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La préseme invention concerne la préparation de la tétracycline.
Plus particulièrement l'invention a pour objet un procédé pour obtenir la tétracycline par biosynthèse sans formation simultanée d'autres substances antibiotiques apparentées, procédé qui est caractérisé par l'utilisation d'un milieu de fermentation spécialement préparé, l'invention porte sur le procédé de préparation du nouveau milieu de fermentation, le milieu lui- même , etle nouveau procédé de fermentation par lequel on prépare la tétra- cycline.
La tétracycline est une substance antibiotique à laquelle on a donné le nom chimique de 4-diméthylamino-1,4,-4a,5,5a,6,11,12a-cotahydro-3,6,
10,12,12a-pentahydroxy-6-méthyl-1,11-dioxo-2-naphtacénecarbosamide On l'a tout d'abord préparé par déchloration de la chlorotétracycline par hydrogé- nation, en utilisant comme catalyseur du palladium sur charbon de bois.
On a trouvé récemment que certaines souches de micro-organiques qui produisent la chlorotétracycline par fermentation, produisent aussi de faibles quantités de tétracycline, particulièrement dans un milieu contenant des quantités minimes d'ions chlorure. Une sélection soignée de ces micro- organismes, y compris leurs mutants, a conduit aussi à isoler des souches qui produisent une quantité de tétracycline plus importante que la quantité de chlorotétracycline fabriquée simultanément. Mais en aucun cas il n'a été possible d'isoler un micro-organisme qui produise seulement de la té+ra- cycline, à l'exclusion de chlorotétracycline, en milieu de fermentation chloruré.
Bien que les propriétés thérapeutiques de la tétracycline et de la ohlorotétracycline soient étroitement apparentées, il y a pourtant des différences entre les deux substances antibiotiques, particulièrement en ce qui concerne la stabilité dans la circulation sanguine. Par suite de ces différences, et aussi pour plus de certitude dans le traitement de maladies justiciables de ces antibiotiques, il est désirable que la substance soit préparée et utilisée sous la forme d'une entité antibiotique unique, prati- quement pure. Il est très difficile de séparer la tétracycline de la chloro- tétracycline quand ces antibiotiques se présentent ensemble dans les mélan- ges de fermentation bruts à cause de leurs propriétés physiques et chimiques similaires.
Il est donc désirable de posséder une méthode pour préparer la tétracycline sans obtenir simultanément de quantités appréciables de chloro- tétracycline.
On a obtenu un certain succés dans la réalisation de ce but, en préparant un milieu de fermentation consitué par des substances nutritives essentielles qui sont exemptes de chlorures naturelso Mais cela a nécessité le choix d'hydrates de carbone assimilables pratiquement purs, tels que l'a- midon, le sucrose, le glucose, l'acide citrique, etc...; une source d'azote provenant de matières synthétiques, telles que nitrate d'ammonium, urée, sul- fate dammonium, ou des aminoacides purifiés et coûteux. Il a aussi fallu un choix soigné de sels minéraux exempts de chlorures , que l'on ajoute ha- bituellement dans des processus de fermentation pour donner des phosphates et autres cations et anions minéraux.
Non seulement ces milieux synthétiques sont coûteux à préparer, mais chose plus importante, on n'a pas obtenu une combinaison complète et exacte de toutes les conditions essentielles de nu- trition du micro-organisme pour la biosynthèse de la tétracycline. Par suite, la préparation de la tétracycline avec des milieux synthétiques exempts de chlorures reste coûteuse et antiécomomique.
L'expérience en matière de production des antibiotiques par des processus de fermentation montre qu'il y a dans des substances nutritives d'origine naturelle des substituants qui sont très importants pour obtenir des rendements élevés d'antibiotiques. C'est le cas en ce qui concerne la
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préparation de nombreux types et espèces différentes de substances antibio- tiques. Bien que l'on ait fait des efforts diligents pour déterminer la na- ture de ces substituants de substances nutritives d'origine naturelle, on a eu, très peu de succés lorsqu'il s'est agit de les identifier. La liqueur de macération de mais, par exemple, est considérée comme une substance nutri- tive presque indispensable pour obtenir un certain nombre d'antibiotiques avec des rendements maxima.
On trouve aussi ces matières nutritives désira bles,dans une mesure moindre, dans une variété d'autres substances d'ori- gine naturelle, telles que la farine de soja, la farine d'arachide, la fari- ne de poisson, et diverses autres substances d'origine naturelle communément employées, qui offrent une source d'azote, carbone et éléments minéraux biologiquement assimilables.
