à des dilutions et transferts successifs, jusqu'à, ce qu'on ait isolé une nouvelle souche mutative capable de produire régulièrement des colonies vivement pigmentées.
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Cette "mutation" qui sera appelée ici la race A 37, donne par le nouveau procédé de cette invention des rendements qui sont encore supérieurs à ceux de la souche d'origine Y1056.
Suivant le procédé de l'exemple I, on prépare un milieu d' inoculation à partir de la race A 37, et l'on s'en sert pour inoculer une série de flacons de 250 cm3 dont chacun contient 25 cm3 d'un milieu compre-
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natit'2 % (en poids/volume) de liqueur de macération de mais et z d'huile de lard en volume,le reste étant l'eau ordinaire. Dans le premier essaie effectué avec ce milieu de culture simple, la production moyenne de ribo-
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flavine en 5 jours a été de 580 gammas/on0. Les essais ultérieurs donnèrent des rendements atteignant 1460 gammas/ c3..
On a obtenu également dans des récipients de fermentation de 300 litres, des rendements qui sont comparables à ceux qu'on a obtenus dans les flacons à agitateurs. Le tableau 1 ci-après donne les résultats et autres renseignements concernant 5 fermentations effectuées -avec la race A 37 et un milieu de 'culture 'comprenant 2 % d'huile de lard en volume ét la proportion indiquée (poids/volume) de liqueur de macération de mais le reste étant de l'eau ordinaire
TABLEAU 1
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Débit d' air¯e Liqueur de :
Riboflavine eu3 hue (en vol/vol, z macération ' .. -- ---.. , .,- - A mino) o de mais o 32 . 40 e 64 : 88 1 2: : poids/volo : a e : -------------------- -""-4-C¯-------------- 8T""P'1 '1"''' .1......4.11. o ,3. : 2 . 57 e 150 r 435 : 460 t 580 z,52 . 2 e 104 1 208 : 500 : 660 : 7oa os52 z 3 . 204 : 460 : 740 840 : 890 os70 . 3 e 192 : 405 :780 910 : 900 0 ,70 4 t 70 : 320 e g60 : 1100 :1030 --4 -"I¯--"'-------"'----------------¯." -....¯V""'<I-
On voit que le nouveau procédé de l'invention utilisé avec des milieux de culture extrêmement simples, peut donner des rendements supérieurs à ceux qu'on peut obtenir par les procédés antérieurs, qui utilisent des milieux de fermentation complexes contenant des hydrates de carbone. Il faut signaler également que les milieux utilisés dans cet exem- ple ne contiennent pas de substances protéinées.
Dans les fermentations des procédés antérieurs utilisant l'Asbhya gossypii, on estime généralement que
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la présence de prol6làes - animales est nécessaire si l'on veut obtenir le résultat satisfaisant.
EXEMPLE3
On prépare un milieu d'inoculation à l'aide de la race A 37 comme dans l'exemple 2, et l'on procède aux fermentations dans des flacons de 250 cm3 contenant 25 cm3 de milieu de fermentation inoculé avec 1 % d' une culture d'inoculation vieille de 48 h. Dans ces essais, le milieu de fermentation comprenait de l'eau ordinaire, de la liqueur de macération de mais, un lipide assimilable, et une peptone liquidée On a utilisé trois peptones liquides différentes -. peptones N 159,N 343 et N 366 de Wilson & CO Le tableau ci-après indique la composition' de ces peptones.
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TABLEAU 11i
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NI> 159 lY "/6"/ No 366
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<tb>
<tb> Matières <SEP> solides <SEP> (%) <SEP> 56,5 <SEP> 59,0 <SEP> 56,5
<tb>
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Azote G5) 9 ,5 8,0 8 ,4
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<tb>
<tb> Ester <SEP> soluble <SEP> de <SEP> pé-
<tb>
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trole (1 ) 0,3 6,0 1
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<tb>
<tb> Azote <SEP> aminé <SEP> (en <SEP> % <SEP>
<tb> d'azote <SEP> total) <SEP> 21,0 <SEP> 21,0 <SEP> 21,0
<tb>
Le tableau suivant donne les résultats d'une série de fermen- tatiuns d'essai effectuées dans des milieux comprenant 2 % d'huile de lard
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en volume, le pourcentage indiqué de peptone Na 343 de Wilson & Co (en volume) est le pourcentage indiqué de liqueur de iracération de mais et d'eau: TABLEAU III.
