L'invention a trait aux facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086
<EMI ID=1.1>
facteurs A, B et D sont dérivés. Les composés antibiotiques sont utilisables comme agents antibactériens, antifongiques, antivirus, comme agents destructeurs des organismes provoquant des maladies comme la pleuro-pneumonie, comme agents anticoccidiens, insecticides ou acari.cides et pour améliorer l'efficacité d'utilisation de l'alimentation chez les ruminants.
La présente invention fournit un procédé de préparation du complexe antibiotique A-28086 présentant un facteur A, un facteur B et un facteur D, qui comprend la culture de Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 ou Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie immergée jusqu'à ce que l'on ait obtenu grâce audit organisme dans ledit milieu de culture une quantité importante d'activité antibiotique.
<EMI ID=2.1>
contenant des facteurs A, B et D comme il est décrit ci-après.
Le facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc
<EMI ID=3.1> .alcools inférieurs, le diméthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais il est seulement <EMI ID=4.1>
environ 98-100[deg.]C, se resolidifie et refond à environ 195-200[deg.]C et il présente :
a) un poids moléculaire de 764, par détermination par spectrométrie ; b) une composition élémentaire approximative de 66,69 de carbone, 9,85 % d'hydrogène et 23,10 % d'oxygène ; <EMI ID=5.1> d'absorption distinguables suivants : 2,85, 3,34, 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (faible), 7,78 (faible), 8,75 (fort), 8,95 (fort), 9,15, 9,50
(fort), 9,55 (fort), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 et 10,70 (faible) mi crons ; f) dans son spectre ultraviolet dans l'éthanol seulement une bande <EMI ID=6.1>
g) un spectre de résonance magnétique nucléaire dans le chloroforme
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BREVET D'INVENTION'
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Priorité Conventionnelle des. demandes de Brevets américaines
Nos 477.954, 569.740 et 569.719 déposées aux Etats-Unis d'Amérique les 10 juin 1974 et 21 avril 1975 par David Herbert Berg,
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,13, 0,95, 0,93, 0,90, 0,88, 0,85, 0,77, 0,75, 0,73, 0,6S et 0,66 ppm ;
h) un groupement titrable avec une valeur pKa de 7,9 dans le diméthylfor-
mamide aqueux à 80 %.
i) un diagramme caractéristique ce diffraction de poudre aux rayons X
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suivantes entre les plans d'atomes en angstroms (d) :
<EMI ID=12.1>
<EMI ID=13.1>
silice dans un système de solvant benzène-acétate d'étyle (3:2, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisée détecteur ;
<EMI ID=14.1>
papier indiqués ci-dessous, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection :
<EMI ID=15.1>
0,75 Eau : MIBK : acétate d'éthyle (98:1:1)
1) une fonction acide susceptible de former des sels et des dérivés
ester ; et
m) au moins un groupement hydroxyle susceptible d'estérification ;
<EMI ID=16.1>
physiologique.
Le facteur B de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc lorsqu'on le cristallise dans un mélange acétone-eau, il est soluble dans des alcools inférieurs, le diméthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais il est seulement
<EMI ID=17.1> a) un point de fusion d'environ 150-153[deg.]C ; b) un poids moléculaire de 762, par détermination par spectrométrie de masse à forte résolution ; <EMI ID=18.1> de masse à résolution élevée d) un spectre infrarouge dans le chloroforme avec les maxima d'absorption distinguables suivants :
2,82, 3,30, 5,77, 5,85, 6,80, 7,20, 7,50 (faible), 7,72 (faible)
7,80 (faible), 8,57 (fort), 8,68, 8,90 (fort). 9,10, 9,50, 9,83 (fort), 9,90, 10,10, 10,17 (fort), 10,43 (faible), 10,80 (faible), 11,20 (faible),
11,35 (faible), 11,73 (faible), et 12,03 (faible) microns ; e) un maximum d'absorption observé dans l'éthanol sur son spectre ultra- <EMI ID=19.1> f) un spectre de résonance magnétique nucléaire dans le chloroforme deutérié avec les caractéristiques suivantes : S 7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62, 3,59, 3,52, 3,48, 2,81, 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, 0,96, 0,94, 0,90, 0,87, 0,84, 0,77, 0,74 et 0,68 ppm ;
g) une valeur Rf de 0,42 pour la chromatographie en couche mince sur gel de
silice dans un mélange benzène-acétate d'éthyle (3:2), en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection ;
h) les valeurs suivantes Rf pour des systèmes de chromatographie sur
papier indiqués ci-dessous, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection ;
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<EMI ID=21.1>
avec NH40H puis diminué à pH 7,5 avec H3P04
<EMI ID=22.1>
1) une fonction acide susceptible de donner des sels et des dérivés ester ;
j) deux fractions cétoniques ; et
k) au-moins une fraction hydroxyle
et ses sels acceptables sur le plan physiologique.
Le facteur D de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc lorsqu'on le cristallise dans un mélange acétone-eau ; il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le dimëthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais il est seulement légèrement soluble dans l'hexane ; et il est insoluble dans l'eauau ; il fend à environ 96-98[deg.]C, et il présente : a) un poids moléculaire de 778, par détermination par spectrométrie de masse à forte résolution ; <EMI ID=23.1> nation à 25[deg.]C ; e) un spectre d'absorption infrarouge dans le chloroforme avec les maxir.a d'absorption observables suivants : 2,89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 et
11,49 microns ; f) pas d'absorption observable dans l'ultraviolet dans l'éthanol aqueux à 95 % ;
g) un spectre de résonance magnétique nucléaire dans le chloroforme avec
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0,84, 0,74 et 0,68 ppm ;
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
j) les valeurs de Rf suivantes dans des systèmes de chromatographie en
couche mince sur gel de silice indiqués ci-dessous, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection :
Valeur Rf Système de solvants
0,26 Benzène acétate d'éthyle (3:2)
0,66 Acétate d'éthyle-diéthylamine (95:5)
k) les valeurs Rf suivantes sur des systèmes de chromatographie sur papier
indiqués ci-dessous, en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection :
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0,64 Eau : MIBK : acétate d'éthyle (98:1:1)
1) une fonction acide susceptible de donner des sels et des dérivés
ester ; et
m) au-moins un groupement hydroxyle susceptible d'estérification ;
et ses dérivés ester d'acyle en C2-C6 et, ses sels acceptables sur le plan physiologique.
Bien que l'on connaisse actuellement de nombreux agents antibactériens,
il y a une demande continue pour de nouveaux antibiotiques améliorés. Un problème dans la thérapeutique courante par antibiotique est le fait que les antibiotiques diffèrent du point de vue de leur efficacité vis-à-vis des organismes pathogènes. Un autre problème est le développement des souches d'organismes qui sont résistantes aux antibiotiques normaux. Un autre problème également est le fait que certains malades souffrent souvent de réactions sérieuses à des antibiotiques spécifiques, compte tenu de l'hypersensibilité et/ou des effets toxiques. Compte tenu de ces problèmes dans la thérapeutique courante, il existe une demande continue pour de nouveaux antibiotiques.
En plus des demandes pour de nouveaux antibiotiques qui soient utilisables dans le traitement des maladies humaines, il existe également une demande pour des antibiotiques améliorés dans le domaine vétérinaire. Dans un domaine important, il existe une demande pour des antibiotiques améliorés pour améliorer la croissance de la volaille et du bétail. Par exemple, on obtient l'augmentation de la croissance en réduisant les maladies et en augmentant l'efficacité d'utilisation d'alimentation.
Une maladie bien ronnue de la science vétérinaire quant à son importance économique, plus particulièrement dans l'industrie de la volaille, est la coccidiose protozoaire. La coccidiose résulte de l'infection par une ou plusieurs espèces d'Eimeria ou Isospora (pour un résumé, voir Lund et Farr
<EMI ID=29.1>
State University Press, Ames, la., 1965, pages 1056 à 1096). Compte tenu des pertes économiques importantes dues à la coccidiose et des inconvénients des agents anticoccidiens bien connus, la recherche pour de nouveaux agents anticoccidiens se poursuit.
