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La présente invention est relative à de nouveaux compo- sés et à leurs procédés de préparation. Elle a parmi ses objets, un nouvel antibiotique, désigné ici par 101a et un procédé de production de cet antibiotique.
Le nouvel antibiotique de la présente invention peut être produit dans un procédé de fermentation dans lequel l'espèce de Streptomyces 101 est cultivée dans un milieu nutritif aqueux et en est récupérée âpres qu'une activité antibiotique importante lui ait été impartie.
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EMI2.1
L'espèce Streptomycea est une nouvelle eSpb\" qui a été isolée d'un échantillon de sol de Dallas, Texas . Une cuxtu- re de l'organisme vivant a été déposée à la Fermentation Division, Northern Utilization Research Branche Département 'de l'Agriculture des Etats-Unis à Peoria, en Illinois, et a été ajoutée à sa collec-
EMI2.2
tion permanente sous la référence MOREL 2494. Ce nouveau micro-or- ganisme se caractérise nettement par le développement de granules pigmentés, à la fois dans le mycélium végétatif et dans le mycélium aérien.On a observé que seules deux autres espèces, Steptomyces fulvissimus et Streptomyces rubrireticuli, développent des granule* pigmentées. Ces deux espèces, cependant, produisent des antibioti-
EMI2.3
ques qui sont nettement différents du lOla.
La première espèce produit la valinomycine qui se distingue du 10.a par ses cristaux incolores. Les cristaux de lOla sont colorés de façon caractéris- tique. L'autre espèce produit la streptine et J'hydroxyscrevtomyci- ne (réticuline), qui se dîstin,7,.t-, toutes deux du lOla par leur insolubilité dans l'acétone, le chloroforme et l'éther. Une autre caractérisation de la nouvelle espèc" t de ses diverses souches ou variantes, qui produisent toutes le sera donnée ci-après.
Le 101a peut être produit en cultivant l'espèce Strep-
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tomyces 101 dandjun milieu nutritif aqueux sous des cúdiGion2 aérobiques de fermentation submergée, de préférence dans un Milieu nutritif contenant à la fois un hydrate de carbone assimilable
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et un composé azoté. Bien qu'il y a un certain nombre ae milieux pouvant convenir et qui soient disponibles, on préfère cer 1Íll::; milieux de culture pour des raisons d'économie de production, de rendement maximum de la matière antibiotique et de la facilité de l'isolement de cette dernière. Les sources actuellement préférées
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d'hydrates de carbone sont constituées par le glucose, la dext;rinet les mélasses et l'amidon, y compris des combinaisons de ces pre duits.
D'autres sources convenables sont constituées par le maltose, le galactose, la mannite, l'huile de soja, etc. Les sources préfé- rées d'azote sont constituées par la farine de soja, la farine de
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poisson, la farine de coton, le Kay Soy (farine 'de soja dégraissée, finement pulvérulente), etc. D'autres sources convenables sont la farine d'arachide, la levure de brasserie (cellules de levure sé- chées, obtenues d'une fermentation de bière), lafârine de gluten de maïs, une liqueur de macération de maïs, etc.
Des sels inorganiques nutritifs, par exemple, des sels capables de produire des ions, tels que de potassium, de sodium, de calcium, de phosphate, de sulfate, etc, peuvent avantageusement être incorporés dans le milieu. Des traces d'éléments, tels que le magnésium, le manganèse, le zinc, 'le fer, etc, peuvent également être incluses dans le milieu de culture pour la croissance de l'es- pèce Streptomyces 101. De tels éléments sous forme de traces sont couramment fournies comme impuretés inhérentes à l'addition des constituants du milieu.
Les milieux utilisés dans le procédé de l'invention peu- vent contenir des dérivés précédents, en plus des composants nutri- tifs qui y sont présents,pour obtenir des produits de valeur. 'Par exemple, une source assimilable de cobalt peut être incluse lors- que des cobalamines (vitamines B12 et produits similaires aux vi- tamines B12 sont désirées, et ces sous-produits sont alors récu- pérés par des méthodes habituelles. De même, des dérivés précédents steroïdes, tels que la progestérone ou le Composé S de Reichstein ou acétate S peuvent être ajoutés pour obtenir un steroïde oxydé en position 11.
Pour obtenir la croissance et le développement maxima de l'espèce Streptomyces 101, le milieu de culture, avant ensemen cement du micro-organisme, devrait être réglé à un pH compris entre environ 6,5 et environ 7,5
Des conditions de culture aérobique submergée sont les conditions de choix pour la production de grandes quantités de 101a Pour la préparation de quantités limitées de l'antibiotique, on
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peut employer des flacons seoués et des cultures-en surface dans des bouteilles. Lorsqu'une croissante est réalisée dans de grands récipients ou réservoirs, il est préférable d'utiliser la forme végétative du micro-organisme pour l'ensemencement afin d'éviter un retard prononcé dans la production de l'antibiotique et l'uti- lisation inefficace, qui en découle, de l'installation.
De ce fait il est désirable de produire (.'abord un inoculum ou ensemen- cement végétatif du micro-organisme, en ensemençant une relative- ment petite quantité du milieu de culture avec une matière issue d'une culture en tube couché du micro-organisme dans de l'agar- agar nutritif, et lorsqu'on dispose d'un inoculum végétatif ac- tif jeune, on transfère l'incoulum végétatif de façon aseptique dans d grands récipients ou réservoirs. Le milieu d.ns lequel l'inoculum végétatif est produit peut être le'même ou différent de celui qui est utilisé pour la production de l'antibiotique.
On obtient des rend ments optima de 101a lorsque le milieu de culture est maintenu à petempérature comprise entre environ 24 et environ 37 C, de pré: rance entre environ 28 et environ 34 c pendant une période comprise entre environ deux et environ six jours.
Le procédé de l'invention n'est pas limité à la pro- duction de 101a par l'espèce Streptovmyces 101. Il doit ture enten- du que les procédés de fermenation de la présente invention en- globent d'autres souches ou variantes productrices de 101a telles que, par exemple, les souches et variantes qui sont facilement produites et isolées par des méthodes routinières d.'isolement et /ou de modification de souche, qui supposent le choix de mi- cro-organismes cultivés et leur exposition à une modification par des procédés physiques, tels que les rayons X ou la lumière a ultraviolette, et/des agents chimiques mutagéniques, tels que les moutardes azotées et la colchicine.
La vitesse de production du 101a et la concentration
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de 1 antibiotique dans le milieu de culture sont aisément suivies durant la période de croissance du micro-organisme en examinant l'activité antibiotique de prélèvement du milieu de culture, en- -vers un (organisme connu pour être sensible à l'antibiotique, par exemple,, ,les Mycobacterium rance ou Micrococus pyogenes variété aureus gar des proceus standards de diffusion dans de l'agar agar ou .des tests d'opacimétrie. En général, une production maxi- mum de 1'* antibiotique, après ensemencement du milieu de culture, se produit après environ .2 à environ 6 jouts lorsqu'on -emploie des cultures aérobiques .submergées.
La matière antibiotique peut être récupérée du milieu de culture par des techniques d'extraction ou d'adsorption, no- tamment l'adsorption de l'antibiotique sur du carbone et son élu- tion de celui-ci avec des agents d'élution convenables. Des procé dés d'extraction par solvant sont préférés pour la production in dustrielle, du fait qu'ils sont moins longs et moins coûteux et qu'on arrive à des rendements de récupération supérieurs.
Un processus d'extraction préféré pour la récupération de l'activité antibiotique, du milieu nutritif fermenté, consiste à filtrer la liqueur à un pH compris entre environ 4 et environ 8 et à procéder à l'extraction ensuite avec un solvant organi- que, non miscible dans l'eau, tel que :un acétate d'alkyle infé- rieur, par exemple, les acétates d'amyle, d'éthyle, de n-propyle et d'isopropyle et les acétates de butyle normal et d'isobutyle; des cétones aliphatiques inférieures, telles que la méthyl éthyl cétone, la méthyl isobutyl cétone et la mathyl isopropyl cétone; des hydrocarbures alphatiques halogènes, tels que le chlorure de méthylène, le chlorure d'éthylène, le tétrachlorure de carbone et le chloroforme ;
des hydrocarbures, tels que benzène, toluène, cyclohexane, et méthyl cyclohexane, On préfère l'acétate d'éthyle et le chlorure de méthylène. Les solvants hydrocarbonés, les plus sélectifs pour les composants les moins polaires, par exemple,
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le 101a-4 et le lOla-5, peuvent être avantageusement utilité' en combinaison avec un ou plusieurs solvants non hydrocarbônés..
L'extrait par solvant est ensuite concentré et séché pour obtenir la matière antibiotique. Lorsque la matière antibio- tique ainsi obtenue est dissoute dans un solvant convenable, tel que du cyclohexane, du benzène, du méthyl; cyclohexane, du toluè- ne, de l'acétate d'éthyle, etc, avec ensuite l'addition d'hexane normal technique éther de pétrole consistant essentiellement en hexane normal, vendu sous le nom "Skellysolve B la matière antibiotique est obtenue sous la forme de cristaux jaunes.
EMI6.1
Le lOla est un complexe de composants étroitement apparentés, possédant chacun une activité anúiotique. Dans la plupart des ! 1 liqueurs, on trouve cinq composants lOla / 101a-, 10la-3, 101a-4 et 101a-5. Dans certaines liqueurs, on a observé des composants
EMI6.2
supplémentaires 101a-6 et 101a-7. :En outre, le lola, un compo- sant très acylé, a été converti ar traitement avec un catalyseur d'acétylation et par traitement avo;: de l'ar-moniaque, en les au- tres composants, cor.ime montré aux ex-'les 10, 11 et 12.
La figure 1A est un chromatogrF' .:e sur papier dévelop- pé dans un système solvant à tampon de phosphate d'une liqueur
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type produite suivant l'exemple 1, montrant les composants 101a-l, lCla-2, 101a-3, 10la-lé et 101a-5.
Les figures 1B et 10 sont des chromatogratrinres sur pa- pier développés dans un système solvant Bush B5 (benzène-méthanol- eau dans un rapport en volumes de 2/1/1) de la même liqueur, mon-
EMI6.4
tr,nt la séparation des composants lU7a-1, 101a-, 101a-3 et un mélange de lofa-4 et 101a-5.
La figure 1D est un chromatogramme quantitatif sur pa- pier développé dans un système solvant Bush B5 modifié (benzène- méthanol-eau dans un rapport en volumes de 1/1/2', développé à la température ambiante)montrant les cinq mêmes composants.
La figure 1E est un chromatogramme sir papier, dévblop-
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pé dans le système solvant Bush B5,. d'-une autre liqueur- produisit:
EMI7.1
suivant l'exemple 1, montu.'ant la présence de sept composants: , D ces analyses. chromatogpaphiques et. d'autres analy- ses, les valeurs Rf à savoir le rapport de la distance parcou- rue par le composant, à celui parcouru par le solvant, ont été déterminées comme suitpour les sept: composants.
TABLEAU 1
EMI7.2
<tb> Composant <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lOla-1 <SEP> 0,65
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lOla-2 <SEP> 0,35
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 101a-3 <SEP> 0,75
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 101a-4 <SEP> et-5 <SEP> 0,85
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lOla-6 <SEP> ' <SEP> 0,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 101a-7 <SEP> 0,55
<tb>
La relation étroite entre les propriétés chimiques et physiques des composants du 101a est; montrée par le fait qu'ils ne sont pas séparés dans les systèmes de solvants habituels. Com- me montré par les analyses chromatographiques du tableau suivant, tous les composantsse déplacent à la même allure dans les divers systèmes de solvants repris ci-après..
TABLEAU II
EMI7.3
<tb> Système <SEP> de <SEP> solvant <SEP> Rf
<tb>
EMI7.4
61/<) butanol normal 0,9 1; butanol normal, 0,25 acide p-toluène.
