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La présente invention concerne la fabrication de l'hormone adrénocorticotrophique et plus particulièrement un procédé pour accroître la puissance sous-cutanée de l'adrénocorticotrophine.
Le brevet américain No. 2.669.536, déposé le 15 Août 1950 décrit un procédé dans lequel une solution aqueuse d'adrénocorticotrophine peut être amenée en contact avec une matière cellulosique, telle qu'oxycellulose, à un pH d'environ 4,5, pour adsorber l'adrénocorticotrophine sur cette ratière et dans lequel l'adrénocorticotrophine adsorbée peut être séparée par
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élution de la matière cellulosique avec une solution aqueuse à un pH d'environ 1,0 à 1,5.
Le traitement d.'adrénocorticotro- phine porcine suivant ce brevet donne un produit qui montre, lors de l'administration sous-cutanée ou intramusculaire, une activité d'adrénocorticotrophine bien supérieure à celle que l'on pourrait attendre sur la base d'une pureté accrue, tandis que l'activité d'adrénocorticotrophine montrée par ce produit, lors de l'administration intraveineuse, est sensiblement de la valeur prévue sur la base d'une teneur réduite en solides.
Ainsi, on peut dire que le procédé de ce brevet produit un accroissement de la puissance manifestée par l'adrénocorticotrophine porcine lors de l'administration sous-cutanée. Cependant, un accroissement de la puissance d'adrénocorticotrophine bovine et ovine de cette grandeur n'est pas obtenu par le procédé du brevet précité, bien que l'on réalise un accroissement analogue quant à sa pureté.
On a aussi décrit un procédé dans lequel l'adrénocorticotrophine peut être incubée à un pH entre 4,5 et 8,0 pour obtenir un accroissement de la puissance d'adrénocorticotrophine manifestée lors de l'administration sous-cutanée. On a trouvé que par ce procédé l'accroissement de la puissance sous-cutanée est produit non seulement avec de l'adrénocorticotrophine porcine, mais aussi avec de l'adrénocorticotrophine bovine et ovine. Suivant un aspect de ce dernier procédé, un mélange aqueux d'adrénocorticotrophine bovine peut être incubé à un pH entre 5,5 et 7,0 et à une température entre 50 et 150 C pour accroître la puissance sous-cutanée de cette adrénocorticotrophine de l'ordre de 150 à 250 %.
L'invention apporte des perfectionnements à ce procédé pour accroître la puissance de préparations d'adrénocorticotrophine, en particulier, celle manifestée lors de l'administration sous-cutanée.
D'autres résultats et avantages ressortent d'ailleurs de la description détaillée qui suit.
L'invention crée un procédé dans lequel l'adrénocorti-
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cotrophine peut être traitée avec de la pyridoxine pour accroître sa puissance manifestée lors de l'administration sous-. cutanéeoDans ce procédé, l'adrénocorticotrophine peut être incubée avec de la pyridoxine pour produire un accroissement de puissance sous-cutanée d'environ 400 % et le degré d'accroisse- ment peut s'élever jusqu'à 900 %, L'incubation d'un mélange aqueux d'adrénocorticotrophine traité à la pyridoxine produit un accroissement maximum de la puissance sous-cutanée en un laps de temps diminuant dans la mesure où la température d'incubation est élevée.
Par exemple, cet accroissement maximum peut être produit à la température ambiante en plusieurs mois, tandis qu'un accroissement similaire peut être obtenu en un nombre d'heures relativement faible, à une température d'environ 100 C.
Cependant, il est évident que cette température d'incubation doit être inférieure à celle à laquelle l'activité d'adrénocorti- cotrophine serait détruite. De même, on a trouvé que lorsque la pureté de l'adrénocorticotrophine est augmentée, la durée nécessaire pour le renforcement maximum de sa puissance sous- cutanée est diminuée.
Par exemple, un extrait à l'acétone à 70% acide déshydraté de tissu pituitaire peut nécessiter entre 6 et 8 heures à une température de 100 C pour obtenir l'accroissement maximum de la puissance d'adrénocorticotrophine manifestée lors 'de l'administration sous-cutanée, tandis que l'adrénocorticotro- phine préparée par le procédé du brevet américain précité peut' demander d'environ 1 à 6 heures d'incubation à la même température pour obtenir un accroissement maximum analogue..
L'inclusion de pyridoxine dans un mélange aqueux d'adrénocorticotrophine pendant l'incubation produit un accroissement de sa puissance sous-cutanée bien supérieur à celui pouvant être obtenu en l'absence de pyridoxine et le renforcement maximum de cette puissance peut être obtenu en un . laps de temps beaucoup plus court. C'est-à-dire qu'à une tempéra- @ ture d'incubation quelconque et avec tout degré de pureté de l'adrénocorticotrophine, on peut produire un accroissement, notable de la puissance sous-cutanée de l'adrénocorticotrophine
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avec de la pyridoxine en une période d'incubation beaucoup plus courte qu'en l'absence de pyridoxine..
Par exemple, l'adrénocorticotrophine bovine préparée par le procédé du brevet américain peut être traitée avec de la pyridoxine à'une température d'environ 100 C pour obtenir un accroissement environ maximum de sa puissance sous-cutanée en 4 à 6 heuresß .tandis que de l'adrénocorticotrophine bovine, préparée de façon analogue, incubée à la même température, en l'absence de pyridoxine, demande environ 8 à 12 heures pour produire un accroissement équivalent de cette puissance sous-cutanée.
