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La présente invention concerne un nouvel antibiotique soluble dans l'eau qui, dans ce qui va suivre, sera désigné par A 9578, ses compasants, ses sels et dérivés, ainsi que les préparations pharmaceutiques renferment ces com- posés. L'invention concerne aussi un procédé de préparation de ces substances et mélanges de substances.
Le nouvel antibiotique A 9578 se forme lors de la culture d'une nouvelle souche d'actinomycètes qui a été isolée à partir d'une prise d'essai faite dans le sol près de Boston, Massachusetts, Etats Unis d'Amérique, et qui a été conservée dans leslaboratoires de la Demanderesse et à l'Ecole Polytech- nique Fédérale (Zurich Suisse), Institut de botanique spéciale, sous la désig- nation A 9578.
Le Streptomyces A 9578 appartient à la famille du Streptomyces grise- oflavus (Krainsky) de Waksman et Henrici, mais se différencie des autres repré- sentants de cette famille par la formation du nouvel antibiotique soluble dans l'eau. On ne connaît jusqu'à présent qu'une souche de Streptomyces griseoflavus produisant un antibiotique. Il s'agit dans ce cas de ce qu'on appelle la grise- oflavine#Y. Waga "J. Antibiotios Japan", A 6, 66 (1953)qui se différencie cependant déjà du nouvel antibiotique A 9578 par sa solubilité dans les solvants organiques. Le mycélium aérien du Streptomyces A 9578 est gris-cendre.
Les supports des spores sont ramifiés et forment de nombreuses spirales comportant la plupart du temps de 2 à 5 spires. Les spores elles-mêmes ont une grosseur de 1,0-1,4 u x 0,7-0,9 # et portent à leur surface des piquants longs d'environ 0,2 [gamma] qui vont en pointe et ne sont que peu élargis à la base. La croissance dé- pent relativement peu de la température et le champignon se développe aussi bien à 18 qu'à 40 ; toutefois la croissance optimum se situe entre 25 et 32 .
Pour donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance du Streptomyces A 9578 sur différents milieux nutrifis. Les milieux nutritifs 1 à 7 ainsi que 10 ont été préparés suivant W. Lindenhein, "Arch. Pikrobiol." 17, 361 (1952).
1) Célose synthétique Croissance voilée, incolore, pas de mycélium aérien.
2) Milieu synthétique liquider: Sédiment, flocons rougeâtres. Péllicule bien for- mée comportant un mycélium gris-blanc en forme de voile. Substratum jaune-brun à jaune foncé.
3) Célose-glucose : Croissance punctiforme au début, rugueuse au bout de 12 jours jaune pâle.
4) Gélose-glucose à l'asparagine Croissance punctiforme au début, plus tard voilée, jaunâtre. Mycélium aérien velouté, au début gris-brunâtre, plus tard gris-cendre. Substratum jaune.
5) Gélose au malate de calcium -. Croissance voilée jaune-blanc, plus tard jaune foncé. Mycélium aérien peu abondant, farinacé, blanc comme de la fa- rine. Substratum brun-clair.
6) Milieu gélosé (gélatine) à 18 C : Croissance très peu abondante, liquéfaction très lente (0,5 cm au bout de 30 jours).
7) Gélose à l'amidon :Croissance voilée d'un blanc laiteux, pas de mycélium aé- rien. Hydrolyse de l'amidon 1 cm au bout de 5 jours.
8) Pommes de terre Croissance punctiforme au début, jaune-pâle, plus tard pus- tuleuse. Mycélium aérien velouté, jaune-blanc à gris-cendre. Substra- tum coloré en gris-brunâtre.
9) Carottes Croissance très peu abondante. Mycélium aérien peu abondant. Sub- stratum non décoloré.
10) Lait de tournesol :Croissance annulaire et pellicule superficielle incolore.
Mycélium aérien gris-blanc. Hydrolyse lente sans coagulation; tourne-
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sol bleu.
Réaction à la tyrosinase :Négative.
Le Streptomyces A 9578 présente une bonne croissance, d'après la mé- thode de T. G. Pridham et D. Gottlieb, "J. Bacteriology" 56, 107 (1948), lorsqu' on utilise les sources de carbone suivantes : L-xylose, L-arabinos,L-rhamnose,saccha- rose,raffinose,inu line, D-mannite, D-sorbite, mésoinosite, salicine, D-fructose.
En ce qui a trait à la préparation de l'antibiotique A 9578, la pré- sente invention n'est pas limitée à l'utilisation du Streptomyces A 9578 ou d' autres souches correspondant à la description, mais elle concerne également l'u- tilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient, par exemple, par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra- violet ou des rayons X, ou l'action de moutarde à l'azote.
Pour obtenir l'antibiotique A 9578, on cultive de manière aérobie une souche de streptomycètes présentant les propriétés de Streptomyces A 9578, par exemple dans une solution nutrive aqueuse renfermant des hydrates de carbone, des composés azotés ainsi que des sels inorganiques, jusqu'à ce que cette solu- tion présente une action antibactérielle notable, puis on isole ensuite l'anti- biotique A 9578.
Comme hydrates de carbone assimilables, ou envisage par exemple le glucose, le saccharose, le lactose, la mannite, l'amidon ainsique la glycérine.