EMI7.5
<tb> sulfonique <SEP> 0,9
<tb>
<tb> butanol <SEP> normal-acide <SEP> acétique-eau <SEP> (2/1/1) <SEP> 0,9
<tb>
EMI7.6
81% butanol normal, bzz;
pipéridine 0,9 96'L" eau, i- 4) butanol normal 0, 5 96ejo eau, 4 butanol normal,. 0,25% acide p-toluène sulfonique 0,9 IdH OH 0,1H saturé avec e la méthyl éthyl iv cétone 0,b Des préparations de 101a cristallin ont montré des
EMI7.7
points de fusion ou de décomposition compris entre environ 1H!' C
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EMI8.1
et environ 255 C, des rotations opti'iues [o(.J 2.1 comprises entre D
EMI8.2
environ 301 et environ 425" (.2 0,3 dans éthanol absolu), et, en utilisant un spectrophotomètre Modèle DU Beckmann au quartz ou un spectrophotomètre a'enregistrBcient Cary, des maxima d'absorptionde rayons ultraviolets (dans une solution neutre dléthan0l:à 92) à 435 et 245 nyu , et l'analyse élémentaire suivante : Calculé pour CHNO : C : 60,2;- H: 7, OF; N: 2,07 Trouvé : C : 63,,6JH H: 6,89;
N: 1,6S
Le 101a est soluble dans les alcools, tels que le mé- thanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, l'alcool amylique, y compris les formes isomères, l'alcool dodécylique, l'alcool undé-
EMI8.3
cylique, l'alcool décylique, l'alcool nonylique, l'alcool hepty- lique, l'alcool hexylique, y compris les formes isomères; les acétates d'alkyle inférieur, tels que l'acétate d'amyle, l'acétate
EMI8.4
d'éthyle,etc; les cétones dialky,!s inférieurs, telles que la méU.yl éthyl cétone, la méthyl isobucyl cétone, la méthyl iso- propyl cétone, etc; les hydrocarbures -.aliphatiques chlorés, tels que le chlorure de méthylène, le chlorure d'éthylène,le chlorofor me, etc ; le dioxane, le diméthylacétamide, le diméthylformamide
EMI8.5
( > 5 'mgr/ml);
il est légèreuent soluble dans le tétrachlorure de carbone, le toluène (5 mgr/ml), les éthers tels que l'éther éthy- lique, l'éther butylique, l'éther propylique, y compris leurs
EMI8.6
formes is?l1.ères, etc, l'he:ane normal technique, l'eau ( z 1 mgr/ ml), etc.
Le 101a est stable à la température ambiante pendant
EMI8.7
3 à 4 jours à un degré de pH d'environ 2 à environ 6 et, à 80 G il est stable pendant une heure à un pH de 2. La matière antibio- tique est instable dans les alcalis ; il y a une perte graduelle d'activité, lorsqu'elle repose à la température ambiante à un pH de 7,8 pendant une période de deux à trois jours.
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Le spectre d'absorption d'infrarouge .(prismes de
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chlorure de sodium) du 101. '"#il une suspension dans de l'huile mi-
EMI9.2
nérale (figure 2) montre des bandes d'absorption caractéristiques (exprimées en cm-1) aux fréquences Suivdltes 3380, 1760 1715, - #r-- # - 1650 1615 1585, 1537, 1510 1490, lié5e, 1402 1374, 1336, 1262 32<..
EMI9.3
1194, 1124, 1104, 1062, 1035, 1010, gt3rl 925, 875, a 797 735.
A la figure, les longueurs d'onde sont données en microns en abscisse inférieure, les 5 de transmission en ordonnée, et les nombres d'onde en abscisse supérieure, en cm" .
Le 101a est une matière neutre ou faiblement acide.
Il s'hydrolysera lors d'un traitement avec un alcali dilué. Lors de la réaction d'une solution éthanolique de cette matière avec une solution aqueuse de méthylorange , l'hélianthate du complexe est obtenu; lors d'une réaction avec des agents acylants, les dérivés acylés correspondants sont obtenus, notamment les déri- vés acétyle et benzoyle.
Le 101 se caractérise par son activité envers les organismes suivants .
TABLEAU III
Spectre antimicrobien - 101a
EMI9.4
Concentration inhibitrice minimmn, mogr/1,11,
EMI9.5
Organisme d'essai ...l:.Q1a* Ic/obacterium tuberculosis H37Rv 0,16 Myc'obacterium tuberculosis BCG z hiyc:obacterium ranae 0,78 Hicrococcus pyogenes v, aureus 0,39 hicrococcus pyogenes v.
albus 0,39
EMI9.6
<tb> Streptococcus <SEP> hemolyticus <SEP> 25
<tb>
<tb> Streptacoccus <SEP> viridans <SEP> 3,12
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0,39
<tb>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 6,25
<tb>
EMI9.7
Kbsie11a pneumoniae 3112
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TABLEAU 111 (suite
EMI10.1
<tb> Organisme <SEP> d'essai <SEP> 101a
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 12,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmnellea <SEP> typhosa <SEP> 25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli' <SEP> 25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nocardia <SEP> asteroides <SEP> 1000 <SEP> inhibition
<tb>
<tb> ( <SEP> partielle <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> 100)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Blastomyces <SEP> dermatitid'is <SEP> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Coccidioides <SEP> immitis <SEP> >1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Geotrichum <SEP> sp. <SEP> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hormodendrum <SEP> compactum <SEP> 1000 <SEP> (inhibition
<tb>
<tb>
<tb> partielle).
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Phialôphora <SEP> verrucosa <SEP> 1000 <SEP> ( <SEP> " <SEP> )
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans <SEP> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporotrichum <SEP> schenck. <SEP> 1000 <SEP> (inhibition <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> partielle)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Monosporium <SEP> apiospermum <SEP> 1000 <SEP> ( <SEP> Il) <SEP> )
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micrisoporon <SEP> audouini <SEP> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> Ab <SEP> >1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> Up <SEP> >1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Microsporon <SEP> canis <SEP> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> interdigitale <SEP> >1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> 1000
<tb>
* 101a-l, 370 mcgr/ml; 101a 125 mcgr/ml;
lOla-3, 430 mcgr/ml; 101a-4 et 101a-5, environ 20 mcgr/ml chacun.
Les composants du lOla peuvent être séparés par une chromatographie de répartition ou par une extraction à contre- courant. On a trouvé que plusieurs systèmes de solvants donnent une bonne séparation dans une chromatographie à bande de papier,
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comme montré aux figures lA, 1B, 1C, 1D et 1E. Des chromatogram- mes sur papier dans les mêmes systèmes de solvants, obtenus du 101a isolé, montrent les sept mêmes composants.
Un autre système de solvant donnant le même type de séparation que le système Bush B5 est le chloroforme saturé avec de l'eau; un autre encore est le cyclohexane .- chloroforme-eau dans un rapport en volumes de 1/8/2 Dans ce dernier système, des bandes tamponnées à un pH de 4,1 équilibrées pendant 2 heures dans la phase aqueuse, et développées environ 4 heures dans la phases non aqueuse, montren .les valeurs de -Rf suivantes.
TABLEAU IV
EMI11.1
<tb> ¯¯¯¯¯¯Composants¯¯¯¯¯ <SEP> Rf
<tb>
<tb> 101a-l <SEP> 0,37
<tb>
<tb> 10la-2 <SEP> 0,13
<tb>
<tb> 101a-3 <SEP> 0,77
<tb>
<tb> 101a-4 <SEP> et <SEP> -5 <SEP> 0,88
<tb>
Les mêmes systèmes de solvants ou des systèmes simi- laires peuvent être utilisés de façon efficace dans des colonnes -pour réaliser une séparation des composants.
En utilisant une colonne chromatographique, une bonne séparation de tous les com- . posants est obtenue. sauf pour les composants 4 et 5'. -fin. utilisant une colonne bourrée de terre à diatomées, on obtient une bonne séparation avec le système de solvant Bush B2 (toluène-hexane normal technique-méthanol-eau dans un rapport en volumes de 67 33/60/40 Une charge de lOla isolé, contenant les composants 101a-1 à 5,, était placée au-dessus d'une colonne de terre à dia- tomées, contenant la phase (inférieure) fixe du système de sol- vant, et était ensuite éludée avec la.phase (supérieure) mobile du système de solvant.
La charge de 101a isolé est préparée en dissolvant la matière isolée, dans la phase fixe, et en mélangeant la solution résultante avec de la terre à diatomées dans la pro- portion de deux graumes par millilitre. Les deux phases du
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système de solvant sont obenues en laissant simplement le système se séparer en deux phases. La colonne est bourrée dans ia propor- tion de 2 gr de terre à diatomées'par millilitre de la phase in- férieure ou fixe. Lors d'une élution avec la phase mobile, les composants 4 et 5 apparaissent d'abord, puis les composants 3 et 1 et ensuite le composant 2, dans l'ordre qui vient d'être donné.
Le composant 2 se déplace très lentement et parfois il est avan- tageusement enlevé de la colonne par lavage, avec du chlorure de méthylène ou un solvant similaire, après que les autres fractions de composant ont été récupérées.
Le complexe peut également être partiellement divisé, en utilisant le processus Craig standard à contre-courant. La figure 3 montre la répartition des 5 composants dans les fractions Craig obtenues avec le-système de solvant eau-éthanol-cyclohexàne- acétate d'éthyle (1/1/1/1 en volumes). On observera qu'on obtient une séparation nette des composants lOla-1, 101a-4 et lOla-5 mais que les composants lOla-2 et 101a-3 ne sont pas séparés.
En combinant une séparation dans une colonne de chroma- tographie avec une séparation Graig, tous les cinq composants sont séparés. C'est ainsi que le mélange des composants 4 et 5, obtenu avec la colonne de chromatographie, peut être séparé par le procédé Craig, ou bien que le mélange des composants ? et 3 obtenu par le procédé Craig peut être séparé avec ladite colonne,
La figure 4 montre le mouvement des composants des fractions Craig sur une bande de papier en utilisant le système Bush B5 .Le chromatogramme A montre que la première fraction Craig ne contient que le lOla-2 et le 101a-3 Le chromatogramme B montre que la seconde fraction Craig ne contenait que le 101a-l.
Le chromatogramme C montre le résultat abtenu avec les troisième et quatrième fractions CraiR. Comme le 101a-4 et le 101a-5 ont le même Rf dans le système Bush B5, un seul chromatogramme sert à
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illustrer les deux fractions.
Une répartition quantitative type des composants est donnée au tableau V. Le milieu de culture (1850 ml) était filtré clair et le liquide/était extrait avec de l'acétate d'éthyle.
TABLEAU V
Répartition quantitative des composants de 101a
EMI13.1
<tb> Stade <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> composant <SEP> en <SEP> mcgr/ml <SEP> ou
<tb>
EMI13.2
Dlcgr/msr 101a-l 'I.Ola-2 10la-3 101a-4 et/ou 5¯ Liqueur filtrée 46 aë 85 70 Gâteau. épuisé (1) 1. c 10 lés ,2.
Liqueur épuisée 0 < 10 trace 0
EMI13.3
<tb> Solides <SEP> extraits <SEP> (2) <SEP> 110 <SEP> 82 <SEP> 255 <SEP> 254
<tb>
EMI13.4
Matière surnageante (2) 82F 12 237 546 (1) dix gr. de ce gâteau étaient transformés en boue dans 20 ml d'acétone et filtrés, et le filtrat d'acétone était titré.
(2) l'extrait à l'acétate d'éthyle était traité avec 5 volumes d'hexane normal techique et filtré.
Les principaux composants du 101a ont les caract,éris- tiques physiques suivantes :
TABLEAU VI
Analyse
EMI13.5
Composant fc C iô H fez N ¯ ¯ fo Acyle lola-1 58,84. 7,22 z70 11,75 lola 59,72 6,57 1,87 1,17 101a-3 59',07 6,si9 2,03 9 e 81F 101a-4 60,06 7,5 2,14 5,91
EMI13.6
<tb> 101a-5 <SEP> 63,11 <SEP> 7,16 <SEP> 1,92 <SEP> 6,13 <SEP> . <SEP>
<tb>
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TABLEAU VII
EMI14.1
<tb> Notation <SEP> spécifique <SEP> Point <SEP> de <SEP> fusion
<tb>
<tb>
<tb> Ó <SEP> 24 <SEP> Solvant
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> Solvant
<tb>
EMI14.2
+454 Choc1] . 182-1811.0 +61 CE01 3 195-200 +317 GHC7.3 168-1710 +102 CHC13 115-1180
EMI14.3
<tb> +164 <SEP> chai <SEP> 3 <SEP> 102-105"
<tb>
Ils ont le spectre antimicrobien suivant :
TABLEAU VIII
EMI14.4
Spectre antimicrobien - lOJ.a et composants Concentration inhibitrice minimum, mcr/m7..
EMI14.5
Organisme de test 10la 10la-1 101a-2 10la-3 101a-4 101a-?
