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La présente invention concerne un perfectionnement au procédé de' préparation des spiramycines II et III.
On sait que la. spiramycine, antibiotique composé de trois constituants de propriétés très voisines, les spiramycines I, II et III, est produite par la culture d'un Streptomyces : S. ambofacines (dont un specimen a été déposé au NRRL à Péoria, Illinois, Etats-Unis d'Amérique, où il a été affecté de l'indicatif NRRL 2420), ou de ses mutants, dans des milieux de culture appropriés.
La constitution exacte de ces spiramycines n'est pas encore connue avec certitude, mais on sait (PAUL & TCHELITSCHEFF- Bull. Soc. Chim. France, p. 443, 197) que les spiramycines II et
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III sont respectivement les dérivés acétylé et propionylé de la spiramycine I. On sait aussi que les spiramycines II et III peuvent être cristallisées, ce qui peut faciliter leur purification et constitue un avantage important pour 1'emploi pharmaceutique.
Un second avantage des spiramycines II et III est la toxicité moindre de ces formes de spiramycines,, ainsi qu'il ressort du tableau suivant où figurent les doses (exprimées en g/kg) des trois spiramycines qui provoquent la mort de 50% des souris trai- tées par voie sous-cutanée (DL50g/kg s.c.) .
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Produits <SEP> DL50(g/kg <SEP> s.c.)
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<tb> Spiramycine <SEP> 1 <SEP> 1,01
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<tb> Spiramycine <SEP> II <SEP> 1,52
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<tb> Spiramycine <SEP> III <SEP> 2,04
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Enfin l'activité antimicrobienne in vitro et in vivo des spiramycines II et III est au moins égale à celle de la spiramy- cine I.
On a déjà montré que, par des conditions particulières de fermentation, notamment par des modifications dans la composition des milieux de culture, on pouvait agir sur la proportion des trois spiramycines présentes dans le produit élaboré par les Streptomyces ambofaciens NRRL 2420. Cependant avec les milieux habituels utilisés pour la préparation de la spiraraycine., que ce soient des milieux à base de substances complexes mal définies ou des milieux purement synthétiques, la teneur en spiramycine I de la spiramycine produite reste assez importante. Il en résulte que l'obtention de spiramycines
II et III exemptes de spiramycine I est assez difficile et se fait avec un rendement peu satisfaisant.
On a trouvé, et c'est l'objet de la présente invention, qu'en opérant dans des conditions appropriées on pouvait orienter 'la fermentation de S. ambofaciens ou de ses mutants de telle sorte qu'on obtienne un accroissement considérable de la spiramycine II @
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et/ou de la spiramycine III dans la spiramycine totale élaborée par le microorganisme : cette quantité pouvant atteindre par exemple dans le cas de la spiramycine III jusqu'à 75 à 80% en poids de la spiramycine totale. On a trouvé également que ce même S. ambofa- ciens ou ses mutants était capable de transformer la spiramycine I en spiramycine II et en spiramycine III par un processus enzymatique d'acétylation ou de propionylation; dans ce cas la transformation de la spiramycine I peut être totale dans les meilleures conditions.
Ces résultats sont obtenus essentiellement en effectuant la fermentation (fermentation en milieu habituel, complexe ou synthétique ou fermentation sur milieu contenant de la spiramycine I). en présence, d'un agent d'acétylation ou de propionylation suivant que l'on veut obtenir de la spiramycine II ou de la spiramycine III:
Comme agents d'acétylation on peut utiliser l'acide acétique, ses sels, ses esters, l'acétamide. On peut également utili-, ser tout composé susceptible de donner naissance, après transforma- tion par S. ambofaciens, à un radical acétylé comme par exemple l'acide butyrique et ses dérivés. Pour des raisons de commodité on emploie de préférence l'acide acétique ou l'acétate de sodium à une concentration comprise entre 0,1 et 30 g/1 dans le milieu de transformation.
Comme agents de propionylation on peut utiliser l'acide propionique, ses .sels, ses esters, la propionamide, le propanol- On peut également utiliser tout composé susceptible de donner naissance, après son métabolisme par S.ambofaciens, à un radical . propionyle, comme l'acide valérianique ou ses sels. Pour des raisons de simplicité on emploie par exemple de préférence l'acide propioni- que ou ses sels ou la propionamide à une concentration comprise entre 0,1 et 30 g/1 dans le milieu,la concentration optimum étant au voisinage de 2-15 g/1. Suivant les besoins on peut ajouter l'a- gent acylant en solution dans l'eau ou dans un solvant organique comme le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzène, l'éther, le dichloréthane.
Un peut également fractionner en plusieurs additions successives la quantité d'agent acylant à ajouter, sans qu'il en
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résulte des modifications Importantes de la transformation récherchée
Bans le cas de milieux habituels complexes ou synthéti- ques la fermentation ne présente pas de difficultés et est conduite normalement
Dans le cas d'un milieu contenant de la spiramycine I il a fallu préciser les différents facteurs qui favorisent la transformation biochimique de la spiramycine I en spiramycine II ou III et réaliser cette transformation d'une manière pratique. II faut en particulier cultiver S. ambofaciens dans des conditions qui permettent à la fois son développement et l'élaboration du système enzymatique.
Il convient aussi d'utiliser la capacité transformatrice acquise par la culture en se plaçant dans les conditions requises pour la transformation recherchée.
A cette fin, on peut cultiver S. ambofaciens dans un milieu de culture renfermant dès le départ la spiramycine I à transformer ainsi que tous les facteurs nécessaires à la production du système enzymatique et à la transformation, par ce système, de la spiramycine I présente en spiramycine II et III. Mais il a été trouvé particulièrement avantageux, pour réaliser la présente inven- tion, de cultiver dans une première phase S. ambofaciens dans des conditions telles qu'il élabore le système enzymatique acylant.