Comme substances nutritives azotées et comme substances favorisant le cas échéant la croissance, on citera : des acides aminés, des peptides et des protéines, ainsi que leurs produits de dégradation comme les peptones ou les tryptones, ainsi que des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le mais et le froment, des résidus de distillation provenant de la préparation d'alcools, des levures, des fèves, notamment de soja, des graines, par exemple de coton, etc. mais aussi des sels d'ammonium et des ni- trates. Comme autres sels inorganiques, la solution nutritive peut renfermer, par exemple, des chlorures, des carbonates, des sulfates de métaux alcalins et alca- lino-terreux, du magnésium, du fer, du zinc et du manganèse.
La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en cul- ture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans des flacons agités oudans les fermentuers connue. Comme température, une température comprise entre 18 et 40 s'avère appropriée. En opérant ainsi, la solution nutritive accuse un effet an- tibactériel notable, en général au bout'd'un jour et demi à cinq jours.
Pour isoler l'antibiotique A 9578, on peut, par exemple, se servir des procédés suivants : on sépare le mycélium du filtrat de culture, après quoi on trouve dans ledit filtrat la majeure partie de l'antibiotique. Il reste toutefois des quantité'notables d'antibiotique qui sont adsorbées sur le mycélium.
Il est en conséquence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage. A cet effet, sont appropriés notamment l'eau et des solvants organiques aqueux, comme les alcools, par exemple le méthanol aqueux.
Pour extraire l'antibiotique du filtrat de culture et pour le purifier, différentes méthodes sont appropriées qui peuvent être utilisées seules ou en combinaison. Il s'est avéré avantageux, pendant ces opérations, de maintenir la solution de culture à un pH compris entre 3 et 5.
1) On peut utiliser des agents d'adsorption, par exemple des charbons actifs, comme la norite, des terres activées comme la terre à foulon ou la flo- ridine, ou des adsorbants à base de résine, comme l'asmite. L'élution des adsor- bats a lieu avantageusement avec des mélanges de solvants organiques miscibles à l'eau et d'eau ou d'acides aqueux, par exemple avec des mélanges d'eau et de méthanol, d'eau et de pyridine, d'acide acétique dilué et de méthanol, ou d'eau, de méthanol, d'acide acétique glacial et de butanol. C'est avéré particulièrement
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avantageux pour l'élution d'un adsorbat de norite, un mélange d'eau (2.parties en volume), de méthanol (1 partie en volume), d'acide acétique glacial (1 partie en volume) et de butanol (2 parties en volume).
2) Une seconde méthode pour séparer l'antibiotique du filtrat de cul- ture consiste à adsorber l'antibiotique sur des échangeurs de cations, cas dans lequel notamment des résines renfermant des groupes acides, telles l'Amgerilite IRC-50, sont appropriées. Cette dernière peut être utilisée aussi bien sous for- me acide que sous la forme sodique bien qu'un mélange de ces deux formes dans fane proportion volumétrique de 1:2 ait notamment fait ses preuves. L'élution a lieu avantageusement avec des acides dilués, par exemple avec une solution méthanolique d'acide chlorhydrique.
3) En outre, on peut aussi précipiter directement l'antibiotique basique du filtrat de culture, par exemple par réaction sur un acide organique du type de l'acide piorique. En traitant ces précipités avec des sels de bases organiques, par exemple avec du sulfate de triéthylammonium, ou avec des acides dilués, on obtient l'antibiotique:sous la forme du sel correspondant. Dans ce cas, on peut travailler aussi bien dans un milieu aqueux que dans un solvant miscible à l'eau, comme le méthanol ou l'acétone. Cette transformation des sels difficilement solubles en sels facilement solubles de l'antibiotique est effec- tuée soit à l'aide d'acides minéraux, soit sur des résines échangeuses d'ions, par exemple sur de l'Amberlite IRA-400.
4) On peut aussi obtenir un enrichissement de l'antibiotique en ajoutant à des solutions aqueuses ou à des solutions alcooliques aqueuses du sel, un excès de solvants organiques miscibles à l'eau, comme l'acétone, le dioxane, etc., les sels étant alors précipités sous forme solide.
5) Une autre méthode d'enrichissement de l'antibiotique consiste à extraire des solutions aqueuses dudit antibiotique avec des solutions de phé- nol dans le chloroforme, auquel cas aussi bien le pH de la solution aqueuse que la teneur en phénol de la solution chloroformique sont susceptibles de variations.
Lorsqu'on effectue par exemple une répartition entre une solution renfermant 100 g de phnéol pour 100 cm3 de chloroforme, et une phase aqueuse d'un pH de 1 à 6, l'antibiotique se trouve alors presque exclusivement dans la phase organique, tandis que lorsqu'on utilise une solution ne renfermant que 33 g de phénol pour 100 cm3 de chloroforme, on soutire ledit antibiotique presque complètement de la phase aqueuse, simplement à un pH compris entre 4 et 6. Si l'on entend par coefficient de répartition de l'antibiotique le rapport de la concentration dans la phase organique à la concentration dans la phase aqueuse, il ressort alors des indications ci-dessus que le coefficient de répartition augments au fur et à mesure que croit la teneur en phénol de la phase organique et décroît au fur et à mesure que diminue le pH de la phase aqueuse.
Etant donné qu'il est ainsi possible d'établir dans ce système tout coefficient quelconque de répartition de l'entibiotique, on peut en combinant un nombre minime d'opérations de répar- tition, séparer une grande quantité d'impureté inactives.
