BE563122A - - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'antiboitiques nouveaux qui sont la distamycine et ses constituants, et la   distacyne.,   ¯par culture   dlune   nouvelle espèce de Streptomyces, le "S. distallicus",dans des conditions appropriées. 



   Elle vise également ces nouveaux antibiotiques, en particulier tels qu'obtenus par ce procédé., qui sont doués 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 d'une activité antibactérienne et/ou fongicide. Ces antibiow tiques sont notamment applicables au traitement de plantes atteintes de maladies causées par des   micro-organisrre z   sensi- bles aux   antibiotiques   en question. 



   Les antibiotiques préparés par le procédé objet de la présente invention ne sont pas 'décrits parmi les antibio- tiques connus. Les compositions contenant ces antibiotiques 
 EMI2.2 
 "¯ # ' - . ' ' nouveaux sont intéressantes par suite de leur grande activité vis-à-vis de plusieurs champignons'3t sahizomyaétes pathogènes. 



  Ces antibiotiques nouveaux   sont   produits par une   @   
 EMI2.3 
 espèce ¯nouvelle de -Streptomyces (dont la souche a été iso- lée par la demanderesse à partir d'un échantillon de sol prélevé en Campanie, province de Naples), dans divers milieux de culture appropriés à la croissance du   microorganisme   pro- ducteur et à la production des antibiotiques par ce même   miaroorganisme,   
D'après la description qui suit,-il apparaît que 
 EMI2.4 
 la souche isolée par la. demanderesse ne oorreepond à aucune des espèces cataloguées-dans lè Manuel de Bergey, ou par Waksman-Leohevèlier dans ItA?t1nomytes and their Antibiotios"5 en 1953.

   Cette espèce nouvelle a été appelée t'streptomyaes dist3.11ioas ". , Le microorganisme producteur présente les càracté- riS%i4Uea suivantes: AU microscope optique, hyphes longs, plutôt droits, peu ramifiés. Sur agar-agir-levure, hyphes longs et droits avec vertioilles' d!hyphes courts, d,xoits, sympodi- que s . Sur agar-agar-p'omme'de -terre, agar-agar-c9tte et asar-asar-axparagine, il-se forme'un'mycélium végétatif,,qui présente d'un côté   une   couleur passant du jaune-miel au brun en vieillissant, tandis'que le coté opposé varie du brun clair au brun noisette.

   Le'mycélium aérien est rare sur-ces milieux de culture, il présente une apparence poudreuse et satinée et 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 une couleur blanche grisâtre les premiers jours de croissance, et par'la   suite   une couleur légèrement gris-crème; sur agar- agar-asparagine, il présente une légère nuance violet-brun, 
Sur agar-agar-amidon et agar-agar-Czapek le mycélium végétatif varie de l'incolore au jaune miel, le côté opposé étant jaune; sur Czapek le mycélium aérien est blanc grisâtre; sur agar-agar-amidon il est légèrement lie-de-vin,   toujours   poudreux et satiné. 



   Dans le bouillon de viande et le bouillon peptone- glucose, le mycélium végétatif est abondant, presque complè- tement immergé sous forme de flocons; sur bouillon de viande il croit aussi à la surface, sous forme annulaire, un   coté   étant jaune miel tandis que le côté opposé a une couleur jaune. 



  Le mycélium aérien est absent. Sur-gélatine il se produit une croissance abondante, le mycélium végétatif étant brun-miel et le verso brun jaune;.le mycélium aérien varie du blanc   grisâtre au gris ; existe un pigment noir-brun diffus. Il   ne se produit pas de pigmentation sur d'autres substrats. Il liquéfie fortement la gélatine au bout de 25 jours et hydrolyse considérablement l'amidon. Le milieu de culture le plus appro- prié à une bonne croissance du mycélium et à une activité antibiotique élevée en proportion, est constitué   par :  des hydrates de carbone, des substances azotées et des sels. 



   Comme source d'hydratesde carbone, on peut utiliser:   le   glucose, le saccharose, le maltose, l'amidon et aussi les hydrates de carbone présents dans la liqueur de macération de mais. Comme source d'azote, on peut utiliser: la liqueur de macération de mais, la farine de soja et les sels d'ammonium. 