L'entérite est une autre maladie qui peut provoquer des pertes économiques sévères aux producteurs de cheptel vif. L'entérite se produit chez les poulets, les porcs, les bêtes à cornes et les moutons et on l'attribue essentiellement
à des bactéries anaérobies, plus particulièrement Clostridium perfringen , et à
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C. perfringens.
L'amélioration de la croissance chez des ruminants, tels que des bêtes <EMI ID=31.1>
rinaire. D'un intérêt plus particulier est l'amélioration de la croissance obtenue par l'augmentation de l'efficacité d'utilisation de la nourriture. Le mécanisme d'utilisation de la plus grande partie de la fraction nutritive
(glucides) ces aliments pour ruminants est bien connu. Des microorganismes présents dans le rumen de l'animal dégradent les glucides
pour donner des monoglucides, puis transforment ces monoglucides en pyruvates. Les pyruvates sont métabolisés par des processus microbiologiques pour donner des acétates, des butyrates ou des propionates que l'on connait
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<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
<EMI ID=35.1>
On prépare le complexe antibiotique A-28086 par culture de la nouvelle souche de Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 dans des conditions de fermentation aérobie immergée jusqu'à ce que l'on obtienne un taux important d'activité antibiotique. On peut également préparer le complexe antibiotique A-28086 par culture d'une autre nouvelle souche de Streptomyces aureofaciens, NRRL 8092. Lorsqu'il est préparé soit par S. aureofaciens NRRL 5758 ou par
S. aureofaciens NRRL 8092, on extrait le complexe antibiotique A-28086 du bouillon de fermentation et du mycélium à l'aide de solvants organiques polaires. On sépare le mélange antibiotique extrait par concentration des solvants, par addition des concentrés des excès d'éther de pétrole pour précipiter les impuretés, par filtration et par évaporation des filtrats pour obtenir le mélange antibiotique A-28086. On purifie ultérieurement le mélange antibiotique et on le sépare en facteurs individuels par chromatographie sur colonne.
Les composés A-28086 arrêtent la croissance des organismes qui sont
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anti-PPLO (organismes provoquant des maladies du genre pleuro-pneumonie), insecticides et acaricides et ils améliorent l'efficacité d'utilisation de 1'alimentation chez les ruminants.
Les spectres d'absorption infrarouges suivants dans le chloroforme sont présentés sur les dessins : figure 1 - facteur A de l'antibiotique A-28086 figure 2 - facteur B de l'antibiotique A-28086 figure 3 - dérivé ester d'acétyle du facteur A de l'antibiotique
<EMI ID=37.1> figure 5 - dérivé ester de butyryle du facteur A de l'antibiotique
<EMI ID=38.1>
A-2S036 figure 7 - dérive ester de caproyle du facteur A de l'antibiotique
<EMI ID=39.1> figure 3 - facteur D de l'antibiotique A-28086
Les facteurs de l'antibiotique A-28036 sont reliés d'une manière: structu-
<EMI ID=40.1>
relance. Cn sépare les facteurs les uns des autres, et on isole les facteurs <EMI ID=41.1>
Le mélange des facteurs A-28086 est soluble dans la plupart des solvants organiques, mais il est insoluble dans l'eau.
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1>
Le facteur 8 de l'antibiotique A-28036 est un composé cristallin blanc
(par cristallisation dans un mélange acétone-eau) qui présente un point de fusicr. d'environ 150-153[deg.]C.
Par détermination par spectrométrie de masse à forte résolution, le
facteur B présente un poids moléculaire ipparent de 762 et on suggère la
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Le spectre infrarouge du facteur B dans le chloroforme est représenté sur la figure 2 des dessins ci-joints. On observe les maxima d'absorption
<EMI ID=47.1>
7,80 (faible), 8,57 (fort), 8,68, 8,90 (fort), 9,10, 9,50, 9,83 (fort), 9,90,
10,10, 10,17 (fort), 10,43 (faible), 10,80 (faible), 11,20 (faible), 11,35
(faible), 11,73 (faible), et 12,03 (faible) microns.
Le spectre ultraviolet du facteur B dans l'éthanol présente un maximum
<EMI ID=48.1>
Le spectre de résonance magnétique nucléaire du facteur B de l'antibiotique A-28086 dans le chloroforme deutérié présente les caractéristiques suivantes : S 7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62,
<EMI ID=49.1>
1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, 0,96, 0,94, 0,90, 0,87, 0,84, 0,77, 0,74, et 0,68 ppm.
Le facteur B de l'antibiotique A-28086 est soluble dans un certain nombre
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thylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais il est seulement légèrement soluble dans des solvants organiques non polaires tels que l'hexane ; et il est insoluble dans l'eau.
<EMI ID=51.1>
soit pas élucidée, les données physico-chimiques précédentes montrent que ce facteur B présente une fraction acide carboxylique unique, deux fractions cétoniques et une ou plusieurs fractions hydroxyles.
Le facteur B de l'antibiotique A-28086, lorsqu'on le prépare à l'aide de
S. aureofaciens NRRL 5758, est un facteur peu important. Toutefois, lorsqu'on le prépare à partir de S. aureofaciens NRRL 8092, le facteur D de l'antibiotique
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récupérée.
Le facteur D de l'antibiotique A-28086 est un produit cristallin blanc
(par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 96-98[deg.]C. Le facteur D de l'antibiotique A-28085 présente un poids
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<EMI ID=54.1>
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
Les valeurs Rf des facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 dans différents systèmes de chromatographie sur papier, en utilisant comme orga-
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Tableau 1
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Dans le tableau II on donne les valeurs Rf des facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 dans deux systèmes de chromatographie en couche mince sur gel de silice (plaques enduites de E. Herck, Darmstadt, F-254, épaisseur de couche 0,25 mm), en utilisant également comme organisme de détection Bacillus subtilis ATCC 6633.
Tableau II
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Une autre substance, arbitrairement désignée sous le nom deA-28086-I, est produite simultanément avec le complexe antibiotique A-28086. Bien que le produit A-28086-I ne soit pas microbiologiquement actif, il est structurellement en relation avec les facteur'' antibiotiques du produit A-28G36.
Le produit A-28036-I est un compose cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) et il présente un point de fusion d'environ 160-162[deg.]C. Des études comparatives des spectres RMN et des autres propriétés du produit
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préparé par voie synthétique, montrent d'une manière évidente que le produit A-28OS6-I est l'ester de méthyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 ou un . composé très voisin tel qu'un stéréoisomère.
Bien que le produit A-28086-I co-précipite initialement avec les facteurs antibiotiques actifs du produit A-28086, on le sépare facilement de ceux-ci par
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Rf approximative de 0,53 dans une chromatographie de couche mince sur gel de silice avec l'acétate d'éthyle en utilisant pour la détection un réactif pulvé-
<EMI ID=65.1>
pour 100 ml de solution). Après avoir pulvérisé la vanilline et après avoir chauffé, le produit A-28086-I donne une tâche bleue tandis que les facteurs antibiotiques du produit A-28086 donnent des tâches rose brillant qui deviennent rapidement bleu brunâtre foncé.
Les facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 et les dérivés ester d'acyle spécifiés des facteurs A et D sont susceptibles de former des sels. Des sels "physiologiquement acceptables" sont des sels qui sont également acceptables sur le plan pharmaceutique, c'est-à-dire des sels pour lesquels la toxicité du composé dans son entier vis-à-vis des animaux à sang chaud
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et appropriés de métal alcalin etde métal alcalino-terreux des facteurs A et B de l'antibiotique A-28086 comprennent les sels de sodium, de potassium, de lithium, de césium, de rubidium, de baryum, de calcium et de magnésium. Des sels d'amine appropriés des facteurs A et B de l'antibiotique A-28086 compren-
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illustratifs comprennent ceux préparés par réaction des facteurs A et B de l'antibiotique A-28086 avec l'hydroxyde d'ammonium, la mêthylamine, la butylamine secondaire, l'isopropylamine, la diéthylamine, la diisopropylamine, l'éthanolamine, la triéthylamine, le 3-amino-1-propanol et des amines semblable:.