Dans une deuxième phase, on u tilise la capacité transformatrice acquise par le champignon en mettant son mycélium en présence de la spiramycine I et des éléments nécessaires à la transformation: substances susceptibles de fournir des radicaux acétyle ou propiony- le et les activateurs.
La culture de S.ambofaciens en vue de l'élaboration du système enzymatique acylant peut être effectuée sur des milieux très divers, en particulier sur les milieux qui sont utilisés habituelle- ment pour la préparation de la spiramycine :milieux complexes ou milieux synthétiques. Cependant'la quantité et la qualité du système enzymatique acylant peuvent varier dans une large mesure suivant la composition du milieu employé. Aussi, pour obtenir un mycélium possédant une capacité élevée de transformation de
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la spiramycine I en spiramycine II et III, est-il préférable de sélectionner très soigneusement les divers produits entrant dans la composition du milieu.
Il a été trouvé particulièremant avanta.geux d'employer un milieu synthétique ne renfermant qu'une source énergétique glu- cidique, une source d'azote ammoniacal et des substances neutrali- santes. On utilise de préférence le glucose ou l'amidon à des doses variant de 1 à 100 g/1, l'optimum étant compris entre 40 et 60 g/1.
Parmi les sels ammoniacaux, on emploie le chlorure, le sulfate ou le nitrate, la quantité d'azote ammoniacal pouvant varier entre 0,1 et 10 g/1, l'optimum étant situé entre 2 et 4 g/1.
Le pH de départ de la culture de S. ambofaciens doit être,, ajusté entre 5 et 9 de préférence entre 6,5 et 7,5 pour obtenir une bonne capacité de transformation de la spiramycine I.
Pour éviter une évolution du pH, dans le milieu de culture vers des valeurs trop basses, qui pourraient être néfastes à une bonne production du système enzymatique acylant, il convient d'ajou- ter dans le milieu de culture des substances neutralisantes au moment opportun et en quantité adéquate pour maintenir le pH à la valeur désirée. On peut employer à cet usage des agents alcalins tels que les hydroxydes et les carbonates des métaux alcalins et alcalino-terreux, en solution ou en suspension dans l'eau ; on peut aussi ajouter des le départ de la culture une substance neutralisante de réserve telle que les carbonates insolubles de métaux alcalino-terreux. On emploie de préférence le carbonate de calcium à des doses comprises entre 1 et 50 g/1, la dose optimum étant au voisinage de 25 g/1.
Il convient également de cultiver S.ambofaciens, dans des conditions de température bien définies, pour obtenir l'élaboration maximum du système enzymatique acylant. On pourra par exemple effectuer la culture entre 20 et 35 mais de préférence à 23-27 .
La culture de S.ambofaciens peut être effectuée dans les conditions habituellement requises pour la conduite des fermenta- tions aérobies et plus spécialement dans tout appareil permettant
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à la fois une bonne dispersion de l'air nécessaire à la respira- tion du streptomyce et une bonne homogénéisation de la culture.
Il a été trouvé que la capacité transformatrice des cultures de S. ambofaciens varie avec l'âge de la culture. Au début de celle-ci la capacité transformatrice est pratiquement propor- tionnelle à la quantité de mycélium présente dans la culture. Au bout d'un certain temps, la capacité transformatrice se fixe à une valeur maximum puis décroît ensuite, alors que le mycélium continue sa croissance. Dans la pratique il se trouve que le mycé- lium possède la capacité transformatrice maximum après 30 à 150 heures de culture, le plus souvent entre 40 et 100 heures, ce temps optimum dépendant essentiellement des conditions générales de la culture.
Après avoir préparé, ainsi qu'il vient d'être décrit, une culture de S. ambofaciens ou de ses mutants, en vue de l'élabora- tion du système enzymatique acylant qui transforme la spiramycine I en spiramycine II et III, il convient ensuite de placer le même streptomyce dans des conditions judicieusement choisies pour utiliser ses capacités transformatrices et effectuer la transforma- tion recherchée. On peut alors apporter à la culture, telle qu'elle a été obtenue, en même temps que la spiramycine I à transformer, les éléments nécessaires à cette transformation : agents acylants et les activateurs. On peut aussi isoler, par tout moyen approprié, le mycélium de S. ambofaciens et le replacer ensuite dans un milieu adéquat de transformation contenant la spiramycine I, les agents acylants et les activateurs.
Or,il a été trouvé que la proportion des produits de transformation de la spiramycine I varie d'une façon importante suivant la nature de,s radicaux acyles présente dans le milieu de transformation. En effet, les radicaux acyles à 3 atomes de carbone se fixent plus facilement sur la spiramycine I que les radicaux à 2 atomes de carbone. Chaque fois que les deux types de radicaux sont présents simultanément dans le milieu de transformation, il y a
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utilisation préférentielle des radicaux à 3 atomes de carbone po transformer la spiramyeine I en spiramycine III. On conçoit qu'il soit alors possible d'orienter spécifiquement la transformation de la spiramycine I en spiramycine III par l'apport judicieux de substances capables de fournir un excès de radical propionyle.
On conçoit aussi que la transformation spécifique de la
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spiramycine 1 en spiramycine II ne puisse s'effectuer qu'en l'absent ce, dans le milieu de transformation, de toute substance susceptible de fournir le radical propionyle. Comme S. ambofaciens élabore avec une très grande facilité et dans les milieux les plus divers les substances capables de fournir le radical propionyle, la transfor- mation spécifique de la spiramycine 1 en spiramycine II ne peut s'effectuer que dans des conditions très particulières.
Si l'on utilise directement comme milieu de transforma- tion les cultures effectuées en* vue de l'éLaboration du système acylant, on obtient alors par l'addition d'agent propionylant de la spiramycine III pratiquement pure. Mais par addition d'agent acétylant on transforme la spiramycine 1 seulement en un mélange de spiramycine II et III, en raison de la présence dans le milieu de petites quantités d'agent propionylant.