   De plus, on ajoute NaCl, CaCO3, K2HOP4, MgSO4, SO4 etc. Le pH du bouillon est d'environ 6,6. On peut con-   @uire   la fermentation dans un Erlenmeyer de 300 cm3, dans des conditions de bonne aération et à 28 C. L'activité maxi- 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 mum se produit entre 100.et 120 heures, avec un pH d'environ   7,6.   



   On peutaussi effectuer la culture du microorganisme, en conduisant une fermentation immergée qui comporte une agita- tion et une aération, ainsi qu'il est bien connu de l'homme de l'art. 



   Pour obtenir une bonne croissance des cultures, on peut utiliser un bouillon de culture contenant une ou plu- sieurs sources de carbone et d'azote assimilables et des sels, comme indiqué plus   hau t.   



   La présente invention a aussi pour objet l'extraction des antibiotiques produits par le microrganisme cultivé dans les conditions mentionnées ci-dessus. 



   Les exemples suivants   indiquent   quelques détails expérimentaux de cette partie de la présente inven tion; de façon générale, pour extraire les produits actifs des cultures, on traite le mycélium, séparé de la liqueur de culture, par divers solvants, par exemple les alcools méthylique, éthylique et butylique normal. Parmi ceux-ci, il est préférable dtutili- ser l'alcool butylique; on conduit généralement l'extraction en agitant le mycélium avec des fractions successives du sol- vant ; on sépare les extraits par centrifugation ou filtration, on les lave à l'eau et on les évapore sous vide. Du concentré huileux ainsi obtenu, on tire un précipité jaune ou brun-jaune, en traitant par l'éther, puis on sèche. Ce produit (distamycine) présente le spectre d'absorption d'ultra-violet qui caractérise un polymère conjugué.

   On trouve les maxima du spectre ultra- violet à 235, 290, 305, 318, 333, 350, 380 et 405   mp.   Les maxima à 318, 333 et 350 mu sont caractéristiques   d'un   chromo- phore du type penta-ène. Avec l'acide sulfurique concentré, le produit donne une couleur violet foncé. Il contient de l'azote, 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 
Le produit est soluble dans les alcools inférieurs,   l'éthylcellosolve,   la pyridine et les autres bases aliphati- ques ou aromatiques, ou- dans l'acide acétique   glacis!.   Il est partiellement soluble dans le chloroforme, les acides et les alcalis dilués, il est insoluble dans l'éther. Il est instable à chaud, particulièrement en milieu acide et alcalin, et sta- ble en solution dans le méthanol. 



   Rf chromatographique: Butanol aqueux : 0,15 ; eau saturée de butanol :   0,3 ;   butanol-pyridine-eau   (1:0,6:1) :   
0,6 ; butanol-acide acétique-eau (2:1:1) :0,73 ; chlorure d'ammonium à 3%:   0,04 ;   acétone à 60%: 0,8 ; benzène-acide acétique-eau   (2:2:1) :   0,00 (détection par bio-autographies sur Candida albicans). 



   Le spectre d'absorption d'infra-rouge montre un maximum à 2,9  avec des points d'inflexion à 3,00 et   3,05 ,   deux maxima nets à 6,04 et 6,33  avec des points d'inflexion à 6,10, 6,42, 6,52 et   6,58 ,  une raie moins évidente à 5.82 , une raie de forte absorption entre.6,8 et 7,3  . 



   Les produits tirés des cultures de Streptomyces distallicus suivant le procédé décrit ci-dessus ou un autre procédé équivalent, ou aussi au moyen d'un.solvant différent du butanol, par exemple un autre alcool, le chloroforme, l'acétone, une solution de bases aliphatiques, aromatiques ou hétérocycliques, présentent tous une aotion inhibitrice remarquable sur divers champignons et bactéries pathogènes. 



   En particulier, le produit obtenu par extraction au butanol (distamycine), et qui présente les caractéristiques mentionnées plus haut, est actif sur le S. lutea, le B. subtilis, le 
Mycobacterium tuberculosis souche 607, l'Actinomyces bostrômi, 
1'0. albicans, le Tric. mentagrophytes, le Sab. gypseuse l'Epid, floccosum, le Deb. Hudeloi (voir ci-dessous). 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 



   Des produits du type distamycine, on peut tirer, par divers procédés, des produits différents doués d'une remarquable activité antibiotique. Ces composés nouveaux peu- vent être déjà présents dans le produit brut, ou bien être formés par une modification du même produit. On peut obtenir un composé très actif en filtrant une solution méthanolique de distamycine par une colonne d'alumine; ce produit nouveau a été appelé "distramycine A", son spectre ultra-violet pré- sente des maxima à 304 et 240 m : le produit traité par l'acide sulfurique concentré donne une couleur lie de vin. 