Les efforts faits pour éliminer les chlorures de ces substances nutritives naturelles désirables n'ont pas eu de succès. Quand on traite par des résines échangeuses d'ions les solutions nutritives . faites de liqueur de macération de mais, etc....dans le but d'éliminer les ions chlo- rures, on arrive à des rendements ridiculement faibles en tétracycline, lors- qu'on utilise ces milieux traités dans le processus de fermentation. Appa- remment, la résine échangeuse d'ions épuise le milieu, en un ou plusieurs des éléments essentiels inconue de la biosynthèse , ou bien elle fournit un corps indésirable. En tous cas, le rendement total en activité antibiotique que l'on obtient par fermentation d'un milieu nutritif adéquat après traite- ment par une résine échangeuse d'ions est notablement plus faible qu'on ne l'aurait pensé sans cela.
En sonséquence, il ne semble pas que la tétracy- cline puisse être préparée à bon marché à partir de matières nutritives d'o- rigine naturelle qui ont été soumises à un traitement d'échange d'ions..
11 y a lieu de noter que la croissance du micro-organisme produc- teur n'est pas nécessairement synonyme de production d'antibiotique. Des milieux nutritifs qui aménent une croissance luxuriante du cryptogame peuvent donner un rendement d'antibiotique faible ou nul Par contre, un milieu nutritif qui entretient une croissance de mycélium d'apparence ordinaire peut donner des rendements très élevés de substances antibiotique.
S'il est difficile d'obtenir un milieu de fermentation qui puisse servir de substrat pour la préparation de la tétracycline sans donner lieu aussi à la production de quantités appréciables de chlorotétracycline, la chose est devenue plus difficile encore par les récents progrés dans ce domaine, qui ont créé des milieux de fermentation améliorés et des souches de micro-organismes grosses productrices de chlorotétracycline, de sorte que maintenail est possible d'obtenir, sur une échelle commerciale, plu- sieurs milliers de microgrammes de chlorotétracycline- par cm3, contre quel- ques centaines de microgrammes de la matière il y a quelques années.
Le procédé de préparation de la tétracycline basé sur cette fermentation doit, pouvoir raisonnablement soutenir la concurrence avec lesprocédés similaires' de préparation de la chlorotétracycline. Les organismes qui produisent la chlorotértracycline particulièrement ceux du groupe Streptomyces aureofa- sont des utilisateurs extrêmement efficaces de chlorures, ils recher- chent et utilisent les chlorures qui existent dans les milieux de fermenta- tion, même à des concentrations inférieures à 1 mg/1.
L'élimination des chlo- rures pour permettre la production de la tétracycline est rendue plus diffi- cile par l'usage de souches à fort rendement, car elles sont très sensibles au milieu nutritif, et l'élimination de métabolites essentiels diminue sé- rieusement le rendement total en antibiotique que l'on peut obteniro
Chose inattendue, on a découvert que l'on peut enlever les ions dlo- rure de ces milieux de fermentation sans enlever sumutanément des quantités notables
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de corps nutritifs essentiels ou éléments de la biosynthèse de la tétracy- cline, et sans anone diminution appréciable du rendement total d'antibio.i- que que l'on pourrait obtenir autrement.
Conformément à la présente invention, l'élimination des ions chlo- rure par ce moyen se fait de préférence sous la forme de chlorure d'argent qui se forme dans les fractions chlorurées du milieu. Apparemment, on peut former le chlorure d'argent et l'éliminer du milieu nutritif sans pertur- ber l'équilibre délicat des autres métabolites qui sont nécessaires pour les rendements extrêmement élevés en tétracycline que l'on peut obtenir par le procédé de la présente invention.
On a trouvé aussi que pratiquement tous les ions chlorure présents dans le milieu, qui normalement serviraient à former la chlorotétracycline, peuvent être éliminés sous forme de chlorure mercureux, sans éliminer aussi simultanément d'autres constituants désirable- au milieu. Les résultats ex- cellents obtenus quand on utilise l'argent et-le mesure pour éliminer les ions chlorure du milieu de fermentation, sont inattendus aussi, étant donné la nature toxique de ces sels pour les micro-organismes.