EMI14.6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuber-
<tb>
<tb>
<tb> culosis <SEP> H37Rv <SEP> 0,16 <SEP> 0,26 <SEP> 0,08 <SEP> 0,31
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuber-
<tb>
<tb>
<tb> culosis <SEP> BCG <SEP> 0,16 <SEP> 0,31 <SEP> 0,16 <SEP> 0,31' <SEP> 3,12 <SEP> 6,25
<tb>
EMI14.7
Mycobacterium ranae z 0,' 0,39
EMI14.8
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes
<tb> v. <SEP> aureus <SEP> 0,39 <SEP> 0,39 <SEP> 0.39 <SEP> 3,12 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25
<tb>
EMI14.9
Microcbecus pyogenes v.
albus 0,39 Os2 0,2 0,78 6,25 6,25
EMI14.10
<tb> Streptococcus <SEP> hemolyticus <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 3,12 <SEP> 100 <SEP> 25 <SEP> 12,5
<tb>
<tb> Streptococcus
<tb>
EMI14.11
viridans 3,12 3,12 3,12 12,5 > 100 = 100
EMI14.12
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0,39 <SEP> 0,2 <SEP> 0,39 <SEP> 0.78 <SEP> 0,39 <SEP> 1,56
<tb>
<tb> Diplococcus
<tb> pneumoniae <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 1,56 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 1,56
<tb>
<tb> Klebsiella
<tb> pneumoniae <SEP> 3,12 <SEP> 3,12 <SEP> 3,12 <SEP> 6,25 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb>
EMI14.13
Pseudomonas aeruginosa 12,5 12,5 12,5 25 > 100 ? . ,jO Salmonella typhosa 25 25 12,5 5 7 100 > 00 Salmonella paratyphi>100 > 100 > 100 :
> 100 100 > 100 Pasteurella multocida 1,56 1,56 Oe7g lt56 -?- 50 50 Escherichia coli 25 12,5 2 25 > 100 > 100
EMI14.14
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 25 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
Le composant lOla-2 était préparé suivant l'exemple 9 les autres suivant les exemples 13 et 14. Le composant lOla-2 était recristallisé dans de l'acétone, les autres dans de l'acé- tone aqueuse (quatrè volumes d'acétone pour un volume d'eau).
Les composants recristallisés comme indiqué ont les spectres d'ab- sorption d'infrarouges (en une suspension dans de l'huile miné- rale), ayant les maxima d'absorption caractéristiques suivants :
TABLEAU IX
EMI15.1
Maxima d'absorption d'infrarouges lOla-1 : 3400 , 1758, 1715, 1652 1642 1602 15849 1540 1522, 1492, 1455, 1405, 1374, 1335, 1265, 1240, 1195 1189e 1155, 1115, 1069, 1035, 1012, 988e 925, Ô75, 850s 8351 797, 750 740 725, 6ëo 101a-2 : 3400 3310, 1740 1720 1706, 1631, 159Ô 1505,1550 1536, 1510, 1459 1437, 1406, 1375 1365, 13389 1290 1281t 1252, 1190 1175, 1149, 1120 1105, .0$5 1070, 1037 1026 1015, 1096, 972, 942 935, 916, 900, 975, 930t 800, 750 740 730 722, 685 101a-3 : 3410, 1756 1720, 1651, 1515 1590, 1535, 1510 1490, 1455, 1405, 1372, 1335, 1265, 1239, 1192, 11249 iioot 1068o 1035, 1010, 990 975, 940, 924, 905, 877 855, #si gaz 798 782, 750 737 726 101a-4 :
3420, 1760 1718$ 1655 1602 1589s 1542, ZG.9$, 1455, 1405, 1375 1365, 1339, 1275 1255, 1192, 1130, 1100 108ge 1060, 1035, 1000, 996 974, 900, 674, 825o 799 790 ?73, 740 730 710, 677 101a-5 : 3530 3480 3420, 1760, 1720, 1655 1600 1535, 1496, -# . >4Lj 1450, 1405, 1375 1364, 1332, rj6 ,67, 1248 1240, 1193, 1155e 1124, bzz, 1005 1072 1062, 1034, 1011, * # A 990, 950t 925o 876# 852e 017, 798, 786 7759 752 z >#A.
723 712
<Desc/Clms Page number 16>
Ces composants recristallisés ont également des spec très d'absorption d'ultraviolet (dans le l'éthanol à 95%) ayant les maxima d'absorption et les coefficients d'extinction carac- téristiques suivants .
TABLEAU X
Maxima d'absorption de rayons ultraviolets et visibles
EMI16.1
<tb> Composant <SEP> max <SEP> a
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 101a-1 <SEP> 245 <SEP> 40,83
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 266 <SEP> 33,85
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 320 <SEP> 14,01
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 432 <SEP> 10,97
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 101a-2 <SEP> 245 <SEP> 41,89
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 260 <SEP> 35,21
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 320 <SEP> 13.98
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 430 <SEP> 13,62
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 101a-3 <SEP> 245,5 <SEP> 44,35
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 260 <SEP> 3,97
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 320 <SEP> 15,31
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 430 <SEP> 12,19
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 101a-4 <SEP> 246 <SEP> 43,14
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 264 <SEP> 37,03
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 320 <SEP> 14,
77
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 433 <SEP> 10,53
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 101a-5 <SEP> 245 <SEP> 30,22
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 273 <SEP> 34,69
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 320 <SEP> 19,04
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 437 <SEP> 9,19
<tb>
Ces résultats étaient obtenus en partant de solutions dans de l'acétone : 100% d'acétone dans le cas de lOla-2 et 80% d'acétone plus 20% d'eau pour les autres.
<Desc/Clms Page number 17>
Les composants donnent des tests positifs au FeCl3 et à l'iodoforme.
Le 101a, ainsi que ses composants et ses dérivés, sont intéressants pour combattre beaucoup de maladies causées par les infections microbiennes chez les humains et chez les animaux.
Pour cet usage, l'antibiotique peut être utilisé seul ou avec un support acceptable pharmaceutique, qui peut être sous forme d'une matière solide, d'une poudre ou d'un liquide..Les compo.si- tions peuvent prendre la forme de tablettes comprimées, de ta- blettes effervescentes, de poudre, de granules, de capsules (capsules de gélatine dures et molles), de suspensions de solu- tions aqueuses dans des huiles comestibles,de suspensions a- queuses, ou d'autres formes de dosage qui sont intéressantes pour une administration par voie buccale. Des préparations liquides- stériles sont employées pour une utilisation parentérale.
Un tel milieu peut être un solvant stérile ou unVéhicule de suspen- sion stérile contenant une huile injectable, ou des colloïdes hydrophiles contenant de l'eau, comm de la carboxyméthyl cellu ' lose de sodium, de la méthyl cellulose,.lu polyvinyl pyrrolidone-,, de la gélatine, de la gomme adragante, etc. Les compositions peuvent prendre la forme de matière active, à savoir la matière antibiotique, en mélange aurec des diluants solides et/ou des adjuvants pour la formation de tablettes, tels que de* l'amidon de mats, du lactose, du talc, de l'acide stéarique, du stéarate de magnésium, des gommes, etc.
Lorsqu'elles ne sont pas incompa- tibles avec l'antibiotique, on peut employer les diverses ma- tières de formation de tablettes et capsules, utilisées dans le domaine pharmaceutique. La matière peut être mise en tablettes avec ou sans adjuvants. Ou bien, l'antibiotique peut être placé dans la matière habituelle ou résorbable, telle que la capsule habituelle de gélatine, et administrée sous cette forme. Dans
<Desc/Clms Page number 18>
une autre forme d'utilisatin l'ant iotique peut être mis .'. paquets de poudre et utilisé ainsi.
Le 101a ainsi que ses composants et ses dérivés, peu- vent être préparés sous la forme d'une suspension sapide dans une huile fixe convenable, par exemple, de l'huile de Coo de l'huile d'arachide, ete,contenant environ 2% de monostéarate d'aluminium, comme agent de mise en suspension. Une telle suspension peut être administrée par voie buccale, telle qu'elle est produite, ou bien elle peut être mise en capsules.
La matière antibiotique peut être utilisée localement dans des bases de graisses du type pétrolatum, des bases d'onguent solubles dans l'eau, telles que les Carbowaxes (glycols polyéthyléniques solides ayant un poids moléculaire d'environ 1500, notamment des mélanges de glycols polyéthyléniques de poids moléculaires plus élevés et plus bas) pour donner un produit ayant la consistance d'un onguent, des crèmes, des émulsions eau dans l'nule ou huile dans l'eau, et des lotions; une thérapeutie topique intéressante se fait par gouttes dans le nez, vaporisations, et ettes et suppositoires.
Pour une utilisation en médecine vétérina , les préparations sont surtour intéressantes sous la forme de bougies, capsules, tablettes, onguents pour mammites, suspensions huileuses, etc.
A cause de son activité antibactérienne et de sa bas- se toxicité remarquables, de même qu'à cause des niveaux sanguin!* élevés résultants, le 101a et ses dérivés sont intéressants com- me agents thérapeutiques dans le traitement de diverses maladies.
Par -exemple, à cause de son activité remarquablement élevée con- tre le M. tuberculosis H37Rv, la matière antibiotique est inté- ressante dans le traitement de la tuberculose. Dans le traitement de la tuberculose, on obtient des résultats avantageux en combi- nant le 101a avec d'autres médicaments contre la tuberculose, tels que de l'hydrazide d'acide isonicotinique, la streptomycine et/ou la dihydrostreptomycine, l'acide p-amino-salicylique et
<Desc/Clms Page number 19>
ses sels, le D-4-amino-3-isoxazlidone (Cycloserine), une combi- naison d'hydrazide d'acide isonicotinique et d'acide p-amino- salicylique et des sels de celui-ci, une combinaison de strepto- mycine, d'hydrazide d'acide isonicotinique et d'acide p-amino- salicylique et des sels de celui-ci, etc.
La matière antibiotique de l'invention est également intéressante comme agent anti-tuberculose du milieu, par exemple, dans les hôpitaux et dans l'hygiène des laiteries. A cette fin, elle est incorporée dans les supports habituels, par exemple, des aérosols et des solutions abluantes,seule ou en combinaison avec des composés sulfa, tels que sulfadiazine, sulfamérazine et sulfaméthazine (dans'le rapport d'environ une partie de l'anti- biotique pour deux parties de sulfa total), ou des antibiotiques; tels que tétracycline, oxytétracyçline, chloPtétracycline, néomy cine, polymyxine, chloramphénicol, pénicillines G, 0 et V, novo- biocine, bacitracine, streptothricine, cirçuline, et erythromy- cine.
La matière antibiotique ou ses combinaisons avec les pro- duits thérapeutiques mentionnés ci-avant sont également intéres santes dans le traitement des infections respiratoires et pul- monaires par staphylocoques et pneumocoques. L'administration peut se faire par voie topique, buccale et parentérale.L'anti- biotique est également intéressant en combinaison avec diverses vitamines, telles que thiamine, riboflavine, acide as.corbique, niacinamide, pyridoxine, acide pantothénique, vitamine B12 et acide folique. D'autres matières thérapeutiquement intéressantes peuvent également être combinées avec l'antibiotique. En combi- naison avec divers corticoïdes, l'activité thérapeutique du 101a et de ses composants et dérivés est accrue dans le traitement de la dermatite atopique et de contact, la neuro-dermatite, le pruriti, etc.
Des corticoïdes qui conviennent sont la cortisone, l'hydrocortisone e t leurs esters; la ¯ 1 -cortisone et la ¯1 hydrocortisone y compris les esters de ces composés dans la posi
<Desc/Clms Page number 20>
tion 21 par exemple, l'acétate le cyclopentylpropinate et le succinate, y compris leurs sels solubles dans l'eau; les corti- sones et hydrocortisones substituées par alkyle telles que le 2-méthyl hydrocortisone et la 6-méthylhydrocortisone, et leurs esters
En plus de leurs usages pour les humains, les agents antibiotiques de l'invention peuvent être utilisés avec des ef- fets thérapeutiques similaires pour les animaux, tels que la vo- laille et les bovidés.
Pour cet usage, ces agents peuvent pren- dre la forme de composés alimentaires pour animaux, tels que des composés alimentaires pour volaille, contenant au moins 0,1% de l'agent et une quantité importante de la matière nutritive.
Lors d'une administration par voie parentérale par exemple, l'antiobiotique est également intéressant dans le trai- tement d'une infection des armaux, causée par le Pasteurella multocida,le micro-organisme caasatif de la septicémie hémorra- gique, à savoir une infection av'', fièvre ayant une grande inci- dence sur le bétail transporté ver- es parcs à bestiaux. La matière antibiotique peut également être utilisée, comme supplé- ment d'alimentation, seule ou en combinaison avec d'autres anti- biotiques ou matières thérapeutiques, pour promouvoir la crois- sance des animaux et de la volaille. A cause de son activité élevée contre le s pullorum, la matière antibiotique est inté resaante dans le traitement de la diarrhée blanche bacillaire des poules, provoquée par ce micro-organisme.
Les exemples suivants illustrent la production, la reçu; pération, la concentration, la purification et l'identification de l'antibiotique 101a et de ses composants et dérivés. Ces exem- ples sont simplement illustratifs et en aucune façon limitatifs.