6) Une autre méthode d'enrichissement pour l'antibiotique est offer- te par la chromatographie, par exemple une chromatographie d'adsorption sur différentes matières, par exemple sur de la norite, de l'oxyde d'aluminium, des silicates de magnésium, du gel de solice, du sulfate de calcium, ainsi qu'une chromatographie de répartition avec de la cellulose, de l'amidon, du gel de silice, de la célite et analogues comme substances de support, ou également une chromatographie sur des résines échangeuses d'ions, par exemple sur du "Dowex 50", de l'Amberlite IRC-50 et analogues. Une chromatographie de répartition sur de la cellulose, avec utilisation du système solvant butanol (4 parties en volume), acide aétique glacial (1 partie en volume) et eau (5 parties en volume), par exemple s'est avérée particulièrement avantageuse.
7) En outre, l'antibiotique peut être enrichi par une chromatographie à contre-courant suivant Craig entre deux phases solvantes non-miscibles. Dans
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ce cas les systèmes solvants suivants se dont avérés particulièrement avanta- geux : a) Butanol secondaire - solution-tampon 1/10 normale d'acétate d'ammonium, d'un pH de 4,68. b) Solution-tampon 1/10 normale d'acétate d'ammonium, d'un pH de 4,6 - solution à 10% de phénol dans le chloroforme. Le coefficient de répartition de l'antibiotique dans le système b) et par suite la situation du maximum d'activi- té dans la répartition peut être modifié à la demande, d'une part, en faisant varier le pH de la solution-tampon et, d'autre part, en faisant varier la teneur en phénol de la phase organique.
Pour obtenir une préparation encore plus pure il s'est avéré appro- prié de combiner de la façon suivante les procédés d'enrichissement indiqués : A partir du filtrat de culture, on adsorbe l'antibiotique sur un échangeur d'ions tamponné d'Amberlite IRC-50 et élue à l'aide d'une solution méthanolique d'aci- de chlorhydrique. Les éluats'sont concentrés sous vide à un pH de 5, ce qui fait qu'on obtient un concentrat aqueux de-l'antibiotique qui, en ce qui con- cerne son volume, correspond environ au 1/100 de la solution de culture.
On répartit ce concentrat suivant la méthode 5) indiquée ci-dessus, à plusieurs reprises entre des mélanges de phénol et de chloroforme, d'une part, et des so- lutions aqueuses d'un pH variable, d'autre part, ce qui fait qu'après un sécha- ge par réfrigération on obtient une préparation qui, par rapport au filtrat de culture, possède une activité spécifique accrue d'une valeur de 500 à 1000.
En traitant une telle préparation suivant la méthode 6) indiquée ci-dessus (chro- matographie de répartition sur de la cellulose), et suivant la méthode 7), on peut obtenir l'antibiotique A 9578 basique, largement unitaire, de préférence sous la forme d'un sel.
Ainsi que l'ont montré des essais effectués par chromatographie sur papier, l'antibiotique A 9578 est constitué par au moins deux composants, à savoir par le composant principal A et par le composant secondaire B. Ces compo- sants sont encore plus séparés l'un de l'autre au cours du processus d'enrichis- sement décrit, spécialement lors de la chromatographie de répartition sur de la cellulose et;lors de la répartition à contre-courant.
Les deux composants de l'antibiotique A 9578 sont définis dans la chro- matographie sur papier par une comparaison directe de leurs valeurs de R avec les valeurs de R d'une série d'antibiotiques connus (2 à 11) dans les systèmes A à G. Dans le système H on chromatographie par traversée. Les nombres indiqués sont dans le tableau qui suit les étalements, exprimés en cm, des antibiotiques au bout de 16 heures de chromatographie. On décèle les antibiotiques de manières auto-biographique à l'aide de Staphylecoccus aureus ou de Bacillus subilis.
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EMI5.1
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Sys-
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<tb> tème <SEP> 1a <SEP> 1b <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11
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<tb> A <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,92 <SEP> 0,07 <SEP> 0
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<tb> B <SEP> 0,49 <SEP> 0,63 <SEP> 0,05 <SEP> 0,05 <SEP> 0,17 <SEP> 0,02 <SEP> 0,02 <SEP> 0,66 <SEP> 0,55 <SEP> 0,92 <SEP> 0,32 <SEP> 0,22
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> C <SEP> 0,34 <SEP> 0,58 <SEP> 0,22 <SEP> 0 <SEP> 0,02 <SEP> 0,22 <SEP> 0,03 <SEP> 0,72 <SEP> 0,62 <SEP> 0,93 <SEP> 0,39 <SEP> 0,11
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<tb> D <SEP> 0,05 <SEP> 0,15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0,92 <SEP> 0
<tb>
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<tb> E <SEP> 0,32 <SEP> 0,32 <SEP> 0 <SEP> 0,10 <SEP> 0,22 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0,86 <SEP> 0,
12
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<tb>
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<tb> F <SEP> 0,47 <SEP> 0,47 <SEP> 0,22 <SEP> 0,14 <SEP> 0,12 <SEP> 0,04 <SEP> 0,05 <SEP> 0,49 <SEP> 0,42 <SEP> , <SEP> 0,91 <SEP> 0,43 <SEP> 0,36
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<tb>
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<tb>
<tb> G <SEP> 0,74 <SEP> 0,74 <SEP> 0,07 <SEP> 0,02 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0,94 <SEP> 0,61 <SEP> 0,69
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<tb> H <SEP> 2,7 <SEP> 7,6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> (14, <SEP> (8,8) <SEP> 27 <SEP> 1
<tb>
A Butanol saturé d'eau B Mélange de butanol, d'acide acétique glacial et d'eau (4: 1:5) (pha- se supérieure) @ @ C Butanol saturé d'eau + 2%d'acide p-toluène-sulfonique D Butanol saturé d'eau + 2% de pipéridine E Mélange de butanol, de pyridine et d'eau (6:4:3).
