CH354093A - Procédé de préparation de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine - Google Patents

Description

      Procédé    de     préparation    de la     L-6-diazo-5-oxo-norleucine       La     L-6-diazo-5-oxo-norleucine    possède des pro  priétés tout à fait     particulières,    comme     cela        ressort     de la description qui suit.

   Ce     composé    contient seule  ment les éléments carbone, hydrogène, oxygène et  azote et a la     formule    brute     C6H@NsO'3.        Il    a     un.    poids  moléculaire de 171     et    peut être représenté par la for  mule développée  
EMI0001.0014     
    La     L-6-diazo-5-oxo-norleucine    est relativement  instable à la chaleur et se décompose avant de fondre.  La décomposition ne se produit pas à une tempé  rature spéciale et, par conséquent, les points de  décomposition et de fusion varient entre de larges  limites selon la méthode employée pour leur déter  mination.

   La décomposition commence en général à  environ 1450 C et peut continuer jusqu'à ce qu'on  atteigne     155,1    C. La     L-6-diazo-5-oxo-norleucine    se  décompose dans les acides aqueux avec libération  d'azote. Les courbes de liaison d'hydrogène montrent  des valeurs pour peu dans l'eau de 2,1 et 8,95. Le  pouvoir rotatoire     spécifique        [a]D    de la     Lr6-diazo-5-          oxo-norleucine        est        -I-        210        (à        5,4'%        dans        l'eau).     



  La     L-6-diazo-5-oxo-norleucine    est très soluble  dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organi  ques non polaires     ordinaires.    Elle est seulement     très          légèrement    soluble dans le méthanol absolu,     Péthanol     absolu ou l'acétone à     froid,

      mais est soluble dans les       solutions        aqueuses    chaudes de     ces        solvants.    Elle  donne la coloration spécifique bleu     pourpre        dans     l'essai à la     ninhydrine.    L'oxydation par l'acide pério-         dique    de la     L-6-diazo-5-oxo-norleucine    donne     l'acide          L-glutamique.     



  La     L-6-diazo-5-oxo-norleucine    forme des .sels de  métaux par     réaction    avec des     hydroxydes,        carbonates,     bicarbonates, oxydes,     alcoyloxydes,        amidures,    etc.,  de métaux     alcalins    ou alcalino-terreux.  



  Dans un tampon de phosphate aqueux, à un pH  de 7, les maxima     caractéristiques    d'absorption dans  l'ultraviolet sont pour     Ei        #m    de 683 à une longueur  d'onde de 274     millimicrons    et de 376 à une .longueur  d'onde de 244     millimicrons.     



       Le    spectre d'absorption dans l'infrarouge de- la       L-6-diazo-5-oxo-norleucine    est remarquable. Quand  on le     détermine        par    la méthode au disque die bro  mure de potassium, le spectre montre des sommets  d'absorption aux longueurs d'onde     suivantes    : 3,19,  3,32, 3,78,     4,6.6,,    6;14, 6,30, 6,59, 6,90, 7,18, 7,39,  7,54, 8,33, 8,66, 8,98, 9,36;     9,71,-    10,08, 10,22,  10,59, 11,65, 12,08, 12,34 et 13,16 microns.  



  La     L-6-diazo-5-oxo-norleucine    possède des pro  priétés     phytotoxiques    bien marquées, et est particu  lièrement utile     comme    herbicide,     destructeur    de mau  vaises herbes et semblables. 5  Elle est également utile du fait     qu'elle    empêche la  biosynthèse, dans les cellules vivantes,, d'acides nu  cléiques essentiels et de précurseurs d'acides nucléi  ques.

   Le produit     exerce    une     action        inhibitrice    sur le  développement de néoplasmes, et pour     cette    raison  est intéressant pour le traitement     de        maladies        néo-          plastiques    chez l'homme et chez     l'animal.    La     L-6-          diazo-5-oxo-norleucine    est     particulièrement    active       contre    les     levures..    Grâce à     cette        particularité;

          elle     peut être     utilisée    pour     l'isolement    de     bactéries,    à par  tir de populations, microbiennes     mixtes    dans     lesquelles     un ou     plusieurs    des composants est une levure.

             Le        procédé        salon    l'invention est     caractérisé    en     ce     que l'on     inocule    avec du     Streptomyces    C-2943 un       milieu        nutritif    aqueux stérile ayant un pH de 5,0 à  8,5 et     contenant    des     sources    convenables de carbone,  azote et sels     minéraux,    on soumet le mélange résul  tant à l'incubation dans des conditions d'aérobie à  une température entre environ 20 et     35o    C,

   on enlève  les matières solides présentes dans le     milieu    de cul  ture et     isole    la     L-6-diazo-5-oxo-norleucine    du     liquide     de     culture    aqueux.  



       Le    Streptomyces C-2943 est un     microorganisme          inconnu    jusqu'à     présent,    qui se trouve dans le sol. Il  a été isolé pour la première fois d'un     échantillon    de  terre     pris    à     Chincha,    Pérou.

   Des cultures de cet or  ganisme vivant ont été     ajoutées    aux     collections    per  manentes du Bureau de Culture de     Parke,    Davis  &   Company, Detroit, Michigan, sous le No 04997, et  aux     collections    de cultures du     Département    de     d'Agri-          culture    des USA,   Fermentation Division,     Northern          Utilization        Research        Branch     ,     Peoria,        Illinois,    USA.  