   Il est insoluble dans le chloroforme, l'acétate   d'éthyle,   l'acétone, l'éther, les alcalis dilués ; il est très faiblement soluble dans le mélange méthanol-éther   1:3 .   



   La distamycine A est plus active que les produits dont on la tire. Elle présente une activité inhibitrice parti- culière sur certains schizomycètes et sur   l'Aotin,     bostro-   mi, 1'0. albicans, le Tric.   mentagrophytes,   le Sab. gypseus, le Gl.   graphii,     l'Epid.   floccosum, le   Deb.     Hudeloy   (voir ci-dessous). 



   On peut obtenir d'autres produits actifs par des frac- tionnements à l'aide de solvants appropriés (chloroforme, alcools, mélanges alcool-éther). Par exemple, si l'on précipite par l'éther, en proportions appropriées, une solution   d'un   produit de distamycine dans le méthanol, on obtient deux pro- duits nouveaux : la distamycine B, insoluble dans le   mélange   méthanol-éther, dont le spectre ultra-violet présente des maxima à   230,   318,   333,   350, 380, 405 mu; avec l'acide   sulfu-   rique concentré, elle donne une couleur violette;

   la distamy- cine C, soluble dans le mélange méthanol-éther, et dont le spectre d'absorption d'ultra-violet est caractérisé par un aximum important à 236 m  et par une absorption plus faible à   300-350   mu, en comparaison des autres produits. 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 



   Ce produit, avec l'acide suif crique concentré, donne une couleur lie-de-vin. Il est presque complètement soluble dans le chloroforme et les alcalis dilués, en donnait 'une couleur jaune. Tous les composés obtenus par ces frac- tionnements ou par d'autres comportant une extraction par' sol- vants (alcools, chloroforme, acétone, etc...), suivie ou non   d'une   précipitation, présentent une activité antibactérienne et fongicide égale ou supérieure à celle de la distamycine. 



   Etant donné leurs propriétés, la   distamycine,   ou les distamycines A, B et C, apparaissent différentes de tous les autres produits fongicides dérivés du métabolisme des actionnmycèts et qui ont été isolés ou suffisamment caracté- risés jusqu'à présent. En particulier, elles sont différentes de la fungichromine et de la philipine, substances qui con- tiennent un chromophore du type penta-ène. 



   De la liqueur-mère éthérée dé précipitation de la   distamyoine,   on tire un autre produit doué d'une activité fongicide, que la demanderesse appelle "distaoyne". On peut purifier ce produit en le cristallisant par l'acétone aqueuse; c'est und substance cristalline jaune, insoluble dans l'eau, mais soluble dans de nombreux solvants organiques; point de fusion   154-156 C;   (Ó   )5   = -17 (dans le méthanol). 



  Le spectre ultra-violet de la distacyne présente des maxima à 255 m  (E1% = 640) et 340 m  (E1% = 470) et donne des résultats d'analyse correspondant à la composition C22H25O6N. 



   Les spectres d'absorption d'ultra-violet des anti- biotiques ici décrits sont reportés sur les graphiques du dessin ci-joint, sur lequel A est la courbe de la   distarnycine,   B là courbe de la distacyne, et A', A", A'" sont les courbes respectives des fractions A, B et C de la distamycine. 



   Tour mieux caractériser le procédé de l'invention, on ajoutera que le filtrat des cultures de Streptomyces 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 distallicus montre une activité inhibitrice sur les schizo- mycètes et les champignons. L'activité antibiotique du filtrat est proportionnelle à la production de distamycine par le   microorganisme.   



   On indique ci-dessous le spectre antibiotique de la distamycine et de*ses dérives, afin de démontrer leur activité contre plusieurs bactéries. 



  Spectre d'activité de la distamycine et des fractions A, B et C que l'on peut en tirer. 