On prépare les sels cationiques de métal alcalin et de métal alcalinoterreux des facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 et des dérivés ester d'acyle des facteurs A et D selon des procédés habituellement utilises pour
la préparation des sels cationiques. Par exemple, on dissout la forme acide libre du facteur antibiotique ou du dérivé ester dans un solvant approprie
<EMI ID=68.1>
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isoler le sel ainsi formé par des procédés habituels, tels que la filtration, l'évaporation du solvant.
On peut préparer les sels formés avec des amines organiques d'une manière semblable. Par exemple, on peut ajouter l'amine gazeuse ou liquide à une solution du facteur antibiotique dans un solvant approprié tel que l'acétone, ci on peut éliminer le solvant et l'excès.d'amine par évaporation.
Il est bien connu dans la technique pharmaceutique vétérinaire que la
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par antibiotique. Dans la plupart des cas, les conditions chez l'animal modifient le médicament pour donner une forme autre que celle sous laquelle il est administré. Par conséquent, la forme de sel sous laquelle on l'administre n'est pas significative du procédé de traitement. Cependant, on peut choisir la forme sel pour des raisons d'économie, de facilité et de toxicité.
Le facteur A de l'antibiotique A-28086 donne des dérivés esters d'acyle. L'estérification se produit sur un des groupement hydroxyles du facteur A de l'antibiotique A-28086 par traitement avec un anhydride ou un chlorure d'acier
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facteur A de l'antibiotique A-28086 avec, par exempte, l'anhydride d'acide correspondant à température ambiante. Ces dérivés esters sont également utilisables comme antibiotiques et comme agents d'amélioration de l'efficacité d'utilisation de l'alimentation.
Les paragraphes suivants décrivent les caractéristique-; de ces dérivés esters d'acyle du facteur A de l'antibiotique A-280S6.
<EMI ID=72.1>
composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 100-103'C. Le dérivé ester d'acétyle du
<EMI ID=73.1>
un poids moléculaire d'environ 807, par rapport à la formule empirique
<EMI ID=74.1>
du dérivé ester d'acétyle du facteur A donne la conposition suivante en pourcentage :
<EMI ID=75.1>
Trouvé : C, 67,67 ; H, 8,71 ; 0, 23,13
Le spectre infrarouge du dérivé ester d'acétyle du facteur de l'antibiotique A-28086 dans le chloroforme est représenté sur la figure 3 des dessins
<EMI ID=76.1>
10,25 (faible) et 10,50 microns.
Le spectre ultraviolet de l'ester .. acétyle du facteur A de l'antibi que A-28086 dans l'éthanol présente seulement une absorption finale.
La titrage électrométrique du dérivé ester d'acétyle du facteur A de
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présence d'un groupement titrable avec une valeur pK de 8,5.
Le dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 96-98[deg.]C. Le dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 a la formule empirique C46H76012et un poids moléculaire d'environ 821, par rapport à la formule empirique proposée pour le facteur A de l'antibiotique A-28086. L'analyse élémentaire du dérivé ester de propionyle du facteur A donne la composition suivante en pourcentage :
Calculé pour C46H76012 : C, 67,29 ; H, 9,33 ; 0, 23,38
Trouvé C, 66,06 ; H, 9,17 ; 0, 23,41
Le spectre infrarouge du dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 dans le chloroforme est représenté sur la figure 4 des dessins ci-joints. On observe les maxima d'absorption suivants ; 2,85, 3,33, 3,38 (fort), 3,45 (fort), 5,75 (fort), 5,82, 6,81, 7,22, 7,30 (fort), 7,50
(faible), 7,60 (faible), 7,80, 8,43, 8,75 (fort), 8,90, 9,05, 9,15 (fort), 9,50 (fort), 9,63, 9,83.(faible), 10,05 (fort), 10,13, 10,20 (fort), 10,45
et 10,63 microns.
Le spectre ultraviolet du dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 dans l'éthanol présente seulement une absorption finale.
Le dérivé ester de butyryle du facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 96-98[deg.]C. Le dérivé ester de butyryle du
<EMI ID=78.1>
rique proposée pour le facteur A de l'antibiotique A-28086.
Le spectre infrarouge du dérivé ester de butyryle du facteur A de
<EMI ID=79.1>
<EMI ID=80.1>
3,45, 3,51, 5,85, 5,92 !fort), 5,97 (fort), 6,90, 7,30, 7,84 (faible), 8,55,
<EMI ID=81.1>
Le dérivé ester de valéryle du facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un pôint de fusion d'environ 173-175[deg.]C. Le dérivé ester de valéryle du
<EMI ID=82.1> <EMI ID=83.1>
proposée pour le facteur A de l'antibiotique A-28086.
Le spectre infrarouge du dérivé ester de valéryle du facteur A de
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
(faible), 8,16, 8,58, 8,85 (faible), 9,26, 9,76, 10,00 (faible), 10,31 et
10,64 microns.
Le dérivé ester de caproyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 est un composé cristallin blanc (par cristallisation dans un mélange acétone-eau) avec un point de fusion d'environ 163-167'C. Le dérivé ester de caproyle du
<EMI ID=87.1>
Le spectre infrarouge du dérivé ester de caproyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 dans le chloroforme est représenté sur la figure 7 des dessins
<EMI ID=88.1>
L'acylation du facteur A de l'antibiotique A-2S036 donne comme résultats les changements suivants dans le spectre de résonance magnétique nucléaire
<EMI ID=89.1>
environ 5,3 ppm (la position exacte varie légèrement selon les différents dérivés acyles), et les signaux des protons vinyliques se déplacent également. Ceci est caractéristique du changement représenté dans la structure partielle par :
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
découplage homonucléaire <1>H et ce résonance magnétique nucléaire <1><3>C à partir des dérivés esters d'acétyle et de propicryle.
<EMI ID=92.1> le méthanol, l'éthanol, le diméthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène ; mais ils sont
<EMI ID=93.1>
l'hexane ; et ils sont insolubles dans l'eau.
<EMI ID=94.1>
présente une fonction acide susceptible de donner des sels et des dérivés esters.
On prépare les nouveaux antibiotiques en cultivant une souche de
<EMI ID=95.1>
aérobie immergée dans un milieu de culture approprié jusqu'à ce qu'il se produise une activité antibiotique importante. On récupère les antibiotiques
<EMI ID=96.1>
utilisés et compris de la technique.
Un des nouveaux organismes utilisables pour la préparation des antibiotiques est isolé d'un échantillon de terre recueilli sur le Mont Ararat en
<EMI ID=97.1>
Species Descriptions from First and Second Studies", International Bulletin Systematic Bacteriology 18, 279-392 (1968). Cette classification est basée sur
<EMI ID=98.1>
and D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces species", International Bulletin Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)] en r.êre temps que certains essais supplémentaires. On définit les noms de couleur
<EMI ID=99.1>
Commerce, Circulaire 553, 1955, Washington, D.C.). Les chiffres entre parer-
<EMI ID=100.1>
<EMI ID=101.1>
New York, N.Y. 1950). On réalise les cultures à 30'C pendant 14 jours sauf indication contraire.
<EMI ID=102.1>
Morphologie
Les hyphes aériens sporulants comprennent des griffes, des boucles et des spirales ouvertes. On observe également une morphologie représentative du type rectus flexibilis. Les spores sont courtes et cylindriques et se
<EMI ID=103.1>
<EMI ID=104.1>
microscope électronique, est régulière.
Caractéristiques de culture de la souche NLRL 5753 dans différents milieux
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
- ..
On étudie l'organisme NRRL 5758 du point de vue de propriétés physiologiques choisies, selon des procédés normaux. Les propriétés observées et les caractéristiques trouvées sont les suivantes :
<EMI ID=107.1>
Impératif de température (plan 26-30[deg.]C bonne croissance ; 30-37[deg.]
<EMI ID=108.1>
de levure, extrait de malt) 45[deg.] croissance légèrement végétative;
pigment soluble rougeâtre.