Pour éliminer les ions chlorure du milieu de fermentatior ,on peut, suivant la présente invention , utiliser des moyens variés. Les sels d'argent ou les sels mercureux qui réagiront sur'-les ions chlorure présents dans tout le milieu, peuvent être ajoutés à celui-ci immédiatement avant le débit du processus de fermentation. On peut alors éliminer par filtration les sels d'argent et de mercure qui se forment. Une manière plus économique de préparer le milieu est de traiter seulement la partie du milieu qui con- tient les constituants naturels.
La source préférentielle d'éléments nutritifs pour la biosynthése de la tétracycline comprend des produits naturels tels que la liqueur de macération de mais, la farine de coton, la farine de soja, etc... Ceux-ci contiennent souvent les quantités appréciables d'ions chlorure, par exemple la liqueue de macération de mais peut contenir de 0,3 à 0,5 % d'ions chloru- re.Il-est généralement préféralbe d'éliminer les ions chlorure de ces consti- tuants naturels avant de passer aux étapes ultérieures de préparation des milieux par addition d'autres corps nutritifs comprenant les sels minéraux et oligo-éléments, et la stérilisation ultérieure. les matières nutritives ajoutées sont généralement exemptes de chlorures,ou on peut les rendre exemp- tes de chlorures par un traitement relativement simple.
La formation du chlorure d'argent ou du chlorure mercureux dans des solutions aqueuses contenant des ions chlorure est une chose bien connue aes chimistes, et n'a pas besoin d'être traitée plus en détail. La forme de réalisation préférentielle de l'invention consiste à diluer la liqueur de macération de mais jusqu'à une concentration appropriée, avec plusieurs vo- lumés d'eau exempte de chlorures, naturelle ou désionisée, puis à en prendre une partie aliquote. On ajuste celle-ci à un pH d'environ 3, et on ajoute lentement un sel soluble d'argent, tel que le nitrate d'argent, jusqu'à ce qu'on-n'obtienne plus de précipité de chlorure d'argent.
Le gros de la liqueur de macération de mais diluée peut alors être traité par des quanti- tés proportionnelles d'argent, et on peut alors éliminer le chlorure d'argent insoluble par filtration, centrifugation, ou par tout autre procédé désirable.
Si l'on connait à l'avance la quantité d'ions'-chlorure dans la liqueur , un calcul chimique stoechiométrique simple révèle la quantité de sel d'argent soluble qu'il faudra pour obtenir la précipitation complète de l'ion chlorure. Les mêmes observations s'appliquent aussi à l'usage des sels mercureux
Les sels d'argent que l'on peut ajouter au milieu de fermentation
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aqueux pour obtenir la précipitation du chlorure d'argent comprennent un certain nombre . de sels d'argent communément connus , tels que l'acétate d'argent, le benzoate d'argent, le propionate d'argent, le chlorate d'ar- gent, le perchlorate d'argent le lactate d'argent, le sulfate d'argent, et divèrs autres sels d'argent que l'on peut ajouter à une solution aqueuse pour précipiter les ions chlorure sous forme de chlorure d'argent.
Il n'est pas nécessaire que ces sels d'argent soient solubles dans une mesure appré- ciable. , bien que ce soit généralement désirable. Des composés d'argent pratiquement insolubles , tels que l'oxyde d'argent , qui réagissent sur les ions chlorure en solution aqueuse, peuvent aussi servir, et présentent l'avantage que leur insolubilité relative empêche l'introduction de quanti- tés excessices d'argent soluble dans le milieu de fermentation. Mais ilsné cessitent un temps plus long pour la précipitation.
Le pH auquel on conduit la précipitation peut varier considérable- ment, mais il est généralement dans la gamme acide. Bien que le chlorure d' argent soit plus insoluble aux environs du PH 7 qu'aux pH inférieurs, il est avantageux de conduire la précipitation aux pH inférieurs parce que, dans ces conditions, le chlorure d'argent précipite plus vite, et il y a moins de risque d'enlever des phosphates au milieu. En conséquence, un pH infé- rieur à 4 environ est préférable. On peut ajuster le milieu,à ces pH avec n'importe quel acide courant, sauf l'acide chlorhydrique.
Les divers sels mercureux que l'on peut aussi utiliser du même point de vue comprennent l'acétate mercureux, le benzoate mercureux, le chlorate mercureux, le nitrate mercureux, le sulfate mercureux, etc...