EXEMPLE 1
Production de 101a A. Inoculum
L'espèce Streptomyces 101 était mise à croître sur une
<Desc/Clms Page number 21>
culture en tube couché de maltose, tryptone, agar-agar (composi- tion en grammes, par litre d'eau distillée maltose, 10; tryptone, 5; K2HPO40,5; FESO4.7H2O 0,1; agar agar, 15) pendant 7 jours à 28 C et la culture ainsi produite était utilisée comme inoculum pour produire une culture primaire.,, B. Culture primaire
50 ml d'un milieu stérile de la composition suivante
EMI21.1
<tb> N-Z-amine <SEP> A <SEP> (digestion <SEP> enzymatique <SEP> de <SEP> caséine) <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> l <SEP> gr
<tb>
<tb> Sauce <SEP> de <SEP> soja <SEP> (un <SEP> extrait <SEP> de <SEP> blé <SEP> et <SEP> de <SEP> soja
<tb> hydrolysé) <SEP> 1 <SEP> ml. <SEP>
<tb>
<tb>
K2HPO <SEP> 0,25 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
KHPO <SEP> 0,25 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> jusqu'à <SEP> 100 <SEP> ml.
<tb>
étaient ensemencés avec une suspension aqueuse de la culture ou .
' inoculum de Streptomyces sp. 101, obtenu à partir du maltose-tryp tone-agar-agar ci-avant, et le milieu était incubé pendant 40 heures à 28 c sur un secoueur rotatif à 250 tours par minute.
C. Fermentation
La culture primaire obtenue était ensemencée à 1% de concentration (v/v) dans 100 ml d'un milieu de fermentation de la composition suivante :
EMI21.2
<tb> Soja <SEP> Kay <SEP> (farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> dégraissée,-finement
<tb> broyée) <SEP> 1 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb> Levure <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> 0,25 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
KCl <SEP> 0,3 <SEP> gr
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 0,4 <SEP> gr. <SEP>
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> jusqu'à <SEP> 100 <SEP> ml.
<tb>
et le milieu était incubé pendant 5 jours sur un secoueur rota- tif à 28 c avec une allure d'aération équivalant à une valeur d'oxydation de sulfite de 0,3 millimoles d'oxygène par litre par
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
minute. Le filtrat montrait une aci rvité contre'le 1l1icrococ',s pyoenes variété aureus, le Bacillus subtilts, le M.t berculosi H37Rv et les mycobactéries saprotiques.
EXEMPLE 2
EMI22.2
MDTL9 Production et isolement du 101a A. Cul-ure pré-primaire
100 ml d t un milieu pré-primaire stérile contenant les ingrédients suivants :
EMI22.3
<tb> N-Z-amine <SEP> A <SEP> 20 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> 10gr
<tb>
<tb>
<tb> Sauce <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> K2HP04 <SEP> 2,5 <SEP> gr.
<tb>
EMI22.4
KH2po4 1,5 gr.
EMI22.5
<tb>
Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> (pH <SEP> : <SEP> 6,8-7), <SEP> quantité <SEP> suffi-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sante <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
EMI22.6
étaient ensemencés avec une culture de l'espèce Streptomycea 101, obtenue d'une culture en tube ,sur agar-%ar, comme dans l'exemple 1 A et le milieu état incubé pendant trois jours à 28 c dans des flacons secoués placé.: sur un secoueur rotatif.
B. Culture primaire
Un réservoir de culture primaire (agitateurs rotatifs , bouteilles de 5 gallons) contenant 12,5 litres au milieu stérile suivant :
EMI22.7
<tb> Soja <SEP> Kay <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Dextrine <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 20 <SEP> gr.
<tb>
<tb> Levure <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> 2,5 <SEP> gr.
<tb>
EMI22.8
KC1 3 ger.
EMI22.9
<tb>
CaCO <SEP> 4 <SEP> gr. <SEP>
<tb>
<tb>
Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> de <SEP> mais <SEP> 10 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville, <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
était ensemencé avec 1% (v/v) de la culture pré-primaire obte- nue comme ci-avant, et en laissant se développer la croissance pendant 10 jours à 28 c
<Desc/Clms Page number 23>
C Fermentation
A chacun de deux réservoirscontenant 250 litres du . milieu suivant :
EMI23.1
<tb> Soja <SEP> Kay <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Dextrine <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 20 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Levure <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> 2,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
KCl <SEP> 3 <SEP> gr. <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
CAGO3 <SEP> 4 <SEP> gr. <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> de <SEP> mats <SEP> 10 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Eau <SEP> de <SEP> ville, <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> 300 <SEP> ml/réservoir
<tb>
Huile de saindoux + 1% sténol (octadécanol) 1550 ml/réservoir, on ajoutait une moitié de la culture primaire (B), et le milieu était ensuite fermenté à 28 c pendant 42 heures. L'huile de sain- doux et l'huile de saindoux plus 1% de Sténol étaient ajoutées suivant les nécessités, pour empêcher la formation de mousse.
D.Isolement
Après 42 heures, l'entièreté de la liqueur était fil- trée à un pH de récolte de 7,4. Le filtrat et le lavage de myce- lium combinés (volume total de 600 litres) étaient saturés avec de l'acétate d'éthyle et extraits avec 0,2 volume d'acétate d'éthyle. L'extrait par solvant (un volume de 121 litres) était' concentré jusqu'à un volume de 960 ml et séché sous le vide. On obtenait 84 gr. d'un solide vitreux rouge (rendement de 57% La matière était purifiée par fournées grâce à un processus de distribution ou répartition à contre-courant (acétone-acétate d'éthyle-eau,1/1/1). Lors d'une reprécipitation de la matière purifiée dans de l'acétate d'éthyle hexane normal technique, on obtenait le 101a sous forme cristalline.
Cette matière possède une puissance ou efficacité de 1000 mcgr/mgr à l'essai Mr 101a E. Essais L'essai Mr lOla est réalisé comme expliqué ci-après.
<Desc/Clms Page number 24>
Du Mycobacterium ranae, n 161 de la collection des cultures Upjohn, est mis à croître sur une culture en tube cou ché Lowenstein-Jensen (K.A.Jensen, Towards Standardization of Laboratory Methods", International Union against Tuberculosis, Vol. 24 pages 102-3, 1954).Une petite quantité de cette cultu. fe est transférée dans un flacon de 250 ml, contenant 50 ml du milieu stérile suivant
EMI24.1
<tb> Dextrine <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Extrait <SEP> de <SEP> boeuf(extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> aqueux <SEP> séché) <SEP> 4 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Peptone <SEP> 4 <SEP> gr
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> (extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> autolysée
<tb> aqueux <SEP> séché} <SEP> 1 <SEP> gr.,
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 2,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Tween <SEP> 80 <SEP> (dérivé <SEP> polyoxyéthylénique <SEP> de
<tb> monooléate <SEP> de <SEP> sorbite) <SEP> 10 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
Eau <SEP> distillée <SEP> à <SEP> un <SEP> pH <SEP> réglé <SEP> à <SEP> 7 <SEP> avant
<tb> passage <SEP> à <SEP> l'autoclave <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
On laissait incuber @ souillon ensemencé pendant 24 heures à 37 c sur un secoueur alte ratif. Un ml. de suspension bactérienne standardisée à environ de transmission de lumiè- re à la lecture au colorimètre Lumetron photovolt Corporation) à 530 mu par rapport un témoin de milieu, est utilisé pour ensemencer 100 ml d'apar-agar d'essai (bouillon d'infusion cer- velle-coeur, contenant, par litre 200 gr d'infusion de cervel- les de veau, 250 gr d'infusion de coeur de boeuf, 10 gr de dex- trose, 5 gr de chlorure de sodium, 2,5 gr de phosphate bisodique, bouillon auquel on ajoute 1,5% d'agar-agar)
refroidi jusqu'à et maintenu à 48 c Cinq ml . d'agar-agar ensemencé sont versés dans des récipients de Petri à gros fonds et on laissait la so- lidification se produire à la température ambiante avant usage.
Des préparations solides inconnues sont dissoutes dans de l'acétone à 1 mgr/ml et de.! uilutions appropriées sont réali- sées dans un tampon de phosphate M 10 à un pH de 6. Des échan- tillons de la liqueur du procédé sont alors dilués à des concen-
<Desc/Clms Page number 25>
trations appropriées dans les solutions tampons. L'essai est mis en oeuvre en utilisant des disques de papier-filtre standards de 12,7 ml auxquels on applique 0,08'ml de solutions de test ou standard ( la solution de charge d'une préparation standard xxx xxxx cristalline contient 1 mgr/ml dans de l'acétone). On réali- sait des dilutions à 5 10 20 40 et 80 megr/ml dans un tampon de phosphate M/10 à un pH de 6.
Les .plaques sont soumises à incubation à 37 C pendant...une nuit. et .les diamètres des zones d'inhibition sont mesurés. La courbe standard est réalisée sur un papier semi-logarithmique avec la concentration en mcgr/ml en abscisse et la dimension des zones en ordonnée. Le facteur de conversion est de .4 microgrammes par unité biologique. Une unité biologique est définie comme étant la quantité d'antibio- tique qui donne une zone de)20 mm d'inhibition, lors d'un test par rapport à un organisme sensitif, tel que M. ranae (essai Mr 101a), S.aureus ou B. subtilis, en utilisant un disque de papier de 12,7 mm.
EXEMPLE 3
Production et isolement de 101a A. Culturepré-primaire Cinq flacons d " Erlenmeyer de 500 ml contenant chacun 100 ml du milieu pré-primaire suivant
EMI25.1
<tb> N-Z-amine <SEP> A <SEP> 20 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Sauce <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
K2HPO4 <SEP> 2,5, <SEP> gr. <SEP>
<tb>
<tb>
KH2PO4 <SEP> 1,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> litre <SEP> , <SEP> ' <SEP>
<tb>
étaient ensemencés avec une culture de l'espèce Streptomyces 101 obtenue d'une culture en tube couché sur agar-agar, comme à l'exemple 1-A, et le milieu était soumis à incubation,pendant 3 jours à une température de 2900 1 sur un secoueur rotatif.
<Desc/Clms Page number 26>
B. Cultureprimaire
Un réservoir contenant 250 ml du milieu suivant : .
EMI26.1
<tb>
Soja <SEP> Kay <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Dextrine <SEP> de <SEP> mais <SEP> 2o <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> Levure <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> 2,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
KCl <SEP> 3 <SEP> gr. <SEP>
<tb>
EMI26.2
C, f,%C,3 4 mgr.
EMI26.3
<tb>
Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> de <SEP> mais <SEP> 10 <SEP> ml.
<tb>
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
était ensemencé avec la culture pré-primaire obtenue ci-avant, et le milieu était incubé pendant 2 jours à une température de 28 c avec une agitation et une aération continues.
C Fermentation
Après deux jours, le contenu du réservoir de culture primaire était ajouté à un réservoir de 2000 gallons contenant 5000 litres du milieu stérile suivant :
EMI26.4
<tb> Dextrine <SEP> de <SEP> mais <SEP> 20 <SEP> gr.
<tb>
<tb> Levure <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> 2,5 <SEP> gr.
<tb>
EMI26.5
Kal 3 ger. caco3 4 ger.
EMI26.6
<tb>
Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> de <SEP> mais <SEP> 10 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
Farine <SEP> d'arachide <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Eau, <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> 3 <SEP> gallons/réservoir
<tb>
EMI26.7
Huile deéaindoux + 1% de sténol 12 gallons /réservoir
EMI26.8
<tb> CLRS <SEP> n <SEP> 10 <SEP> (un <SEP> mélange <SEP> d'acides <SEP> gras <SEP> libres
<tb>
<tb> + <SEP> des <SEP> mono-,di- <SEP> et <SEP> tri-glycérides <SEP> et <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb> matière <SEP> non <SEP> saponifiable) <SEP> 4 <SEP> gallons/réservoir
<tb>
et soumis à incubation à une température de 28 C pendant quatre jours avec agitation et aération continues. L'huile de saindoux, l'huile de saindoux + 1% de sténol, et le CLRS étaient ajoutés, suivant les nécessités, pour empêcher une formation de mousse.
<Desc/Clms Page number 27>
D... Isolement
Après quatre jours,, l'entièreté de la liqueur fermen- tée était ,filtrée à un pH de 7,1 pY naturel et le filtrat (1426 gallons}) était extrait .avec 280 gallons 0,2 volume) d'acé tate d'éthyle. L'extrait par acétate d'éthyle était distillé sous pression .réduite jusquà un volume de 4200 ml. Le concentré était filtré; le filtrat était traité avec 8400 ml d'heptane technique et filtré. Le précipité ainsi obtenu était dissous dans 3920 ml de chlorure de méthylène, traité avec 3920 ml d'hexane normal technique, et le précipité rouge gommeux (Préparation 3A-) était enlevé par filtration,.