Les résultats des essais d'utilisation de carbone réalisés avec l'organisme NRRL 5758 sont reportés ci-dessous. Les symboles utilisés pour indiquer la réponse de croissance sont :
+ Bonne croissance, utilisation positive
(+) Croissance faible à moyenne
(-) Croissance faible, probablement pas d'utilisation
Pas de croissance, pas d'utilisation.
<EMI ID=109.1>
Un second nouveau organisme donnant l'antibiotique à 28086 est dérivé de
<EMI ID=110.1>
d'une mutation chimique. Cet organisme, identifié comme étant NRRL 8092, est également classé comme une souche de Streptomyces aureofaciens Duggar. Cette classification est basée sur des études de l'organisme NRRL 8092 en
<EMI ID=111.1>
et des conditions de croissance identiques. Les caractéristiques de 1 'organisée NRRL 8092 observées dans ces études sont réunies dans les paragraphes suivants.
Caractérisation de la souche NRRL 8092 produisant
l'antibiotique A 28C86
Morphologie
<EMI ID=112.1>
occasionnels, mais donne essentiellement des sporophores courts, droits. Les chaines de spores ont moins de 10 spores par chaîne, habituellement 4 à 7 spores par chaîne. On observe des chaînes de spores courtes droites dans les
<EMI ID=113.1>
une corémie abondante sur la gélose d'Emerson. On pratique des observations
<EMI ID=114.1>
<EMI ID=115.1>
Caractëristiques de culture de la souche NRRL 8092
dans différents milieux
<EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
On a également étudié l'organisme NRRL 8092 vis à vis de propriétés physiologiques choisies, selon des procèdes normaux. Les propriétés observées et les caractéristiques trouvées sont les suivantes :
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
me NRRL 8092 sont résumés ci-après. Les symboles utilisés pour indiquer la réponse de croissance sont :
+ bonne croissance, utilisation positive
(+) croissance faible à modérée
(-) croissance faible, probablement pas d'utilisation
pas de croissance, pas d'utilisation
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
l'antibiotique A-28036 diffèrent des caractéristiques de l'organisme décrit par Shirling et Gottlieb. Ces différences sont résumes dans le tableau III :
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
caractéristiques de l'organisme NRRL 8092 sont résumées dans le tableau IV :
<EMI ID=125.1>
<EMI ID=126.1>
des antibiotiques A-28086 ont été déposées et font partie de la collection de cultures du Northen Marketing and Nutrition Research Division, Ministère de l'Agriculture des E.U.A. Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, USA
61604, où elles sont disponibles au public sous les N[deg.] NRRL 5758 et NRRL
8092.
Le milieu de culture utilisé pour la croissance de Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 ou de Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 peut être
l'un quelconque d'un certain nombre de milieux. Toutefois, pour des raisons d'économie de préparation, de rendement optimal, et de facilité d'isolation du produit, on préfère certains milieux de culture. Par conséquent, par exemple, des sources préférées de glucides pour une fermentation à grande échelle
sont la dextrine de tapioca et le saccharose, bien que l'on puisse utiliser
du glucose, de l'amidon de mais, du fructose, du mannose, du maltose,
du lactose, et des glucides semblables. L'huile de mais, l'huile d'arachide, l'huile de soja et l'huile de poisson sont d'autres sources de carbone utilisables. Une source préférée d'azote est la caséine hydrolysée par enzyme, bien que l'on puisse également utiliser des peptones, de la farine de soja,
de la farine de graines de coton, des aminoacides tels que l'acide glutamique, etc. Parmi les sels minéraux nutritifs que l'on peut incorporer dans le
milieu de culture, sont les sels solubles habituels susceptibles de donner
des ions sodium, magnésium, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, sulfate, nitrate et des ions semblables.
On doit également introduire dans le milieu de culture des éléments essentiels sous forme de traces nécessaires pour la croissance et le développement de l'organisme. De tels éléments sous forme de traces sont habituellement sous forme d'impuretés des autres constituants du milieu en quantités suffisantes pour satisfaire aux exigences de croissance de l'organisme.
Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (comme par exemple 0,2 ml/1) d'un agent anti-mousse tel que du polypropylène glycol dans des milieux de fermentation à grande échelle si le moussage devient un problème.
Bien que ceci ne soit pas essentiel, on améliore la préparation de l'antibiotique des souches de Streptomyces aureofaciens donnant l'antibiotique A-23086 par addition d'une petite quantité d'huile telle que de l'huile de soja.
Pour la préparation de quantités importantes d'antibiotiques A-28086,
on préfère une fermentation aérobie immergée dans des réservoirs. On peut obtenir des quantités faibles de l'antibiotique A-28086 par une culture en ballon agité. Compte tenu de la perte de temps dans la préparation de l'antibiotique qui est en général associée à l'inoculation de réservoirs importants avec la forme spore de l'organisme, il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume du milieu de culture avec la forme spore ou des fragments de mycelium
de l'organisme pour obtenir une culture fraiche, à croissance active de l'organisme. On transfère ensuite l'inoculum végétatif au réservoir de grande dimension. Le milieu utilisé pour la croissance de l'inoculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour dss fermentations plus importantes, mais
on peut également utiliser d'autres milieux.
On peut développer les organismes donnant l'antibiotique A-28086 à des températures comprises entre environ 20[deg.] et environ 40[deg.]C. Il apparaît que l'optimum de production de l'antibiotique A-28086 se produit à des températures d'environ 27-30[deg.]C.
On injecte de l'air stérile dans le milieu de culture comme il est
habituel dans des procédés de culture aérobie immergée. Pour une croissance efficace de l'organisme, le volume d'air utilisé dans le réservoir de fabrication est de préférence supérieur à 0,1 volume d'air par volume'de milieu de culture par minute. Pour une production efficace des antibiotiques A-28086, le volume d'air utilisé dans le réservoir de fabrication est de préférence supérieur
à 0,25 volume d'air par volume de milieu de culture par minute. Des teneurs importantes d'oxygène dissous ne diminuent pas la production d'antibiotiques.
On peut suivre la production des antibiotiques pendant la fermentation
en prélevant des échantillons de bouillon ou d'extraits des solides
du mycelium afin d'examiner l'activité antibiotique vis à vis des organismes connus comme étant sensibles aux antibiotiques. Un organisme d'examen utilisable pour l'essai des antibiotiques selon la présente invention est Bacillus subtilis ATCC 6533. On réalise d'une manière facile l'examen biologique par un essai
au disque de papier sur des plaques.de gélose.
Le pH initial du milieu de culture inoculé varie avec le milieu utilisé.
En général, le pH doit être dans l'intervalle de 6,0 à 7,5. Le pH de la culture à la fin de la fermentation est habituellement légèrement plus élevé, dans l'intervalle de 6,5 à 8,0.
En général, l'activité antibiotique est détectable le second jour de la fermentation. La production maximale d'activité antibiotique se produit habituellement entre le sixième et le dixième jour.
Après la préparation dans des conditions de fermentation aérobie immergée, on peut récupérer les antibiotiques A-28086 précédemment décrits à partir du milieu de fermentation par des procédés habituellement utilisés dans la technique de la fermentation. L'activité antibiotique produite pendant la
<EMI ID=127.1>
<EMI ID=128.1> procédés comprenant la filtration, l'extraction, et la chromatographie d'absorption. Un solvant préféré pour la séparation des antibiotiques A-28086 soit à partir du bouillon total soit à partir du bouillon de fermentation
filtré est l'acétate d'éthyle, bien que d'autres solvants habituellement utilisés soient satisfaisants.
Un procédé plus particulièrement avantageux de séparation des facteurs
A, B et D de l'antibiotique A-28086 est de diminuer le pH du bouillon de ' fermentation complet à environ pH 3,0. A ce pH 3,0, on sépare facilement
les facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 et lamasse de mycélium par filtration. Un autre procédé avantageux de séparation du facteur de l'antibiotique A-28086 comprend l'addition d'un bicarbonate tel que, par exemple, le bicarbonate de sodium, au bouillon total en quantités d'approxinativement
1 gramme par litre. De cette façon, on sépare facilement les facteurs de l'antibiotique A-28086 de la masse de mycelium sous la forme de sel. On préfère le méthanol comme solvant pour la séparation des antibiotiques de la masse de mycélium, mais d'autres alcools inférieurs et des cétones sont également appropriés.