EMI5.2
F 80%''d'éthanol + 1,5% de chlorure de sodium, papier Whatman N 4 imprégné avec une solution 0,95-molaire de sulfate de sodium + une solution 0,05-molaire d'hydrosulfate de sodium.
G Mélange de butanol, d'éthanol et d'eau (1:1:2).
H Mélange de butanol, d'acétate de butyle, d'acide acétique glacial et d'eau (10:3:1,3:14,3) (phase supérieure)
1a A 9578 base A
1b A 9578 base B
2 Streptomycine
3 Ristocétine A
4 Ristocétine B
5 Néomycine B
6 Viomycine
7 Chlorotétracycline
8 Hydroxytétracycline
9 Actinomycine J
10 Cyclosérine
11 Griséine x Antibiotique réparti sur tout le trajet d'étalement () Position imprécise
Lors d'une électrophorèse sur papier dans une solution 0,1-molaire d'un acétate-tampon, d'un pH de 4,6, l'antibiotique A 9578 migre vers la cathode.
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La vitesse de migration est environ moitié de celle de la streptomycine.
Le composant A de l'antibiotique A 9578 est une poudre d'une jaune- orange, qui se dissout facilement dans l'eau, se dissout bien dans le méthanol et se dissout difficilement dans la plupart des solvants organiques.
La base A fournir les réactions colorées suivantes : FeCl3 : rouge-brun FeCl3-K3Fe(CN)6 :bleu Ninhydrine : violet pâle Les tests de Sakaguchi, de Maltol et d'Ehrlich-Morgan sont négatifs. Une solution aqueuse du composant A présente dans le spectre ultra-violets des maxima d'absorp- tion à 215 mn/ (E 1 % 1 cm = 312) et à 315 mu (E 1 cm = 42).
La base libre de l'antibiotique A 9578 est facilement accessible à partir de ses sels, à partir du sulfate par exemple, par réaction-en milieu
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aqueux sur de l'hydroxyde de baryum, par neutralisation de2a baryte en exoesa#didicsde de car1x# am3io,7e par séjaraticndu Izédpa:ê de ca.eb#ace de k.:r;llUl et du. sulfate de baryum et-par L3D]eimnt de la base libre à l'aide d'un séchage par réfrigération. Plus simplement, la préparation à partir des sels a lieu en utilisant un échangeur d'anions for- tement basique, par exemple la forme hydroxylée du produit qu'on trouve dans le commerce sous la dénomination "Dowex 2".
Une des propriétés de l'antibiotique A9578 qui se reproduit le plus souvent est un minimum de stabilité marqué entre pH 6 et pH 9. A 2000-et à une valeur de pH de 7 et de 8 les solutions de l'antibiotique perdent, au cours de 48 heures, la majeure partie de leur activité tandis qu'à la même tempéra- ture et à un pH de 1 à 5 et de 10 à 13, elles restent pleinement efficaces.
Les sels de l'antibiotique A 9578 et de ses composants dérivent des sels inorganiques et organiques connus,par exemple de ceux de l'acide chlorhydri- que, des acides sulfuriques et des acides phosphoriques, des acides acétique, propionique, valérianique, palmitique ou oléique, des acides succinique, ci- trique, mandélique, glutamique ou pantothénique. Ils constituent des sels neutres ou acides. Leur préparation a lieu en faisant agir les acides correspondants sur la base libre, ou par double décomposition de sels, par exemple de sulfate de! A 9578 avec du pantothénate de calcium.
L'antibiotique A 9578 présente une activité antibiotique très élevée vis-à-vis des différents organismes-tests. Dans le test dit du trait transversal à la gélose il est actif vis-à-vis des organismes-test suivants : le Micrococ- cus pyogenes, var. aureus, le Streptococcus viridans, le Streptococcus faccalis, le Corynebacterium diphteriae, l'Escherichia coli, le Bacillus megatherium et le Bacillus subtilis.
L'antibiotique A 9578 est également actif in vivo. Lorsqu'on l'admi- nistre à 5 reprises par voie sous-cutanée, à raison de 10 mg par kg, à des sou- ris infectées*avec du Sttphylococcus pyogenes, var. aureus, on observe 100 % de survivantes et pour une dose de 5 fois 5 mg par kg, on observe 50% de survi- vantes. Lorsque les souris sont infectées avec de l'Escherichia coli on observe 50% de survivantes en leur administrant à 5 reprises, par voie sous-cutanée, 50 mg d'antibiotique par kg.
La toxicité de l'antibiotique est minime. C'est ainsi, par exemple, qu'une administration sous-cutanée de 1000 mg par kg est supportée sans dommage par des souris. Des doses supérieures n'ont pas encore été éprouvées.
L'antibiotiqueA 9578, ses composants, ses sels ou dérivés peuvent être
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utilises comme médicaments, par exemple sous la forme de préparations pharmaceu- tiques renfermant les composés indiquée en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, appropriée pour une application enté- rale, parentérale ou locale. Pour cette matière de support, on envisage les substances ne réagissant pas sur les nouveaux composés, comme par exemple, la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommes, des polyalcoylèneglycols, la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus.
Les préparations phar- maceutiques peuvent se présenter par exemple à l'état de comprimés, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes, de suppositoires, ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émulsifiants.
Elles peuvent aussi renfermer encore d'autres substances thérapeutiquement pré- cieuses.
L'invention concerne également, à titre de produits industriels nou- veaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limita- tifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centi- grades.