Si l'on sépare le mycélium de S.ambofaciens du milieu qui a servi à élaborer le système enzymatique acylant, il est alors possible d'orienter beaucoup plus spécifiquement la transformation de la spiramycine I. Il suffit en effet d'apporter au mycélium en plus des activateurs éventuels., les substances capables de fournir les radicaux acyles. Suivant la nature de ces dernières on obtient alors la spiramycine II, la spiramycine III ou un mélange des deux. Ce procédé est particulièrement avantageux pour la production de la spiramyciné II qui ne peut être obtenue qu'en présence de substances capables de fournir le radical acétyle, à l'exclusion de toute substance capable de fournir un radical propionyle en parti- ticulier de celles pouvant provenir du métabolisme de S. ambofacines.
La spiramycine I peut être employée à l'état pur, ou en
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mélange avec les spiramycines II et III, un tel mélange pouvant être obtenu par les procédés habituels de fabrication de la spiramycine brute. On peut employer la spiramycine à l'état de base ou de sel et l'ajouter au milieu de transformation à l'état solide ou dissous.
Pour des commodités de manipulation, on peut employer par exemple la spiramycine à l'état de base en dissolution dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'éther, l'acétone, le benzène, le dichlor- éthane. On peut également l'employer à l'état de sel et plus spécialement de'chlorhydrate, de sulfate, d'acétate et de propionate, en solution aqueuse.
Il est préférable que la concentration des solutions de spiramydcine ajoutées dans le milieu de transformation soit telle qu'il n'y ait pas une dilution trop importante de ce dernier milieu.
La concentration finale en spiramycine I dans ce milieu de trans- formation peut varier .entrel et 50 g/1 mais il est particulièrement avantageux d'employer une concentration en spiramycine I voisine de 5-20 g/1. Cette concentration peut être atteinte par une seule addition de spiramycine I ou par plusieurs additions fractionnées, sans qu'il en résulte des variations importantes dans le produit de transformation recherché.
Ainsi qu'il ressort des considérations précédentes, une culture de S. ambofaciens possédant le système enzymatique acylant additionné éventuellement d'agents acylants, permet à elle seule de réaliser la transformation enzymatique de la spiramycine I, objet de la présente invention.
L'addition de nombreux sels minéraux ou organiques n'apporte pas de variations importantes dans la quantité de spiramycine I transformée. Cependant, il a été trouvé que certains anions et cations avaient un effet favorable sur la transformation de la spiramycine I en spiramycine II et III, soit en accélérant la transformation, soit en augmentant la quantité de spiramycine transformée:
Parmi les anions jouant le rôle d'activateur de la réac- tion enzymatique se trouve lechlore. On peut ajouter celui-ci
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sous forme de chlorures de métaux alcalins, alcalino-terreux ou autres, à la condition que le métal ne soit pas un inhibiteur de la transformation. La quantité de chlore apportée au milieu sous forme de chlorure peut être comprise entre 0,1 et 20 g/1, la dose optimum se situant au voisinage de 1 à 3 g/1.
Parmi les cations .susceptibles d'améliorer la réaction de transformation, le magnésium, le fer et le cobalt sont particu- lièrement actifs, ce dernier métal se comportant comme l'activateur de choix de la réaction enzymatique d'acylation. On peut ajouter ces métaux sous forme de chlorure, sulfate, nitrate ou de tout autre sel ne gênant pas la réaction enzymatique. On peut employer par exemple le magnésium et le fer à doses comprises entre 0,1 et 500 mg/1 dans le milieu de transformation, l'optimum se situant vers 5 à 10 rùg/1. On peut employer le cobalt à des doses comprises entre 0,1 et 1000 mg/1 l'optimum se situant entre 10 et 400 mg/l.
Pour obtenir la transformation de la spiramycine I en spiramycine II et III, dans les meilleures conditions possibles, il est donc nécessaire d'ajouter à la culture de S.ambofaciens possédant' le système enzymatique acylant, la spiramycine I à transformer, les agents acylants et les activateurs.
L'addition de ces différents éléments peut être simultanée mais elle peut être séparée dans le temps. Dans ce dernier cas il y a cependant intérêt à ajouter la spiramycine I après les agents ' acylants et les activateurs si l'on veut orienter correctement la transformation.
Enfin il a été trouvé avantageux dans certains cas d'ajou ter, en même temps que la spiramycine I, les agents acylants et les activateurs, une source énergétique, comme le glucose ou l'amidon.
Cela est important notamment dans le cas où l'on sépare le mycélium de S.ambofaciens de son milieu de culture et où on le replace dans un milieu ne contenant que la spiramycine, les agents acylants et les activateurs. On peut ainsi ajouter le glucose ou l'amidon à une dose comprise entre 1 et 50 g/1, l'optimum se situant vers 10 g/1.
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Dans le cas où l'on utilise, comme milieu de transforma- tion, la culture d'élaboration du système enzymatique acylant, l'addition des différents éléments se fait dans un milieu de culture de pH bien déterminé, généralement compris entre 5,0 et 8,0 et plus spécialement entre 6,0 et 7,0. Il peut être avantageux, pour effectuer la transformation dans les meilleures conditions possibles, de modifier, dans certains cas, le pH de la culture au moment de l'addition des divers éléments. On emploie alors dans ce but diverses substances acides ou alcalines dont le choix est principale- ment guidé par leurs propriétés inhibitrices éventuelles de la réaction de transformation.
On utilise par exemple, les acides chlorhydriqùe, sulfurique, nitrique, acétique, propionique, citrique, les hydroxydes de sodium, de potassium, d'ammonium, de calcium, de baryum.