Bien que les avantages de l'invention puissent être obtenus avec tout dérivé de pyridoxine, le meilleur accroisse- ment de la puissance d'adrénocorticotrophine peut être obtenu avec un dérivé acide de pyridoxine et des résultats particulière- ment bons peuvent être produits avec du chlorhydrure de pyridoxine.
La pyridoxine peut être comprise dans un mélange aqueux d'adrénocorticotrophine à une concentration d'au moins
0,005 % (poids/volume). Les meilleurs résultats peuvent être obtenus à une concentration de pyridoxine entre 0,05 et 10 % (poids/volume) et un accroissement particulièrement désirable de la puissance d'adrénocorticotrophine peut être produit à une concentration de pyridoxine dans cette dernière d'environ
0,1 à 3 % (poids/volume), c'est-à-dire qu'une concentration d'environ 1 % (poids/volume) convient dans les opérations industrielles.
L'effet de pyridoxir pour accroître la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotrophine, semble optimum à un pH entre 3,5 et 5,5 bien qu'un certain accroissement puisse être obtenu à la fois sur le côté alcalin et sur le côté acide de cette gamme de pH. Le meilleur accroissement peut être obtenu à un pH entre 4,0 et 5,0 et des résultats particulièrement désirables sont produits à un pH entre 4,7 et 4,8. Le réglage du pH du mélange de réaction de pyridoxine peut être produit avec tout alcali, acide ou tampon convenable, par
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exemple de l'acide chlorhydrique, de l'hydroxyde de sodium, une solution tampon d'acétate de sodium dans l' a.cide acétique, etc.
Le réglage d'une solutionacide d'adrénocorticotrophine à un pH plus alcalin, c'est-à-dire au moins 5,0, peut donner lieu à la formation d'un précipité. Une partie importante de la matière en suspension est solubilisée pendant l'incubation dans ce procédé. Après que l'incubation a été terminée, une faible partie d'un résidu insoluble peut rester dans le mélange aqueux.
Ce résidu insoluble peut être séparé de la solution aqueuse pour obtenir une adrénocorticotrophine de puissante souscutanée accrue qui est complètement soluble dans la gamme de pH neutres, c'est-à-dire environ aux pH 6,2 à 7,4 (gamme physiologique). La séparation de ce résidu peut être effectuée par filtrage, centrifugeage, etc. Le résidu insoluble séparé peut montrer une faible mesure d'activité adrénocorticotrophique.
Le mélange aqueux d' adrénocorticotrophine et de pyridoxine doit être incubé à une température d'au moins 15 C.
Cependant, dans l'adaptation de ce procédé à la fabrication . industrielle, la température d'incubation peut 'être entre 30 et 15C C pour réduire le laps de temps nécessaire pour effectuer l'accroissement maximum de puissance d'adrénocortico- tropliine . Les meilleurs résultats peuvent être obtenus à des températures d'incubation entre 75 et 125 C et une incubation particulièrement désirable est produite à une température d'environ 90 à 100 C.
Ce procédé peut être utilisé pour accroître la puissance sous-cutanée de toute adrénocorticotrophine, bien que les meilleurs résultats puissent être obtenus avec de l'adrénocorticotrophine ovine et qu'un accroissement particulièrement désirable soit obtenu avec de l'adrénocorticotrophine bovine.
Par exemple, la matière de départ peut être tout tissu pituitaire de mammifères, tel que glandes pituitaires de porcs, boeufs et moutons. De même, cette matière de départ peut être un dérivé de tissu pituitaire, tel qu'un extrait de tissu pituitaire, par exemple un extrait à l'acide acétique glacial
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de la corticotrophinc brute ou l'extrait prémentionné à l'acétone à 70% acide déshydraté de tissu pituitaire et d'adrénocorticotrophine, préparé par le procédé du brevet américain précité.
Ce procédé est particulièrement applicable pour accroître la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotrophine bovine et ovine préparée par le procédé du brevet américain, bien qu'un certain accroissement de puissance souscutanée d'adrénocorticotrophine porcine préparée de façon analogue puisse être obtenu avec ce procédé, par exemple de l'ordre d'environ 20 à 50 %.
On' a trouvé que l'inclusion d'un agent réducteur organique contenant au moins un groupe sulfhydryle dans le mélange aqueux d'adrénocorticotrophine et de pyridoxine pendant l'incubation à un pH d'environ 4,7, neutralise l'effet de pyridoxine de telle façon que l'on n'obtient sensiblement pas d'accroissement de puissance. Cependant, l'adrénocorti- cotrophine préalablement traitée avec de la pyridoxine suivant ce procédé.peut être stabilisée par l'inclusion de cet agent réducteur. Bien que cet agent réducteur puisse être par exemple du bêta-mercapto-éthanol ou de l'acide thioglycolique, des résultats particulièrement bons peuvent être obtenus avec la cystéine, par exemple le chlorhydrure de cystéine-1 et la base cystéine-1.
La stabilisation de l'adrénocroticotrophine préparée par ce procédé peut être produite en mélangeant Jans raie solution aqueuse de celle-ci au noins 0,025% (poids/volume) de cet agent réducteur. Lorsque cet agent réducteur est ce la cystéine, une meilleure stabilisation peut être obtenue à une concentration de celle-ci dans la gamme de 0,05 à 5 % (poids/volume) et des résultats particulièrement bons peuvent être obtenus avec de la cystéine à une concentration d'environ 0,1 % (poids/volurne). Pour obtenir une stabilisation importante avec cet agent réducteur spécial, le pH de la solution d'adrénocorticotrophine traitée à la pyridoxine peut être de l'ordre de 5,5 à 7,5.