Etant donné la nature toxique des sels d'argent et des sels mer- cureux, il est préférable d'enlever l'excès stoechiométrique par rapport à la quantité nécessaire pour précipiter l'ion chlorure, avant le débit de la fermentation. On peut y arriver facilement en traitant par l'hydrogène sul- furé ou par d'autres sulfures, ce qui -amène la formation de sulfure d'argent ou de sulfure mercurux insolubles. Ces sulfures en question comprennent le sulfure d'ammonium, le sulfure de sodium, le sulfure de potassium, etc...
La précipitation de l'argent et du mercure par es sulfures est une chose bien connue de l'homme de l'art, et n'a pas besoin d'être traitée en détail.
Mais on peut noter qu'aux pH inférieurs, il y a moins de chance de précipi- ier les métaux lourds désirables qui peuvent se trouver dans le milieu nu- tritif. Le pH de la préoi- itation doit donc être inférieur à 7,0 environ.
Quand on utilise les suliures alcalins, la solution doit êtrebien tamponnée ou avoir un pH initial suffisamment bas pour que le pH final ne soit pas supé- rieur à 7 environ. On recueille les sels insolubles par filtration ou autre- ment, et on peut conserver le métal utile, argent ou mercure, qu'ils contien- nent.
Quand la quasi-totalité des besoins en phosphates de la fermenta- tion sont contenus dans la solution aqueuse que l'on traite par le sel d'ar- gent, il peut y avoir élimination d'une partie de l'ion phosphate, comme noté plus haut, En pareil cas, il sera désirable de rétablir les concentra- tions nécessaires en phosphate, et on peut le faire à n'importe quel stade avant fermentation, en ajoutant de l'acide phosphorique , du phosphate d'am- monium , du phosphate de magnésium, ou des phosphates alcalins, à la liqueur de fermentation..
Il faut prendre une précaution similaire en ce qui concerne les métaux lourds essentiels qui sont généralement nécessaires à l'état de tra- ces. Si ces ions métalliques lourds sont compris dans la liqueur que l'on traite, et si l'on constate que des quantités appréciables de ces ions pré- cipitent en plus de l'ion chlorure dans les conditions appliquées, il peut être nécessaire d'ajouter au milieu nutritif des quantités supplémentaires
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d'oligo-éléments après le traitement d'élimination de chlorures. Il est relativement simple de déterminer dans quel cas il y a lieu de le faire, et cela rentre dans le savoir technique.
Le milieu nutritif utilisé dans le procédé de la présente inven- tion est par ailleurs le même que celui recommandé actuellement pour la pré- paration de la chlorotétracyclîne ou de la tétracycline, et contient une sour- ce assimilable de carbone qui peut venir en totalité ou en partie de matiè- res aussi diverses que la liqueur de macération de mais, la farine de soja la farine de poisson, la farine d'arachides le sucre, l'amidon, le glucose, le maltose, le dextrose, les alcools les sucres, l'acide citrique, 'et di- verses autres substances carbonéeso Les besoins en azote de la fermentation peuvent être satisfaits par la lique .r de macération de mais, la farine de soja, la farine de poisson, la farine de viande, la caséine hydrolysée, les am no-acides, les sels d'ammonium, les nitrates, l'urée,
et divers autres corps naturels ou sythétiques ou mélanges de ceux-ci. Les divers sels inor- ganiques qui sont souvent utilisés avantageusement comprennent les phospha- tes et carbonates alcalino-terreux et de divers métaux lourds à l'état de traces, omme on l'indiquera dans les exemples précis qui suivent.
Les micro-organismes qui sont envisagés pour servir dans le procé- dé de la présente invention comprennent tous les micro-organismes producteurs d tétracycline qui ont aussi la faculté de produire de la chlorotétracycl'- nE .Les sels organismes décrits jusqu'à présent sont du genre Streptomyces .
En fait, tous les Streptomyces connus qui produisent de la chlorotétracycl-.- ne et de la tétracycline peuvent être classés comme Streptomyces aureofaciens.
On a obtenu de nombreuses souches et de nombreuses mutants, tant naturels que provoqués, de cette espèce, et bien que chaque souche ou chaque mutant puisse varier quelque peu par l'apparence grossière, les besoins nutritifs et à d'autres poirts de vue, pourtant tous les organismes de cette espèce qui produisent de la chlorotéracycline et de la tétracycline doivent selon toute vraisemblance être classés comme Streptomyces aureofacines ll est re- connu que certains taxonomistes peuvent préférer pour des raisons jugées per- tinantes par eux, attribuer à une ou plusieurs de ces variétés une classifi- cation autre que celle de Streptomyces aureofaciens, mais les connaissances que l'on possède actuellement sur l'espèce ne justifient pas cette classifi- cation.