Le filtrat était traité avec 3 volu- mes d'hexane normal technique, et le précipité cristallin jaune ainsi obtenu était séché sous le vide. On obtenait 104 gr de 101a (Préparation 3B) possédant une puissance d'environ 920 mcgr/mgr.
Lors de l'addition de 30 ml d'une solution aqueuse saturée de méthylorange à 10 ml d'une solution aqueuse éthano- lique contenant 0,5 gr de Préparation 3B, et lorsqu'on maintient 1 a solution résultante à 50 C pendant 30 minutes, on obtient le sel hélianthate de 101a sous forme de cristaux bruns. La matière cristalline est enlevée par filtration et séchée.
Le précipité rouge gommeux (Préparation 3A) était dis- sous dans 600 ml d'acétone, avec chauffage modéré et agitation.
On laissait refroidir la solution et on la laissait reposer à la température ambiante. Après 13 jours, la solution était évaporée jusqu'à un volume d'environ 500 ml. Le précipité jaune qui se formait était enlevé' par filtration, lavé ensuite avec de l'acé- tone et de l'hexane normal technique et, séché sous le vide. On obtenait 71 gr de .101a Préparation 3c possédant, une puissance ou efficacité de plus de 2000 mcgr/mgr.
Lorsqu'on soumettait ce produit à chromatographie (Préparation 30) dans un système tampon de phosphate d'un pH de 7
<Desc/Clms Page number 28>
et un système Bush B5, on notait que les composants lOla-1; 101a-2 et lOla-3 étaient présents.
EXEMPLE 4
Préparation et isolement de 101a
Le processus des exemples 3-A, 3-B et 3-C était suivi à une échelle plus importante avec un réservoir de 15000 gallons. en utilisant un milieu ayant la composition suivante, par litre:
EMI28.1
<tb> Soja <SEP> kay <SEP> 20 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Dextrine <SEP> de <SEP> mais <SEP> 40 <SEP> gr.
<tb>
<tb> Levure <SEP> de <SEP> bière <SEP> 2,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
KC1 <SEP> 3 <SEP> gr. <SEP>
<tb>
<tb>
CaC03 <SEP> 12 <SEP> gr.
<tb>
La température étant maintenue à 82 F et les récoltes étaient faites à 84-88 heures. La liqueur venant des trois réser- voirs était filtrée et extraite à un pH de 6,75-7 avec 8000 gal- 'Ions d'acétate d'éthyle. L'extrait était concentré par étapes jusqu'à 19 gallons. Le 101a était écipité par deux volumes d'hexane normal technique. Le précipité était dissous dans du chlorure de méthylène de reflux (sauf pour environ 200 gr de goudron noir, qu'on rejetait).
La solution dans le chlorure de méthylène était mélangée avec un volume d'hexane normal techni- que pour donner un solide qui, au sé.chage, pesait 2665 gr et titrait 132 mcgr/mgr de 101a-1 120 mcgr/mgr de lOla-2 et 141 mgr/mgr de 101a-3 par chromatogrammes quantitatifs sur papier (Préparation 4A La partie surnageante était alors traitée avec 3 volumes d'hexane normal technique pour donner un solide pesant 1561 gr.
Celui-ci titrait 345 mcgr/mgr de 101a-l 165 mcgr/mgr de 10la-2 et 665 megr/mgr de 101a-3 (Préparation 4B La partie surnageante était refiltrée après repos pour produire 178 gr de solides titrant 76 mcgr/mgr de 101a-1 2 mcgr/mgr de 10 la -2, 440 mcgr/mgr de 101a-3 et 77 mcgr/mgr de 101a-4 ou -5 (Prépara- tion 40).
EXEMPLE 5
Préparation et isolement de 101a A.La liqueur provenant de deux autres réservoirs de 15.000 gal-
<Desc/Clms Page number 29>
Ions, avec préparation comme à l'exemple 4 était filtrée et extraite à un pH de 4-5 avec 4800 gallons de chlorure de méthylè- ne. Le milieu utilisé avait la composition suivante, par litre :
EMI29.1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 20 <SEP> gr.
<tb>
<tb> Levure <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> 2,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
NaCl <SEP> 3 <SEP> gr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CaCo3 <SEP> 0,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Amidon <SEP> 40 <SEP> gr.
<tb>
Du CLRS n'était pas utilisé. La fermentation était poursuivie à 82 F pendant les 65 premières heures et ensuite à 90 F jusqu'à la 112e heure, les réservoirs étant ensuite soumis à récolte.
L'extrait était distillé jusqu'à un concentré de 90,litres et était mélangé avec 5 volumes d'hexane normal,technique. Le préci- pité résultant était filtré et séché sous le vide. Le rendement était de 22.157 gr (Préparation 5A), titrant au chromatogramme quantitatif sur papier, 115 mcgr/mgr de 101a-l, 105 mcgr/mgr de 101a-2, 250 mcgr/mgr de 101a-3, et une quantité importante de 101a-6 B.La liqueur provenant de deux'autres réservoirs de 15,000 gallons avec préparation comme à l'exemple 4 sauf que la température était maintenue à 90 F et que les récoltes étaient faites à 114 heures, était filtrée à un pH de 4-5 avec 4800 gallons de chlorure de méthylène.
L'extrait était traité comme à l'exemple 5A pour produire 29,036 gr de 101a titrant '62,1 mcgr/mgr de lOla-1, 62,6 mcgr/mgr de 101a-2 147,6 mcgr/mgr de 101a-3, et 105,1 mcgr/mgr de 101a-5 par une titration au chromatogramme quantitatif sur papier Précaration 5B EXEMPLE 6
Préparation et isolement de 101a
La liqueur provenant de deux autres réservoirs de 15.000 gallons, avec préparation comme à l'exemple 4, était filtrée et extraite à un pH de 4-5 avec 4800 gallons de chlorure de méthylè-
<Desc/Clms Page number 30>
ne. L'extrait était distillé jusque obtention d'un concentré ayant un point d'ébullition de 60 c (une atmosphère) et un poids spécifique de 0,99.
Un examen indiquait que l'acétate .de butyle avant contaminé le CH2Cl2 La concentration était terminée lors- que le point d'ébullition sous le vide était de 70 c Le concen- tré final était mélangé avec 7,5 volumes d'hexane normal techni- que. Le précipité résultant pesait 4093 gr et titrait 725. mcgr/ mgr. Il était composé de 32,5 mcgr/mgr de lOla-l, de 27,5 mcgr/ mgr de lOla-2, de 104,1 mcgr/mgr de 101a-3, et une certaine quantité de lOla-4 et/ou de 101a-5.
EXEMPLE 7
Préparation de 101a
La liqueur provenant de deux autres réservoirs de 15.000 gallons, préparée comme à l'exemple 4 sauf que la tempe- rature était toujours maintenue à 90 F et que la récolte était faite à 136 heures, était filtrée et extraite à un pH de 4 à 5 avec 4800 gallons de chlorure de merhylène Après que l'extrait a été concentré, une couche aqueuse @ séparait et était enle- vée du concentré. La phase organique étair concentrée encore jusqu'à 10 gallons. Le concentré final était versé dans 5 volu- mes d'hexane normal technique. Le précipité résultant était re- cueilli et séché.
Il pesait 17,325 gr, titrant 174 mcgr/mgr et contenait 31 mcgr/mgr de 101a-1 40 mcgr/mgr de 101a-2 et 142 mcgr/mgr de 101a-3 par des chromatogrammes quantitatifs sur pa- pier.
EXEMPLE' 8
Préparation de 101a-2
Lors de la dissolution de la Préparation 30 ci-avant dans un mélange chaud de dioxane et de benzène (3/1), on obte- nait, au refroidissement, une matière cristalline filamenteuse.
Le produit cristallin ainsi obtenu était lavé avec un mélange
<Desc/Clms Page number 31>
de dioxane et de benzène (3/1) et ensuite séché sous le vide pour obtenir .une matière. -cristalline jaune-orange fondant entre 194 c et 200 c et possédant une rotation optique Ó 24 +376 0,25%
D dans du méthanol et montrna tune pointe dans le spectre d'ab sorption. des ultraviolets à 435 m/u. , E 1cm 115 Le produit
1cm ainsi obtenu (Préparation 8A possédait une puissance de 3080 mcgr/mgr.
A la chromatographie de ce produit dans un système tampon de phosphate d'un pH de 7, on notait que le 101a-2 pré- dominait.
Lors d'une trituration avec du benzène, les cristaux orange-jaune (Préparation 8A étaient convertis en une autre forme cristalline ayant un rapport longueur/largeur d'environ 5/1 à environ 10/1, possédant une coloration chartreuse sous . lumière polarisée et fondant entre 195 et 200 0. Cette matière, au séchage, prenait l'apparence des cristaux jaunes initiaux.
EXEMPLE 9
Préparation et caractérisation du lQla-2
Cristallisation du 101a-2
On préparait une solution en dissolvant 11,3 kg d'un produit préparé et isolé par le processus de l'exemple 3-A à D dans 113 1 de 1,4-dioxane. Ltaddition d'une quantité égale d'hexane technique donnait des cristaux 101a-2 bruts (724 gr).
Ils étaient recristallisés dans du dioxane et du benzène. Les . cristaux de lOla-2 étaient dissous dans 7,25 litres de dioxane et précipités par l'addition d'un volume de benzène. Une premiè- re récolte était de 362 gr (Préparation 9A). Les liqueurs mères dioxanes-benzène étaient concentrées à 2 litres. Une seconde ré- colte, 283 gr (Préparation 9B), était obtenue en ajoutant 5 vo- lumes d'hexane normal technique.
Les premières liqueurs mères (dioXane-hexane normal
<Desc/Clms Page number 32>
technique) étaient distillées à 38 gallons. Cinq gallons étaient utilisés pour préparer une solution presque exempte de 101a-2 en précipitant tout ce composant avec 10 volumes d'hexane techni- que (Préparation 9C). Les 33 gallons restants étaient mélangés avec 5 volumes d'hexane technique pour précipiter 7860 gr de sulides qui titraient 167 mcgr/mgr et étaient composés de. 335 mcgr/mgr de 101a-1 de 60 mcgr/mgr de 101a-2 et de 380 mcgr/mgr de lOla-3 par des chromatogrammes quantitatifs sur papier (Préparation 9D).
Recristallisation de 101a-2
La préparation '9 -± (362 gr) était recristallisée dans du benzène (20 litres) en produisant 4 récoltes comme ci-après:
EMI32.1
<tb> lre <SEP> récolte <SEP> Préparation <SEP> 9E <SEP> 173 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
2me <SEP> récolte <SEP> Préparation <SEP> 91 <SEP> 62 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
3me <SEP> récolte <SEP> Préparation <SEP> 9H <SEP> 41 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
4me <SEP> récolte <SEP> Préparation <SEP> 91 <SEP> 11 <SEP> gr.
<tb>
La préparation 9E criscaux benzène") était ensuite. recristallisée dans du dioxane. Si @ refroidissait rapidement, on obtenait de longs cristaux semblab des cheveux. Si ces cristaux sont laissés au repos dans la liqueur mère, ou si la solution chaude est refroidie lentement, il se formait des pla- ques carrées. Le résultat est le même si on utilise du dioxane exempt de peroxyde-. Les plaques carrées sont des cristaux solvatés au dioxane contenant 1,5 mole de dioxane par mole de lOla-2 (préparation 9J).
Caractéristiques
Lors d'un séchage sous le vide, les longs cristaux filamenteux perdaient leur forme. Il en résultait des masses qui brillaient sous des prismes de Nicol croisés.Lors d'une suspen- sion dans du benzène ou d'une recristallisation dans du benzène, il se formait des aiguillelus courtes et plus épaisses. Lors
<Desc/Clms Page number 33>
d'une recristallisation dans de l'acétate de butyle, il se for- mait des touffes d'aiguilles. Le lOla-2 est soluble dans du chlo- roforme, du méthanol, du dioxane; légèrement soluble dans le benzène, l'acétone et l'eau; et insoluble dans les éthers de
EMI33.1
pétrole. Il ne fixe pas du Br. dans du 001 49 lorsqu'elle était chauffée, la solution devenait rouge cerise.