Exemple 1
La culture du Streptomyces A 9578 est effectuée suivant le procédé de culture immergée. On utilise une solution nutritive renfermant par litre d'eau du robinet 20 g de farine de soja et 20 g de mannite. On stérilise la solution nutritive dans le ballon d'ensemencement ou dans les fermenteurs,pendant 20 à 30 minutes sous une pression d'une atmosphère effective. La solution nutritive stérilisée présente un pH de 7,5 à 8,0. L'ensemencement a lieu avec une quan- tité allant jusqu'à 10% d'une culture végétative partiellement sporulante de l' organisme. Tout en secouant bien ou en agitant, on incube, à 27 , dans les fermenteurs,en faisant passer par minute, dans les cultures, environ 2 volumes d'air stérile par volume de solution.
Au bout de 48 à 120 heures d'incubation, la solution de culture atteint la valeur inhibitrice maximum vis-à-vis des organismes tests (Bacterium subtilis, Bacterium megatherium, Micrococcus pyoge- nes, var. aureus). On interrompt la culture, porte le pH à 4,5 par addition d' acide sulfurique dilué, puis par filtration ou centrifugation, sépare le mycé- lium ainsi que d'autres composantes solides de la solution renfermant la majeu- re partie de l'antibiotique, en ajoutant le cas échéant à la solution de culture, avant filtration, environ 1% d'un auxiliaire de filtration, par exemple de l'Hyflo supercel. On lave les résidus de filtration à l'eau et avec du méthanol aqueux, puis réunit les liquides de lavage avec les filtrats de culture.
Si 1 on utilise, à la place de la solution nutritive indiquée ci-des- sus, une solution renfermant par litre d'eau les substances nutritives ci-après, on obtient alors après une culture et un traitement analogues, des filtrats de culture présentant une activité antibiotique aussi élevée.
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<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb> b) <SEP> Glycérine <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
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<tb> c) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor <SEP> (eau <SEP> de <SEP> gonflement <SEP> du <SEP> mais) <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb> d)
<SEP> Lactose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
Exemple 2.
En ajoutant une solution diluée d'hydroxyde de sodium, on ajuste à un pH de 7,5 trois litres d'un filtrat de culture obtenu suivant l'exemple 1, puis ajoute 50 g de charbon actif (Norite A). On agite mécaniquement pendant une heure, ce qui fait que la totalité de la substance présentant une activité antibiotique est adsorbée par le charbon. On sépare cette substance active de la solution complètement inactive, en filtrant, avantageusement en ajoutant un peu d'un auxiliaire de filtration, tel que de l'Hyflo Supercel par exemple.
On verse ensuite le charbon dans 500 cm3 d'un mélange formé de 4 parties en volume d'eau et d'une partie en volume de pyridine, agite le mélange mécanique- ment pendant une demi-heure et filtre ensuite, pour extraire encore à une repri- se, de la même manière, le résidu du charbon. Les éluats renferment la totalité de l'activité antibiotique.
Exemple 3.
En ajoutant une solution diluée d'hydroxyde de sodium, on ajuste à un pH de 7,5 trois litres d'un filtrat de culture obtenu suivant l'exemple 1 et ensuite porte aussitôt le tout, avec une vitesse de traversée de 0,5 litre par heure, sur une colonne d'Amberlite IRC-50 (forme hydrogénée), dont la lon- gueur et le diamètre sont respectivement de 30 et de 5 cm. L'antibiotique est alors complètement adsorbé. On lave la colonne avec 3 litres d'eau. Pour l'élu- tion, on utilise un litre d'acide chlorhydrique 0,4-normal. Les premiers 500 em3 de l'éluat sont inactifs du point de vue antibiotique, tandis que les 500 cm3 suivants renferment la totalité de l'activité. En vue de l'élimination de l'aci- de chlorhydrique en excès, cet éluat actif est soumis à une percolation à travers une colonne d'Amberlite IR-4B.
En soumettant le produit de percolation à un séchage par réfrigération, on obtient l'antibiotique A 9578 enrichi sous la for- me d'une poudre amorphe hautement active.
Exemple 4.
En ajoutant une solution diluée d'hydroxyde de sodium, on ajuste à un pH de 7,5 six litres d'un filtrat de culture obtenu suivant l'exemple 1 et percole ensuite aussitôt à travers une colonne d'Asmite 173 d'une longueur de 14 cm et d'un diamètre de 4,5 cm. L'antibiotique est alors complètement adsorbé.
On lave ensuite la résine adsorbante avec 3 litres d'eau et élue l'antibiotique avec un litre d'un mélange de méthanol et d'acide chlorhydrique normal (1:1).
On concentre sous vide, à 35 , jusqu'à un volume de 15 cm3, l'éluat qui renfer- me la totalité de l'activité. A cette solution, on ajoute 75 cm3 d'une solution méthanolique 0,25-normale d'acide chlorhydrique et verse le mélange dans 10=li- tres d'acétone, ce qui fait que le chlorhydrate de l'antibiotique précipite.
On le filtre et le lave à l'acétone. En vue de le purifier davantage, on le dis- sout dans 150 cm3 de méthanol et filtre la solution un peu trouble en ajoutant de la célite. Après avoir évaporé le filtrat sous vide à 25 , on obtient le chlorhydrate de l'antibiotique A 9578 sous la forme d'une poudre amorphe.
Exemple 5.
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On ajuste à un pH de 4,5 trente litres d'un filtrat de culture obte- nu suivant l'exemple 1 et concentre ensuite jusqu'à 2 litres dans un évaporateur en couches minces. On ajuste le concentrat a un pH de 8 par addition d'une so- lution diluée d'hydroxyde de sodium, puis le filtre en ajoutant de la célite.