Dans le cas où l'on effectue la transformation en séparant le mycélium de S.ambofaciens du milieu d'élaboration du système enzymatique et en replaçant le mycélium en présence de la spiramycine, ds agents acylants des activateurs et des substances énergétiques, il est également avantageux de se placer dans des conditions de pH bien définies. On peut ainsi régler le pH de 3,0 à 8,0 à l'aide des agents acidifiants ou alcalinisants précédemment cités. On peut également régler le pH à l'aide de milieux tampon, comme les mélanges acide acétique-acétate, acide propionique- propionate, acide citrique-citrate, acide phtalique-phtalate.
Enfin quelque soit le mode de transformation choisi, il peut être avantageux de corriger les variations éventuelles de pH -qui se produisent au cours de la transformation par des additions appropriées d'agents acidifiants ou alcalinisants ou de mélanges- tampon.
La transformation de la spiramycine I en spiramycine II et III par S.ambofaciens exige que l'on maintienne la culture de cet organisme dans des conditions parfaitement aérobies, que l'on utilise la culture d'élaboration du système enzymatique ou le
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mycélium séparé de cette culture. Il faut donc, après addition des différents éléments, maintenir le milieu de transformation dans des conditions d'aération et d'agitation voisinesde ce qu'elles étaient pour la culture d'élaboration.
La tempéra bure à laquelle s'effectue la transformation enzymatique acylante a, dans les conditions habituelles de travail, assez peu d'importance. On peut se placer à une température compri- se entre 15 et 40 , la température optimum étant au voisinage de 25 .
La transformation de la spiramycine I en spiramycine II et III est une transformation relativement rapide et en 24' heures une partie importante de la spiramycine I a déjà été transformée.
Pour l'obtention d'un rendement de transformation maximum, il convient, cependant de maintenir dans certains cas un contact suffisant entre le système enzymatique acylant, la spiramy- cine et les autres éléments et plusieurs jours peuvent être alors nécessaires pour que l'évolution complète du système ait lieu.
Après avoir transformé ainsi qu'il vient d'être décrit la spiramycine 1 en spiramycines II et III, celles-ci peuvent être séparées,par des méthodes connues telles que distribution à contre courante chromatographie sur alumine ou autres adsorbants, cristal- lisation fractionnée. Si on désire simplement connaître les propor- tions relatives des différentes spiramycines en cours ou en fin de transformation, il est commode d'appliquer la méthode de caractérisation par chromatographie sur papier aux milieux de transformation'et de,comparer les chromatogrammes obtenus à des chromatogrammes témoins correspondant à des quantités connues des différentes spiramycines isolées à l'état pur.
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif;, montrent comment le perfectionnement, objet (le l'invnetion, peut être mis en oeuvre.
EXEMPLE 1. -
Un erlenmeyer de 2 litres est charge avec 250 cm3 du
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milieu suivant :
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C.orn--steep (50% extrait sec) .................... 40g- Glucose ......................................... 20 g Chlorure de sodium .............................. 5 g
EMI12.2
&ne ville ....................................1000 l g Ùille ...................................,lo00 Ville ....................................1000
Le pH est ajusté à 6,8 par de la soude et la charge est complétée par : Carbonate de calcium ............................ 5 g
EMI12.3
Huile de soja ................................... 4 cm3
Ce milieu est stérilisé 45 minutes à 120 .
Après refroi- dissement, on ensemence avec une culture sur gélose de la souche de Streptomyces ambofaciens NRRL 2420. La culture est mise à agiter sur une'table à secousses pendant 48 heures.
D'autre part, des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 50 cm3 du milieu suivant : Corn-Steep (50% extrait sec) .................... 35 g
EMI12.4
Glucose ...................*............,q....... 50 g
Chlorure de sodium .............................. 20 g Phosphate monopotassique ........................ 2 g Sulfate' de magnésium ............................ 1 g
Eau de ville ....................................1000 cm3
Le pH est ajusté à 6,8 avec de la soude. On ajoute alors:
EMI12.5
Carbonate de calcium ............................ 5 g
On ajoute ensuite de .la propionamide dans les proportions indiquées dans le tableau ci-dessous qui rassemble les résultats obtenus..
- Les erlenmeyers sont stérilisés 20 minutes à 1200 puis, après refroidissement, ensemencés avec 4 cm3 de la culture en erlenmeyer de 2 litres, et mis à agiter à 25 sur table à secousses4
Les dosages et l'analyse de l'antibiotique sont effectués aux 6,7 et
Sème jours de culture afin de déterminer l'activité maximum et les proportions respectives des 3 spiramycines.
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<tb>
Teneur <SEP> ,du <SEP> milieu <SEP> Activité <SEP> Proportion <SEP> en <SEP> poids <SEP> des <SEP> spiramyen <SEP> propionamide <SEP> maximum <SEP> cines <SEP> %
<tb> g/1 <SEP> mcg/cm3 <SEP> 1 <SEP> II <SEP> III
<tb>
<tb>
<tb> 0 <SEP> 285 <SEP> 51 <SEP> 26 <SEP> 23
<tb>
<tb> 1 <SEP> 205 <SEP> 27 <SEP> 18 <SEP> 55
<tb>
<tb> 2 <SEP> 175 <SEP> 24 <SEP> 10 <SEP> 66
<tb>
<tb> 4 <SEP> 150 <SEP> 15 <SEP> 7 <SEP> 78
<tb>
EXEMPLE 2. -
Dans un fermenteur de 170 litres on charge :
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CÔrn-Xteep (50% extrait sec) ...................... 4,$00 kg , Glucose O..OO.Q...c.o.coe..e.oo...oo.....eQ...o. 2,400 kg Chlorure de sodium e............................... 0600 kg Sulfate de magnésium ........,....................0 0,120 kg Eau de ville ...................................... 100 litres
Le pH est ajusté à 6,8 par de la soude et la charge est complétée par .
