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Publication number: BE552940A
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Description


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  La jrasante concerne un procédé de faoriotion. d'une hormone e-b plus particulièrsu.erit un procédé de x'aorioatlon d.' a:1ranocorticotrophine à partir :..IU;10 sUQstance tirée du. sai-j. de -4-iailliriif ères. 



  L ' AormOn.3 alrériocortiootrophiçue ( adrénocorticotroest 58';J: ide fJ:;:.r J.8. laidlo pituitaire des ...aurifères dans le courra g obtuuin et transportée lu âtu-,--'riale pour stipuler la production, d'hormoney adrénocorticales par le uorcôy.adréaal. AU. 000.1':;> dus d¯ruju res années, i'adrénocortioo t.cOPÚilL8 a été extraite du tissu pituitaire, par eeuiple de audos pituituires de porc, boauf et mouton, et, aurôs 

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 purification, elle est utilisée dans le traitement de certaines maladies des animaux et des êtres humains. Il :a été rapporté que le sang de   mammifère   comporte. très peu.   s'il   en contient, d'activité   d'adrénocorticotrophine.   G.

   Sayers dans le   "Journal   
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 of Clinical Endocrinology and vetabolism 15, 754-59 (1955)" a démontré que le sang d'êtres humains contient moins de z0,5 milli-unité d'adrénocorticotropnine par 100 ml sous des conditions optima. En conséquence, on a considéré que le sang n'est pas une source convenable pour la fabrication d'adrénocortico- trophine pour usages pharmaceutiques. 



   La présente invention crée un procédé de fabrication   d'adrénocortiootrophine   à partir de sang de mammifères et en fait, de diverses fractions du sang; ce procédé engendre l'activité   d'adrénocorticotrophine   dans le sang; il comporte un processus pour détecter cette activité dans le sang. D'autres résultats et avantages du procédé de l'invention ressortent d'ailleurs de la description qui suit. 



    @  
Le procédé de l'invention pour fabriquer de   l'adréno'-   
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 corticotrophine à partir d'une substance de se. '@de iiiaiunifères consiste à traiter cette substance avec un agent activateur d'adrénocorticotrophine. Bien que le sang ne présente sensible- 
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 ment pas cette activité dta"':'r0nocorticotropÜine, on a maintenant constaté que le traitement de sang avec cet agent activateur, tel que pyridoxine, produit une activité d'adrénocorticotrophine dans le sang entre 0,5 et 2 unités par fil. Aux fins de l'inven- 
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 tion, on entend par "des substances de sang de mammifères" des substances de sang contenant de l'adrénocorticotrophine, telles que le sang complet, le plasma , le sérum et le sang défibriné. 



   Dans la mise en oeuvre de l'invention, de la pyridoxine 
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 peut être incubée avec une substance de sang de ftta.ti-.tifGres à une température d'au moins 15 C pendant un laps de temps suffisant pour y obtenir la production complète de l'activité   d'adrénocor-   ticotrophine. Le laps de temps nécessaire pour obtenir l'acti- 
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 vatïon aaxiJ"um de 1 tadr5nocorticotrophine du sang varie en raison- inverse avec la température d'incubation. C'est-à-dire 

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 que lorsqu'on, évève   la     Température     d'incubation.,   il faut moins 
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 de temps pour effectuer l'activation ,18.ÀL,UIiI <le' l' adranocorticotrophine.

   On a, [)....1' exemple, constate que 1 'activation coihpiëte J.'adr-5n.ocorticotrophin8 dans le 8(1[1'; peut être obtenue en 6 1/2 heures environ à une   température   de   100 C,   tandis que trois mois peuvent être nécessaires pour effectuer l'activation complète à une température de 25 C et deux à trois semaines à une   d'environ   57 C.

   L'adaptation de ce procédé 
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 pour la fabrication industrielle d'adrénocorticoWopiine peut être obtenue d'une manière désirable à une   température     d'incuba-   tion entre 30 et 150 C, bien que les meilleurs résultats puissent être obtenus   à   une entre 75 et 120 C, et une activa- 
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 tion d'adrénocorticqtrophine particulièrement désirable puisse être produite à une   température   entra environ 90 et   100 C.   
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  La ax.Jue de pH optimum pour l'activation de l'adrénocorticotropiiine du sang avec de la pyridoxine a été trouvée être a un pH de   3,5   5,5, bien qu'une certaine activation puisse être effectuée à un   pH     acide   ou basique par rapport à 
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 cette arr,me. Une meilleure activation diadréiiocorticotrophine avec la pyridoxine peut âtre effectuée à un pH entre 4,0 et 5,0, puis des résultats particuliireinent désirables sont obtenus   à   unpH d'environ 4,7 à 4,8.