Si on le du sire, de la gélatine peut être comprise
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dans le mélange aqueux d'adrénocorticotrophine et de pyridoxine pour obtenir un accroissement supplémentaire de la puissance d'adrénocorticotrophine manifestée lors de l'administration : sous-cutanée. De même, cet accroissement supplémentaire de la puissance sous-cutanée peut être produit en incorporant de la gélatine dans une solution aqueuse d'adrénocorticotrophine traitée à la pyridoxine avant son administration. La concentra-
EMI7.1
tion de gélatine du mélange d'incubation ou solution'd'adrénocor ticotrophine peut être d'environ 8 à 40 % (poids/volume) et une fluidité désirable de ce mélange peut être obtenue avec de la gélatine partiellement hydrolysée à: une concentration d'environ 16 % (poids/volume).
D'autre part, la gélatine peut être de nouveau hydrolysée.jusqu'à un point de gélification de moins de 22 C, après quoi une fluidité équivalente du
EMI7.2
mélange d'incubatin ou solution dr adrénocorticotrophine peut être assurée à une concentration de gélatine d'au moins 28% (poids/volume) et parfois jusjqu'à 32 % .(poids/volume). La gélatine peut être hydrolysée par[. chauffage à l'autoclave à une pression de 1,05 kg au cm2 pendant 15- à 60 minutes ou jusqu'à ce que le point de gélification désiré soit obtenu.
Un conservateur, tel que parahydroxybenzoate de propyle ou méthyle, ou une combinaison de ces ingrédients, peut être compris dans le mélange d'incubation ou dans une solution d'adrénocorticotrophine traitée à la pyridoxine et des résultats particulièrement bons peuvent être obtenus avec un conservateur qui montre aussi une action anesthésique locale, tel que le phénol.
Les ingrédients utilisés dans ce procédé doivent convenir à l'administration parentérale à des êtres humains lorsque le produit d'adrénocorticotrophine résultant est destiné à l'usage humain, puis à l'administration parentérale à des animaux lorsque ce produit est utilisé comme préparation vétérinaire.
EMI7.3
.La puissance sous-cutanée,d'adrénocort3ootrophine., , préparée par ce procédé peut être déterminée suivant le procédé
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d'essai de corticotrophinc du Codex américain (US Pharmacopeia, Vol. XV, 1955).
L'invention peut être illustrée en outre par les exemples particuliers qui suivent.
Exemple 1
L'adrénocorticotrophine bovine préparée par le procédé du brevet américain précité, en une quantité de 300 mg, fut mise en suspension dans 150 ml. d'eau distillée exempte de pyrogène. On ajouta à la suspension obtenue 15 g. de chlorhydrure de pyridoxine et 0,75 g. de phénol. Cette solution avait un pH de 3,0. Des parties de cette solution furent réglées à un pH particulier soit avec une solution d'acide chlorhydrique à 10 %, soit avec une solution d'hydroxyde de sodium à 10 %. Chaque partie, en une quantité de 20 m1. fut incubée à une température de 37 C pendant deux semaines. A la fin de la période d'incubation, chaque préparation fut analysée par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané en utilisant 8 rats hypophysectomisés par préparation.
On donne ci-après les résultats de l'analyse. pH de préparation Puissance (Unités Codex US par ml. )
EMI8.1
<tb>
<tb> 2,0 <SEP> 21,0
<tb> 3,0 <SEP> 22,8
<tb> 4,0 <SEP> 51,2
<tb> 5,0 <SEP> 73,8
<tb> 6,0 <SEP> inactive
<tb> 7,0 <SEP> inactive
<tb>
Ces résultats indiquent que le pH optimum pour le traitement d'adrénocorticotrophine bovine préparée par le procédé du brevet américain rentre dans la gamme d'environ 4,0 à 5,0, bien qu'un certain effet puisse être obtenu avec un pH à l'extérieur de cette gamme.
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Exemple 2
EMI9.1
L'adrénooorticotrophine bovine, préparée par le procédé du brevet américain, en une quantité de 400 mg., fut dissoute dans 14 ml. d'eau distillée exempte de pyrogène..
On ajouta à la solution obtenue 1 g. de chlorhydrure de pyridoxine et cette solution fut réglée à un pH de 4,7 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 10 %. Cette solution fut placée dans des flacons de verre de 5 ml. à raison de 2,5 ml. par flacon.
Les flacons remplis furent fermés hermétiquement et immergés dans un bain d'eau bouillante. Une partie des flacons fut retirée du bain à des intervalles d'une heure. Chaque partie fut centrifugée et 1 ml. du liquide surnageant fut dilué à un volume de 5 ml. avec une solution de gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,5 % de phénol.
Chaque préparation fut analysée par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané en utilisant
8 rats hypophysectomisés par préparation. Les'résultats d'analyse sont donnés ci-après :
EMI9.2
<tb>
<tb> Durée <SEP> d'incubation <SEP> Puissance <SEP> d'échantillon <SEP> Puissance, <SEP> calcu-
<tb> (heures) <SEP> d'essai <SEP> (Unités <SEP> Codex <SEP> lée <SEP> de <SEP> préparaUS <SEP> par <SEP> ml.) <SEP> tion <SEP> (Unités
<tb>
EMI9.3
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ .