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Carbonate de calcium ...00....................00... 0,b00 kg Huile de soja .......0............................. 0,4$0 1.
Le milieu est stérilisé à 120 pendant 45 minutes. Après mise en température à 25 ,le milieu est ensemencé avec 250 cm3 d'une culture en erleomeyer agité de S.ambofaciens.
La culture en fermenteur est aérée et agitée pendant 25 heures et sert à ensemencer la culture productrice. Celle-ci est effectuée en fermenteur de 30 litres chargé avec le milieu suivants
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Autolysat de levure ooomooooooaooeeemomeamomooooomo 300 g Glucose eeoeeeooooeeooooooomoeeoeeaomamomoseooesooe 750 g Propionamide moaoeeooeooaeoeoeoooemeeoeommoeooooooe 30 g Chlorure de sodium .'...0.'..................'....0 300 g Sulfate de magnésium.,.............................. 15 g Phosphate monopotassique 0.....0..................0 15 g Eau de ville .....................0...6'........... 1695 litres
Le pH est ajusté à 6,5 par de la soude.
La charge est complétée avec :
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Carbonate .de calcium ............................... 75 g Huile de soja ...................................... 60 cm3
Le milieu est stérilisé pendant 40 minutes à 120 .
Après refroidissement le volume est de 15 litres et le pH de 6,8.
Le milieu est alors ensemencé par transfert de 2 litres de culture inoculum en fermenteur de 170 litres, puis agité par une turbine tournant à 550 t/min. aéré avec 1 m3/heure d'air et maintenu à 25 .
Dès le début de l'opération le pH descend régulièrement pour atteindre 5,b vers 60 heures : cette première phase correspond exactement à la consommation du glucose. Le pH remonte ensuite lentement jusqu'à 90 heures (6,2) puis très b@talement : il passe à 7 à 100 heures. L'activité finale du moût est de 645 mcg/cm3. La proportion respective en poids des trois spiramycines produites est la suivante : I 12% II 13% III 75%
Une opération réalisée parallèlement sur le même milieu mais sans propionamide a donné en 120 heures, une activité de 760 mcg/cm3, avec la répartition suivante : I 24% ' II 53% III 23% EXEMPLE 3.-
La culture inoculum est effectuée comme dans l'exemple II.
La culture productrice est effectuée cette fois en fermenteur de 800 litres, chargé avec le milieu suivant : Amidon ................................................. 16 kg Chlorure d'ammonium.................................... 1,600 kg Propionamide 1,600 kg Chlorure de potassium ................................. 1,200 kg Chlorure de sodium 6,800 kg Phosphate monopotassique.............................. 2 kg Sulfate de magnésium.................................. 0,.00 kg Acide citrique 0,400 kg
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Sulfate de zinc à 7 OIi2................................ 40 g Chlorure de cobalt à 6 OH2 ............................. 0,12 g Eau de ville 370 litres
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Le pH est ajusté à b,7 par addition de 1450 cm3 de soude à 36 Bé.
La charge est complétée par :
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Carbonate de calcium ............................. 2 kg Huile de soja .................................... 1600 cm3
Le milieu est stérilisé par barbotage de vapeur 40 minutes à 120 . Après refroidissement le volume est de 400 litres et le pH de 6,7.
Le milieu est alors ensemencé par transfert de 40 litres de culture inoculum en fermenteur de 170 litres, puis agité par une turbine tournant à 205 t/min., aéré avec 15 m3/heure d'air et maintenu à 25 . Apres 150 heures de culture l'activité du moût est maximum : 660 mcg/cm3. La proportion respective en poids dès trois spiramycines produites est la suivante: I : 17% II 8% III 75% EXEMPLE 4.-
Un erlenmeyer de 2 litres est chargé avec 250 cm3 du milieu suivant :
Corn-steep (50% d'extrait sec) ................... 40 g Amidon ........................................... 20 g
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Chlorure de sodium ees..e.enao.ee.s.e.o.eew e?.... 5 g Sulfate de magnésium ............................. 1 g Phosphate monopotassique ......................... 2 g Eau de ville ................................q.s.p.1000 cm3
Le pH est ajusté à 6,8 par de la soude et l'on ajoute au milieu :
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Carbonate de calcium .soo..oease.eosomo.ss..eo.eo 5 g
Ce milieu est stérilisé 45 minutes à 120 . Après refroi- dissement on ensemence avec une culture sur gélose de la souches. ambofaciens. La culture est mise à agiter sur une table à secousses pendant 48 heures 'à 25 .
Par ailleurs, des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 40 cm3 du milieu suivant : Corn-steep (50% d'extrait sec) 45 g
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Glucose .**** ......6......... 50 g Carbonate de calcium ............................. 25 g Eau de ville ................................q.s.p.1000 cm3
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Le pH du milieu est ajusté à 7,0 avec de.la soude.
Le Milieu est ensuite stérlisé 30 minutes à 120 . Après refroidisse- ment, on ensemence le contenu de chaque erlenmeyer avec 4 cm3 de la culture inoculum précédente. La culture est mise à agiter sur une table à secousses à 25 . Après 48 heures le développement du champignon est excellent. On ajoute alors à chaque erlenmeyer 20 cm3 d'une solution aqueuse stérile contenant 12 g/1 de spiramy- cine I pure à l'état de base et 6 g/1 de propionate de sodium.
On maintient l'agitation de la culture pendant 24 heures, puis on mélange le contenu de tous les erlenmeyers. L'analyse chromatographi- que du bouillon montre que ce dernier renferme 2,6 g/1 de spiramy- cine I non transformée et 1,4 g/1 d'un mélange contenant 20% de spiramycine II et 80% de spiramycine III.