  Dose inhibitrice minimum, en  g/cm3; dilution dans du bouillon de   levure :   
 EMI8.1 
 
<tb> Souches <SEP> Distamy- <SEP> Fraction <SEP> A <SEP> Fraction <SEP> B <SEP> Fraction <SEP> C
<tb> 
 
 EMI8.2 
 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ cine ¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯ 
 EMI8.3 
 
<tb> Staph. <SEP> 114 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> 
<tb> S.lutea <SEP> 50 <SEP> <10 <SEP> 50 <SEP> + <SEP> 10
<tb> 
<tb> 
<tb> B.subtilis <SEP> 50 <SEP> <10 <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> 
 
 EMI8.4 
 Tycob.607 . 7 50 + 50 >50 50 
 EMI8.5 
 
<tb> E. <SEP> Coli <SEP> > <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> >50 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI8.6 
 Ps.aeruginosa ¯-50 >50 qi50 >50 Actin.bostrami A - 10 10 + 10 a- 10 0.

   alibicans < 10 + 10 < 10 + 10 Tr.mentagroph5rtes 10 10 10 + 10 
 EMI8.7 
 
<tb> Sab.gypseus <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 
<tb> 
<tb> G1. <SEP> graphii <SEP> 50 <SEP> + <SEP> la <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> 
 
 EMI8.8 
 Epid.floCCOSL1!Il < 10 <10 < 10 C 10 Deb.hudeloi + 10 + 10 + 10 + 10 
La distacyne à une dose de 100  g/cm3 dans une' cul- ture Sabouraud sur agar-agar exerce une action inhibitrice sur   l'Epydermophyton   floccosum, le   Tricophyton     mentagrophytes,   
 EMI8.9 
 -1-1- Glenospora graphii, le Sabourandites gypse us, et une ction sub-inhibitrice sur le Pseudomonas aeruginosa   et 'le   arcina lutea. 

 <Desc/Clms Page number 9> 

 



   Les exemples suivants illustreront mieux la pré- sente invention, mais il est entendu qu'elle n'est pas limitée par les substances et proportions particulières citées dans ces exemples. 



  EXEMPLE 1. 



     A   3000 cm3 d'un milieu stérile comprenant 2 % de dex- trose,   2%   de liqueur de macération de maïs, 1% de Ca CO3, 
 EMI9.1 
 O3;î de (NH4)2S04 ' 0,3% de NaCl, on ajoute une suspension de spores correspondant au lavage d'une kolle, On poursuit la fermentation pendant   40   heures avec une vitesse d'agita- tion de 150-250 t/mn et un débit d'air de 1 à 2 litres par minute et par litre de milieu de culture. 



   On utilise 300 cm3 de mycélium végétatif pour inocu- ler 6000 cm3 d'un milieu de culture stérile similaire, pour le stade de production. On prolonge ce stade pendant 85-100 heures; vitesse d'agitation   350-400     t/mn;   débit d'air, 1 litre par minute et par litre de milieu.de culture. 
 EMI9.2 
 2X?llLiB% 2. 



     A   17 litres d'.une culture obtenue par fermentation immergée comme dans l'exemple 1, on ajoute une substance coo- pérante et on filtre le tout. On agite pendant 1 heure le mé- lange de mycélium et de substance coopérante avec   2500   litres- de butanol. On répète ce traitement à deux reprises. 



   On réunit les extraits au butanol, on les lave avec H2O et on concentre jusqu'à consistance huileuse, puis on traite par   l'éther.   On obtient 8,9 g   d'un   produit brun jaune (distamycine). On laisse reposer les liqueurs-mères éthérées pendant 5-6 jours. On recueille le précipité cristallin et on le cristallise par   l'acétone   à 75%; point de fusion 154-156 C (distacyne). 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 



  EXEMPLE 3. 



   On dissout 1,0 g. de distamycine dans du méthanol (70 cm3), et on sépare d'un'léger résidu par filtration. 



   On filtre la solution jaune orange sur une colonne contenant 100 g d'alumine acidifiée suivant Wieland, et on lave au méthanol. On conduit   l'élution   avec le même solvant. 



  On prend la première quantité de 100 om3 recueillie après l'apparition d'une couleur jaune dans l'effluent, on la sèche par évaporation, et elle donne 0,2 g de   distamyoine.A.   