   Le   rlae du   pH dals ce procédé peut être obtenu avec tout acide, alcali ou solution,   tampon   
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 convenable, par exemple de l'acide chlorhydrique, de l'hydroxyde desodium et une solution tampon d'acétate de sodium dans l'acide   acétique-  
Dien que   l'on   puisse utiliser toute substance do sang 
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 d3 ...<::...""L:"::ces 001111.,8 ,H3tiÈore riG J.;;p:lrt dans ce procédé, on a trouvé que de meilleurs résultats peuvent être obtenus avec du ;,.1 as..,a ou du :=; 5ru! et des résultats particulier ement désirables sont (j;:.t'..:1LUS aV0C 'la plasma ou au sérum de boeuf.

   Le mécanisme de 1 aciV,..tion dans ce n'est pas L;:C,.;,J bien compris, mais on croit que .' 'al' .:llocor tiuo t:cop.lile est rjé¯;rjtJ;3 par la glande pituitaire al' et ut inactif ou que i 'Li\1l'J.nocorticatro.Qhin0 active introduite dans le courant sanguin 

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 est inactivée par certains ., cm is.Le àu sang.

   C'est probaoleuia'tb un .Scanis..,e aS30cié à la glande adrénale capable de transformer la pro-   adrénocorticotrophine   en adrénocorticotrophine   pour .   stipuler la production d'hormones adrénocorticales par le cortex   adrénal.   Cette adrénocorticotrophine inactive ou précurseur contenue dans le sang peut être appelée pro-adrénocorticotrophine Ainsi, la matière de départ pour ce procédé peut être .toute 
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 substance', de sang de maumifères pro-adrénocorticotrophine. 



  La succession des opérations dans ce procédé peut comprendre la régénération, de l'activité d'adrénocorticotrophine dans tout le sang, plasma, sérum, etc, et ensuite la récupération d'adrénocorticotrophine sous la forme active. D'autre part, 1 tadrénocorticotroph,ine peut être extraite de la source sanguine pour obtenir un concentré de   pro-adrénocorticotrophine   et ce concentré peut être traité à la pyridoxine pour transformer la 
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 pro-adrénocorticotrophine. en adr$nùcorticotrp9hine.

   La récupération ou concentration, soit de la pro-ar8nocorticotrophine soit de ltaârénocorticotrophiixe à partir de la source sanguine, peut être obtenue par fractionnement chimique avec des sels neutres, par exentple du sulfate   d'ammonium,   du chlorure de sodium ou du sulfate de sodium, des ions métalliques lourds, par exemple du zinc et de l'aluminium, ou un solvant aliphatique oxygéné, tel qu'un, alcool ou une cétone, par exemple de   l'éthanol,   du méthanol et de l'acétone. Dans ce procédé de fractionnement chimique, les protéines du sang et autres contaminants 
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 â'adr3nocorLicotrophïne peuvent être précipités et le précipité résultant peut être séparé de la solution d'adrénocorticotrophine. 



  De même, la pro-adrénocorticotrophine ou l'adrénocorticotrophine peut être séparée de la source de sang par adsorption sur la 
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 matière cellulosique, coni or mènent au procédé du brevet américain NO 2.669.536, déposé le 15 Moût 1950, dans lequel l' adranocorticotrophine est séparée de la solution par adsorption d'adrénocorticotrophine sur de 1loxyce.Llulose à un pH d'environ °;5, l'adsorbat résultant est lavé pour retirer la ma bière inerte et 1 'adrénocorticotrophine est ensuite enlevée par élubion 

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 de 1. 'adGorul-,j lave avec de l'acide chlorhydrique à un pipi entre 0,1 et 1,5.

   Un autre procédé de fractionnement cuiudque de la substance sanguine, pjur obtenir une concert rabion'd'adrenocorti- cotrophine activée par la pyridoxine, est le procédé   à   choc thermique dont le mode opératoire préféré consiste à combiner avec le sérum du   sang, du   caprylate de sodium en une concentration entre   0,11   et 0,13 M,à régler la solution résultante à un pH 
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 entre 5,0 et 5,2, à chauffer cette solution à une taupérature entre 65 et 71 C pendant au moins 20 minutes pour coaguler 
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 sélectivement une partie des p:C""f14ines qui s'y trouvent et à séparer les protéines coagulées du liquide surnageant . 