Tests Chimiques
EMI33.2
<tb> Test <SEP> Résultat <SEP> Contrôle <SEP> Conclusions'
<tb>
<tb> Benedict's <SEP> N <SEP> glucose <SEP> pas <SEP> de <SEP> sucre <SEP> réducteur
<tb>
<tb>
<tb> Ninhydrine <SEP> N <SEP> glycylglycine <SEP> pas <SEP> d'amino-acide
<tb>
<tb>
<tb> Biuret <SEP> N <SEP> bactopeptone <SEP> pas <SEP> de <SEP> peptide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Molisch <SEP> N <SEP> glucose <SEP> pas)d'hydrate <SEP> de <SEP> carbone
<tb>
<tb> Liebermann <SEP> N <SEP> - <SEP> pas <SEP> de <SEP> stérolde
<tb>
<tb>
<tb> Zimmerman <SEP> N <SEP> acétone <SEP> pas <SEP> de <SEP> cétones <SEP> libres
<tb>
<tb>
<tb> 2,4-dinitrophényl- <SEP> pas <SEP> de <SEP> groupes <SEP> carbonyles
<tb>
<tb> hydrazine <SEP> N <SEP> acétone
<tb>
EMI33.3
AgN03 alcoolique N pas de -CEC-' Chlorure ferrique P phénol phénol ou énol Iodoforme P - ;
. rFi C p.
EMI33.4
(N - négatif et P - positif) RIESULTATS ANALYTIOUES Préparation E Calculé pour C.J4HJ7...J.9N013 : 0 : 60,2; H : ?,0$; N : 90' (poids molécul. 67Fj Trouvé ; C : 59,?; H 6, 7; N : 1,87; cendres : 0 Hydrogène actif, six moles de CHl/mole Hydrogénation, catalyseur de Adams, pression atmosphérique,
2,51, 2,57 moles H2/mole Acyle, 18,17% ou trois groupes 0 par molécule
CCH
<Desc/Clms Page number 34>
EMI34.1
Méthoxyle, 4,92% ou un groupe OCH3/molécule Caméthyle, 3,b5 ou 11 groupes de C-SEL/molécule 24 ,I + 618 (CHC13) D Equivalent de saponification de Préparation A (non solvaté)-
269,5 Equivalent de saponification de Préparation E
EMI34.2
(produit de solvatation dans du dioxane)-226$3 Poids moléculaire (calculé)
- 678 Poids moléculaire de produit de solvatation dans du dioxane 810
EMI34.3
Formule empirique probable CH79NO13 Point de fusion 195-200"C.
Lors d'une recbistallisation de la préparation 9E dans de l'acétone, on obtenaitdes cristaux qui avaient les spectres d'absorption d'infrarouges et d'ultraviolets représentés.
La relation étroite entre les composants du 101a est montrée par les exemples suivants.
EXEMPLE 10
EMI34.4
Conversion de 10la-2 par ?m5tylation Un gramme de lola-2 (Préparation 9F) était dissous dans 20 ml de pyridine et soumis à reflux pendant 4 heures avec 3,3 ml d'anhydride acétique. Le mélange de réaction était ré- frigéré pendant une nuit et ajouté à 200 ml d'eau froide.
Un gramme d'un précipité jaune était recristallisé pour produire 564 mgr de produit jaune brillant (Préparation 10A) ayant les caractéristiques suivantes :
EMI34.5
r¯.i 24 + 153,7 (&, ,3 dans 95% EtOH) H + 12l.o (J 1 dans OHOl) a 412 nyu 16,5 a242 mu 6.3,5 etlaalyse suivante
<Desc/Clms Page number 35>
EMI35.1
<tb> C <SEP> 60,02
<tb>
<tb> H <SEP> 6,4
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 1,63
<tb>
<tb>
<tb> Acyle <SEP> 30,09
<tb>
<tb>
<tb> Cendres <SEP> 0,93
<tb>
L'analyse par chromatogramme montrait la.présence du composant 101a-7 en quantité importante dans la préparation 9F tandis que l'analyse montrait la présente des composants 101a-1 101a-2 et lOla-7 dans la Préparation 10A et la présence des composants 101a01 101a-2 lOla-3, 101a-4,
101a-5 et 101a-7 dans le filtrat.
EXEMPLE 11
Conversion de 101a-2 par du p-toluène sulfonate et de l'acide acétique glacial
Un gramme.de 101a-2 (Préparation 9F) était soumis à reflux pendant 1 heure et demie avec 100 mgr de p-toluène sulfo- nate de sodium et 20 ml d'acide acétique glacial. La solution était amenée à un pH de 3,3 et extraite deux fois avec. 30 ml de chlorure de méthylène. La solution dans du chorun de méthylène était fractionnée par addition de 1,5, 10 et 20 volumes d'hexa- ne normal technique.
-Les préparations résultantes ne montraient que le com- posant lOla-1 à l'analyse par chromatogramme. Ges préparations étaient accumulées et soumises à une distribution a contre-cou- rant dans un tube 230, en utilisant des parties égales de cyclo- hexane, d'eau, de l'acétate d'éthyle et de l'éthanol à 95%. Une seule pointe se montrant à l'analyse par chromatogramme sur pa- pier, uniquement du lOla-l était obtenu. Ceci montre que la con- version de 101a-2 en lOla-1 était réalisée.
EXEMPLE 12
Conversionde 101a-2 par de l'ammoniaque
0,5 gr de 101a-2 .(Préparation 9F était dissous dans 2 ml d'éthanol à 95% et agité pendant 25 minutes avec 10 ml
<Desc/Clms Page number 36>
d'ammoniaque concentrée. Le pH était réglé à 1,5' avec de l'aubre suif urique concentré. Lors d'un refroidissement à la température ambiante, une huile de couleur brun foncé se séparait d'une phase aqueuse jaune. L'huile était dissoute dans 80 ml d'acétone, et environ 500 mgr de sel blanc-grisâtre se précipitaient et étaient filtrés. De l'eau (210 ml) était ajoutée au filtrat et la solution résultante était séchée par congélation.
L'analyse par chromatogramme sur papier montre la présence de tous les 7 composants de 101a dans le produit séché par congélation.
EXEMPLE 13
Chromatographie de répartition du 101a
Le système solvant utilisé était préparé de la manière suivante : Pour quatre litres du mélange
EMI36.1
<tb> Toluène <SEP> 1333 <SEP> ml
<tb>
<tb> Hexane <SEP> normal <SEP> technique <SEP> 667 <SEP> ml
<tb>
<tb> Méthanol <SEP> 1200 <SEP> ml
<tb>
<tb> Eau <SEP> 800 <SEP> ml
<tb>
Ces solvants étaient combinés den mélangés et admis à se séparer en deux phases. Les phases étaient d'un volume à peu près égal.
La colonne était préparée comme suit : 250 gr de terre à diatomées étaient soumis à agitation avec 300 ml d'acide chlorhydrique 6-N pendant une heure, recueillis par filtration et lavés avec de l'eau distillée jusqu'à ce que le pH de l'eau de lavage soit de 5,5. On lavait ensuite avec du méthanol et on séchait à l'air. 180 gr de cette terre à diato- mées, lavée à l'acide, étaient mélangés intimement avec 90 ml de la phase inférieure du système solvant décrit ci-avant, et la terre à diatomées était introduite à sec avec bourrage dans une conduite de Pyrex d'un pouce de diamètre jusqu'à une hauteur d'environ 36 pouces (90 cm).
<Desc/Clms Page number 37>
L'échantillon fractionné était constitué par 1 gr du 101a de l'exemple 6. Cet échantillon était dissous dans 10 ml de la phase inférieure du système décrit ci-avant, mélangée avec 20 gr de la terre à diatomées, lavée à l'acide, et le mélange était introduit à sec au sommet de la colonne.
La colonne était alors é.luoe avec la phase supérieure) Des fractions étaient prises à des intervalles de 20 minutes (volumes de 20-25 ml).
Les fractions 1-25 contenaient du 101a-4 et du 101a-5
Les fractions 76-126 contenaient du 101a-3
Les fractions 148-193 contenaient du 101a-1
Ce qui reste dans la colonne est alors enlevé et le 101a est élué à partir de la terre 8. diatomées avec 300 ml de chloroforme. Celui-ci était évaporé alors jusqu'à siccité pour obtenir 121 mgr de 101a-2 (Préparation 13A).
Les fractions 1-25 étaient rassemblées et évaporées jusqu'à siccité pour donner environ 1105 mgr d'un mélange de 101a-4 et 101a-5 artion 13B).
Les frantions76-126 étaient ressemblées et évaporées jusqu'à siccité pour donner 385 mgr de 101a-3 solide (Préparation 130).
Les fractions 148-193 étaient rassemblées et évaporées jusqu'à siccité pour donner 275 mgr de 101a-l solide (Prépara- tion 13D).
EXEMPLE 14
Séparation des composants 101a-4 et 101a-5 par distribution à contre-courant A. Un méange de 101a-4 et de 101a-5 préparé suivant l'exemple 13 (Préparation 13B) était fractionné par la technique de distri- bution à contre-courant Craig . Le système utilisé était consti- tué par l'ensemble éthanol à 95/-acétate d'éthyl-cyclohexane eau (1/1/1/1 en volumes). Une quantité de 5 gr du mélange était dissoute dans 160 ml du système solvant ci-vant et, après 195
<Desc/Clms Page number 38>
transferts, deux bandes de couleur étaient évidentes. La pre- mière k 5,73 ne cadrait pas avec la courbe théorique' indi- quant au moins deux matières. Cette pointe conteait du 101a-5 et une impureté ambre-noir.
La seconde K 2,04 cadrait avec la courbe théorique et était du 101&-4 essentiellement pur (Pi-éparation 14A).
B. Le processus ci-avant était répété avec une seconde quantité de 5 gr pour 197 transferts; les produits étaient rassemblés et évaporés jusqu'à obtention d'une boue aqueuse. Celle-ci était extraite avec du chlorure de méthylène, et celui-ci était évapo- ré jusqu'à siccité, en produisant 1,61 gr de 101a-4 biologique- ment pur Préparation 14B C. Les fractions 10la-5 de A et B étaient rassemblées et la mas- se contenant le 101a-5 et l'impureté était évaporée jusqu'à siècle té, redissoute dans 140 ml du sy,me solvant ci-avant et redis- tribuée dans la machine Craig. En utilisant la technique du re- cyclage, on appliquait 466 transferts à nouveau deux bandes de couleur étaient évidentes.
La bande con le 101a-5 k 5,66) était évaporée jusqu'à obtention d'une boue aqueuse et extraite avec du chlorure de méthylène. On ajoutait 10 volumes d'hexane normal technique, et la solution était filtrée. Le filtrat était évaporé jusqu'à siccité et on obtenait 1,22 gr de 101a-5 biolo- giquement pur (Préparation 14c
Les exemples suivants illustrent des compositions ou dosages convenables. Le 101a peut être constitué par l'une quel- conque des préparations des exemples 3 à 7. De même, 'les compo- sants isolés peuvent être substitués au 101a dans ces exemples.
EXEMPLE 15
10.000 tablettes pour une administration par voie buc cale, contenant chacune 500 mgr de 101a sont préparées en par- tant des types et quantités de matière ci-après :
<Desc/Clms Page number 39>
EMI39.1
<tb> 1 <SEP> 101a <SEP> 5000 <SEP> gr.
<tb>
<tb> 2 <SEP> Lactose <SEP> 1500 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> Amidon <SEP> de <SEP> mais <SEP> 250 <SEP> gr. <SEP> , <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> Talc <SEP> 100 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
5 <SEP> Stéarate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 50 <SEP> gr.
<tb>
Les matières 1,2 et 3 finement pulvérulentes, sont mélangées à fond, puis transformées en granules ; granules sont mélangés avec 4 et 5 et transformés en tablettes. Celles-ci sont titrées pour examiner leur puissance et utilisées clini- quement.
EXEMPLE 16
10. 000 tablettes pour absorption par voie,buccale, con- tenant chacune 250 mgr de 101a, sont préparées à partir des types et quantités de matières ci-après
EMI39.2
<tb> 1 <SEP> 101a <SEP> 2500 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
2 <SEP> Lactose <SEP> 1250 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
3 <SEP> Amidon <SEP> de <SEP> mais <SEP> 750 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
4 <SEP> Amidon <SEP> de <SEP> mais <SEP> pâte <SEP> 10% <SEP> 200 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
5 <SEP> Stéarate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 50 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
6 <SEP> Amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> séché <SEP> 150 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
7 <SEP> Talc, <SEP> . <SEP> 100 <SEP> gr.
<tb>
Les matières 1,2 et 3 finement pulvérisées sont mélan- gées, puis transformées en granules avec 4 ; les granules séchés sont mélangés avec 5 , 6 et 7 et transformés en tablettes. Cel- les-ci sont titrées pour examiner leur puissance et utilisées cliniquement.