On peut également utiliser avantageusement la distillation azéotropique pour la récupération des antibiotiques A-28086. Dans ce procédé, on ajoute au bouillon aqueux de fermentation un solvant organique qui donne un azéotrope approprié avec l'eau. On soumet ce mélange solvant-bouillon à une distillation azétropique en vue d'éliminer au moins la moitié de l'eau du bouillon, en laissant un mélange eau-solvant dans lequel les antibiotiques A-28086 sont en solution dans le solvant organique. On peut séparer les sous-produits insolubles par des moyens appropriés tels que la filtration ou la centrifugation. On peut ensuite récupérer les antibiotiques A-28086 de la solution organique par des procédés bien connus tels que l'évaporation de solvants, la précipitation
par addition d'un non-solvant, ou l'extraction.
Des solvants organiques qui donnent des azéotropes appropriés avec l'eau afin de mettre en oeuvre un tel procédé de récupération comprennent, à titre illustratif, l'alcool butylique, l'alcool amylique, l'alcool hexylique, l'alcool benzylique, l'acétate de butyle, l'acétate d'amyle, le 1,2-dichloroéthane, la 3-pentanone, la 2-hexanone, le benzène, la cyclohexa-none, le toluène, les xylènes et des solvants semblables.
Il est particulièrement avantageux de pratiquer une récupération par distillation azéotropique dans des procédés de fermentation à échelle importante. L'eau et le solvant qui distillent en tête dans l'azéotrope peuvent être séparés par des procédés connus puis ensuite être recyclés pour une utilisation ultérieure. L'eau ainsi récupérée ne contient pas de contaminants et ne nécessite
<EMI ID=129.1> manière recycler dans le procédé le solvant ainsi éliminé.
Une purification ultérieure des antibiotiques A-28036 comprend des procédés supplémentaires d'extraction et d'adsorption. On peut utiliser avantageusement des produits adsorbants, tels que le gel de silice, le carbone,
<EMI ID=130.1>
Fla.) et des adsorbants semblables.
Dans une autre variante, on peut utiliser les solides de culture, comprenant les constituants du milieu et le mycélium sans extraction ou séparation, mais de préférence après l'élimination de l'eau, comme source des antibiotiques A-28086. Par exemple, après la production de l'activité antibiotique A-28086, on peut sécher le milieu de culture par lyophilisation et le mélanger directement dans un pré-mélange d'alimentation.
Dans un autre aspect, après la production de l'activité de l'antibiotique A-28086 dans le milieu de culture, on peut séparer et sécher le mycelium pour obtenir un produit que l'on peut utiliser directement dans un pré-mélange d'alimentation. Lorsque l'on sépare le mycelium pour une telle utilisation, l'addition de carbonate de calcium (environ 10 g/1) aide à la filtration et donne un produit séché amélioré.
<EMI ID=131.1>
aureofaciens décrites précédemment et désignées sous les N[deg.] NRRL 5753 et
NRRL 8092 donnent comme facteur prédominant le facteur A de l'antibiotique A-28086. Bien que le rapport des facteurs varie en fonction des conditions de fermentation utilisées, en général, le facteur A représente plus de 99 \_ de l'activité antibiotique totale récupérée à partir de NRRL 5758 et environ 90 �
<EMI ID=132.1>
de l'antibiotique A-28086 représente la plus grande partie de l'activité antibiotique restante à partir de NRRL 5758, et le facteur D est un facteur mineur. Par ailleurs, le facteur D de l'antibiotique A-28086 représente environ 8 à 10 % de l'activité antibiotique totale récupérée à partir de NRRL 8092,
et le facteur B est un facteur mineur.
On sépare les facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28036 les uns des autres et on les isole en tant que composés individuels en utilisant des procédés bien connus tels la chromatographie de colonne, la chromatographie de couche mince et les procédés semblables. Par exemple, on utilise une chromatographie de colonne sur gel de silice pour séparer les facteurs A, B et D
par élution de la colonne avec différents mélanges de solvants, tels que un mélange benzène-acétate d'éthyle. Lorsqu'on utilise des mélanges de solvants benzène-acétate d'éthyle sur colonne de gel de silice, le facteur B est d'abord élue, puis les facteurs A et D sont ensuite élues. La chromatographie de couche mince, comme décrite précédemment, est un procédé facile pour contrôle^ la <EMI ID=133.1>
progression de l'élution.
Les composés de l'antibiotique A-28086 arrêtent la croissance des
<EMI ID=134.1>
plantes. Les activités ;nicrobiologiques relatives des facteurs A et B de l'antibiotique A-28086 sont décrites ci-dessous dans le tableau V.
Le procédé d'essai est le procédé habituel de diffusion sur disque
<EMI ID=135.1>
par ml de solution ; les tampons sont placés sur des plaques de gélose ensemencées avec l'organisme à l'essai).
TABLEAU V
<EMI ID=136.1>
Dans un aspect important, les composés de l'antibiotique A-23036 arrêtent la croissance des bactéries anaérobies. Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) pour lesquelles le facteur A de l'antibiotique A-28086 inhibe les diverses bactéries anaérobies, déterminées par un essai normalisé de dilution sur gélose sont résumées dans le tableau VI. Les lectures sont faites après 24 heures d'incubation.
TABLEAU VI
<EMI ID=137.1>
<EMI ID=138.1>
A-28086 présentent également une activité antimicrobienne et fongicide. Dans un aspect, ces dérives présentent une activité gram- positive améliorée. Les activités gram- positives relatives de certains de ces dérivés sont comparées avec l'activité du facteur A. On examine les composés par un essai
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
<EMI ID=141.1>
utilise les paramètres d'essai suivants : Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 dans un milieu de bouillon nutritif (pH 7), incubé pendant 4 heures à 37[deg.]C. On dissout les échantillons d'essai et le témoin dans un mélange éthanol-eau (10:90). On présente le témoin, le facteur A de l'antibiotique <EMI ID=142.1>
5 mcg/m1. On dilue les composés d'essai pour qu'ils contiennent approximativement 3 ou 4 mcg d'activité par ml, lorsqu'ils se présentent sur le carrousel. On donne ci-dessous les activités relatives des composés examinés, comparativement à celles du témoin.
<EMI ID=143.1>
L'activité vis à vis de Mycoplasma est un autre aspect utilisable de l'activité antimicrobienne des composés A-28086. Les espèces Mycoplasma, également connues comme organismes provoquant la pleuropneumonie (PPLO), sont des organismes pathogènes vis à vis de l'homme et de différents animaux. Des agents actifs vis à vis des organismes PPLO sont plus particulièrement demandés pour l'industrie de la volaille. Les concentrations inhibitrices minimales
<EMI ID=144.1>
telles qu'elles sont déterminées in vitro par des études de dilution de bouillon, sont résumées dans le tableau VII ci-dessous.
TABLEAU VII
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Des solutions contenant aussi peu que 10 microgrammes d'antibiotique A-28086 par ml de solution sont utilisables pour désinfecter des surfaces pour protéger les animaux des différentes espèces de mycoplasma.
Les composés A-28086 sont également des composes anti-virus. Le facteur A de l'antibiotique A-28086 est actif vis à vis du poliovirus type III, du virus vaccinia, du virus de l'herpès et du virus Semliki Forest, comme on le démontre par des essais in vitro de suppression de plaques, semblable à celui
<EMI ID=146.1>
gastro-enteritis, du virus de la maladie de Newcastle, et du virus rhinotracheitis d'infection des bovins, comme on le démontre par des essais semblables de culture de tissus.
Par conséquent, dans un des aspects de l'invention, on peut administrer un composé A-28086 par voie orale, par voie locale ou parentérale à des mammifères pour détruire les virus. Des niveaux utiles de doses pour la prévention ou le traitement des maladies virales varient d'environ 1 à environ 5 mg/kg de poids corporel de mammifère, en fonction du virus et de l'utilisation prophylactique ou thérapeutique du médicament.