EXEMPLE 5 . -
Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 40 cm3 du milieu suivant : Extrait de levure ............................... 30 g Glucose ......................................... 50 g Carbonate de calcium ............................ 25 g Eau de ville ..............................q.s.p. 1000 cm3
Le pH du milieu est ajusté à 7,0 avant l'addition de carbonate de calcium. Le milieu est ensuite stérilisé 30 minutes à 120 . Après refroidissement le contenu de chaque erlenmeyer est ensemencé avec 4 cm3 d'une culture inoculum préparée dans les con- ditions décrites à l'exemple 4. La culture est mise à agiter sur une table à secousses à 25 .
Après 48 heures de développement,. on ajoute dans chaque erlenmeyer 20 cm3 d'une solution aqueuse sté- rile contenant 12 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base et 6 g/1 depropionate de sodium. On laisse incuber la culture sur la table à secousses pendant 3 jours. Après ce temps, le contenu des erlen- meyers est mélangé. L'analyse chromatographique du bouillon de cul- ture montre qu'il y a encore 2,1 g/1 de spiramycine I non transfor- mée et 1,9 g/1 de spiramycine I transformée en un mélange contenant
<Desc/Clms Page number 17>
6% de spiramycine II et 94% de spiramycine III.
EXEMPLE 6 . -
Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 40 cm3 du milieu suivant :
EMI17.1
Chlorure d'ammonium ......ov...........ec.eee...... 6 g Glucose ........................................... 25 g
EMI17.2
Carbona:e.d calcium ..... 20 g.,;:..
Eau dé'fJJ.v1:1:t"e e . a w ....... sa.s.rt........ a .., q. s.p. 1990 cm3:,, Ces erlenmeyers sent. stérilisés, ensemegç#s etrtrutivés, dans les conditions décrites#.'zxen?ple 5. Après .48,--heures de culture, on ajoute à chaque erlenmeyer. 20 cm3 d'une solution aqueuse stérile contenant 9g/1 de spiramycine I pure à l'état de base, et 21 g/1 de propionamide.
EMI17.3
Après 3 jours d'incabation l'analyse chromatographiquet du bouillon montre que 1,86 g/1 de spiramycine 1 ont été transformés en un mélange contenant 55% de spiramycine II et 45% de spiramycine III. Il reste par ailleurs 1,14 g/1 de spiramycine I non transformée.
EXEMPLE 7. -
Une culture de S. ambofaciens est effectuée dans les conditions décrites à l'exemple 6. La solution qui contient la spira- mycine base renferme en outre 6 g/1 de propionate de sodium. On trou- ve, d'après la chromatographie sur papier du bouillon de culture, qu'il reste 0,96 g/1 de spiramycine I non transformée et que 2,04 g/1 de spiramycine I ont été transformés en un mélange.contenant 11% .de spiramycine II et 89% de spiramycine III.
EXEMPLE 8,
Des erlenmeyers de;300 cm3 sont chargés avec 40 cm3 du
EMI17.4
mi:lieu: suivant : Chlorure d'ammonium ...ee......e..e.......1.,..a...sea 10 g Glucose ........ee.m .....eoes.a.l.s..s..........et.s. 50 g carboflate de calcium 25 g Eau de= Ville .....................e............q.s.p,1000 cm3 Ces erlenmeyers sont stérilisé-.,, ensemencés et cultivés
<Desc/Clms Page number 18>
dans les conditions décrites à l'exemple 5. Après 48 heures de cul, ture, on ajoute dans chaque erlenmeyer 20 cm3 d'une solution aqueuse stérile renfermant 12 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base et b g.l de propionate de sodium. Les erlenmeyers sont alors divisés en quatre lots. Le premier lot reste tel quel.
Dans les trois autres lots sont ajoutés respectivement du sulfate de magnésium, du sulfate ferreux et du chlorure de cobalt, les additions de ces sels étant telles que chaque métal se trouve à la concentration de 1 milli- molécule par litre dans le milieu de transformation. Apres 3 jours d'incubation, les erlenmeyers de chaque lot sont mélangés entre eux et leur contenu est analysé par chromatographie sur papier.
Les ré- sultats de l'analyse sont les suivants :
EMI18.1
<tb> Activateur <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> spiramycine <SEP> I <SEP> Proportions <SEP> des <SEP> spiramyci
<tb> transformée <SEP> g/1 <SEP> nes <SEP> % <SEP>
<tb> IIIII
<tb>
<tb> 0 <SEP> 1,88 <SEP> 21 <SEP> 79
<tb>
<tb> magnésium <SEP> 2,12 <SEP> 28 <SEP> 72
<tb>
<tb> fer <SEP> 2,32 <SEP> 30 <SEP> 70
<tb>
<tb> cobalt <SEP> 2,80 <SEP> 27. <SEP> 73
<tb>
EXEMPLE 9. -
Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés, s térilisés, ensemencés et cultivés dans les conditions décrites à l'exemple 8.
Apres 48 heures de culture les erlenmeyers sont divisés en deux lots.
Chaque erlenmeyer du premier lot reçoit 20 cm3 d'une solution aqueuse stérile renfermant 12 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base et 6 g/1 de propionate de sodium.. Chaque erlenmeyer du second lot reçoit 20 cm3 de la même solution à laquelle ont été ajoutés 30 g/1 de chlorure de sodium.