C'est pourquoi aux fini de la présente invention, l'expression Streptom ces aureofaciens" comprend tous les cryptogames du genre Strepto- myces qui produisent à la fois de la chlorotétracycline et de la tétraycli- ne dans des milieux favorables à la fabrication de ces antibiotiques. L'in- vention , sous ses aspects larges, ne concerne pas particulièrement l'espè- ce de micro-org-nisme dont il s'agit, mais bien plutôt la conception nouvel- le qui tend à éliminer les ions chlorure dans les matières nutritives dont on dispose, sans influer aussi de façon nuisible sur la faculté que présen- te la solution nutritive de supporter une croissance adéquate des cryptoga- mes, et sans aucune perte de sa capacité de production d'antibiotique.
L'élimination absolue de tous les ions chlorure dans le milieu de fermenta ion n'est pas nécessaire, et bie entendu, elle est probablement impossible à réaliser. Toutefois, il est désirable d'avoir un produit aussi exempt de chlorotétracycline que possible, et à cet effet, il faut éliminer le plus possible de l'ion chlorure, Giossièrement la présence de 1 micro- gramme par cm3 d'ions chlorure dans le milieu de fermentation peut donner environ quatorze microgrammes par cm3 de chlorotétracycline dans la liqueur de fermentation.
Si le milieu de fermentation et la souche particulière de S aureofaciens choisie amène la formation de seulement 500 microgrammes par cm3 d'antibiotique total, et si le milieu contient 1 mg/1. d'ions chlo- rure, on peut s'attendre à ce que la liqueur de fermentation contiennet 14 microgrammes par cm3 de chlorotétracycline, soit environ 3% du total.
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Par contre ,si le milieu de fermentation et la souche de S.aureo- faciens sont tels qu'il y ait production de 5000 microgrammes par cm3 d'an- tibiotique, et ce résultat est possible si l'on utilise la présente invention, le produit final contiendra moins de 0,3% de chlorotétracycline dans la li- queur de fermentationo Etant donné que, pour la pratique, il n'y a pas d'in- convénient à ce q'un produit antibiotique de ce genre contienne environ 5 -il 6 % de chlorotétracycline, et étant donné que la présente invention est particulièrement applicable à la production de la tétracycline avec des ren- dements de 2000 microgrammes par cm3 et plus,
en voit que le milieu de fer- mentation peut contenir jusqu'à 20 mg/1 d'ion chlorure quand le rendement de fermentation est supérieur à 5000 microgrammes par cm3, mais que, lorsqu' on obtient des renements de seulement 2000 microgrammes environ par cm3 d'antibiotique total, le milieu ne doit pas contenir plus de 8 mg/1 environ d'ic- chlorure. Bien que les souches de s.aurcofaciens à rendement élevé per- mettent l'élimination totale de l'ion chlorure, les grandes quantités d'ions chlorure contenues dans la plupart des matières nutritives d'origine naturelle nécessitent l'élimination des chlorures par le procédé de la présente inven- tion, si l'on veut obtenir les nouveaux résultats envisagés par le procédé de la présente invention.
On illustrera maintenant 1 invention plus en détail au moyen des exemples suivants, dans lesquels on expose en détail les conditions et cons- tituànts précis. On comprendra que l'invention n'est pas limitée à ces for- mes de réalination particulières. Les exemples illustrent la portée de l'in- vention plutôt qu'ils ne la définissent
EXEMPLE 1
On mélange 200 parties en poids de liqueur de macération de mais avec 600 parûtes en volume d'eau, on agite avec un adjuvant, de filtration au silicate de magnésium, et on filtre. On ajuste à 2,3 le p de la solution, d'une valeur initiale de 4,0 à l'aide d'acide sulfurique 6N, dont il faut 60 parties.