En plus, on peut également utiliser des solutions contenant un composé A-28086, de préférence conjointement avec un agent surfactif, pour décontaminer l'habitat in vitro sur.lequel sont présents des virus tels que des virus polio ou de l'herpes. Des solutions contenant d'environ 1 à environ 1500 mcg/ml d'un composé A-28086 sont efficaces pour détruire les virus.
La toxicité aiguë du facteur A de l'antibiotique A-28086, administré par
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7,5 mcg/kg.
Les composés A-28086 sont également des insecticides et des acaricides. Les composés A-28086 sont actifs vis à vis des insectes tels que l'épilachne
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<EMI ID=149.1>
des taux aussi faibles que 500 ppm. En plus, les composés A-28086 sont actifs vis à vis des larves de moustiques lorsqu'on les applique à des taux aussi faibles que 1 ppm.
L'activité anticoccidienne est une propriété importante des composés A-28086. Par exemple, des expériences d'alimentation montrent qu'un composé A-28086, lorsqu'il est présent dar.s l'alimentation de jeunes poulets à des teneurs aussi faibles que 0,003 améliore les gains de poids, et, à des teneurs aussi faibles que 0,005 %, évite la mortalité et diminue le nombre
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des essais avec le facteur A chez des poulets inoculés avec différentes espèces Eimeria sont représentés dans les tableaux VIII à X.
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Pour la prévention ou le traitement des coccidioses de la volaille, on administre aux oiseaux une quantité anticcocidienne non toxique d'un composé A-28086, de préférence par voie orale, sous la forme d'une dose quotidienne. On peut fournir le composé A-28086 de nombreuses façons, frais on le fournit plus facilement avec un support acceptable sur le plan physiologique, de
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un certain nombre de facteurs dans la détermination d'une concentration appropriée du composé A-28086, les taux d'administration seront en général dans l'intervalle de 0,003 à 0,04 % en poids de l'alimentation non traitée, et
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L'aptitude à améliorer l'efficacité d'utilisation de l'alimentation des animaux est une autre propriété importante des composés A-28086. Par exemple, les composés A-28086 améliorent l'efficacité.d'utilisation de l'alimentation chez des ruminants qui possèdent une fonction développée du rumen.
Comme on l'a discuté ci-dessus, on augmente l'efficacité d'utilisation
des glucides chez des ruminants par des traitements qui stimulent
la flore dan� le rumen des animaux pour donner des composés de propionate plutôt que des composés d'acétate ou de butyrate. On peut contrôler l'efficacité d'utilisation de l'alimentation en observant la production et la concentration des composés de propionate dans le rumen, en utilisant les procédés suivants :
On obtient du fluide de rumen à partir d'un jeune boeuf à l'aide d'une fistule installée par voie chirurgicale et s'ouvrant dans le rumen. On maintient le jeune boeuf avec une ration riche en grains. On fait égoutter un échantillon du fluide du rumen à travers quatre couche de gaze, et on recueille le filtrat. On remet en suspension le produit particulaire retenu sur la gaze dans suffisamment de tampon physiologique pour revenir au volume initial du fluide du rumen, et on égoutte à nouveau cette suspension. Le tampon utilisé
à la composition suivante :
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<EMI ID=159.1>
quatre Dallons par traitement. On utilise égalèrent deux enser.bles ce quatre flacons témoins chacun. On utilise un témoin au terps zéro et un témoin à
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<EMI ID=161.1>
dans les ballons témoins.
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<EMI ID=163.1>
L'efficacité de l'utilisation des glucides est en plus démontrée par des essais in vivo réalisés sur des animaux chez lesquels on a installé des fistules dans le rumen, ce qui permet de prélever des échantillons
du contenu du rumen.
On réalise l'essai décrit dans le tableau XII avec des jeunes boeufs arrivés à maturité et munis d'une fistule, pesant environ 450 kg chacun. On alimente deux jeunes boeufs avec une nourriture normale, et quatre jeunes boeufs dans chaque groupe de traitement avec une nourriture identique à laquelle on a ajouté le facteur A de A-28086. A chaque prélèvement (100 ml)
<EMI ID=164.1>
On laisse reposer les échantillons, et on analyse les liquides surnageants par des procédés de chromatographie gazeuse pour déterminer les concentrations en acide propionique.
Les résultats du tableau XII sont les augmentations moyennes en pour cent de la concentration en acide propionique du rumen, moyennes sur cinq analyses pendant une période de traitement de 14 jours. Les témoins présentent environ
20 % molaires d'acide propionique.
TABLEAU XII
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En plus, des essais in vivo démontrent que le facteur A de A-28086 augmentent l'efficacité d'utilisation de l'alimentation des moutons. Les résultats de ces essais, réalisés pendant une période de 56 jours, sont résumés dans le tableau XIII.
<EMI ID=166.1>
Les composés du facteur D de l'antibiotique A-28086 sont des agents antiviraux. Le facteur D de A-28086 est actif vis-à-vis du virus Maryland B, du
<EMI ID=167.1>
D de A-28086 est également actif vis à vis du virus gastro-enteritis transmissible, du virus de la maladie de Newcastle, du virus rhinotracheitis d'infection des bovins, comme on le démontre par des essais semblables de culture de tissus.
Le fait que les composés du facteur D de A-28086 présentent une activité
à la fois vis-à-vis des virus et vis-à-vis des bactéries anaérobies rend ces composés particulièrement intéressants pour le traitement ou la prévention de l'entérite chez les poulets, les porcs, les bêtes à cornes et les moutons. Les composés du facteur D de l'antibiotique A-28086 sont également utilisables pour le traitement de l'entérotoxémie chez les ruminants.
L'activité anticoccidienne est une propriété importante des composés
du facteur D de l'antibiotique A-28086 de la présente invention. Des expériences in vitro démontrant l'activité anticoccidienne du facteur D de l'antibiotique A-28086 vis à vis de Eimeria tenella. On utilise le procédé suivant (pour plus de détails, voir L. R. McDougald et R. B. Galloway dans Exper. Parasitology
34, 189-196 (1973)) .
On prépare des cultures de cellules hôtes par des techniques conventionnelles en utilisant des tubes de Leighton, des récipients de plastique ou des plaques, ou d'autres récipients de culture appropriés. Au bout de 2 à 3 jours de croissance dans un milieu de culture approprié (milieu essentiel minima de Eagle, hydrolysat de lactalbumine dans une solution saline de Earle ou dans une solution saline équilibrée de Hank, milieu 199, etc., il se forme habituellement une mono-couche appropriée et elle est prête pour l'infection et le traitement par le médicament. On utilise pour ces études des cultures primaires de cellules de rein de poulets.
On obtient des ovocystes viables Eimeria Tenella à partir des matières fécales de poulets infectés et on les purifie et on les stérilise avant l'utilisation. Les ovocystes sont sporulés par incubation à température ambiante tout en faisant barboter de l'air à travers la suspension ou en agitant modérément sur un agitateur rotatif ou à l'aide de tout autre moyen approprié. On peut utiliser du bichromate de potassium ou de l'acide sulfurique ou un autre composé chimique, pour éviter la croissance bactérienne ou la croissance des moisissures pendant la sporulation.
La réparation des sporozoïtes infectieux et des ovocystes est réalisée par une combinaison de rupture mécanique de la paroi de l'ovocyste, suivie par un <EMI ID=168.1>
à se libérer eux-mêmes des sporocystes.
On infecte les cultures de cellules par introduction de sporozoïtes aptes à vivre dans le récipient de culture. On peut introduire à ce moment, ou ultérieurement, des produits chimiques d'essai. On introduit le produit
<EMI ID=169.1>
10 % dans une solution saline physiologique. La fin de l'essai est l'inhibition des phases de développement asexuées, et on la détermine par examen microscopique des cultures fixées et colorées 96 heures après infection. On enregistre
les résultats comme étant actif (A), inactif (N) et cytotoxique (C) en fonction de la présence ou de l'absence des schizontes de deuxième génération et d'une toxicité apparente vis à vis de la mono-couche cellulaire.