Le filtrat limpide est ajusté à un pH de 5 et, tout en agitant, on y ajoute 1,5 litre d'une solution aqueuse chaude à 5% d'acide picrique. Après avoir laissé le précipité formé reposer pendant plusieurs heures à 0 , on le sépare par fil- tration tout en ajoutant 50 g de célite. Le filtrat n'a qu'une très faible acti- vité antibiotique. On agite ensuite'le résidu de filtration à trois reprises avec chaque fois 800 cm3 d'acétone froide, puis filtre. On concentre le filtrat sous vide jusqu'à 80 cm3, ce qui fait que le picrate de l'antibiotique et l'aci- de picrique en excès précipient. Après séparation, on obtient 8,5 g de substan- ce sèche.
Pour isoler l'antibiotique à l'état de chlorhydrate, on dissout, dans 30 cm3 de méthanol, 2,5 g de la substance sèche mentionnée. Ensuite, on ajoute d'abord un mélange d'un cm3 d'acide chlorhydrique concentré et de 10 em3 d'acétone, puis ensuite 500 cm3 d'éther, ce qui fait que le chlorhydrate préci- pite quantitativement. En dissolvant à plusieurs reprises le précipité dans une solution chlorhydrique de méthanol et en précipitant à l'éther, on peut éliminer dudit précipité les derniers restes picrique. Finalement, on dissout le chlorhy- drate dans le moins possible de méthanol, filtre et évapore sous vide. On ob- tient 714 mg du chlorhydrate de l'antibiotique A 9578, qui est très actif du point de vue antibiotique.
Exemple 6.
Avec 5,5 kg d'Hyflo supercel, on agite 600 litres d'un filtrat de culture obtenu suivant l'exemple 1, ajuste à un pH d'une valeur de 4,0 à l'aide de 2,5 litres d'acide chlorhydrique binormal, et filtre ensuite. On lave le ré- sidu de filtration avec 100 litres d'eau. On agite le filtrat limpide pendant 45 minutes avec 7 kg de nor.ite préalablement traitée. Le traitement préalable de la norite a lieu en l'agitant à plusieurs reprises avec de l'acide chlor- hydrique normal et en lavant ensuite à neutralité avec de l'eau. La norite char- gée d'antibiotique est séparée par filtration. Le filtrat ne renferme pas d'ac- tivité antibiotiqueo L'adsorbat de norite est lavé à deux reprises avec 200 li- tres d'eau, par agitation et filtration. Le liquide de lavage ne renferme pas d'activité.
L'élution a lieu en agitant par deux fois pendant une heure le char- bon actif avec un mélange de butanol normal, de méthanol, d'acide acétique gla- cial et d'eau dans un rapport volumétrique de 2:1:1:2, le charbon actif étant séparé par filtration. Après avoir réuni les éluats (140 litres + 46 litres), on les mélange bien avec 96 litres d'acétate de n-butyle. La phase aqueuse qui se forme est séparée et la phase organique est lavée ensuite avec 1,2 litre d'eau. Après avoir réuni les phases aqueuses (65,5 litres) on les lave, par agi- tation, successivement avec 72 litres d'un mélange de butanol normal et d'acéta- te de n-butyle dans un rapport volumétrique de 1:2, avec 48 litres d'acétate d'éthyle et finalement avec 24 litres d'éther. Les phases organiques sont jetées.
La phase aqueuse qui reste (44 litres), qui renferme la totalité de l'activité antibiotique, est concentrée à 30 au plus, dans un évaporateur de Quickfitt, jusqu'à un volume de 5,45 litres. A partir de ce concentrat hautement actif, d' un brun noir, on obtient l'antibiotique, par un séchage par réfrigération, sous la forme de 509 g d'une poudre brune. Cette matière présente, par rapport au fil- trat de culture, une activité antibiotique spécifique 30 à 50 fois plus forte.
Exemple 7.
Pour isoler l'antibiotique A 9578 à partir de 300 litres d'un filtrat de culture obtenu suivant l'exemple 1, on mélange une partie en volume d'Amber- lite IRC-50, sous la forme hydrogénée, avec deux parties en volume d'Amberlite IRC-50, sous la forme sodique. On verse 6,3 litres de ce mélange dans une colon- ne en verre. Le rapport de la hauteur au diamètre du lit de résine est de 8 :1.
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Le filtrat de culture est ajusté à un pH de 4,0 avec de l'acide chlorhydrique binormal et on le percole, à une vitesse de passage de 0,2 litre par minute et par litre de résine, à travers ladite résine, ce qui fait qu'il se forme dans les deux tiers supérieurs de la colonne une zone brun-orange. La résine est ensuite lavée avec 30 litres d'eau et avec 60 litres de méthanol à 80%. Le produit qui passe et les liquides de lavage ne renferment que peu d'activité antibiotique. L'élution a lieu en deux portions avec au total 37 litres d'un mé- lange de 8 parties en volume de méthanol et de 2 parties en volume d'acide chlor- hydrique normal.
Les deux portions sont ajustées à un pH de 5,0 à l'aide d'une solution penta-normale d'hydroxyde de sodium, réunies et concentrées ensuite, à une température au plus égale à 30 , à un volume de 2 litres dans un évapora- teur à circulation. Le concentrat aqueux est ajusté à un pH de 5,6 et, en vue d'éliminer peu de matière insoluble, on filtre à travers de l'Hyflo-superoel.