On ajoute 60 parties d'une solution aqueuse à 10% de nitrate d'argent, on agite le mélange et on sépare par centrifugation le précipité obtenu, qui contient du chlorure d'argent, et on le met de côté pour en ré- cupérer l'argent. On sature l'hydrogène sulfuré le liquide surnageant, et on sépare par filtration le sulfure d'argent résultant. On élimine sous vi- de l'hydrogène sulfuré en excès, à l'aide d'azote. Après l'élimination de l'hydrogène sulfuré, on ajuste le pH à 4,0 avec de l'ammoniaque aqueux con- centré,et n porte le volume à 1000 volumes par addition d'eau, On utilise cette liqueur de macération de mais déshalogénée comme matière nutritive or- ganique d'origine naturelle pour un milieu de fermentation.
On prépare un milieu de fermentation contenant :
55 g d'amidon
5 g de sulfate d'ammonium
1,2g de sulfate de magnésium
60 mg de sulfate ferreux heptahydraté
50 mg de sulfate de manganèse tétrahydraté
100 mg de sulfate de zinc heptahydraté 6,lm de nitrate cobalteux hexahydraté
20 cm3 d'huile de saindoux g de carbonate de calcium exempt de chlorures
80 mg d'acide phosphorique
1000 g de solution de liqueur de macération de mais déchlorurée, préparée comme décrit plus haut, eau distillée:q.s.)our
1 litre.
On cuit le milieu de fermentation à 120 C pendant 15 min.,on refroi-
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dit et on inocule avec une souche à grand rendement de S.aureofaciens S-77 et on fait fermenter avec agitation et aération. Au bout de 120 h, le milieu fermenté contient plus de 5000 microgrammes par cm3 de tétracycline, teneur déterminée par titrage spetrophotométrique. L'analyse chromatographique indique la présence de 5 % au maximum de chlorotétracycline par rapport à l'antibiotique total présent.
EXEMPLE II
Quand on repète le procédé de l'exemple I en utilisant de la liqueur de macération de mais non traitée au lieu de la liqueur de macéra- tion de mais déchlorurée décrite dans cet exemple, et en utilisant la même souche de S aureofacens on obtient à peu près le même rendement total d' antibiotique par cm3 de substances , dont 1300-1600 microgrammes par cm3 sont de la chlorotétracycline.
EXEMPLE III
Quand on utilise, dans le procédé de l'exemple I, une liqueur de macération de mais qui a été déchlorurée par traitement avec des résines échangeuses d'ions, le rendement total d'antibiotique est inférieur à envi- ron 2000 microgrammes par cm3, ce qui indique que des métabolites essentiels ont été enlevés à la liqueur de macération de mais traitée, par le traite- ment au moyen des échangeurs d'ions.
EXEMPLE IV
On mélange 200 parties en poids de liqueur de macération de mais avec 600 parties en volume d'eau, on agite avec un adjuvant de filtration au silicate de magnésium et on filtre. On ajuste le pH de la solution à 2,5 avec de l'acide nitrique, et on ajoute 60 parties d'une composition à 10% de nitrate mercureux dans l'acide nitrique aqueux à 3% On agite le mélange , et on sépare par filtration le précipité résultant, qui contient du chlorure mercureux. On sature la solution clarifiée avec de l'hydrogène sulfuré, et on sépare par filtration le sulfure mercureux résultant . On élimine l'excès sous vide en utilisant de l'air pour l'agitation. Après élimination de l'hy- drogène sulfuré, on ajuste le pH à 4,0 avec de l'ammoniaque concentré, et on porte le volume à 1000 volumes par addition -d'eau.
On utilise la liqueur de macération de mais ainsi déchlorée dans une fermentation conduite par ailleurs comme dans l'exemple I, et on obtient un rendement d'environ 5000 microgrammes par cm3 de tétracycline. La produc- tion de chlorotétracycline obtenue dans ce procédé est de même inférieur 5% environ de l'antibiotique total obtenu.
La récupération de la tétracycline dans les solutions de fermenta- tion décrites plus haut peut être réalisée par des moyens variés qui toute- fois ne font pas partie de la présente invention . Pour servir dans l'alimen- tation animale, la liqueur de fermentation peut être simplement incorporée aux aliments pour animaux, et on obtient un effet de stimulation de crois- sance REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un milieu nutritif pratiquement exempt de chlorures pour la production de la tétracyoline par biosynthèse, caracté- risé en ce qu'on traite la solution aqueuse de matière nutritive chlorurée par des ions argent et/ou des ions mercureux , à un pH inférieur à 7 environ, et en ce qu'on sépare de la solution aqueuse le chlorure d'argent et/ou le chlorure mercureux ainsi formés.