  EXEMPLE 4. 



   On agite pendant 30 minutes 1,0 g de distamycine avec 2 portions successives de 50 cm3 de méthanol. On obtient une dissolution presque complète (résidu 50   mg).   On concentre les extraits jusqu'à   25 em3,   on les sépare d'un léger préci- pité (25 mg) et on traite par 3 volumes d'éther. On sèche le précipité (distamycine B). Le rendement est de 0,4 g. 



  On évapore complètement les liqueurs-mères éthériées et on le.s reprend par l'éther. On recueille le produit résiduel et,on le sèche, il donne 0,33 g   (distamyoine   C).

Claims (1)

1. R E S U M E.

   1. L'invention a pour objet un procédé pour la pré- paration de produits doués d'une action antibiotique, procédé caractérisé en ce qu'on cultive une nouvelle espèce de Streptomyces (le Streptomyces distallicus) dans des liqueurs nutritives oontenant une ou plusieurs so urces de carbone et d'azote assimilables et des sels minéraux.

   2. Ce procédé peut, en outre;, comporter les carac- téristiques suivantes, considérées séparément ou en combinai- sons : <Desc/Clms Page number 11> a) On cultive le microorganisme par fermentation immergée, tout en agitant et en aérant. b) On sépare les cultures et le mycélium de la liqueur de culture, on extrait au moyen d'un solvant approprié (par exemple un alcool aliphatique inférieur à C5), on concentre l'extrait sous vide et on précipite par l'éther, puis, après avoir séché la précipité, on obtient un produit brun jaune (distamycine) qui présente un spectre d'absorption .d'ultra-violet caractéristiques d'un polyène conjugué, avec .

   des maxima d'absorption à 255, 290, 305, 318, 333, 350, 380 et 405 m , les maxima à 318, 333 et 350 m étant caracté- ristiques 'd'un chromophore du type penta-ène, et un spectre d'absorption d'infra-rouge qui présente un maximum à 2,94 avec des points d'inflexion peu évidents à 3,00 et 3,05 , deux maxima nets à 6,04 et 6,33 ,avec des points d'infle- xion à 6,10, 6,42, 6,52, 6,58 , une raie moins évidente à 5,82 et une forte absorption entre 6,8 et 7,3 .

   c) En filtrant une solution de distamycine dans le méthanol à travers une colonne d'alumine, on obtient un nouveau produit très actif (distamycine A),qui présente des maxima d'ultra-violet à 304 et 240 m . d) En précipitant par l'éther une solution de distamycine dans le méthanol, on obtient deux produits nou- veaux, la distamycine B (insoluble dans le mélange méthanol- éther, présentant des maxima d'absorption d'ultra-violet à 25,318, 333, 350, 380, 405 m ), et la distamycine C (solu- .)le dans les mélan@es méthanol-éther et dont le spectre d'absorption d'ultra-violet est caractérisé par un maximum important à 236 m ,avec une absorption plus faible à 300-350 m en comparaison des autres produits.

   <Desc/Clms Page number 12> e) Des liqueurs-mères éthérées provenant de la précipitation de la distamycine, on tire un autre produit EMI12.1 (distacyne, point de fusion 154-15600, (0< )5 = -17 dans le méthanol), dont le spectre d'absorption d'ultra-violet pré- sente des maxima à 255 mu (E l = 640) et 340 mU (.1,,, = 470), ce produit ayant pour formule brute C22H25O6N. f) Comme solvants pour extraire la distamycine des cultures ou du mycélium ou pour la fractionner, on utilise des dérivés halogénés d'hydrocarbures aliphatiques inférieurs, EMI12.2 ou l'acétone, ou des bases hétérocycliqtlese ou des solutions de bases alipMiJ;LSlue,s, '.J;'oJilE1;'giue s oullétér 00 Yliq e ue-s dans - un solvant appropri.é.

   , :3. Zve3a-iWv-isé,-également 3es.notrea.ux..antibiot- ques spécifiés ci-dessus (distamycine, distamycines A, B, C ,et distacyne), en particulier tels qu'obtenus par Le procédé ci-dessus, qui sont doués d'une activité antibactérienne et/ou fongicide.