       On    peut     obtenir    des     cultures    de ce microorga  nisme en     préparant    une suspension dans de l'eau sté  rile d'un     échantillon    de terre le     contenant,    en laissant  les particules plus lourdes se déposer, en étendant la  suspension surnageante résultant, en dilutions en sé  rie, sur des plaques     d'agar    nutritif, en incubant les  plaques à 24-28  C pour     obtenir    des croissances de       microorganismes    et en transplantant des croissances  individuelles choisies, qui ressemblent au Streptomy  ces C-2943 sur des plaques fraîches     d'agar    nutritif.

    Par     un        sélectionnement    répété et une     transplantation     sans     contamination    de croissances     caractéristiques    sur  des plaques fraîches     d'agar        nutritif,    on obtient des  thalles,     constituant    dies cultures pures des     mioroorga-          nismes    cherchés.  



  Le     Streptomyces    C-2943 est un membre aérobie  et     formant    à l'air des spores, de l'ordre des     Actinomy-          cetes    et     appartient    au genre Streptomyces tel     qu'il    est  décrit à la sixième édition du       Manual    of     Determi-          native        Bacteriology      de     Bergey.    Cet organisme a la       caractéristique    suivante:

       quand:        il        est    cultivé sur des       milieux        glucose-tryptone    ou     agar    nutritif, le     myce-          lium    principal de fond est gris à blanc<B>;</B> sur des mi  lieux     asparagine-glycérol    ou glucose     synthétique-agar,          ce        mycelium    est blanc ou légèrement gris à légère  ment     pourpre    ou rouge     clair    à gris<B>;

  </B> sur des     milieux          Czapek    ou de     malate    de     calcium-agar,    il est blanc à  jaune clair ou gris. Sur ces     milieux,    le     mycelium    aé  rien est d'abord blanc, puis     il    passe au gris.

   Quand       cet        organisme    est cultivé sur des     milieux        glucose-tryp-          tone    ou     agas    nutritif, une coloration brun     foncé    ou  noire apparaît dans la couche inférieure, mais quand       il    est     cultivé    dans des milieux     glycérol-asparagine,    de       Czapek    ou     malate    de     calcium-agar,    la     couleur    du       milieu    reste     sensiblement    inchangée.

       Microscopique-          ment,    les hyphes aériens sont longs, d'une     longueur          d'environ    100 à 500 microns.     Il    se produit     dies    em  branchements     primaires    et     parfois:    des secondaires,       ainsi    que des boucles et spirales     terminales.    Les spi  rales varient de longueur et consistent en 2 à 15    tours.

   Les spires sont souvent lâches et     irrégulières.     Les     parties        distales    de     ces    hyphes se subdivisent en  chaînes de spores.  



  Cet organisme liquéfie     lentement    la     gélatine,    en  formant une couleur brun foncé dans     le        milieu,    et       ordinairement    il ne     peptonise    pas le lait de tournesol.

    En     milieu    synthétique     [Pridham    et al., J.     Bacterio-          logy,    58, 108 (1948)]     cet    organisme     utilise    de nom  breuses sources     de    carbone, parmi     lesquelles    le     L-ara-          binose,    la     cellobiose,    la dextrine, le     glucose,    le     D-ga-          lactose,    le glycérol,     l'i-.inosite,        l'inuline,

          le        lactose,        le     lévulose, le maltose, la     D-mannite,    le     D-mannose,    le       mélibiose,    le     raffinose,    le     rhamnose,    l'amidon,     le          sucrose,    le     tétralose    et le     D-xylose    ;

   il     utilise    moins       facilementl'adonite,l'aesculineet    la     salicine,    et pas la       dulcite,    le     melezitose,    et la     D-sorbite.    Cet organisme uti  lise les     sources        organiques    et inorganiques. d'azote.  



  Le procédé selon l'invention est     caractérisé    en     ce     que l'on inocule avec un     champignon    de     l'espèce     Streptomyces C-2943 un     milieu        nutritif    aqueux sté  rile ayant un pH de 5,0 à 8,5 et contenant des sour  ces de carbone et     d'azote    et     des    sels minéraux, en     ce     qu'on soumet le mélange résultant à l'incubation     dans     des conditions d'aérobiose à une     température    entre  20 et     35,1    C,

   en ce qu'on sépare les matières     solides          présentes    dans le milieu de culture et isole la L-6  diazo-5-oxo-norleucine du liquide     die        culture    aqueux.  



  Pour     l'inoculation,    on peut employer des,     spores     ou     eonidies.    de Streptomyces C-2943,     ainsi    que des  suspensions     aqueuses    de     ceux-ci    contenant une faible  quantité de savon ou autre agent mouillant. Pour des  fermentations en grand, il est préférable     d'utiliser    des  cultures jeunes et vigoureuses du     Streptomyces     C-2943, plutôt que des spores ou     conidies    ou des sus  pensions aqueuses de ceux-ci.  