Ce filtrat (2,3 litres) renferme à peu près la totalité de l'activité antibioti- que de la solution de culture. On l'extrait en 4 portions avec au total 500 cm3 d'un mélange de phénol et de chloroforme renfermant 100 g de phénol dans 100 cm3 de chloroforme. On jette la phase aqueuse. On dilue avec un litre de chloroforme l'extrait (500 am3) obtenu avec le mélange de phénol et de chloroforme, puis extrait à trois reprises avec chaque fois 500 om3 d'une solution décinormale d' un tampon à l'acétate d'ammonium d'un pH de 4,60, ce qui permet de soutirer de le phase organique les impuretés colorées qui sont inactives du point de vue antibiotique. On extrait alors la phase chloroformique avec 300 + 2 fois 100 cm3 d'une solution décinormale d'acide chlorhydrique.
L'extrait acide de couleur rouge formé qui renferme l'antibiotique est ajusté à un pH de 3,5 avec du bicar- bonate de potassium et extrait en retour avec 4 portions de 50 cm3 d'un mélange de phénol et de chloroforme (100 g : 100cm3). On filtre à travers de la célite l'extrait obtenu avec le mélange de phénol et de chloroforme. Tout en secouant fortement on ajoute au filtrat limpide (200 om3) de couleur rouge 50 cm3 d'eau, 500 cm3 d'éther et 300 cm3 d'éther de pétrole. Après avoir séparé la phase aqueu- se, on lave ensuite la phase organique à deux reprises avec 50 cm3 d'eau. Après avoir réuni les extraits aqueux on les extrait à deux reprises avec 500 cm3 d'éther et à une reprise avec 500 cm3 de benzène, et les lyophilise ensuite.
On obtient 2,60 g d'une poudre de couleur brun-orange,qui possède une haute ac- tivité antibiotique. Par rapport à la matière de départ, cette matière présente une activité antibiotique spécifique 500 à 1000 fois plus grande (activité par unité de poids de substance sèche)o Sur du papier Whatman N 1, cette matière présente dans le système butanol normal :acétate de n-butyle :acide acétique glacial eau = 10:3:1,3:14,3, lors du développement autobiographique avec du Staphylococcus aureus, 2 taches de substance. La substance antibiotique qui migre plus lentement est désignée par base A, et la substance qui migre deux fois et demie plus vite est désignée par base B. La base A fournir sur le papier une réaction colorée bleue lorsqu'on effectue une touche avec un mélange de Fecl3 et de K3feCl6.
Exemple 8.
Dans 1,5 litre d'eau on dissout 338 g d'une préparation d'antibiotique obtenue suivant l'exemple 6. On ajoute au tout 150 g de sulfate d'ammonium cris- tallin et extrait la solution avec un litre + deux fois 500 cm3 d'un mélange de phénol et de chloroforme renfermant 100 g de phénol dans 100 cm3 de chloroforme.
Après avoir réuni les extraits obtenus avec le mélange de phénol et de chloro- forme, on les extrait avec 750 cm3 d'acide chlorhydrique normal pour les filtrer ensuite à travers une couche de célite. Tout en agitant, on ajoute au filtrat limpide de couleur brun-rouge 600 cm3 d'eau, 4 litres d'éther et finalement 4 litres d'éther de pétrole. On sépare la phase aqueuse et extrait ensuite la pha- se organique avec deux fois 200 cm3 d'eau. Après avoir réuni les phases aqueuses (un litre) on les lave à deux reprises avec un litre d'éther, et ensuite les lyophilise. On obtient 136 g d'une poudre brune qui, par rapport à la matière de départ, présente une activité antibiotique spécifique accrue du facteur 2.
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Exemple 9.
Dans 55 cm3 d'une solution décinormale d'un tampon à l'acétate d'am- monium d'un pH de 4,60, on dissout 550 mg d'une préparation d'antibiotique for- tement active (base B) obtenue suivant l'exemple 1 et extrait à quatre reprises avec 20 cm3 d'un mélange de phénol et de chloroforme renfermant 100 g de phénol dans 400 cm3 de chloroforme. On lave en retour les extraits organiques avec deux fois 15 cm3 de la solution-tampon. L'extrait organique (80cm3) renfermant l'an- tibiotique est dilué avec 40 cm3 de chloroforme, lavé encore une fois avec 60 cm3 de la solution-tampon, puis filtré ensuite à travers un double filtre à plis.
On extrait le filtrat de couleur rouge foncé avec 30 + 20 + 10 cm3 d'acide chlor- hydrique 0,2-normal. La solution acide renfermant l'antibiotique est diluée avec 50 cm3 d'eau, puis extrait jusqu'à épuisement avec 2 fois 20 +'10 cm3 d'un mé- lange de phénol et de chloroforme renfermant 100 g de phénol dans 100 cm3 de chlo- roforme. Après avoir réuni les extraits obtenus avec le mélange de phénol et de chloroforme, on les filtre à travers un double filtre à plis et extrait avec 20 cm3 d'eau, 200 cm3 d'éther et 100 cm3 d'éther de pétrole. Après avoir séparé la phase aqueuse, on extrait ensuite la phase organique avec deux fois 15 cm3 d'eau. Après avoir réuni les extraits aqueux ; on les lave à deux reprises avec 50 cm3 d'éther à et à une reprise avec 50 cm3 de benzène, et ensuite les lyophi- lise.
On obtient 117 mg d'un poudre d'un rouge-brun qui, par rapport à la matiè- re de départ, présente un enrichissement à peu près quintuple de l'activité antibiotique.
Exemple 10.