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ Codex US par ml.) o # 18,3 91,5
EMI9.4
<tb>
<tb> 1 <SEP> 22,8 <SEP> 114,0
<tb> @ <SEP> 34-,5 <SEP> 172,5
<tb> 4 <SEP> 83,7 <SEP> 418,5
<tb> 6 <SEP> 112,2 <SEP> 560,0
<tb> 8 <SEP> 36,6 <SEP> 183,0
<tb>
Ces résultats indiquent que l'accroissement maximum de la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotrophine bovine, préparée par le procédé du brevet américain, peut être produit
EMI9.5
à un pH de .,7 et à une température d'environ 100 C en 6 heures environ.
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Exemple 3
EMI10.1
La préparation d'adrénocorticotrophine obtenue par le procédé de l'exemple 2, après 6 heures d'incubation dans un bain d'eau bouillante, et diluée cinq fois avec une solution de gélatine aqueuse à 16 %contenant 0,5 % de phénol, en une quantité de 4 ml., fut de nouveau diluée à un volume de 22 ml* avec une solution de gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,5 % de phénol. Cette solution diluée fut placée dans des flacons de verre de 5 ml., à raison de 3 ml. par flacon. Les flacons remplis furent soumis à l'incubation dans un bain d'eau bouillante et une partié des flacons fut retirée de ce bain à des intervalles de temps choisis.
Les produits contenus dans ces flacons furent analysés par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané en utilisant', 8 rats hypophysectomisés par préparation. ,
Les résultats furent les suivants : Durée d'incuba- Puissance d'échantillon Puissance calculée tion d'essai (-Unités Codex de préparation (heures) US parmi.) initiale (Unités
EMI10.2
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ Codex US par ml.
EMI10.3
<tb>
<tb>
0 <SEP> 11,2 <SEP> 318
<tb> 0,5 <SEP> 10,2 <SEP> 280
<tb> 1 <SEP> 13,4 <SEP> 368
<tb> 2, <SEP> Il,8 <SEP> 325
<tb> 3 <SEP> 10., <SEP> 2 <SEP> 280
<tb> 4 <SEP> 14,0 <SEP> 385
<tb>
Ces résultats indiquent qu'à la dilution quintuple, le produit incubé 6 heures peut être de nouveau incubé pendant 4 heures sans perte de puissance notable.
Exemple 4
La corticotrophine brute, en une quantité de 210 ml., fut dissoute dans 30 ml. d'eau distillée exempte de pyrogène.
On additionna à la solution obtenue 750 ml. de chlorhydrure de pyridoxine et le pH de cette solution fut réglé à 4,7 avec
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une solution à 10% d'hydroxyde de sodium. Cette solution fut placée dans des flacons de verre de 5 ml., à raison de 1,5 ml. par flacon. Les flacons remplis furent fermés hermétiquement' et immerges dans un bain d'eau bouillante. Des parties des flacons furent retirées du bain à des intervalles de temps choisis. Ces préparations furent analysées par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané en utilisant 8 rats hypophysectomisés par préparation.
Les résultats furent les suivants : Durée d'incuba- Puissance d'échantillon Puissance calculée tion d'essai (Unités Codex US de préparation (heures) par ml.) (Unités Codex US ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ par mg. de solides).
EMI11.1
<tb>
<tb>
0 <SEP> 3,1 <SEP> 0,44
<tb> 4 <SEP> 9,9 <SEP> 1,40
<tb> 6 <SEP> 15,0 <SEP> 2,10
<tb> 10 <SEP> 4,8 <SEP> 0;70
<tb>
Ces résultatsindiquent que l'accroissement maximum de corticotrophine brute peut être obtenu en 6 heures environ à une température de 100 C approximativement et à un pH de 4,7.
Exemple 5
L'adrénocorticotrophine porcine, préparée par le procédé du brevet américain précité, en une quantité de 13 ml., fut immergée avec 325 mg. de chlorhydrure de pyridoxine. La solution obtenue fut réglée au pH 4,7 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 10 ci. Cette solution fut placée dans un flacon de verre de 50 ml. Le flacon rempli fut fermé hermétiquement et immergé dans un bain d'eau bouillante. Des parties dèsproduits contenus dans ce flacon furent retirées à des intervalles de temps choisis. Chaque partie, en une quantité de 1 ml. fut diluée avec 29 ml. d'une solution de gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,5% de phénol.
Les préparations furent analysées par le procédé à la gélatine sous-cutané en utilisant 8 rats
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par préparation.
Les résultats furent les suivants : Durée d'incuba- Puissance d'échantillon Puissance calculée tion d'essai (Unités Codex US de préparation (heures) parmi.) (Unités Codex US
EMI12.1
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ par mlo
EMI12.2
<tb>
<tb> 0 <SEP> 14,1 <SEP> 423
<tb> 1 <SEP> 19,5 <SEP> 585
<tb> 2 <SEP> 9,6 <SEP> 144
<tb> 3 <SEP> 10,8 <SEP> 162
<tb> 4 <SEP> inactive <SEP> inactive
<tb> 5 <SEP> inactive <SEP> inactive
<tb> 6 <SEP> inactive <SEP> inactive
<tb> 8 <SEP> inactive <SEP> inactive
<tb>
Ces résultats indiquent que l'accroissement maximum d'adrénocorticotrophine porcine préparée par le procédé du brevet américain peut être effectué à une température de 100 C et à un pH de 4,7 en une heure environ.