       Des    milieux nutritifs aqueux qui     conviennent    sont  ceux dont le pH est entre 5,0 et 8,5 et qui contien  nent des sources de carbone et d'azote, ainsi que     des          sels        inorganiques.    Comme     sources    de carbone et  d'azote, il y a entre autres la     farine    de       tourteau    de soya, la poudre de gluten de  froment, la levure de     brasserie,    l'estomac de  porc (extrait au sel), les     hydrolysats    de protéines  de viande,

   les     produits    solubles     de    distilleries et les       corps    solides de macération de     grains.    Diverses com  binaisons de     ces        sources    de carbone et     d'azote    avec  d'autres matières azotées, telles qu'un mélange de  farine de     tourteau    de soya, de caséine hydrolysée à  l'acide et de     levures    débarrassées     des        substances    amè  res, un mélange d'estomac de porc (extrait au     sel)    et  de peptone de soya,

   et un mélange de     farine    de tour  teau de soya et de caséine     hydrolysée    à     -l'acide,    ont  été trouvées aussi propres à donner des résultats par  ticulièrement bons. La     concentration    optimum de     ces          ingrédients        est        comprise        entre        1,

  5        et    2     %        du        poids     total du     milieu.    La     source    de carbone peut n'être       composée    que des     substances        susmentionnées,    mais  les meilleurs résultats sont obtenus quand on ajoute  au milieu du     glucose    ou du     galactose.    La concentra  tion en     glucose    ou galactose peut varier de 0 à 2 %.

        Des     concentrations    supérieures à 2 0/0 paraissent  avoir un effet défavorable sur le     rendement    en le pro  duit cherché. Comme     sels    inorganiques, on peut em  ployer le chlorure de sodium, le     chlorure    d'ammo  nium, le nitrate     d'ammonium,    le chlorure de     potas-          sium,    le carbonate de calcium, etc. Les sels d'ammo  nium tels que le     chlorure    et le nitrate d'ammonium       sont    des constituants particulièrement avantageux et  conduisent à de hauts rendements en le produit cher  ché.

   La     concentration    maximum de ces sels.     d7ammo-          nium        est        entre        0,1        et        0,5        -%        du        milieu        nutritif.     



  La     culture    du Streptomyces C-2943 en milieu  nutritif aqueux peut être effectuée de diverses ma  nières.     Par    exemple, le     microorganisme    peut être cul  tivé dans     des    conditions d'aérobie à la surface     d'a     milieu, ou     i1    peut être cultivé au-dessous de la surface  du milieu, c'est-à-dire à l'état submergé, à condition  que l'on     fournisse    simultanément de l'oxygène.  



  Dans la     méthode    préférée pour produire la     Lr6-          diazo-5-oxo-norleucine    par fermentation sur une  large échelle, on     emploie    des cultures submergées ou  en     profondeur    de Streptomyces C-2943.

   Dans     cette          manière        d'effectuer    la     fermentation,    on     inocule    un       milieu    nutritif aqueux stérile avec du     Streptomyces     C-2943 et le soumet à l'incubation avec agitation et  aération à une     température        entre        environ    20 et     35     C,  de préférence au voisinage de 23-29  C, jusqu'à pro  duction d'une concentration maximum de     L-6-diazo-          5-oxo-norleucine    dans le liquide de culture.

       Le    temps  requis pour cette production maximum de     L-6-diazo-          5-oxo-norleucinc    varie     avec    les dimensions et le genre  de l'équipement employé. Par exemple, dans les fer  mentations industrielles sur     une    large     échelle,    telles  qu'on les effectue dans les appareils de fermentation  du genre à réservoir, la     production    maximum de     L-          6-diazo-5-oxo-norleucine    est atteinte     en        environ    32  heures ou moins.

   Quand on emploie     des        ballons        se-          coueurs    pour la culture, le temps de production maxi  mum peut être plus long, soit     de        trois    à huit jours,  que     celui    requis pour les cuves de     fermentation    sur  une grande     échelle.    Dans les     conditions    de     culture     submergée, le microorganisme se     développe    en parti  cules plus ou moins séparées, dispersées dans tout le  milieu     nutritif,

      ce qui contraste avec la pellicule plus  ou moins     continue    présente à la     surface    du     milieu     dans le     procédé    de culture en     surface.    Grâce à     cette     distribution de l'organisme dans le milieu, on peut  cultiver en une seule fois de grands volumes du mi  lieu nutritif inoculé dans les grands réservoirs ou  cuves employés ordinairement dans     l'industrie    de la  fermentation.

       Des        appareils    de fermentation à cuve  stationnaire, munis de dispositifs convenables d'agita  tion     et/ou    d'aération, de même que des appareils à  tambour horizontal, ont été trouvés     particulièrement     utilisables sous     ce    rapport. En revanche, pour la pré  paration de faibles quantités de l'antibiotique ou de  cultures du microorganisme, le procédé par culture  submergée peut être exécuté dans de petits ballons  ou vases qui peuvent être -secoués ou agités par des  moyens mécaniques. convenables.    L'agitation et l'aération de la culture peuvent être       réalisées    de diverses manières.

   L'agitation peut être       produite    par des turbines, des pales, des     propulseurs     ou     autres    dispositifs d'agitation     mécaniques.,    en fai  sant tourner ou en     secouant    le récipient de     fermenta-          tion    lui-même, par     divers        dispositifs    de pompage ou  par passage d'air ou autre gaz contenant de l'oxygène  à travers le milieu.

   L'aération peut être effectuée en       injectant    de l'air ou autre gaz contenant de l'oxygène  dans le mélange en fermentation par des tuyaux  ouverts, par des. tuyaux perforés, à     l'aide    de moyens  de     diffusion    poreux     tels    que des     bougies    de charbon,  de carborundum, de verre aggloméré, etc. ; elle peut  aussi être     effectuée    par     projection    ou     écoulement    de  la masse dans ou à travers une     atmosphère    contenant  de l'oxygène.  