Chaque lot d'erlenmeyer est traité ' comme précédemment et le résultat de l'analyse chromatographique est le suivant :
<Desc/Clms Page number 19>
EMI19.1
<tb> C1Na <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> spiramycine <SEP> I <SEP> Proportion <SEP> des <SEP> spiramyg/1 <SEP> transformée <SEP> g/1 <SEP> cines <SEP> %
<tb> IIIII
<tb>
<tb> 0 <SEP> 1,88 <SEP> 21 <SEP> 79
<tb>
<tb> 10 <SEP> 2,60 <SEP> 23 <SEP> 77
<tb>
EMI19.2
¯¯-#¯¯-¯¯¯-###¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯f EXEMPLE 10.-
Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec .50 cm3 du milieu suivant :
EMI19.3
Chlorure d'ammonium ............................ 10 g Glucose ........................................ 50 g Carbonate de calcium ...........o..*..o..*...é.. 25 g Eau de ville ...........................q.s.p. 1000 cm3
Ces erlenmeyers sont stérilisés, ensemencés et cultivés dans les conditions décrites à l'exemple 5.
Après 52 heure de culture, chaque erlenmeyer reçoit 1 cm3 d'une solution à 15% de propionate de sodium, puis on divise les erlenmeyers en deux lots. Chaque erlenmeyer du premier lot reçoit 2 cm3 d'une solution à 15% de spiramycine I pure, à l'état de base dans le méthanol. Chaque erlenmeyer du second lot reçoit une solution de même composition mais dans l'acétone. On laisse la culture incuber 72 heures sur la table à secousses. Le contenu des erlenmeyers d'un même lot est réuni et analysé chromatographique ment.
Les résultats de la transformation sont les suivants :
EMI19.4
<tb> Solvant <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> spiramycine <SEP> I <SEP> Proportion <SEP> des <SEP> spirainy-
<tb>
<tb>
<tb> transformée <SEP> g/1 <SEP> cines <SEP> %
<tb>
<tb> II <SEP> III
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthanol <SEP> 3,48 <SEP> 24 <SEP> 76
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétone <SEP> 3,36 <SEP> 27 <SEP> 73
<tb>
EXEMPLE 11.-
Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés comme dans l'exemple précédent, stérilisés 30 minutes à 120 et ensemencés chacun avec b cm3 d'une culture inoculum préparée comme il est dit
<Desc/Clms Page number 20>
dans l'exemple 4. Les erlenmeyers sont rais en incubation sur une table à secousses à 25 . Les erlenmeyers sont divisés en 3,lots.
Après 48 heures de culture, chaque erlenmeyer du premier lot reçoit 2 cm3 d'une solution à 15% dans le méthanol de spiramycine I pure à l'état de base et 1 cm3 d'une solution aqueuse à 15% de propionate de sodium. Les mêmes additions sont faites dans chacun des erlenmeyers des deux autres lots, mais respectivement après 72 et 96 heures de culture. La culture est, dans chaque cas, poursuivie trois jours après l'addition de spiramycine. Le contenu des erlenmeyers d'un même lot estanalysé par chromato- graphie sur papier. Le tableau. suivant indique les résultats de l'analyse.
EMI20.1
<tb>
Addition <SEP> de <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> spiramycine <SEP> I <SEP> Proportion <SEP> des <SEP> spiramycines
<tb>
<tb>
<tb> spiramycine <SEP> transformée
<tb>
<tb>
<tb> heures <SEP> g/1 <SEP> II <SEP> III
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 48 <SEP> 3,00 <SEP> 16 <SEP> 84
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 72 <SEP> 3,06 <SEP> 18 <SEP> 82
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 96 <SEP> 1,62 <SEP> 28 <SEP> 72
<tb>
EXEMPLE 12.- ¯ Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 50 cm3 du milieu suivant :
Nitrate d'ammonium ............................ 13 g Glucose ....................................... 50 g Carbonate de calcium .......................... 25 g Eau de ville q.s.p. 1000 cm3
Les erlenmeyers sont stérilisés 30 minutes à 120 , refroidis et ensemencés avec 5 cm3 d'une culture inoculum dont la préparation est décrite à l'exemple 4. Après trois jours de culture à 25 sur une table à secousses, on ajoute dans chaque erlenmeyer 5 cm3 d'une solution aqueuse renfermant 100 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base, 38 g/1 d'acide propionique, 10 g/1 de chlorure de cobalt hexahydraté et dont le pH a été ramené à 6,5 par addition de-soude.
On laisse la culture se poursuivre trois
<Desc/Clms Page number 21>
jours supplémentaires et on analyse le contenu des erlenmeyers par chromatographie.sur papier. 8,70 g/1 de spiramycine I ont été transformés en un mélange contenant 9% de spiramycine II et 91% de spiramycine III.
EXEMPLE 13.-
Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 50 cm3 du milieu suivant :
EMI21.1
Nitrate d'ammonium .....................:...... 20 g Amidon......................................... 60 g Carbonate de calcium .......................... 25 g Eau de ville ..........................q.s.p. 1000 cm3 .
Lés erlenmeyers sont stérilisés, ensemencés et mis à incuber dans les conditions décrites à l'exemple 5. Après 96 heures de culture, on ajoute dans chaque erlenmeyer 5 cm3 d'une solution aqueuse contenant 140 g/1 d'une spiramycine brute à 1',état de base (composée respectivement de 59, 27 et 14% de spiramycine I, II et III), 56 g/1 d'acide propionique, 0,5 g/1 de chlorure de cobalt hexahydraté et ramenée à pH 6,5 à l'aide de lessive de soude. On laisse la culture se poursuivre pendant 3 jours et on analyse chromatographiquement le contenu des erlenmeyers. Sur les 8,26 g/1 de spiramycine I ajoutés, 6,30 g/1 ont été transformés en un mélange contenant 13% de spiramycine II et 87% de spiramycine III.
EXEMPLE 14.-
Deux erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 50 cm3 du milieu suivant Chlorure d'ammonium ............................ 10 g Glucose ...................,.................... 50 g Carbonate de calcium ........................... 25 g
EMI21.2
Eau de ville .............,................ q. s.p.1000 cm3
Les erlenmeyers sont stérilisés, ensemencés et mis à incuber dans les conditions décrites à l'exemple 5. Après 72 heures de culture, le contenu des erlenmeyers est centrifugé et on élimine le liquide surnageant.