L'activité anti-coccidienne du facteur D de l'antibiotique A-28086 démontrée par cet essai est résumée dans le tableau XIV.
TABLEAU XIV
<EMI ID=170.1>
* Résultats de deux essais
Une autre caractéristique utilisable des composés du facteur D de l'antibiotique A-28086 est leur aptitude à améliorer l'efficacité d'utilisation de l'alimentation chez des ruminants qui présentent une fonction développée du rumen. Le mécanisme d'utilisation de la fraction nutritive la plus importante
(glucides) des aliments de ruminants est bien connu. Des micro-organismes dans
<EMI ID=171.1>
puis transforment ces monoglucides en composés pyrivates. Les composés <EMI ID=172.1>
des acétates, des butyrates ou des propionates, qui sont collectivement connus comme étant des acides gras volatils (VFA). Pour une discussion plus
<EMI ID=173.1>
Ruminant", Phillipson et coll., Eds. Orien Press, Newcastle upon Tyne, Grande-Bretagne, 1970, pp. 408-410.
L'efficacité relative de l'utilisation des VFA est discutée par McCullough dans Feedstuffs, 19 juin 1971, page 19 ; Eskeland et coll., dans J. An. Sci.
33, 282 (1971) ; et par Church et coll., dans "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Vol. 2, 1971, pp. 622 et 625. Bien que les acétates et butyrates soient utilisés, les propionates sont utilisés avec une plus grande efficacité. En plus, lorsqu'il n'y a pas assez de propionate disponible, les animaux peuvent développer une cétose. Par conséquent, un composé bénéfique stimule la production chez les animaux d'une proportion plus importante de propionates à partir des glucides, ce qui permet d'améliorer l'efficacité d'utilisation des glucides et également de réduire l'apparition de la cétose.
On peut déterminer l'activité d'un tel composé bénéfique, en observant son effet dans la production et la concentration des composés de propionate dans le rumen par le même procédé que celui utilisé comme facteur A ci-dessus.
On compare statistiquement des résultats d'essai avec des résultats témoins. Le Tableau XV donne le rapport des concentrations d'acides aras volatils
dans des flacons traités par le facteur D de A-28086 par rapport aux concentrations dans des flacons témoins.
<EMI ID=174.1>
Les composés sont typiquement efficaces pour améliorer la teneur en propionates et, par conséquent, l'efficacité d'utilisation de l'alimentation lorsqu'on les administre à des ruminants par voie orale, à des taux d'environ 0,05 mg/kg/jour, à environ 5 mg/kg/jour. On obtient les résultats les meilleurs
<EMI ID=175.1>
tation des animaux ; cependant, on peut l'administrer de toute autre manière, par exemple, sous la forme de comprimés, de breuvages, de bols ou de capsules. On peut réaliser la formulation de ces différentes formes de dosage selon des procédés bien connus dans la technique pharmaceutique vétérinaire. Chaque unité de dosage individuelle doit contenir une quantité de composé directement en relation avec la dose quotidienne appropriée pour l'animal à traiter.
On peut utiliser les antibiotiques.de A-28086, dans des compositions d'alimentation adaptées pour engraisser les bêtes à cornes, comprenant l'alimentation du bétail et de 1 à 30 g par tonne de composé.
Comme les techniciens le reconnaîtront, les alimentations pour bétail sont différentes des autres alimentations telles que pour les alimentations pour volailles. Les rations pour bétail contiennent des fourrages tels que,
<EMI ID=176.1>
En plus, des alimentations pour bétail contiennent un pourcentage élevé, souvent
<EMI ID=177.1>
protéinique habituelle est l'urée.
Comme on l'a décrit ci-dessus, les composés A-28086 sont des agents antivirus et sont également des composés actifs contre les bactéries anaérobies, plus particulièrement Clostridium perfringens. Par conséquent, les composés A-28086 sont bénéfiques dans le traitement ou la prévention de l'entérite chez le poulet, le porc, le bétail et le mouton. Les composés A-28086 sont
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On donne ci-après les exemples suivants :
Exemple 1
A. Fermentation par la technique du ballon agité de A-28086 en utilisant
S. aureofaciens NRRL 5758
<EMI ID=179.1>
maintient sur de la gélose inclinée, présentant la composition suivante :
<EMI ID=180.1>
<EMI ID=181.1>
recouvre la culture inclinée arrivée à maturité avec du sérum de boeuf, et on la gratte avec une anse stérile, pour détacher les spores. On lyophilise
<EMI ID=182.1>
des spores et des fragments de mycelium.
<EMI ID=183.1>
végétatif présentant la composition suivante :
<EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
<EMI ID=186.1>
d'un arc de diamètre 5,1 cm, à 250 tours par minute.
<EMI ID=187.1>
Afin d'obtenir un plus grand volume d'inoculum. on utilise 10 ml du milieu végétatif incubé décrit ci-dessus pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance
<EMI ID=188.1>
végétatif. On fait incuber ce milieu de deuxième étape, dans un ballon d'une
<EMI ID=189.1>
arc de 5,1 cm de diamètre, à 250 tours par minute.
On utilise ce milieu végétatif de deuxième étape (1 litre) pour inoculer
100 litres d'un milieu de production stérile ayant la composition suivante :
<EMI ID=190.1>
<EMI ID=191.1>
pendant 30 minutes sous une pression de 1,05 à 1,40 kg/cm . On met à fermenter dans un récipient de fermentation d'une capacité de 165 litres le milieu de
<EMI ID=192.1>
de ferrentation par de l'air stérile sous un débit de 0,4 volume d'air par volume
<EMI ID=193.1>
conventionnels à 250 tours par minute.
<EMI ID=194.1>
On prépare les antibiotiques A-28086 selon le procédé de l'exemple 1, mais en utilisant un milieu de production dans un ballon présentant la composition suivante :
<EMI ID=195.1>
Exempte
<EMI ID=196.1>
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1> <EMI ID=199.1>
obtenue à partir du filtrat pèse 20,6 g.
Exemple 4
Isolation des facteurs A et B individuels de l'antibiotique A-28086
<EMI ID=200.1>
préparé comme décrit dans l'exemple 3) dans environ 80 ml de benzène. On soumet cette solution benzénique à une chromatographie sur colonne contenant du gel de silice (9 x 130 cm, 8 1, gel de silice Matheson qualité 62). On élue la colonne
à l'aide de mélanges variables benzène-acétate d'éthyle. On suit la progression d'élution à l'aide d'une chromatographie de couche mince. En utilisant un
système de solvant benzène-acétate d'éthyle (90:10) on élue d'abord le facteur B et
<EMI ID=201.1>
dans un mélange acétone-eau, p.f. 150-153[deg.]C.
En poursuivant l'élution avec des mélanges benzène-acétate d'éthyle mais en augmentant progressivement le rapport de l'acétate d'éthyle présent, on élue
le facteur A ; on combine les différentes fractions contenant le facteur A et on les concentre sous vide jusqu'à obtention d'un résidu. On dissout ce résidu
dans l'acétone (environ 150 ml) ; on ajoute environ 150 ml d'eau à la solution acétonique. On ajuste le pH de la solution résultante à pH 3 par addition d'acide
<EMI ID=202.1>
pendant lequel il se forme un précipité. On sépare ce précipité par filtration et le recristallise dans l'acétone (environ 150 ml) par addition d'eau (environ
60 ml). On sèche le produit pendant une nuit sous vide pour obtenir le facteur A
(environ 6,6 g). Après évaporation partielle de l'acétone du filtrat, on obtient une deuxième récolte de facteur A (environ 1,2 g).
<EMI ID=203.1>
Dérivé ester d'acétyle du facteur A de l'antibiotique A-28086
<EMI ID=204.1>
pyridine. On ajoute à cette solution 50 ml d'anhydride acétique. On mélange intimement la solution résultante et on la laisse au repos pendant une nuit à température ambiante.