  Selon la méthode de culture en     surface    pour la  production de     L-6-diazo-5-oxo-norleucine,    .on inocule  une couche peu profonde, en général de moins de  2 cm, d'un     milieu    nutritif     stérile    aqueux, avec     du          Streptomyces    C-2943 et soumet le mélange à l'incu  bation dans des conditions d'aérobie à une tempéra  ture d'environ     20-350    C, de préférence     dans    le voisi  nage de 23-290 C.

   Il faut en général un temps     d7incu-          bation    plus long que pour la culture en     profondeur     pour     obtenir    la production     maximum    de     L-6-d#iazo-5-          oxo-norleucine.    En. général, cette période d'incube  tion dure environ trois à huit jours.  



  Lorsque la phase<B>de</B>     fermentation    est     terminée,    la  matière solide est     enlevée    du     liquide    de culture, par  exemple par     filtratiôn,    centrifugation, etc.     Le    liquide  résultant qui contient la     L-6-diazo-5-oxo-norleucine     possède les propriétés désirées     d'inhibition    des néo  plasmes..

   Cependant, pour les résultats optimums, on       traite    le liquide pour isoler la     L-6-diazo-5-oxo-nor-          leucine    sous     forme        concentrée    ou     cristalline.    Une  méthode qui convient pour isoler le produit consiste  à concentrer à un faible     volume    le     liquide    de culture       clarifié,    par     exemple    jusqu'à     1/5        -1/2o    de son volume       original,

      à     ajouter        environ    3 à 10 volumes     d'un    sol  vant organique miscible à l'eau,     tel    que le     méthanol     ou     l'éthanol,    à séparer de la solution les impuretés  qui ont précipité, à     soumettre    la solution purifiée à  une adsorption et une     élution    avec un.

   adsorbant  pour la     L,6-diazo-5-oxo-norleucine    et à récupérer le  produit de     l'éluat.    Scion une autre     méthode    qui con  vient, on concentre à siccité le     liquide    de culture cla  rifié, on extrait le produit résiduaire avec un solvant  organique miscible à l'eau et     contenant    moins.

   de       50        %        d'eau,        on        soumet        l'extrait    à     une        adsorption        et          élution    avec un adsorbant pour la     L-6-diazo-5-oxo-          norleucine    et récupère le produit de     l'éluat.    L'adsorp  tion est     effectuée    en faisant passer la solution     diluée     ou l'extrait mentionné à     travers    une     colonne    d'ad  sorption 

      contenant    un adsorbant neutre ayant un pH  ou ajusté à     un    pH     d'environ    5 à 8, de     préférence    6  à 8. Des     exemples    d'un tel adsorbant sont     l'alumine     et l'alumine de     Brockmann.    Le produit est     élué   <B>da</B>  l'adsorbant     avec    de l'eau ou une solution     aqueuse     d'un solvant organique miscible à l'eau.

       L'éluat    est           recueilli    en fractions, et les fractions montrant la plus       forte        absorption    dans l'ultraviolet à     une    longueur  d'onde de 275     millimicrons    environ, sont séchées. Vu  la nature instable du produit aux températures éle  vées, il est préférable d'enlever le     diluant    en con  gelant     l'éluat    et soumettant la masse congelée à un  vide élevé.     Le    produit peut être encore     purifié    par       adsorption    et     élution    en employant du charbon activé.

    A ces fins, le produit sec préparé comme décrit     ci-          dessus,    est dissous     dans    une petite quantité d'eau  contenant une faible     proportion    de solvant     organique     miscible à l'eau, le pH de la solution est ajusté à 6-7,  si     nécessaire,    et on fait passer la solution à travers  une colonne     d'adsorption        contenant    du charbon ac  tivé, et     produit        l'élution    de la colonne avec de l'eau.  contenant une faible proportion d'un     solvant    organi  que miscible à l'eau, de préférence de l'acétone.

   Pour  faire la solution pour l'opération     d'adsorption,    on  peut employer de l'eau contenant une faible propor  tion d'un solvant     organique    tel que l'acétone, le       méthanol,    l'éthanol, le phénol et semblables.

   De pré  férence, on emploie de l'eau contenant environ 1 0/0  d'acétone, et utilise     suffisamment    de solvant pour  avoir une solution contenant environ 2 à 10 mg de       L-6-diazo-5-oxo-norleucine    par     millilitre.    La quan  tité de charbon activé     nécessaire    pour adsorber tout  le produit cherché de la solution varie avec la con  centration du produit sec en     L-6-diazo-5-oxo-norleu-          cine.    Par exemple un produit     donnant    à l'essai 5 %  de cette     substance    requiert environ 15 grammes de  charbon activé par     gramme.    On obtient les     meilleurs   

    résultats quand le charbon activé a été préalablement  mélangé avec de la terre de diatomées, cette dernière  aidant à maintenir une vitesse     d'écoulement    satisfai  sante. Après l'adsorption, la colonne est     éluée    par  lavage avec un     éluant    convenable     tel    que     de    l'eau  contenant moins de 25 % d'un solvant organique  miscible à l'eau.