EXEMPLE 17,
Des capsules de gélatine d'une ou deux pièces, pour une utilisation par voie buccale, contenant chacune 250 mgr de 101a et 125 mgr de chlorhydrate de tétracycline, sont préparées de la manière habituelle en mélangeant d'abord les matières actives finement pulvérulentes avec des excipients (-talc, amidon
<Desc/Clms Page number 40>
de mais, huile minérale légère et se éarate de magnésium) et en formant ensuite les capsules. Ces capsules peuvent être adminis- trées au taux de 8 à 10 capsules par jour.
On préfère des compositions dans lesquelles le 101a constitu la majeure proportion du mélange. En général, environ 2 à 3 parties en poids de 101a devraient être présentes dans ces compositions pour chaque partie d'un antibiotique de tétracy- cline. Une proportion plus élevée de 101a peut être trouvée in- téressante dans certains cas. Dans chaque dose unitaire., la quan- tité de 101a peut varier d'environ 35 mgr à environ 1 gramme, suivant l'ge, le poids et l'état du patient ou de l'animal.
Par "antibiotique de tétracycline", on désigne la tétracycline et l'oxytétracycline sous la forme de la substance amphotère ou l'un quelconque ou des combinaisons des divers sels et déri- vés qui sont actifs, tels que le chlorhydrate, des complexes de sels métalliques, et des sels mét siques notamment les sels de sodium ou de calcium.
EXEMPLE 18
En utilisant la formule et le p. @ sus décrits à l'exemple 17, sauf qu'on remplace le chlorhydrate de tétracycline par des capsules d'isoniazide, des capsules sont préparées,,con- tenant chacune 250 mgr de 101a et 30 mgr d'isoniazide. L'adminis- tration de 8 à 12 capsules par jour a pour résultat des effets thérapeutiques améliorés, notamment une réduction dans le déve- loppement de la résistance bactérienne. En général, environ 5 à 10 parties en poids de 101a devraient être présentes dans ces compositions pour chaque partie d'isoniazide. Une proportion plus élevée de 101a est intéressante dans certains cas.
Par "isoniazide", on désigne non seulement l'isoniazide lui-même, mais également divers sels, tels que le chlorhydrate et des dé- rivés, tels que le dérivé substitué par isopropyle et autres dérivés alkyliques du composé.
<Desc/Clms Page number 41>
EXEMPLE 19
Des mélanges pulvérulents destinés à une utilisation par voie buccale, contenant dans chaque gramme de poudre, 600 mgr d'acide para-aminosalicylique et 150 mgr de 101a, sont pré- parés de la manière habituelle en mélangeant d'abord les matiè- res actives finement pulvérulentes avec des excipients (silicate de magnésium, amidon de maïs, huile minérale légère et stéarate de calcium).Lorsque ce mélange pulvérulent est pris pour le traitement de la tuberculose au taux de 20 à 30 gr par jour (en doses également réparties au moment des repas et au moment du coucher), il en résulte une réduction,du développement de la ré- sistance bactérienne et une amélioration de l'effet thérapeuti- que.
En général, environ 4 à 6 parties en poids d'acide para- amino-salicylique devraient être présentes dans ces compositions pour chaque partie de 101a Une proportion plus élevée d'acide para-amino-salicylique est intéressante dans certains cas.
Par"acide para-aminosalicylique", on désigne non seulement l'aci- de para-aminosalicylique lui-même, mais également divers sels, tels que les sels de sodium, de potassium et de calcium, et des dérivés,tels que les dérivés N-acétyl chlorés (Brevet hollandais 74*340) et autres dérivés acylés du composé.
EXEMPLE 20
Comme à l'exemple 19, des mélanges pulvérulents desti- nés à une administration par voie buccale contenant dans chaque gramme de poudre, 600 mgr d'acide para-aminosalicylique, 150 mgr de lOla et 10 à 20 mgr d'isoniazide sont préparés. L'addi- tion d'isoniazide a pour résultat une amélioration accrue de l'effet thérapeutique et une réduction de la résistance bacté- rienne, lors d'une utilisation dans le traitement de la tuber- culose chez les humains et les animaux.
EXEMPLE 21
Comme à l'exemple 19, sauf,qu'on remplace la tétracy-
<Desc/Clms Page number 42>
line par de la novobiocine (comme également sous le nom d'Alba- mycine ou Cathomycine), on prépare des capsules contenant chacune 250 mgr de 101a et 125 mgr de novobiocine sodium. L'administra- tion de 8 à 12 capsules par jour dans le traitement des infec- tions par staphylocoques a pour résultat une résistance bacté- rienne réduite et un effet thérapeutique amélioré.
On préfère des compositions dans lesquelles le 101a constitue la majeure proportion du mélange. En général, environ 2 à 3 parties en poids de lOla devraient être présentes dans ces compositions pour chaque partie de novobiocine. Une propor- tion plus élevée de 101a peut être trouvée intéressante dans certains cas. Dans chaque dose unitaire, la quantité de 101a peut varier d'environ 35 mgr à environ 1 gr, suivant l'âge, le poids et l'état de l'animal ou du patient humain.
Par "novobio- cine", on désigne non seulement la novobiocine elle-même, mais également divers sels et dérivé: actifs, tels que les sels mono- sodique, bisodique, monocalcique, bicalcique, monomagnésien, bi- magnésien ou d'autresmétaux alcalinsou alcalino-terreux, ou les sels aMnés de novobiocine et de dibrdronvobiocine EXEMPLE 22
Une suspension liquide destinée à une administration par voie buccale, contenant dans chaque cm3 100 mgr de lOla, est préparée à partir des types et quantités de matières ci-après :
EMI42.1
<tb> Saccharine <SEP> soluble <SEP> 0,3 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Cyclamate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> N.N.R. <SEP> 2 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Sucrose <SEP> pulvérulent <SEP> 25 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
101a <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Poudre <SEP> d'acide <SEP> benzoïque <SEP> 0,10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Méthylparabène <SEP> 0,10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Hydroxyanisole <SEP> butylé <SEP> 0,01 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Arome <SEP> d'orange <SEP> 0,25 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Gel <SEP> de <SEP> monostéarate <SEP> d'aluminium
<tb>
<tb> et <SEP> d'huile <SEP> d'arachide, <SEP> quantité
<tb>
<tb>
<tb> suffisante <SEP> pour <SEP> 100 <SEP> cc.
<tb>
<Desc/Clms Page number 43>
Le gel d'huile d'arachide et de monostéarate d'alumi- nium est préparé par addition de 2'gr de la poudre de stéarate, à 100 cc de l'huile avec agitation et chauffage jusqu'à 115 c jusqu'à ce qu'un gel clair se forme, et refroidissement ensuite jusqu'à la température ambiante. A une partie de ce gel, les stabilisants et l'antioxydant sont ajoutés avec agitation. L'anti- biotique est ensuite ajouté, et puis les agents d'adoucissement et d'assaisoment Lorsque le mélange est convenablement réali- sé, du gel additionnel est ajouté pour amener la suspension à
100 ce. La préparation achevée est passée à travers un moulin à colloïdes et ensuite titrée pour connaître sa puissance ou ef- ficacité, et utilisée cliniquement.
EXEMPLE 23
En utilisant la formulent le processus décrits à l'exem ple 22, sauf qu'on ajoute 5 gr d'érythromycine, on prépare une suspension liquide destinée à une administration par voie bucca- le, contenant dans chaque cm3 100 ml de 101a et 50 mgr d'érythro mycine. Une administration de cette combinaison d'antiobiotiques a pour résultat une thérapie antibactérienne efficace, de même qu'une réduction du développement de la résistance bactérienne.
-En général, environ 1 à 3 parties en poids de 101a devraient être présentes dans ces compositions pour chaque.partie d'éry-. thromycine. Une proportion plus élevée de 101a est intéressante dans certains cas. Par "érythromycine", on désigne non seulement l'érythromycine elle-même, mais également divers sels et esters, tels que le stéarate, l'éthylcarbonate,le. lactate, le maléate, le glutarate, etc.
EXEMPLE 24
Une préparation aqueuse stérile, convenant pour une injection intramusculaire et contenant dans chaque cm3, 500 mgr de 10 la, est préparée en partant des types et quantités de ma- tières ci-après.
<Desc/Clms Page number 44>
EMI44.1
<tb>
Glycol <SEP> polyéthylénique <SEP> 4000 <SEP> U.S.P <SEP> 3 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,9 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Polysorbat <SEP> 00 <SEP> U.S.P. <SEP> 0,4 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Méthylparabène <SEP> U.S.P. <SEP> 0,18 <SEP> gr.
<tb>
<tb> prepylparabène <SEP> U. <SEP> S.P. <SEP> 0,02 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
101a <SEP> (micronisé) <SEP> 50 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
Eau <SEP> par <SEP> injection <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> 100 <SEP> ce.
<tb>
Tous les ingrédients, sauf l'antibiotique,sont ajoutés à une quantité d'eau suffisante pour l'injection, avec agitation et chaleur modérée; après dissolution, le véhicule est réglé au pH de 6 avec des tampons convenables, et stérilisé par filtra- tion. L'antibiotique- est stérilisé par exposition à des vapeurs d'oxyde d'éthylène, et ensuite incorporé dans le véhicule pré- cédemment stérilisé. On ajoute de l'eau stérile pour injection, pour amener le volume à 100 ce,La suspension finale est passée à travers un moulin à colloïdes ? Périls, luise en bouteille, titrée et utilisée cliniquement.
EXEMPLE 25
En utilisant la formule et le processus décrits à l'exemple 24 sauf qu'on ajoute 52 gr de sulfate de streptomyci- ne, une préparation aqueuse stérile convenant pour une injection intramusculaire est préparée ; ellecontient dans chaque cm3 520 mgr de sulfate de streptomycine et 500 mgr de 101a. Le sul fate de streptomycine est dissous dans le véhicule après que le pH a été réglé à environ 6 comme ci-avant, et stérilisé par fil- tration. En outre du tampon, l'addition d'un stabilisant est importante avant addition de la streptomycine.
Des stabilisants convenables sont constitués par 0,5 à 1,5% de monothroglycérol, de monothiosorbite, de monothioglucose, d'acide ss ss-thiodipro piônique ou d'un de ses esters solubles dans l'eau, de sels d'aci des sulfureux ou hydrosulfureux et de leurs produits par addi-
<Desc/Clms Page number 45>
tion d'aldéhyde, tels que le bisulfite de sodium, le formaldé- hyde sulfoxylate de sodium, le métabisulfite de potassium et, l'hydrosulfite de sodium. On utilise avantageusement une combi- naison 03 stabilisants organiques et inorganiques, tels qu'envi- ron 0,2 à 0,7% de monothioglycérol avec environ 0,25 à 0,75% de bisulfite de sodium.
L'administration de cette combinaison d'antibiotiques est efficace dans le traitement de la tuberculose et montre une bonne réduction dans le développement de la résis- tance bactérienne. Une moitié du sulfate de streptomycine est avantageusement remplacée.par une quantité équivalente de sulfate de dihydrostreptomycine.
L'apparence macroscopique et microscopique de l'espèce steptomyces 101 sur divers milieux est dissemblable de celle de l'une/quelconque des cultures décrites dans le " Manual of Deter- minative Bacteriology" de Bergey,'6e édition, et dans le "Acti- nomycetes and Their Antibiotics" de Waksman et Lechevalier.
Son nom expérimental est Streptomyces spectabilis.
L'espèce Streptomyces 101, telle qu'initialement isolée d'un sol, montrait les caractéristiques de culture citées au tableau XI. Tout ensemencement était fait avec un inoculum végé- tatif développé dans 100 ml d'un bouillon d'extrait de levure- tryptone (contenant 0.5% de tryptone et 0,3% d'extrait de levure) sur un secoueur alternatif à 28 c Après 48 heures, l'inoculum était mélangé (Waring blendor) pendant une minute, et ensuite 0,2 ml de l'inoculum était ajouté à chaque plaque d'agar-agar.
Les plaques d'agar-agar étaient soumises à incubation à 28 c Les lectures étaient faites les quatrième et septième jours.