Exemple 6
Une préparation d'adrénocorticotrophine porcine obtenue par le procédé du brevet américain précité, contenue dans une solution de gélatine aqueuse à 16 % et emmagasinée pendant au moins deux ans, fut traitée avec de la pyridoxine suivant le procédé ci-après.
La solution d'adrénocorticotrophine et gélatine avait perdu sa puissance pendant l'emmagasinage et contenait environ 4 unités Codex US par ml. Là préparation, en une quantité de 100 ml., fut mélangée avec 10 g. de chlorhydrure de pyridoxine.
Des parties du mélange obtenu furent réglées aux concentrations d'ions d'hydrogène choisies et incubées à une température de 37 C pendant deux semaines. Los produits incubés furent analysés. par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané en utilisant 8 rats par produit.
Les résultats furent comme suit:
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pH de produit ¯ .puissance de produit ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ (unités Codex US par ml.)
EMI13.1
<tb>
<tb> 3,5 <SEP> 11,1
<tb> 4,5 <SEP> 14,7
<tb> 5,5 <SEP> 10,7
<tb>
Ces résultats indiquent que la puissance d'adrénocor- ticotrophine perdue pendant l'emmagasinage peut être récupérée avec la pyridoxine.
Exemple 7
De l'adrénocorticotrophine bovine, préparée par le procédé du brevet américain, en une quantité de 1 g., fut dissoute dans 100 ml. d'eau distillée 'exempte de pyrogène. On ajouta à la solution obtenue 2,5 g. de chlorhydrure de pyridoxine et cette solution fut réglée à un pH de 4,7 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 10 %. Cette solution fut placée dans des flacons de'verre et les flacons remplis furent fermés hermétiquement et mis à incuber dans un bain d'eau bouillante pendant 6 heures; Le produit ainsi obtenu avait-une puissance de 306 unités Codex US par ml. Ce produit fut 'de nouveau incubé dans un bain d'eau bouillante pendant 40 minutes et la préparation obtenue avait une puissance de 391 unités Codex US par ml.
Ce produit traité à la pyridoxine, en une quantité de 50 ml., fut dilué à 500 ml. avec une solution de gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,5 % de phénol. Le produit dilué fut utilisé en préparant les compositions suivantes :
A - Une partie de ce produit traité à la pyridoxine, 300 ml., fut filtrée stérile.et placée dans des flacons de verre de 5 ml., 5 ml. par flacon.
B - A 110 ml. de produit A, on ajouta 100 mg. de cystéine et la solution résultante fut filtrée stérile. La solution stérile fut placée dans des flacons de 5 ml., 5 ml. par flacon.
C - A 100 ml. du produit traité à la pyridoxine,'on ajouta 300 ml. d'une solution de gélatine aqueuse à 16 %,
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contenant 0,5 % de phénol et 110 mg. de vitamine cristalline B12, La solution obtenue fut filtrée stérile et placée dans des flacons de 5 ml., 5 ml. par flacon.
D - Une préparation dadrénocorticotrophine bovine obtenue par le procédé du brevet américain précité, contenue dans une solution de gélatine aqueuse à 16 % à un pH de 6,5, en une quantité de 210 ml., fut filtrée stérile et placée dans des flacons de 5 ml., 5 ml. par flacon (contrôle).
E - Une solution d'adrénocorticotrophine et gélatine de contrôle (produit D ci-dessus), en une quantité de 210 ml., fut mélangée avec 210 mg. de cystéine. La solution obtenue fut filtrée stérile et placée dans des flacons de 5 ml., 5 ml. par flacon.
Chacune des compositions qui précèdent fut analysée en utilisant deux essais à la gélatine sous-cutanés à trois, niveaux. Une partie de chaque(produit fut incubée pendant 8 et 16 heures, à une température de. 100 C, pour déterminer la stabilité. Ces produits incubés furent analysés par le procédé dressai à la gélatine sous-cutané en utilisant 8 rats par produit.
Les résultats furent les suivants : .- Puissance-(unités Codex US par ml.) Produit Estimé Essai à deux essai Détermination de détermina- (moyenne) stabilité : incuba- tions tiôn de 8 et 16 h.
(unités Codex US par ml.
¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯ 8 16
EMI14.1
<tb>
<tb> A <SEP> 40 <SEP> 34,8+4,0 <SEP> 30,3 <SEP> ¯ <SEP> 2,6 <SEP> 17,7 <SEP> 10,5
<tb> 28,0 <SEP> + <SEP> 2,4
<tb> B <SEP> 40 <SEP> 33,6 <SEP> + <SEP> 6,4 <SEP> 33,4 <SEP> ¯ <SEP> 4,3 <SEP> 15,8 <SEP> 12,9
<tb> 33,3 <SEP> ¯ <SEP> 4,3
<tb> C <SEP> 30 <SEP> 39,0 <SEP> ¯6,9 <SEP> 31,2 <SEP> + <SEP> 3,4 <SEP> 8,1 <SEP> 6,0
<tb> 28,4 <SEP> ¯ <SEP> 4,0
<tb> D <SEP> 40 <SEP> 24,8 <SEP> + <SEP> 4,0 <SEP> 26,1 <SEP> + <SEP> 2,1 <SEP> 9,4 <SEP> 5,1
<tb> 26,5 <SEP> ¯ <SEP> 2,5
<tb> E <SEP> 40 <SEP> 32,0 <SEP> ¯ <SEP> 4,0 <SEP> 30,0 <SEP> ¯ <SEP> 2,7 <SEP> 15,6 <SEP> 6,2
<tb> 27,2 <SEP> ¯ <SEP> 3,2
<tb>
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Exemple 8
De l'adrénocorticotrophine 'bovine, préparée par le procédé du brevet américain, en une quantité de 2 g.,
fut mise en suspension dans 220 ml. d'eau distillée exempte de pyrogène.