   Les meilleurs résultats sont obtenus  en employant une solution aqueuse d'acétone à 1     u/o.          L'éluat    est recueilli en fractions et les fractions mon  trant la plus forte absorption dans. l'ultraviolet à  une longueur d'onde d'environ 275     millimicrons    sont  séchées à partir de l'état congelé. Si on le désire, le  produit sec ainsi obtenu peut encore être traité par  recristallisation     dans    un     solvant    convenable tel que  le méthanol aqueux, l'éthanol aqueux et semblables.

    Le produit est identique sous tous les     rapports    à la  substance produite par synthèse     chimique.       <I>Exemple 1</I>  On met 300 ml d'un milieu nutritif     de    la compo  sition suivante  
EMI0004.0049     
  
    Pour <SEP> cent
<tb>  Maltose <SEP> ........................ <SEP> 1,0
<tb>  Résidu <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> butanol-acétone <SEP> 0,5
<tb>  Caséine <SEP> hydrolysée <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> <B>........</B> <SEP> 0,5
<tb>  Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>............</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb>  Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>..............</B> <SEP> 0,5
<tb>  Eau <SEP> en <SEP> suffisance <SEP> pour <SEP> faire <SEP> <B>.....</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> .

   <SEP> 100,0       dans chacun de deux     flacons        d'Erlenmeyer    de 1 litre,  et le pH est ajusté à 7,5 avec de     l'hydroxyde    de so  dium 6 N. Le milieu nutritif es     stérilisé    en chauffant  les     flacons    à 1200 C pendant 25 minutes. On refroi  dit le milieu et inocule chacun des deux     flacons    avec  2 ml d'une suspension, dans 40 ml d'une solution sté  rile de savon de Castille à 0,01      /o    de spores.     de    qua  tre     cultures    en pente sur     agar        (glucose-tryptonessels     minéraux) de Streptomyces C-2943.

   Les     flacons    sont  maintenus à la     température    ordinaire (24-26  C) pen  dant 90 heures avec agitation produite par des     se-          coueurs    mécaniques qui font tourner les     flacons    à  160 tours par minute dans un cercle de 6 cm de dia  mètre.

   Le liquide de culture contient     alors    approxi  mativement 1 mg de     L-6-diazo-5-oxo-norleucine,    la  détermination étant faite par des     essais    de     diffusion     sur plaques-disques     d'agar,    dans lesquels on mesure  l'étendue de l'inhibition du développement de la le  vure     Torulopsis        albida    N R R L Y 1400. Le     liquide     de culture est filtré et le produit cherché, la L-6  diazo-5-oxo-norleucine, est isolé du     filtrat    par les  méthodes d'adsorption et     élution    décrites en détail  ci-après.

      <I>Exemple 2</I>  On place 12 litres d'un milieu ayant la composi  tion     suivante     
EMI0004.0077     
  
    Pour <SEP> cent
<tb>  Glucose <SEP> monohydraté <SEP> <B>----- <SEP> ....</B> <SEP> 2,0
<tb>  Farine <SEP> de <SEP> tourteau <SEP> de <SEP> soya <SEP> <B>........</B> <SEP> 1,0
<tb>  Estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> (extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb>  Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> .......... <SEP> 0,167
<tb>  Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>............</B> <SEP> 0,5
<tb>  Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>......</B> <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb>  Eau <SEP> en <SEP> suffisance <SEP> pour <SEP> faire <SEP> . <SEP> .

   <SEP> <B>....</B> <SEP> 100,0
<tb>  Hydroxyde <SEP> de <SEP> sodium <SEP> (10 <SEP> N) <SEP> en <SEP> suf  fisance <SEP> pour <SEP> porter <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,5       dans un récipient de fermentation en verre de 30 li  tres, muni     d'accessoires    en acier inoxydable compre  nant distributeur, propulseur, chicanes et tube de  prise d'échantillons et le milieu est stérilisé par chauf  fage à     1211,    C pendant 2 heures. Le pH du milieu  après     stérilisation    est de 7,8.

   On refroidit le milieu et  on l'inocule avec une suspension, dans 10 ml     d'une     solution stérile     d'heptadécyl-sulfate    de     sodium    à       0,1        %        de        spores        d'une        culture        en        pente        sur        agar        (glu-          cose-tryptone-sels    minéraux)

  <B>de</B>     StreptomycesC-2943.     Le milieu inoculé est     incubé    à 25-260 C pendant 72  heures pendant lesquelles le milieu est agité à 225  tours par     minute    et pendant lesquels on fait passer  de l'air stérile à travers le milieu à raison de 12 litres  par minute. Pendant l'incubation, on ajoute pour  contrôler la formation de mousse, 98 ml d'un mé  lange stérilisé de graisse de porc crue et d'huiles       minérales    contenant des mono- et     diglycérides.    La  culture incubée ainsi obtenue est     employée    pour ino  culer     les    cultures en grand, comme décrit ci-après.  



       Quatre    récipients de fermentation de 30 litres,  contenant chacun 16     litres    du milieu décrit ci-dessus,  sont     stérilisés    à     1211,    C pendant 2 heures, :le pH après      stérilisation étant de 7,6.<I>On</I> laisse     refroidir    à la  température ordinaire les     récipients    contenant le mi  lieu stérile puis on introduit dans chaque récipient  une portion de 800 ml de la culture     incubée    d'écrite  ci-dessus, et on soumet les milieux     inoculés    à l'incu  bation à 25-260 C pendant 40 heures.