<Desc/Clms Page number 46>
TABLEAU XI
EMI46.1
Caractéristiques de culture de l' espèce gtreptomyeos .101
EMI46.2
Milieu Croissance C-.wissance Remarques
EMI46.3
<tb> végétative <SEP> aérienne
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> Amidon <SEP> orange <SEP> moucheté <SEP> -.race <SEP> d'orange <SEP> orange <SEP> moucheté
<tb>
<tb>
<tb> caséine <SEP> à <SEP> orange <SEP> pale <SEP> ;
<SEP> moucheté <SEP> à <SEP> à <SEP> orange <SEP> inverse;
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> secteurs <SEP> orange <SEP> orange <SEP> pâle <SEP> hydrolyse <SEP> + <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> foncé
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> Agar-agar <SEP> rouge <SEP> moucheté <SEP> orange <SEP> mouche- <SEP> orange <SEP> moucheté
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> scrdse <SEP> de <SEP> à <SEP> orange <SEP> crème <SEP> té <SEP> à <SEP> orange <SEP> à <SEP> rouge-orange
<tb>
<tb>
<tb> Czapek <SEP> inverse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> Agar-agar <SEP> couleur <SEP> crème <SEP> orange;
<SEP> crème <SEP> à <SEP> rouge
<tb>
<tb>
<tb> tryptone <SEP> avec <SEP> secteurs <SEP> diverses <SEP> orange
<tb>
<tb>
<tb> Maltose <SEP> orange <SEP> à <SEP> crème <SEP> teintes <SEP> inverse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> orange;
<tb>
<tb>
<tb> teintes <SEP> variant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> Agar-agar <SEP> jaune <SEP> tournant <SEP> trace <SEP> de <SEP> rouge- <SEP> jaune-orange <SEP> à
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> Bennett <SEP> av <SEP> rouge-orange <SEP> orange <SEP> à <SEP> gris <SEP> rouge-orange
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> orange <SEP> inverse;
<SEP> pigment
<tb>
<tb>
<tb> jaune
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> Agar-agar <SEP> A <SEP> couleur <SEP> crème <SEP> blanc <SEP> tacheté <SEP> crème <SEP> à <SEP> orange
<tb>
<tb>
<tb> amidon <SEP> de <SEP> tachetéed'oran- <SEP> d'orange <SEP> à <SEP> inverse;
<tb>
<tb>
<tb> Waksman <SEP> ge <SEP> rose <SEP> pale <SEP> à <SEP> hydrolyse <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> orange
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> Agar-agar <SEP> B <SEP> couleur <SEP> crème <SEP> ange <SEP> paie, <SEP> crème <SEP> tacheté <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> amidon <SEP> de <SEP> tachetée <SEP> d'orange <SEP> cteurs <SEP> plus <SEP> rouge, <SEP> à <SEP> crème
<tb>
EMI46.4
Waksman -c:cés spécia- à orange inverse; 1. sont à la pé- hydrolyse + ri tie;
rosé paît -â orange 7 Agar>¯agar crème tournant orange lu...c':J jaune orange
EMI46.5
<tb> amidon <SEP> à <SEP> l'orange <SEP> secteurs <SEP> plus <SEP> à <SEP> orange-tan
<tb> nutritif <SEP> pâles <SEP> à <SEP> la <SEP> pé- <SEP> inverse; <SEP> pigment
<tb> riphérie, <SEP> à <SEP> jaune;
<tb> rose <SEP> pâle <SEP> à <SEP> hydrolyse <SEP> +
<tb> orange
<tb>
<tb> 8 <SEP> Agar-agar <SEP> brun <SEP> néant <SEP> Drun <SEP> inverse;
<tb>
EMI46.6
fer assombrissement
EMI46.7
<tb> peptone <SEP> ils
<tb>
Les ingrédients des milieux ci,-avant .sono donnés ci-
EMI46.8
après en grammes par litre d'eau distil1ét, Les milieux sont traités en autoclave pendant 15 minutes à une pression de 15
EMI46.9
livres par pouce carré, à 12C'"C<.
1, Caséinate de sodium : 2; asridor -oluble : 1; K 2 HPO 4 i G,2 IS04.7H20 ce2, FeS0.7HgO : trace; agar-agar ; 15
<Desc/Clms Page number 47>
2. NaNO: 2; KHPO : 1; MgSO4,7H2O 0,5 KC1 : 0,5 FeSO4,7H2O 0,01,; sucrose : 30, réglé à un pH de 6,6; agar-agar 15.
3. Maltose : 10 ; tryptone 5; K2HP04 ' 0,5; NaCl : 0,5 FeSO4,7H2O trace; agar-agar 15 (digestion pancréatique- tryptane de caséine d'une teneur élevée en t ptophane
4. Extrait de levure : 1; extrait de boeuf 1 N-Z-amine A (digestion enzymatique de caséine) : 2; glucose : 10 ; milieu réglé à un pH de 7; agar-agar : 15.
5. Amidon de maïs : 10 ; KHPO : 0,3; MgCO : 1 NaCl : 0,5; NaN03 : 1; milieu réglé à un pH de 7 ; agar-agar:15.
6. Amidon soluble :: 2; K2HPO4 0,5; MgSO4,7H2I 0,2 CaCl : 0,05; NaNO3 0,05; asparagine : 0,05 ; FeSO4,7H2O trace; milieu réglé à un pH de 7,4; agar-agar : 20.
7. Extrait de boeuf : 3; peptone (hydrolysat de proté- ine animale de bas pôids moléculaire) : 5 ; amidon soluble : 2; milieu réglé à un pH de 7; agar-agar : 15. peptone
8. Peptone : 15 ; protéose/(hydrolysat de protéine animale de poids moléculaire élevé) : 5; ammonium citrate ferri- que : 0,5 ; phosphate bipotassique : 1; thiosulfate de sodium : 0,08 agar-agar : 15.
L'espèce Streptomyces 101 montre des caractéristiques distinctives de croissance et morphologiques, lorsqu'elle est développée sur les milieux suivants. Les ingrédients des mi- lieux sont donnés en grammes par litre d'eau distillée. Les mi- lieux sont traités en autoclave pendant 15 minutes à une pres- sion de 15 livres par pouce carré, à 120 c
Gélatine ordinaire (gélatine 120)
Gélatine nutritive (extrait de boeuf : 3; peptone : 5; gélatine 120, réglage à un pH de 7)
<Desc/Clms Page number 48>
EMI48.1
Agar-agar nutritif (extrait de boeu' : 3, pepfconej 5; réglage à un pH de 7; agar-agar : 15) Bouillon nutritif (extrait de boeuf : 3 ; peptone : 5) Bouillon de/glucose (extrait de boeuf : 3; pépier : 5 glucose:
10)
EMI48.2
Age -agar de d-glucose (extrait de boeuf : 3; peptone :
5, glu- cose : 10 ; réglage à un pH de 7; agar- agar :15) Bouillon de tryptone (tryptone : 10)
EMI48.3
Agar-agar tyrosine de Wakman (glucose : 10; tyrosine: 1; (NH4)2 S04 0,5; K2HP04 : 0,5; pH réglé à 7; agar-agar : 15) .
Bouillon de tyrosine (tyrosine :1 réglage,à un pH de 7) Lait de tournesol (lait déshydraté avec teinture de tournesol)
EMI48.4
Bouillon de nitrate nI tritif (extrait de boeuf : 3; 5 pet cône : 5; K.ï : i 1) Bouillon de nitrate synthétique (.'.zhP04: 0,5 ; NaCl : OtS; Ngb)!,.7}l;p : 0,2; NaNO: 2; glucc. : 10) Agar-agar malate de calcium (malate de calcium . 10; NH1FC1 : 0,5; K2HP01. : 0,5; réglage du milieu à un pH de 7; agar-agar : 1.8 ) .
Des dilutions de l'organisme, réalisées à partir d'une charge de sol stérile, étaient traitées en cultures en stries sur des plaques de Bennett et de maltose tryptone agar-agar. On trouvait quatre variantes distinctes (après 6 jours d'incubation à 2800); une variante avec les caractéristiques de la source, à savoir une couleur orange bariolée; une variante orange très fon- cé sans croissance aérienne; une variante avec croissance aérien- ne blanche, et une variante incolore - la même couleur que le milieu.
Les mêmes variantes étaient obnues en traitant au pla- teau la yariante orange bariolé et celle avec la croissance
<Desc/Clms Page number 49>
aérienne blanche.:;- les variantes orange foncé et incolore en trai- tant la forme orange foncé.Les variantes incolores restent sta- bles. Les caractéristiques de culture de la variante avec crois- sance aérienne blanche étaient les mêmes que celles pour la va- riante orange bariolé.
* Les caractéristiques des cultures des variantes sur divers milieux après 14 jours d'incubation à 28 c sont données au tableau XII. L'ensemencement était la même que pour la cul- ture décrite au tableau XI.
TABLEAU XII Caractéristiques de culture des variantes de l'espèce Streptomyces 101
EMI49.1
<tb> Milieu <SEP> (5 <SEP> souches) <SEP> (2 <SEP> souches) <SEP> (3 <SEP> souches)
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<SEP> Forte <SEP> hydrolyse,
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<tb> amidon <SEP> Croissance <SEP> aérien- <SEP> Croissance <SEP> végé- <SEP> Croissance <SEP> végé-
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<SEP> Orange
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<Desc/Clms Page number 50>
TABLEAU XII (suite)
EMI50.1
<tb> Milieu <SEP> (5souches) <SEP> 2 <SEP> seches <SEP> (3 <SEP> souches)
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<tb> orange <SEP> moucheté <SEP> foncé <SEP> incolore
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<tb> Agar-agar <SEP> Croissance <SEP> aé- <SEP> Végétatif <SEP> orange <SEP> Végétatif <SEP> incolo
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<tb> orange <SEP> à <SEP> orange <SEP> Pigment <SEP> brun-tan <SEP> Forte <SEP> hydrolyse
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L'utilisation de composés carbonés par des variantes de l'espèce Streptomyces 101 dans un milieu synthétique est mon- tréeau tableau XIII. Les tubes étaient soumis à incubation à 28 c Les lectures étaient faites le 7me jour* Le processus de Pridham et Gottlieb, J. Bact. 56, 107-114, 1948 était utilisé avec les modifications suivantes
1 Des flacons d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de bouillon d'extrait de levure-tryptone stérile étaient en- semencés avec une charge de sol de l'espèce Streptomyces 101 .
Les flacons étaient incubés à 28 c sur ur souruer alternatif.
<Desc/Clms Page number 51>
(2) Après 48 heures, la matière surnageante était;. dé cantée. La croissance végétative était lavée avec 100 ml d"eau distillée stérile et la matière surnageante était à nouveau dé- cantée. 100 ml d'eau distillée stérile étaient ensuite ajoutés à la croissance végétative lavée. Le flacon contenant le mélan- ge était placé sur un secoueur alternatif et incubé à 28 c (3) Après 48 heures supplémentaires, la matière sur- nageante était décantée. La croissance végétative était lavée comme décrit ci-avant et mélangée (Waring blendor) pendant une minute dans 100 ml d'eau distillée stérile.
(4) Les cultures en tube couché d'agar-agar étaient en- semencées avec 0,2 ml.du mélange inoculum.
TABLEAU XIII Assimilation des composés carbonés par des variantes de l'espèce Streptomvces 101 dans le milieu synthétique de Pridham et Cottielb
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<tb> Composé <SEP> 101 <SEP> original <SEP> liantes <SEP> à <SEP> partir <SEP> de <SEP> l'original
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<tb> croissance.
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<Desc/Clms Page number 52>
Toutes les variantes croissent à des températures de 24 -37 c la température optimum étant de 24 -28 A 37 c un pigment jaune fort est produit dans 1'agar-agar de Bennett par toutes les variantes après une incubation de 24-48 heures.
Des observations microscopiques révèlent de très lon gues chaines droites de conidies issues en monopodes du mycelium atrien On trouve des chlamydospores dans le mycelium aérien.
Ils peuvent être vus germant in situ dans les slides de culture fongique brune. Une caractéristique remarquable de cet organisme est le développement de granules'pigmentés à la fois dans le mycélium végétatif et le mycélium aérien. Dans les solides ci- avant, ils apparaissent exogènes et endogènes dans les aires de mycélium de fusion ou d'anastomose. Les granules sont incolores dans les variantes non pigmentées et rouge-organe dans les va-. riantes pigmentées.
Dans les préparation mouchetées et dans les supports humides de matière non mouchetée, où le mycélium est séparé, les granules apparaissent en rangées plus ou moins régulières. Dans les préparations mouchetées, le mycélium contenant les granules est opaque et mesure plus ou moins 0,78-1,569 /u de diamètre.
Les extraits par solvant du pigment, provenant de cul- tures en tube couché sur agar-agar, ont une activité antibioti-, que. Les variantes incolores et colorées sur des plaques à stries d'agar-agar montrent une activité antibiotique similaire.
Il doit être entendu que l'invention n'est pas limitée aux détails exacts d'opération ou aux composés exacts développés et décrits, car des modifications et équivalents évidents appa- raîtront aux spécialistes en ce domaine; de même, les produits ne sont pas limités à un procédé particulier de préparation.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.