La moitié du culot de centrifugation est remis en suspension dans 50 cm3 d'une solution aqueuse placée
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dans un erlenmeyer de 300 cm3 et contenant 6 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base, 2,3 g/1 d'acide propionique, 1 g/1 de chlorure de cobalt hexahydraté et ramenée à pH 6,5 par addition de lessive de soude. L'autre moitié du culot de centrifugation est remis en suspension dans 50 em3 d'une solution aqueuse de même composition mais renfermant en plus 10 g/1 de glucose.
Les deux erlenmeyers contenant la suspension de mycélium sont mis à incuber à 25 sur une table à secousses pendant 2 jours.
Après ce temps le contenu de chacun des erlenmeyers est analysé par chromatographie. Les résultats de la transformation sont les suivants :
EMI22.1
<tb> ,
<tb>
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> spiramycine <SEP> I <SEP> Proportion <SEP> de <SEP> spiramycine
<tb>
<tb>
<tb> transformée <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb> g/1 <SEP> II <SEP> III
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sans <SEP> glucose <SEP> 2,22 <SEP> 14 <SEP> 86
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> avec <SEP> glucose <SEP> 3,70 <SEP> 14 <SEP> 86
<tb>
EXEMPLE 15.-
Un erlenmeyer de 300 cm3 est chargé avec 50 cm3 du milieu suivant ;
Chlorure d'ammonium..............................'.. 10 g Glucose ............................................ 50 g Carbonate de calcium ............................... 25 g Eau de ville ..............................q.s.p. 1000 cm3 L'erlenmeyer est stérilisé, ensemencé et mis à incuber dans les conditions décrites à l'exemple 5. Après 72 heures de culture, le contenu de l'erlenmeyer est centrifugé et le liquide surnageant est éliminé. Le culot de centrifugation est remis en suspension dans 50 cm3 d'une solution tampon chargée dans un erlenmeyer de 300 cm3. Cette solution tampon contient 9,85 g/1 d'acide acétique cristallisable et 4,9 g/1 d'acétate de sodium.
Elle a un pH de 4. Elle contient en outre 6,45 g/1 de chlorhydrate de spiramycine I pure et 1 g/1 de chlorure de cobalt hexahydraté.
L'erlenmeyer contenant la suspension de mycélium est mis à incuber
<Desc/Clms Page number 23>
à 25 sur une table à secousses pendant 80 heures. On analyse alors par chromatographie sur papier le contenu de l'erlenmeyer.
EMI23.1
On trouve ainsi que 2,.0 g/1 de spiramycine'I'ont été transformés en un mélange contenant 90% de spiramycine II et 10% de spiramycine III.
EXEMPLE 16 . -
Dans un fermenteur de 170 litres'on charge successivement:,'
EMI23.2
Corn-steep (50% d'extrait sec) .........ee.......... 4800 g Amidon ............................................... 2400 g Chlorure de sodium ................................. 600 g Sulfate de magnésium ................................. 120 g.. ; Phosphate monopotassique ........................... 240 g
EMI23.3
Eau de ville ..ee...e.........e.....e...e:.......... 100 1 ¯
Le pH est ajusté à 6,7 avec 750"cm3 de lessive de soude:à 400 g/1 NaOH.-On ajoute ensuite :
Carbonate de calcium ................................ 600 g ,
EMI23.4
Huile de soja ......................... 0.0 .......... 60 cm3 ' Antimousse au silicone ..................... ; ....... -60 cm3..
Le fermenteur et son contenu sont stéxilisés par barbotagé de vapeur 40 minutes à 122 , ce qui amène le volume final à 120 litres. Après refroidissement et mise en température à 25 , le . fermenteur est ensemencé avec les 250 cm3 d'une culture inoculum préparée comme il a été dit dans l'exemple 4. Le milieu est ensuite agité par une hélice tournant à 350 t/min. et aéré par 5 m3/ heure. d'air. Après 23 heures de culture le développement de S.ambofaciens est abondant.
On charge par ailleurs dans un fermenteur de 30 litres : Chlorure d'ammonium ................................ 150 g
EMI23.5
Glucose hydraté .1....'..<. ........................ 750 -g Eau de ville e ........................ 0 ............... 14 1
Le fermenteur et son contenu sont stérilisasse minutes à 122 . Après refroidissement et mise en température à 25 , on ajoute 375 8 de carbonate de calcium en suspension stérile dans 2
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litres d'eau, ce qui amène le volume du milieu à 15 litres. Le pH est alors de 7,5.
On ensemence avec 1,5 Litre de la culture inoculum en fermenteur de 170 litres, décrite précédemment et âgée de 23heures.
On agite le milieu avec une hélice tournant-à 550 t/min. et on aère à raison d'un m3/h d'air. près 48 heures de culture, S.ambofaciens .- présente un bon développement et le milieu de culture a un pH de.6,5. On ajoute alors au milieu une solution aqueuse composée de : Spiramycine base 150 g
Propionate de sodium ............................... 19 g
Chlorure de cobalt hexahydraté 17 g.
/Solution N d'acide propionique ..................... 300 cm3
Eau distillée ......................................1000 cm3
La spiramycine base employée est un produit brut qui contient respectivement 65,23 et 12% de spiramycine I, II et III.
On poursuit la culture dans les mêmes conditions de tempé- rature, d'agitation et d'aération pendant 90 heures. On vidange alors le fermenteur et on obtient 13,75 litres de. bouillon. La chromatographie sur papier du bouillon montre que toute la spiramy- cine I a été transformée en un mélange de spiramycine II et III, leurs proportions respectives étant de 29 et 71% dans le produit final. L'extraction du bouillon permet d'obtenir 122 g de spiramycine base composée de 25% et 75% de spiramycines II et III.