   Pendant     cette     période d'incubation, on fait arriver de l'air par un       distributeur    à raison de 16 litres à la     minute    et pro  duit une agitation par un propulseur tournant à 200  tours par minute. Durant l'incubation, on ajoute  30 ml du     mélange        stérilisé    de graisse de porc et d'hui  les     minérales    mentionné ci-dessus, à chaque     récipient     de fermentation, selon besoin pour contrôler la for  mation de mousse.

   La concentration en     L-6-diazo-5-          oxo-norleucine    dans les milieux de fermentation  après incubation est d'approximativement 37     micro-          grammes    par     ml.     



  Les matières solides     présentes    dans les     milieux    de  fermentation incubés, sont     enlevées    par mélange avec  1     %        de        terre        de        diatomées        et        filtration.        La        matière     filtrée possède l'activité biologique désirée ;

   ainsi, une  injection     intrapéritonéale        journalière    de 0,1 ml de ce  filtrat pendant cinq jours inhibe totalement la crois  sance de tumeurs de     Sarcoma    180     implantées    dans  des souris.  



       Le    gâteau de     filtre    est lavé avec de l'eau et le  filtrat et les eaux de lavage sont     combines    (41,5  litres) et concentrés dans le vide à un volume de  1920     ml.    On ajoute de l'éthanol au     concentrai   <B>da</B>  façon à porter le volume à 19,2 litres; le     précipité     qui se forme est enlevé par filtration et le     gâteau    de  filtre est lavé avec de l'éthanol. Le filtrat     -alcoolique     (pH 6,5) est fait passer à travers une colonne     d7ad-          sorption    préparée comme décrit ci-dessous.  



  2,3 kg d'alumine sont agités avec de l'acide chlor  hydrique     dilué    de telle     sorbe    que le pH reste constant  à 6,4. L'alumine est retirée, lavée avec de l'eau et  activée par chauffage à 200  C pendant 4 heures..  L'alumine est remuée avec de l'éthanol aqueux à       90        %        et        entassée        dans        une        colonne        de        10        cm        de        dia-          mètre    (volume. retenu 2300 ml;

   taux     d'écoulement     par gravité 5 litres à l'heure).  



  On fait passer le filtrat     alcoolique    préparé ci  dessus dans la colonne d'adsorption, puis la colonne  est lavée     successivement    avec 1,9 litre     d"éthanol          aqueux    à     90        %        et        12,1        litres        d'éthanol        aqueux    à  75 0/0. Le     percolatum    est mis de côté.

   La     colonne     est alors     éluée    avec 18 litres d'éthanol aqueux à       25        %        et        l'éluat        est        recueilli        en        fractions        de    1     litre.     Les cinq premières fractions     d'éluat    sont     concentrées     d'ans le vide et le concentre est séché à l'état con  gelé sous un vide poussé.

   Le produit séché possède       l'activité    biologique cherchée ; par exemple l'injection       intrapéritonéale    deux fois par jour pendant cinq jours,  de 0,5 ml d'une solution     aqueuse    de ce produit (300  gamma par ml) empêche totalement la croissance de  tumeurs de     Sarcoma    180 implantées dans des souris.  



  8,5 grammes de cette substance sèche, donnant  à     l'essai        approximativement        4'%        de        L-6-diazo-5-oxo-          norleucine,    sont dissous dans 120 ml d'acétone         aqueuse    à 1     %        (pH        6,2).        On        prépare        une        colonne          d'adsorption    en ajoutant un mélange de 125 g de  charbon activé et 125 g de terre de     diatomées,

      dans       une        solution    à 1     %        d'acétone        dans        l'eau,        le        diamètre     de la colonne étant de 6,5 cm (volume retenu  800 ml ; taux d'écoulement par gravité, 750 ml par  heure).

   On fait passer la solution aqueuse contenant  la     L-6-diazo-5-oxo-norleucine    à travers la colonne,  puis on lave celle-ci avec 4,8 litres d'une solution       d'acétone    à     1%.        L'éluat        est        recueilli        en        fractions     de 100 ml. Les fractions de la quinzième à la     vingt-          troisième    inclusivement sont concentrées et le con  centrai est séché à l'état congelé sous un vide poussé.

         Lamatière    sèche est dissoute dans du méthanol aqueux  chaud à 90'0/0 et la solution est     maintenue    à 50 C  pendant plusieurs heures. La     L-6-diazo-5-oxo-norleu-          cine    qui se sépare en cristaux est recueillie et séchée  dans le vide ;

   El      @m    = 643 à 274,5     millimicrons.       <I>Exemple 3:</I>  a)     On    introduit 150     ml    d'un     milieu    nutritif ayant  la composition suivante  
EMI0005.0132     
  
    Pour <SEP> cent
<tb>  Glucose <SEP> monohydraté <SEP> <B>............</B> <SEP> 2,0
<tb>  Farine <SEP> de <SEP> tourteau <SEP> <B>d</B>e <SEP> soya <SEP> <B>........</B> <SEP> 1,0
<tb>  Extrait <SEP> salin <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> <B>....</B> <SEP> 0,5
<tb>  Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ..........

   <SEP> 0,167
<tb>  Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>............</B> <SEP> 0,5
<tb>  Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>............</B> <SEP> 0,5
<tb>  Eau <SEP> en <SEP> suffisance <SEP> pour <SEP> donner <SEP> <B>....</B> <SEP> 100;0
<tb>  Hydroxyde <SEP> de <SEP> sodium <SEP> (10 <SEP> N) <SEP> en <SEP> suf  fisance <SEP> pour <SEP> porter <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,5       dans un     flacon        d'Erlenmeyer    de 1 litre.