  On a trouvé que l'adrénocorticotrophine, produite à partir d'une substance de sang de mammifères par ce procédé,      tend à être instable,   c'estr-à-die   peut perdre la puissance, et 
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 que cette adrénocorticotrophine peut être staoilh.ae en combinaison avec un agent réducteur , organique contenant au moins un groupe sulxhydryle, tel que cyétéine, acide thioglycolique et beta mercè1:;?toâthaLlol. Cet aôent Téducteur peut être compris dans la composition d1 adrénocortiicotrophine à une concentration de 0,05 à   0,2   (poids/ volume) . La stabilisation de l'adrénocorticotrophine du sang par cet agent réducteur peut être accrue à un pH d'environ 6,5 à 7,0.

   Cette composition d'adrénocorticotrophine peut aussi comprendre de la gélatine en une concentration d'environ 8 à 40 % pour produire un nouvel accroissement de la puissance   d'adrénocorticotrophine   lors de l'injection sous-cutanée ou   intramusculaire,   suivant la préparation du brevet américain N  2,569.537,   dîposé le   27   Décembre     1952.   
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  Les iardie:mcs cotupr:is clans \Jette composition d'adrénocorticotrophine doivent être de qualité pharmaceutique, c'est-àdire appropriés à l'administration parentérale à des êtres hu- mains lorsqu'elle est destinée à l'usage   huamin   ou appropriée à   1 'administration   parentérale pour des animaux   lorsqu'elle   est destinée à êbre utilisée comme produit vétérinaire. 



   .L'activité   d'adrénocorticotrophine   de produits obtenus par le procédé de cette invention peut être déterminée par le 

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 procédé d'essai de corticotrophine à gélatine sous-cutané décritdans le codex africain U.S. Pharmacopoeia   XV.   



   Cette invention peut, en outre, être illustrée par l'exemple qui suit : 
Du sérum de ooeuf en une quantité de 25 ml fut mélangé avec 0,62 g de chlorhydrure de pyridoxine. Une partie du mélange résultant 2,5 ml fut combinée avec 2,5 ml d'une solution de gélatine aqueuse à 32% contenant 1% de phénol. Ce produit fut considéré comme contrôle.      



   Le reste du mélange de sérum de boeuf, 22,5 ml, fut introduit dans un récipient de   \erre.   Ce récipient fut fermé hermétiquement et ensuite chauffé au bain-Marie à une tempéra- ture de 85 à 90 C. Après 30 minutes, 15 ml d'eau distillée, sans pyrogène furent introduits dans le   récipient..   Des parties      du mélange de sérum de boeuf furent retirées du récipient à des intervalles de 2, ° et 6 heures. Ces parties furent diluées chacune dans un rapport 1/1 avec la solution de gélatine aqueuse à   32 %   contenant 1% de phénol. 



   Les divers produits furent désignés comme suit contrôle A, 2 heures B, 4 heures C et 6 heures D. On fit avec chacun de ces produits une injection sous-cutanée à 8 rats en une quantité de 0,5 ml par rat. L'activité   d'adrénocorticotro...   phine des produits fut déterminée par le procédé d'essai de cortie   ootrophine   à la gélatine sous-cutané . Les résultats sont exposés au taoleau /suivant, dans lequel la déplétion à l'acide ascorbique adrénal est exprimé en termes de microgrammes d'acide ascorbique par milligramme de poids d'adrénal; 

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   Préparation.

   Activité   Réaction courante AAA 3,87 3,12 2,58 (moyenne   3,19)  
A   4,36  
C 3,27 Réaction, courante AAA 4,27 3,92 3,17 (moyenne   3,79)  
B 2,15
D 2,75
Les données de réaction courante indiquées au tableau ci-dessus correspondraient à des unités équivalentes du codex américain par 0,5   (Il   respectivement comme suit :   0,0236,   0,0590 et 0,1475.