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Peptone OE) Riboflavine, en Ô jc3 et en 5 ¯¯¯ Jours z 14,94 3$ Ià.Il
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<tb>
<tb> CI <SEP> 9?- <SEP> 930 <SEP> 1020
<tb> 0,5 <SEP> 925 <SEP> 1100
<tb> 130 <SEP> 1130 <SEP> 1310
<tb> 2,0 <SEP> 1370 <SEP> 1200
<tb> 3,0 <SEP> 1475 <SEP> 1090
<tb>
Dans des essais comparatifs dans lesquels 1% de liqueur c abattoir emplaçait le peptone employé plus haut, la production de ribe .--:-ne en 15
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jours a atteint 995 /cr0.i dans un milieu contenant 2% de liqueur de macération de mais, et 1300 /c5 dans un milieu comprenant 3 %' de cette lui- queuro
Le tableau représente les résultats d'une série d'essais utilisant un milieu comprenant 2 % de liqueur de macération de mais, la quantité indiquée d'un lipide assimilable spécifié et la quantité indiquée de peptone et d'eau ordinaire TABLEAU IV.
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Raboflavine eu ² ;' cL1.3 et en 5 jours
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P6p-Gone N0 159 NID ,366 NI> 3., Liqueur d'abattoir Huile de lard - 2% 0 ,25 125C) 1390 1330
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<tb>
<tb> o <SEP> ,5 <SEP> 1590 <SEP> 1420
<tb> 1,0 <SEP> 1590 <SEP> 1380 <SEP> 1290 <SEP> 1300
<tb> 2,0 <SEP> 1550 <SEP> 1070
<tb> 3,0 <SEP> 1420 <SEP> 830
<tb> @
<tb> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> 3%
<tb>
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eaeovo-e-aow --.
www-.ew.oaw-------.--
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<tb>
<tb> 1,0 <SEP> 1580 <SEP> 11\ <SEP> 1520 <SEP> 1570 <SEP> 1330
<tb>
<tb>
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-------------'-""'1 =L 1 '111--------- --4 .1l'1"li-----------Huile de mais
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<tb>
<tb> 0 <SEP> 1070
<tb> 0,25 <SEP> 1340 <SEP> 1160 <SEP> 1200
<tb> 0,50 <SEP> 1500 <SEP> 1230
<tb> 1,0 <SEP> 1700 <SEP> 1100 <SEP> 1590
<tb> 2 <SEP> ,0 <SEP> 1060 <SEP> 1680
<tb> 3,0 <SEP> 1550 <SEP> 1480
<tb>
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w-.a-----..v "'"JIIIT¯¯¯¯¯¯----....¯-- .1>1..4
On a effectué une série d'essais analogues) sauf que dans ces essais on employait 3% de liqueur de mais. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau V.
TABLEAU V
Riboflavine,en 8 /cm3 en 5 jours.
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<tb>
<tb>
Peptone% <SEP> N 159 <SEP> N <SEP> 366 <SEP> N <SEP> 343
<tb> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> 2 <SEP> % <SEP>
<tb> 0,25 <SEP> 1400 <SEP> 1400 <SEP> 1360
<tb> o <SEP> ,50 <SEP> 1460 <SEP> 1400 <SEP> 1500
<tb> 1,0 <SEP> 1670 <SEP> 1580 <SEP> 1480
<tb> 2,0 <SEP> 1720 <SEP> 1210 <SEP> 1550
<tb>
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J 9' 1621J ¯¯¯¯¯¯ ô 1J.F.0 c .t,JS"
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<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> mais <SEP> : <SEP> 3 <SEP> % <SEP> ¯¯¯a. <SEP>
<tb>
0,25 <SEP> 1450 <SEP> 1400 <SEP> 1360
<tb> 0 <SEP> ,50 <SEP> 1450 <SEP> 1500 <SEP> 1300
<tb> 1,0 <SEP> 1600 <SEP> 1550 <SEP> 1420
<tb> 2,0 <SEP> 2280 <SEP> 1480 <SEP> 1880
<tb>
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3 ,o 1300 16oxo 1800
Le tableau VI donne les résultats d'une série d'essais ayant pour but de comparer les rendements possibles quand on emploie divers lipi-
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tes assimilables. Le milieu de fermentation de ces essais compreanait de 1' eau- ordinaire, 3 % de liqueur de mais en volume, 2 % de peptone liquide en
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volume, et:.le pourcentage voluwétriqle indiqué du lipide spécifiéo TABLEAU VI.
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Lipide z Huile de lard 17g0 ml. l7ga
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<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> mais <SEP> raffinée <SEP> 1640 <SEP> 1840
<tb> Huile <SEP> brute <SEP> de <SEP> soja <SEP> 1580 <SEP> 1780
<tb>
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Les essais rapportés ci-dessus montrent que le nouveau procédé de cette invention permet d'obtenir des rendements de riboflavine supérieurs à tous ceux qui ont été signalés précédemment pour les procédés employant l'Asbhya gossypiil Les rendements indiqués ci-dessus sont bien caractéristiques et n'ont pas été choisis pour montrer des valeurs maxima. En fait, le procédé nouveau de l'invention donne souvent des rendements dépassant
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2000 gammasf c3