   Ce     milieu     nutritif est alors     stérilisé    en chauffant le     flacon    à  1210 C pendant     1/2    heure, puis il est refroidi et  inoculé avec 5 ml d'une suspension, dans 10     ml    d'une  solution stérile de     heptadécyl-sulfate    de sodium à       0,

  1        %        de        spores        provenant        d'une        culture        en        pente     sur     agar        (glucose-tryptone-sels    minéraux)

   de     Strepto-          mycesC-2943.        Le        flacon    est soumis à     l'incubation    à       26     C     pendant    72 heures en l'agitant au moyen d'un       secoueur        mécanique    le faisant tourner à 160 tours  par minute dans. un cercle de 60 mm<B>de</B>     .diamètre.    La  culture incubée     ainsi    obtenue est utilisée pour inocu  ler le milieu de 67,5 litres décrit en b) ci-après.  



  b) 67,5 litres d'un     milieu        nutritif    ayant la compo  sition ci-dessus indiquée     en    a) sont placés dans un  récipient de fermentation en     acier    inoxydable de 135  litres, et le     milieu    est     stérilisé    par chauffage à 1210 C  pendant 1 heure. Le pH du     milieu    après     stérilisation     est de 6,9. Le     milieu    est refroidi et inoculé     avec    90m1  de la culture     incubée    décrite ci-dessus.

   Le     milieu    ino  culé est soumis à     l'incubation    à 260 C pendant 24  heures. Pendant ce temps, on introduit de     l'air        stérile     dans     ce        milieu    à travers un distributeur à raison de  96 litres.

   par minute, et le mélange est agité à l'aide  d'un propulseur à 200 tours par     minute.    La culture  incubée de Streptomyces C-2943 ainsi obtenue est       utilisée    pour inoculer 675     litres    du     milieu        décrit    en c)       ci-dessous.         c) 675     litres    d'un milieu nutritif     ayant    la compo  sition     décrite    en a) ci-dessus sont placés dans un réci  pient de fermentation de 900     litres,        en    acier inoxyda  ble,

   et sont     stérilisés    par chauffage à 1210 C pendant  1     heure.    Le pH du milieu après     stérilisation    est     de     6,7.     Le        milieu    est     refroidi    et inoculé avec 67,5 litres  de la     culture    incubée décrite en b) ci-dessus.

       Le    mi  lieu de culture est incubé à     27()    C     pendant    27 heures  durant lesquelles on introduit de l'air     stérile    dans le  mélange à travers un distributeur à     raison    de 700       litres    à la minute, tout en agitant     le    mélange à     l'aide     d'un propulseur tournant à 200 tours par minute. En  vue de contrôler la formation de mousse, on ajoute  de     temps    en temps, selon besoin, 2,4 litres d'un mé  lange stérile de graisse de porc brute et d'huiles miné  rales     contenant    des mono- et     diglycérides.     



       Les-matières        solides    contenues dans le mélange  incubé sont enlevées par filtration à travers un     filtre-          presse    à plateaux et châssis revêtu préalablement de  terre de diatomées, puis le filtrat est concentré sous  pression     réduite    à un volume     d'environ    36     litres,.    Le       concentrat    est mélangé avec 324 litres d'éthanol, et  le     précipité    qui se forme est enlevé par     filtration    et  rejeté.  



  d) On fait passer une portion (214 litres) du fil  trat     éthanolique    (volume total 344 litres ; pH 5,9) à  travers une colonne d'adsorption préparée de la ma  nière su     ivan:te    : on agite avec de l'acide chlorhydri  que dilué 6,75 kg d'alumine, de telle manière que le  pH reste     constant    à 6,0. L'alumine est filtrée, lavée  avec de l'eau     déionisée,    puis activée par chauffage à  2000 C pendant 4 heures.

   L'alumine est     remuée    avec  de l'éthanol aqueux à 90     p/o    et entassée dans une  colonne de 1,8 m ayant un diamètre de 15 cm (vo  lume retenu 21,15     litres    : vitesse d'écoulement 40,5  litres à l'heure sous une pression de 845     g/cm2).     



  Le filtrat     alcoolique    préparé ci-dessus est     percolé     à travers la     colonne    d'adsorption sous une pression       absolue    de     845g/cmY,    puis la     colonne    est     lavéesucces-          sivement        avec        21,15        litres        d'éthanol        aqueux    à     90        %     et 142,6 litres d'éthanol aqueux à 75 0/0.

   La colonne  est ensuite     éluée    avec 128,2 litres     d'éthanol    aqueux  à     25        %,        et        l'éluat        est        recueilli        en        fractions        de        10a8        li-          tres.    Les quatrième, cinquième et sixième     fractions     sont     combinées,    concentrées dans le vide à 350 C, et  le concentrai est séché à l'état congelé sous un vide  poussé.  



  e) La     portion        restante   <B>(130</B> litres) dû     filtrat        étha-          nolique    de c) est     chromatographiée    sur 13 kg d'alu  mine, de la façon décrite en d) ci-dessus, et     l'éluat     est concentré et séché à l'état congelé.  