   Le produit de contrôle   (si)   ne montra pas d'activité d'aurénocorticotrophine- La valeur d'essai pour le produit C   indiqua   0,39-0,4 unité équivalente du codex américain par ml de sérum de boeuf, tandis que la valeur d'essai pour le produitB indiqua une puissance d'adrénocoroticotrophine de deux unités équivalentes du codex   américain   par ml de sérum de boeuf et la valeur d'essai pour le produit D indiqua une puissance d'auréno- corticotrophine d'environ 1,5 unité équivalente du codex améri- cain par    .?¯ de   sérum de boeuf. 



     3ien que l'on   ait décrit diverses féalisationsen détail pour illustrer   l'inventa. on    il   est oien   évident que diverses modifications peuvent y être apportées et que des variantes peuvent être réalisées   sais   sortir de son   ca....re.

Claims

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RV DI;::;.ELNi3 1 - Procédé de fabrication d'adrénocorticotropnine, caractérisé en ce qu'on traite une substance de sang de EMI8.2 mammifères avec un agent activateur dadrénocor-ticotraphine. 2 - Procédé de fabrication d'adrénocorticotrophine, EMI8.3 caractérisé en ce qu'on traite une substance de sang de I1la.Juifères contenant de la pro-adrénocorticotrophine avec un agent activateur d'adrénocorticotrophine.

3 - Procédé, suivant la revendication 24 caractérisé en ce que la substance de sang est du plasma.

4 - Procédé, suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la substance de sang est du sérum.

5 - Procédé, suivant l revendication 2, caractérisé en ce que la substance de sang est une substance sanguine de boeuf EMI8.4 contenant de la p:.o-adrénocorticotrophine.

6 - Procédé de faorication d'adrànocorticotrophine, caractérisé en ce qu'on traite une substance de sang de matumifèree avec de la pyridoxine.

7-Procédé de fabrication d'adrénocorticotrophine, caractérisé en ce qu'on mélange de la pyridoxine avec une EMI8.5 substance de sang de l1ta.,úLli.rères et on sa iraient le mélange résul- tant une température l'au . oins 15 C pendant au moins 30 minutes.

EMI8.6 3 - Procédé de fabrication d'adrénocorticotrophine, caractérisé en ce qu'on mélange de la pyridoxine avec une substance de sari,5 de boeuf, et on maintient le mélange résultant à une température entre 30 et 150 C pendant au moins 30 admîtes. EMI8.7 9 - Procédé de fabrication d'adrénooortiootrophine, caractérisé en ce qu'on .mélange de la pyridoxine avec une suostance de sang de boeuf et on cuauffe le mélange résultant à une température entre 75 et 120 C pendant au moins 30 minutes.

EMI8.8 10 - Procédé de fabrication aladrénocorticotrophine, caractérisé en ce qu'on mélange de la pyridoxine avec une @ substanee de sang de boeuf, on règle le mélange résultant à un <Desc/Clms Page number 9> EMI9.1 ,1 e ',5 5)5 et, eu r.-:.uz.n:, i v .a.l¯ .Ltzk.; uti- tuik, u e 8.1(,;:'j ,'4 eb 1JC''''U tadt.¯-11. une 7..l.'lü:.l.t; d'au moins 30 minutes.

., 1 - i-i'ojJlâ de x-.oi1 ..option Ca.tuût'..'.âIOCOrticoiro;ohine, 'J..1:c'-'.-;.:t .;l'i:O;3 eu co qu'on La..:lttze de lu pyridositie avec une substance de 0..111<...> de ooju-E, ou. l'sle le mélange résultant à un pi entre 4,0 et 5,0 et on cnuufïe ce mélange à une ceuperature en'ere 73 ec 12J .,; pendant au moins 30 ûliL1utes.

12 - Procède, suivant la revendication. 11 caractérisé ci!, ce (-ue la substance le 3Wl. de boeuf est du plasma de boeuf 13 - Procède de xubrication d'adrenocorticotrophine, Ci.;1';.;trt0;j en ce eu 'on n larl,;e de la pyridoxine avec une suoatanoe de S'U0 de b08Ui, on r ¯le le pli du H;léulge résultant entre environ 457 et. 4S- ef; on Ciiuuffe ce mélange à une t0...:)3l',o.Glu:a d'environ SO 0. 1,J , ., L pendant environ 4- heures.

14 - .l:'L'Ù03Ù.j, suivant la revendication 13, caractérisé en ce cue la substance de 8":'116 de boeuf est du N,;rwtl de boeuf.