On ajouta à la solution obtenue g. de chlorhydrure de pyri- doxine et la suspension fut réglée à un pH de 4,7 avec-une solution d'hydroxyde de sodium à 10 %.
La suspension fut placée dans des flacons de 50 ml. et, après fermeture étanche, les flacons furent immergés dans un bain d'eau bouillante pour être incubés pendant. 6 heures. et, 40 minutes. Une partie du produit incubé, en une quantité de 1 ml., fut diluée avec 7 ml. d'une solution de gélatine aqueuse à 15% contenant 0,5 % de phénol. Ce produit de gélatine,, lars de l'analyse à l'essai à la gélatine sous-cutané en utilisant trois niveaux, fut trouvé avoir une puissance de 50,5. + 7 unités Codex US par ml.
Sur la base de ce résultat d'essai, 200 ml. du produit incubé furent dilués avec 1600 ml. d'une solution de gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,5 % de phénol.. Ce produit. dilué fut filtré stérile à travers un tampon Ertel No. 8 et placé dans des flacons de verre de 5 ml., à raison de 5,4 ml. par flacon.
Des parties du produit du flacon furent incubées à une température de 100 C pendant des périodes de 8 et 16 heures pour la détermination de la stabilité. Ces produits furent analysés par le procédé d'essai à la gélatine sous- cutané et le procédé de corticotrophine intraveineux du Codex US. Les résultats furent les suivants'.
Puissance (unités Codex US par ml.) Produit IV FISC Préparation 15,2 + 3,2 39,6 + 5,2) incubée @ 53,9 + 8,8 moyenne = 44,6 + 3,4
39,6 ¯ 5,2 ) moyenne = 44,6 ¯ Préparation incubée après 8 heures à 100 C 9,3 22,0 Préparation incubée après 16 heures à 100 C 7,8 9,2
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Ces, résultats indiquent que dans certaine cas @ l'accroissement de le puissance manifestée par l'adrcnocorticotrophine, lors de l'administration intraveineuse, peut être produit en plus de l'accroissement de la puissance sous-cutanée.
Exemple 9
EMI16.1
'adxénocarticotrophine bovine, préparée par le procédé du brevet américain précité, en une quantité de 200 mg. fut dissoute dans 20 ml. d'eau exempte de pyrogëne. On ajouta à la solution obtenue 500 mg. de chlorhydrure de pyridoxine et cette solution fut réglée à un pH de 4,7 avec une solution d'hydroxyde.de sodium à 20 %. Cette solution fut placée dans des flacons de verre de 30 ml. et la flacon rempli fut soumis à l'incubation dans un bain d'eau bouillante. Des parties du contenu du flacon furent retirées à des intervalles de temps choisis. Ces parties furent diluées à 1 : 10 avec une solution de gélatine aqueuse à 16% contenant 0,5 % de phénol.
Les préparations obtenues furent analysées par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané en utilisant 8 rats par préparation. Les résultats furent comme suit : Durée d'incuba- Puissance d'échantillon Puissance calculée tion d'essai (unités Codex de préparation (heures) US par ml. ) (unités Codex US
EMI16.2
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ par ral. ) -
EMI16.3
<tb>
<tb> 0 <SEP> 13,5 <SEP> 135
<tb> 3,5 <SEP> 18,6 <SEP> 186
<tb> 4 <SEP> 47,6 <SEP> 476
<tb> 4,5 <SEP> 40,4 <SEP> 5,2 <SEP> 404
<tb> 8 <SEP> 24 <SEP> 240
<tb> 10 <SEP> 13,6 <SEP> 136
<tb>
La préparation obtenue dans le procédé qui précède après 4- heures 1/2 d'incubation, en une quantité de 10 ml., fut réglée au pH 6,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 20 %. On ajouta à cette solution 100 mg. de cystéine.
Le mélange résultant fut placé dans des flacons en verre et les flacons remplis furent soumis à l'incubation dans un bain d'eau.bouillante. Certains des flacons furent retirés du bain
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à des intervalles de temps choisis et les produits qu'ils contenaient furent dilués à 1 : 10 avec une solution de gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,5 % de phénol. Ces prépara- tionsfurent analysées par le procédé d'essai à la gélatine sous- cutané en utilisant 8 ra.ts par préparationo Les résultats furent les suivants.
Durée d'incuba.- Puissance d'échantillon Puissance calculée tion d'essai (unités Codex de préparation (heures) US; par ml.) (unités Codex US
EMI17.1
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯par ml . ) ¯¯
EMI17.2
<tb>
<tb> 0,5 <SEP> 35,2 <SEP> 352
<tb> 3,5 <SEP> 93,6 <SEP> 936
<tb> 5,5 <SEP> 29,1 <SEP> 291
<tb>
Ces résultats indiquent que l'adrénocorticotrophine bovine, obtenue par'le procédé du brevet américain, peut être traitée à la pyridoxine pour accroître sa puissance, souscutanée et le produit obtenu peut.être traité à la cystéine a un pH de 6,5 et à une température d'environ 100 0 'sans détruire
EMI17.3
l'activité d'adrénocorticdtrophine sous-cutanée ainsi produite.