  Les poudres sèches de d) et e) sont combinées.  Le produit ainsi obtenu contient 2,16 g de     L-6-diazo-          5-oxo-norleucine.    Ce produit est purifié par adsorp  tion et     élution    de la façon suivante : une boue de  780 g de charbon activé et 780 g de terre de     diato-          mées        dans        une        solution        aqueuse        d'acétone    à     1%        est     placée dans une colonne de 1,5 m, ayant un diamètre  de 10 cm.     Le    lit formé d'adsorbant a 55 cm de hau  teur ;

   il a un volume retenu de 4 litres, et un taux    d'écoulement par gravité de 1,75 litre à l'heure avec  une pression de 950 mm. Le produit est dissous dans  858 ml de solution aqueuse d'acétone à 1 0/0, et on  fait passer la solution à travers la colonne. Celle-ci       est        éluée        avec        20        litres        d'une        solution    à 1     %        d'acé-          tone    dans l'eau. On recueille des fractions de 500 ml  chacune.

   Les fractions de la     17f'me    à la     20Ème    inclu  sivement sont combinées et concentrées dans le vide.  Le     concentrat    est congelé et la glace en est sublimée  sous un vide poussé. Le produit, la     L-6-diazo-5-oxo-          norleucine,    est recristallisé dans du méthanol aqueux  à     90'%    ;     Ei l-rl        =        676    à     274        millimicrons.        Le        pro-          duit    cristallin possède l'activité biologique désirée ;

    par exemple une injection journalière     intrapéritonéale     d'une solution aqueuse du produit (0,25 mg/kg) pen  dant cinq jours inhibe complètement le développe  ment de tumeurs de     Sarcoma    180 implantées dans  les souris.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation de L-6-diazo-5-oxo-nor- leucine, caractérisé en ce que l'on inocule avec un champignon de l'espèce Streptomyces C-2943 un mi lieu nutritif aqueux stérile ayant un pH de 5,0 à 8,5 et contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux, en ce qu'on soumet le mélange résul tant à l'incubation dans des conditions d'aérobiose à une température entre 20 et 350 C, en ce qu'on sépare les matières solides présentes dans le milieu de culture et isole la L-6-diazo-5-oxo-norleucine du liquide de culture aqueux. SOUS-REVENDICATIONS 1.

   Procédé selon la revendication, dans lequel le milieu inoculé est incubé dans des conditions d'aéro biose submergée à une température entre 23 et 290 C. 2.

   Procédé selona la sous-revendication 1, carac térisé en ce que le milieu nutritif contient de la farine de tourteau de soya, de la farine de gluten de blé, de la levure de brasserie, un extrait salin d'estomac de porc, un hydrolysas de protéine de viande, des solu bles de distilleries, des liqueurs de macération die grains, de la peptone de soya et/ou de la caséine hydrolysée en une quantité allant de 1,

   5 à 2% en poids. 3. Procédé selon la sous-revendication 2, dans lequel le milieu nutritif contient moins de 2 % de glucose et/ou de galactose, et de 0,1 à 0,

   5% d'un sel inorganique d'ammonium. 4. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que, pour isoler la L-6-diazo-5--oxo-norleucine du liquide de culture, on concentre le liquide de culture, à un faible volume, on ajoute au liquide concentré un solvant organique miscible à l'eau, on sépare les impuretés précipitées, et on soumet la solution rési duaire à une adsorption et élution. 5.

   Procédé selon la sous-revendication 4, caracté risé en ce que, pour isoler la L-6-d'iazo-5-oxo-nor- leucine, on concentre le liquide- de culture jusqu'à un cinquième à un vingtième de son volume original, on ajoute trois, à dix volumes d'un solvant organiquemis- cible à l'eau, on sépare les impuretés précipitées, on met en contact la solution résiduaire avec <B>de</B> l'alu mine ayant un pH entre 5 et 8 de façon à produire l'adsorption de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine,

   on élue la L-6-d'iazo-5-oxo-norleucine adsorbée avec de l'eau ou une solution aqueuse d'un solvant organique miscible à l'eau et on élimine l'éluant de la portion fractionnaire de l'éluat qui contient la L-6-diazo-5- oxo-norleucine. 6. Procédé selon la sous-revendication 5, dans lequel l'éluant est l'éthanol aqueux. 7.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que, pour isoler la L-6-diazo-5-oxo-norleucine, on concentre ce liquide de culture jusqu'à un cinquième à un vingtième de son volume original, on ajoute trois à dix volumes d'un solvant organique miscible à l'eau, on sépare les impuretés précipitées, on met en con tact la solution résiduaire avec de l'alumine ayant un pH de 5 à 8 de façon à produire l'adsorption de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine,

   on élue la L-6-diazo-5- oxo-norleucine adsorbée avec de l'eau ou une solu- tion aqueuse d'un solvant organique miscible à l'eau, on enlève l'éluant de l'éluat contenant la L-6-di=o- 5-oxo-norleucine,

   on forme une solution diluée de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine ainsi obtenue dans de l'eau contenant une faible proportion d'un solvant organique miscible à l'eau, on ajuste le pH de la solution à 6-7,

   on met en contact cette solution avec du charbon activé de façon à produire l'adsorption de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine,

   on élue cette dernière substance avec de l'eau contenant moins de 25 % d'un solvant organique miscible à l'eau, et on éli mine l'éluant de l'éluat contenant la L-6-diazo-5- oxo-norleucine. 8.

   Procédé selon la sous-revendication 7, dans lequel l'élution hors de l'alumine est effectuée avec de l'éthanol aqueux, et l'élution hors du charbon est effectuée avec de l'acétone aqueuse.