<EMI ID=205.1>
ce mélange pendant 4 heures à température ambiante. Il précipite un solide blanc ; on sépare ce solide par filtration, on le lave à l'eau et on le sèche
<EMI ID=206.1>
la solution acétonique à siccité sous vide (on répète cette opération trois
<EMI ID=207.1>
eau (50 ml), pour obtenir 6,14 g du dérivé ester d'acétyle du facteur A de
<EMI ID=208.1>
Exemples 6 à 9 ...........
On prépare le dérivé ester de propionyle du facteur A de l'antibiotique A-28086 par réaction du facteur A avec l'anhydride propionique en présence de pyridine selon le procédé de l'exemple 5, point de fusion 96-93[deg.]C.
On prépare le dérivé ester de n-butyryle du facteur A de l'antibiotique A-280S6, par réaction du facteur A avec ae l'anhydride n-butyrique en présence de pyridine selon le procédé de l'exemple 5, point de fusion 79-81[deg.]C.
On prépare le dérivé ester de n-caproyle du facteur A de l'antibiotique A-28036 par réaction du facteur A avec de l'anhydride caproique en présence
<EMI ID=209.1>
On prépare le dérivé ester de n-valéryle du facteur A de l'antibiotique A-28086, par réaction du facteur A avec de l'anhydride valérique en présence de pyridine selon le procédé de l'exemple 5, point de fusion 173-175[deg.]C.
Exemple 10
Préparation du sel de sodium du facteur A de l'antibiotique A-23086
<EMI ID=210.1>
On ajoute à cette solution 50 ml d'eau, et on ajoute de l'hydroxyde de sodium
5 N pour porter le pH de cette solution à 10,5-11. On agite la solution résultante pendant une heure puis on l'extrait à l'acétate d'éthyle. On évapore
<EMI ID=211.1>
partir d'une solution acétone-eau pour obtenir 378 mg du sel de sodium du
<EMI ID=212.1>
Exemples 11 à 15
On prépare le sel de baryum du facteur A de l'antibiotique A-2Su86 à partir de 5CO mg du facteur A de l'antibiotique A-28036 et en saturant d'hydroxyde de
<EMI ID=213.1>
<EMI ID=214.1>
<EMI ID=215.1>
<EMI ID=216.1>
<EMI ID=217.1>
de potassium du facteur A de l'antibiotique A-28036, point de fusion 165-167'C.
<EMI ID=218.1>
procédé de l'exemple 10.
Exemple 16
<EMI ID=219.1>
maintient sur une plaque inclinée de gélose présentant là composition suivante :
<EMI ID=220.1>
<EMI ID=221.1>
d'un milieu végétatif ayant la composition suivante :
<EMI ID=222.1>
<EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1>
<EMI ID=225.1>
<EMI ID=226.1>
Exemple 17
<EMI ID=227.1>
On utilise également le procédé initial décrit dans l'exemple 16 pour la
<EMI ID=228.1>
<EMI ID=229.1>
végétatif incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de deuxième étape
<EMI ID=230.1>
minute sous un arc de 5,1 cm.
<EMI ID=231.1>
inoculer 100 litres d'un milieu de fermentation stérile présentant la composition suivante :
<EMI ID=232.1>
<EMI ID=233.1>
<EMI ID=234.1>
tionnels à 300 tours par minute.
Exemple 18
<EMI ID=235.1>
utilisant un milieu de production de flacon agité/cuve présentant la composition suivante :
<EMI ID=236.1>
<EMI ID=237.1>
décrit dans l'exemple 10.
Exemple 19
<EMI ID=238.1>
<EMI ID=239.1>
On ajuste 60 litres de bouillon de fermentation total obtenu par le procédé
<EMI ID=240.1>
sous agitation. Après séparation de cet extrait, on extrait à nouveau le gâtesde mycélium avec à nouveau 30 litres de méthanol . On réunit les deux extraits
<EMI ID=241.1>
<EMI ID=242.1>
laisse reposer pendant 16 heures la solution résultante pour qu'il se produise
<EMI ID=243.1>
sèche sous vide pour obtenir 74 g d'un produit cristallin brut contenant les facteurs A et D de l'antibiotique A-28086 et d'autres impuretés cristallines.
<EMI ID=244.1>
62). On élue la colonne successivement avec 40 litres de chacun des solvants suivants :
<EMI ID=245.1>
On recueille des fractions de 1 litre. Gn examine chaque fraction par essai
<EMI ID=246.1>
successivement par :
<EMI ID=247.1>
<EMI ID=248.1>
<EMI ID=249.1>
<EMI ID=250.1>
<EMI ID=251.1>
en utilisant un milieu de production en ballon présentant la composition suivante :
<EMI ID=252.1>
* Staley Dextrin N[deg.] 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.
** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.
Exemple 23
On prépare les antibiotiques de A-28086 selon le procédé de l'e;.emple 21 mais en utilisant un milieu végétatif intermédiaire de troisième étape ayant la composition suivante :
<EMI ID=253.1>
<EMI ID=254.1>
<EMI ID=255.1>
On prépare un aliment équilibré, énergétique, adapte pour l'alimentation de la volaille pour une croissance rapide selon la recette suivante :
<EMI ID=256.1>
<EMI ID=257.1>
(représentant les vitamines A, D, E,
<EMI ID=258.1>
l'acide pantothénique, la riboflavine
la biotine, avec un diluant qui est le
<EMI ID=259.1>
<EMI ID=260.1>
aliments. On protège la volaille nourrie avec cet aliment, avec de l'eau
ad libitum, vis-à-vis de l'exposition à la coccidiose ; les gains de poids sont comparables à ceux de la volaille sans coccidiose alimentée par une nourriture semblable ne contenant pas de médicament.
Exemple 25
Aliment cour bétail amélioré par A-28086
On prépare un aliment équilibré riche en grains pour bétail comme suit :
<EMI ID=261.1>
<EMI ID=262.1> <EMI ID=263.1>
ajoutée.
.. Graines séchées de distillation du mais avec des produits solubles <EMI ID=264.1>
tion fournit environ 300 mg du facteur A de A-2S086 par animât par jour.
Exemple 26
<EMI ID=265.1>
mélange intimement la solution résultante puis on l'abandonne pendant une nuit à température ambiante.
On ajoute ensuite un excès d'eau, on mélange intimement et on abandonne au repos le mélange pendant quelques heures à température ambiante. On sépare par filtration le précipité qui se forme, on le lave à l'eau et on le sèche.
On dissout le solide résultant dans l'acétone et on l'évaporé à siccité sous vide pour obtenir le dérivé ester d'acétyle du facteur D de l'antibiotique A-28086.
Exemples 27 à 30
On prépare le dérivé d'ester de propionyle du facteur D de l'antibiotique A-23086 par réaction du facteur D de l'antibiotique A-28036 avec l'anhydride
<EMI ID=266.1>
On prépare le dérivé ester de n-butyryle du facteur D de 1 'antibiotique A-28036 par réaction du facteur D de l'antibiotique A-2SG36 avec l'anhydride
<EMI ID=267.1>
<EMI ID=268.1>
<EMI ID=269.1>
<EMI ID=270.1>
Exemples 32 à 34
<EMI ID=271.1>
du facteur D de l'antibiotique A-280S6 et d'hydroxyde de césiun 1 N en utilisant le procédé de l'exemple 31.
Exemple 35
<EMI ID=272.1>
empêcher la coccidiose.
On prépare un aliment équilibré, à pouvoir énergétique élevé adapte à la nourriture de la volaille pour un gain de peias rapide, selon la recette suivante :
<EMI ID=273.1>
<EMI ID=274.1> <EMI ID=275.1>
sont comparables a ceux obtenus avec de la volaille non atteinte de coccidiose recevant une alimentation semblable sans médicament.
Exemple 36
<EMI ID=276.1>
<EMI ID=277.1>
la manière suivante :
<EMI ID=278.1>
<EMI ID=279.1>
REVENDICATIONS
<EMI ID=280.1>
un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides d'azote
<EMI ID=281.1>
jusqu'à ce qu'une quantité substantielle d'activité antibiotique soit produite par ledit micro-organisme dans ledit.milieu de culture.
2. Complexe antibiotique A-280S6 contenant des facteurs A, B et D tels que décrits présentement.