Sur 127 g de poudre de cellulose Whatman N 1, on chromatographie 700. mg d'une préparation antibiotique obtenue suivant l'exemple 7. Comme agent d'élution, on utilise la phase supérieure d'un mélange de 4 parties de butanol, d'une partie d'acide acétique glacial et de 5 parties d'eau. Après avoir séparé la phase supérieure, on y ajoute 10% en volume de butanol pur. On malaxe la sub- stance avec une quantité décuple de poudre de cellulose et la verse à l'état de poudre sur la colonne. La vitesse de passage est de 15 à 20 cm3 par heure.
On recueille les fractions allant jusqu'à 40 cm3. Les diverses fractions sont extraites avec 50 cm3 d'éther de pétrole. La phase aqueuse séparée est lavée au benzène, puis lyophilisée. La majeure partie de l'activité antibiotique se trou- ve dans les fractions 7 et 8 (121 mg) et dans les fractions 10 à 13 (142 mg).
D'après les examens effectués par chromatographie sur papier, les fractions 7 et 8 renferment surtout la base B et les fractions 10 à 13 surtout la base A.
Exemple 11.
Dans un appareillage de répartition de Craig, on répartit en 100 stades, dans le système butanol secondaire-solution-tampon décinormale d'acéta- te d'ammonium d'un pH de 4,68, 3 g d'une préparation d'antibiotique obtenue sui- vant l'exemple 8. Chaque unité renferme 100 cm3 d'une phase supérieure et 100 cm3 d'une phase inférieure. La substance est placée dans l'unité ? 3. Le trai- tement a lieu en ajoutant au mélange des deux phases un volume double d'éther de pétrole en lyophilisant la phase aqueuse. Les fractions 3 à 11 de couleur fon- cée ne renferment que peu d'activité antibiotique. Les fractions 12 à 20 (631 mg) qui sont de couleur jaune-orange renferment la majeure partie de l'activité an- tibiotique (surtout la base A).
Les fractions 21 à 40 qui sont de couleur jaune sont faiblement actives et renferment un mélange de la base A et de la base B dans lequel la seconde prédomine.
Exemple 12.
Dans un appareillage de répartition de Craig, on répartir en 29 sta- des, dans le système solution-tampon 1/20-normale d'acétate d'ammonium, d'un pH de 4,58, - 10% de phénol dans le chloroforme, 200 mg d'une préparation d'anti- biotique (base A) obtenue suivant l'exemple 10. Chaque stade renferme 10 cm3 d'une phase supérieure et 10 cm3 d'une phase inférieure. La majeure partie de
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l'activité antibiotique se trouve dans les fractions 6 à 15. On réunit ces der- nières (environ 200 cm3), y ajoute 400 cm3 d'éther et 300 cm3 d'éther de pétrole, puis secoue. Après avoir séparé la phase aqueuse de couleur rouge-orange, on la lave avec du chloroforme et l'extrait avec 20 + 3 fois 10 cm3 d'un mélange de 100 g de phénol dans 100 cm3 de chloroforme.
Tout en agitant, on ajoute à l'ex- trait obtenu avec le mélange de phénol et de chloroforme, 20 cm3 d'eau, 300 cm3 d'éther et 200 cm3 d'éther de pétrole. On sépare la phase aqueuse de couleur rou- ge, la lave avec beaucoup d'éther et avec du benzène, puis la lyophilise. On ob- tient 86,4 mg de la base A sous la forme d'unepoudre jaune qui est soluble dans l'eau. Spectre ultra-violet dans l'eau : # max 215 mu
EMI12.1
(E m = 312), 9 315 1 (E 1 cm = Q-2 ) .
Réactions $colorées : FeCl3 : rouge-brun;
Fecl3 + K3Fe (CN)6 : bleu; Ninhydrine : faiblement positive
Négatives : Sakaguchi, Maltol, Elson-Morgan.
REVENDICATIONS.
1. Un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique, de ses compo- sants, sels et dérivés, caractérisé par le fait qu'on cultive dans une solution nutritive une souche d'actynomycètes présentant les propriétés du Streptomyces A 9578, ou une mutation de cette souche, jusqu'à ce que ladite solution présen- te un effet antibiotique notable et qu'on isole ensuite de la solution nutritive l'antibiotique A 9578 et, si on le désire, qu'on le divise en ses composants et/ou qu'on prépare des sels ou dérivés de ces composés.
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points sui- vants :
1) On utilise la souche d'actinomycètes A 9578, ou une mutation de cette souche.
2) On effectue la culture dans des conditions aérobies, de préfé- rence en culture immergée dans un milieu aqueux renfermant des hydrates de car- bone assimilables, des composés azotés, des sels inorganiques, ainsi que, le cas échéant, des substances favorisant la croissance.
3) La culture a lieu pendant 36 à 120 heures, à une température com- prise entre 18 et 40 , de préférence à 27 .
4) On sépare le filtrat de culture du mycélium à un pH compris entre 3 et 5.
5) L'antibiotique est isolé de la solution de culture par adsorption à l'aide de charbon actif, de terres activées ou d'adsorbants à base de résine.
6) L'antibiotique adsorbé est extrait avec un agent d'élution acide.
7) On utilise comme liquide d'élution un solvant organique miscible à l'eau ou un mélange aqueux d'un tel solvant.
8) On utilise comme liquide d'élution un mélange de méthanol et d'une solution aqueuse diluée d'acide acétique.
9) L'éluat est concentré sous vide à basse température et l'antibio- tique est précipité du concentrât avec de l'acétone.
10) L'antibiotique est isolé de la solution de culture par adsorption à l'aide d'un échangeur de cations.
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