Exemple 10
De l'adrénocorticotrophine bobine, préparée par le procédé du brevet américain précité, en une quantité de 2 g., fut dissoute dans 200 ml, d'eau distillée exempte de pyrogène.
On ajouta à la solution obtenue 5 g. de chlorhydrure de pyridoxine et cette solution fut réglée au pH 4,7 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 20 %. La solution fut placée dans des flacons de 50 ml. et les flacons remplis furent soumis à l'incubation dans un bain d'eau bouillante pendant 4 heures 1/2. Ensuite, on retira les contenus des flacons, et on les mélangea pour former un produit composite. Ce produit composite fut réglé au pH 6,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 20% et la solution résultante fut additionnée de 2 g. de cystéine. Cette solution fut placée dans des flacons ¯de 50 ml. qui furent bouchés hermétiquement et soumis à l'incubation dans un bain d'eau bouillante pendant deux heures.
Une partie du produit incubé, 1 ml., fut diluée
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avec 9 ml. d'une solution de gélatine aqueuse à 16% contenant 0,5 % de phénol. La solution résultante avait une puissance de gélatine sous-cutanée (deux essais) de 31,2 + 4,4 et 35,4 + 3,6 avec une moyenne de 33,8 + 2,9 unités Codex US'par ml.
Le reste du produit incubé fut clarifié par filtrage à travers un fin filtre de verre fritté. Le résidu de filtrage fut séché et obtenu en un rendement de 374 mg. Le produit filtré, 190 ml. fut dilué avec 855 ml. d'une solution de gélatine aqueuse à 32% contenant 1,0 % de phénol et 665 ml. d'eau distillée exempte de pyrogène. Cett.e préparation avait une puissance de gélatine sous-cutanée de 40,8 6,0 unités Codex par ml.
La solution d'adrénocorticotrophine et gélatine fut filtrée stérile à travers un tampon Ertel 8 et versée de façon aseptique dans des flacons de verre de 5 ml., 5,5 ml. ' par flacon. Le produit du flacon avait une puissance de gélatine sous-cutanée (deux essais) de 36,4¯5,2 et de 56,6 + 9,6 avec'une moyenne de 43,0 ¯ 4,6 unités Codex US par ml.
Une partie .du. produit du flacon fut soumise à la détermination de stabilité en chauffant à une température de 100 C pendant des périodes de 8 et 16 heures. Les produits résultants furent analysés par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané en utilisant 8 rats par préparation. La puissance de ces produits en unités Codex US par ml. était la suivante :
Puissance initiale 43,0 + 4,6
Incubation pendant 8 heures 16,8-et 25,5 avec une moyenne de 21,2
Incubation pendant 16 heures 12,4 et 16,8 avec une moyenne de 14,6.
Une autre partie du produit du flacon fut mélangée avec la cystéine en une quantité de 0,1 % (poids/volume). La solution résultante fut chauffée à une température de 100 C pendant des périodes de 8 et 16 heures. Les préparations résultantes furent analysées par le mode opératoire d'essai à
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la gélatine sous-cutané en utilisant 8 rats par préparation:.
Les puissances de ces préparations en unités Codex US par ml. furent comme suit :
Puissance initiale 43,0 ¯ 4,6
Incubation pendant 8 heures 17,2 et 23,6 avec une moyenne de 20,4
Incubation pendant 16 heures 13,6 et 14,4 avec une moyenne de 14,0
Exemple 11
L'adrénocorticotrophine bovine, préparée par le procédé du brevet américain, en une quantité de 200 mg., fut mise en suspension dans 20 ml. d'eau distillée exempte de pyrogène. On ajouta.à cette suspension 200me. de chlorhydrure de pyridoxine et son pH fut réglé à 4,7 avec une solution d'hydroxyde de sodium IN.
La suspension fut placée dans des flacons en verre. et, après fermeture étanche, les flacons furent immergés dans un bain d'eau bouillante. Dés parties des contenus du flacon, furent retirées à des intervalles de temps choisis pendant l'incubation. Ces parties furent diluées avec 10 parties d'une solution aqueuse contenant 16% de gélatine et 0,5 % de phénol.
Ces solutions de gélatine furent analysées par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané en utilisant 8 rats par ' préparation. Les résultats furent comme suit :
Intervalles de temps Puissance (Unités Codex US par (heures) ml.)
EMI19.1
<tb>
<tb> 0 <SEP> 79
<tb> 1 <SEP> 140
<tb> 2 <SEP> 207
<tb> 3 <SEP> 444
<tb> 4 <SEP> 590
<tb> 4,5 <SEP> 96
<tb> 5 <SEP> 48
<tb> 5,5 <SEP> 64
<tb> 6 <SEP> 84
<tb>
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Ces résultats indiquent que l'inclusion de 1 % de chlorhydrure de pyridoinc dans le mélange d'incubation augmen- te la mesure d'accroissement par rcpport à celle obtenue avec 2,5 ' de chlorhydrure de pyridoxine.
Exemple 12
L'adrénocorticotrophine bovine, préparée par le procédé du brevet américain précité, en une quantité de 200 mg., fut niée en suspension dans 100 ml. d'une solution de gélatine aqucuse à 16% contenant 10 g. de pyridoxine, 110 mg. de vitamine B12 et 0,5 de phénol. La suspension obtenue fut mise à incuber à une température de 32 C. Des parties de la suspension furent retirées à des intervalles de temps choisis pendant l'incubation.
Ces parties furent analysées par le procède d'essai à la gélatine sous-cutané'. Les résultats furent les suivants : Intervalles de temps Puissance (unités Codex US par ml.) ¯¯¯¯¯(jours)¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI20.1
<tb>
<tb> 0 <SEP> 12 <SEP> - <SEP> 16 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 30,4 <SEP> (essai <SEP> sur <SEP> 8 <SEP> rats)
<tb> 9 <SEP> 43,0¯ <SEP> 6,0 <SEP> (essai <SEP> à <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 3 <SEP> niveaux <SEP> - <SEP>
<tb> 36,0 <SEP> ¯ <SEP> 4,8 <SEP> moynne <SEP> = <SEP> 39,4 <SEP> + <SEP> 3,8)
<tb> 16 <SEP> 91,2 <SEP> ¯ <SEP> 8,8 <SEP> (essai <SEP> à <SEP> 3 <SEP> niveaux)
<tb>
Le produit incubé pendant 16 jours fut filtré à travers un tampon Ertel No. 8 et le filtrat stérile fut lysé par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané. Ce ,.-duit stérile avait une puissance de 58,4 ¯ 4,8 unités Codex US par ml. (essai à trois niveaux).
Exemple 13
Les compositions suivantes, utilisant de l'adrénocorticotrophine bovine, obtenue suivant le brevet américain, furent préparées :
Produit A- Une solution de gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,4 unités Codex US par .^.il. d'adrénocorticotrophine qui n'avait pas été traitée à la pyridoxine et 0,5% de phénol.
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Produit B - Une solution de gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,4 unités Codex US par ml. d'adrénocorticotrophine qui n'avait pas été traitée à la pyridoxine, en combinaison avec 24,6 mcg. de vitamine B12 par ml., 2,46 mg. de pyridoxine par ml. et 0,5 % de phénol.
Produit C - Une solution de gélatine aqueuse à .16 % contenant 0,4 unités Codex US par ml. de l'adrénocorticotro- phine obtenue au bout de 16 jours d'incubation dans le procédé de l'exemple 12, en combinaison avec 8 mcg. de vitamine B12 par ml., 0,8 mg. de,pyridoxine par ml. et 0,5 % de phénol.
Produit D - Une solution de gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,4 unités Codex US par ml. d'adrénocorticotrophine obtenue après 16 jours d'incubation suivant le procédé de i l'exemple 12, en combinaison avec26,6 meg. de vitamine B12 par ml., 2,66 mg.'de pyridoxine par ml. et 0,5% de phénol.
Ces produits furent analysés par lé procédé d'essai à la gélatine sous-cutané comme suit.
Des rats hypophysectomisés, au nombre de 80, furent divisés en quatre groupes de 20 rats chacun. On injecta à chaque groupe 0,5 ml. 'd'un des produits prémentionnés. Quatre des rats de chaque groupe furent tués à des intervalles de temps choisis après l'injection. La déplétion dans l'acide ascorbique du contenu des glandes adrénales des rats fut déterminée et les résultats sont indiqués au tableau suivant en nombre de mcg. par mg. de poids d'adrénal aux intervalles de temps choisis.
Intervalle, de temps (heures)
EMI21.1
<tb>
<tb> Produit <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7
<tb> A <SEP> 3,48 <SEP> 3,28 <SEP> 2,98 <SEP> 3,60 <SEP> 4,26.
<tb>
B* <SEP> 3,08 <SEP> 3,36 <SEP> 3,09 <SEP> 3,48 <SEP> 3,69
<tb> C <SEP> 2,87 <SEP> 2,61 <SEP> 2,47 <SEP> 2,57 <SEP> 3,20
<tb> D <SEP> 2,60 <SEP> 2,47 <SEP> 2,00 <SEP> 1,95 <SEP> 2,53
<tb>
* Ceci est une distribution anormale de données d'essai.
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.,X,0),T)lG 1 De 1.adr{nocorticutrohin0 ovine, préparée par le procédé du brevet américain précité, en une quantité de 200 mg.., fut mise en suspension dans 20 ml. d'eau distillée exempte- de pyrogène. On ajouta à cette suspension 500 mg. de chlorhydrure de pyridoxine et son pH fut réglé à 4,7 avec une.solution aqueuse d'hydroxyde de sodium.
Cette suspension fut incubée à une température de 100 C dans un bain d'eau bouillante. Des quantités aliquotes furent retirées à des intervalles de temps choisis. Ces quantités aliquotes furent diluées à 1 : 10 avec une solution aqueuse de gélatine à 16 % contenant 0,5 % de phénol. Ces quantités aliquotes diluées furent analysées par le procédé d'essai à la gélatine sous-cutané.
Les résultats furent les suivants : Intervalles de temps Puissance (unités Codex US par ml.)
EMI22.2
(heures) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI22.3
<tb>
<tb> 0 <SEP> 5,2
<tb> 2 <SEP> 95,8
<tb> 3 <SEP> 98,0 <SEP> ' <SEP>
<tb> 4 <SEP> .20,0
<tb> 5 <SEP> 8,8
<tb> - <SEP> 8 <SEP> inactive
<tb>
Ces résultats indiquent que l'accroissement maximum d'adrénocorticotrophine ovine, préparée par le procédé du brevet américain précité, peut être obtenu avec de la pyridoxine en une période d'incubation de moins de 3 heures.
Bien que diverses réalisations de l'invention aient été décrites en détail dans ce qui précède pour l'illustrer, il est évident que ce ne sont là que des exemples non limitatifs, diverses modifications et variantes étant possibles sans sortir de son cadre.