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La présente invention se rapporte à un procédé de préparation 'de
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l'insuline, l'hormone antidiapétique, à partir d'un extrait acide alcoolique de pancréas, tels que pancréas de pora, de boeuf ou de cheval. De tels extraits alcooliques peuvent être traités de l'une des façons suivantes :
L'extrait alcoolique est soumis à la distillation afin d'évaporer l'alcool à Tuasse température et sous faible pression par exemple, à une tempé- rature de 10-20 0 et une pression de 10-30 mm Hg. Après enlèvement des matières grasses, l'insuline est précipitée du résidu aqueux, au moyen de sels neutres.
L'insuline peut également être récupérée sur l'extrait alcoolique en traitant l'extrait avec un échangeur d'ions, de préférence un échangeur de cations carboxylique, synthétique ounaturel, tel que l'oxycellulose, l'acide peptique, l'acide alginique ou l'Amberlite IRC 50 (le mot "Amberlite" est une marque dé- posée) .L'adsorbat obtenu est traité par un acide minéral et l'insuline est pre- cipitéede l'éluat obtenu.
Avant le traitement par l'échangeur de cations carboxy- lique, on peut ajouter de l'ammoniac à l'extrait alcoolique, jusqu'à réaction neutre ou légèrement alcaline (environ à pH 8,5), afin de précipiterles impuretés protéiques et les sels neutres.,En outre, lorsqu'on emploie certains acides organi- ques, pour acidifier l'alcool, une quantité considérable de l'acide est éliminée sous forme d'un sel d'ammonium insoluble dans l'éthanol à 70%.
Afin d'éliminer
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les imans ammonium restants et d'.éviter lasformation de sels lorsqu'on ajuste la solution au pH acide nécessaire pour l'adsorption ou la concenttation de l'insuline crue sur l'échangeur de cations carboxylique, l'extrait alcoolique peut être
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mie en contact, de préférence graduellement, avec un échangeur de cations sul- foné pourvu de nombreuoes, liaisons transversales du type Dowex 50 ("Dowex" est une marque déposée) en quantité telle qu<5on obtienne une valeur de pH d'environ.3.
Maintenant on a trouvé qu'un plus:grand rendement d'insuline pouvait : être obtenu lorsque l'extrait alcoolique conformément à la présente invention, préalablement à un traitement subséquent, était soumis à une chaleur telle que les enzymes y contenues soient inactivés. Il est préférable d'élever la températu-
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re de l'extrait a7.coôlique endéans un maximum de 30 minutes, à pH 2,0-4,5, à une température d'environ 70-75 Cet alors, soit de le maintenir à cette tempé- rature pendant 5-10 minutes avant de le refroidir, soit de le refroidir immédia- tement à la température de la pièce, par exemple, à 10-30 0, endéans un maximum de 30 minutes. A choix, le chauffage initial peut être plus rapide et la température sera maintenue à 70 C pendant un maximum de 10 minutes.
L'alcool employéopour l'extraction peut être un alcool aliphatique contenant 1 à 4 atomes de carbone, tels que le méthanol ou l'éthanol, à une con- centration mentionnée dans la littérature (par Scott D.A. & Parker., H., "The Preparation of Insulin" Roy. Soc. Canad. Trans. 26, 311, 1932). L'alcool est acidi- fié par l'addition d'un acide inorganique, tel l'acide chlorhydrique.ou un acide
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organique, tels Màoide acétique, l'acide citrique ou l'acide oxalique. L'extrac- tion des glandes hachées réfrigérées se fait à la température de la pièce pendant une durée de 4 à 5 heures
Les exemples suivant sont donnés afin d'illustrer l'invention. Les in- dications de température se rapportent aux degrés centigrade.
EXEMPLE @ Extraction : 1 Kg de pancréas de boeuf est broyé dans 1 8 litres d'éthanol à 95%auquel on avait ajouté 200 ml d'eau et 30 ml d'acide' chlorhydrique '10 N. L'ex- traction se poursuit à la température de la poèce pendant 4 heures,6sous agitation Le résidu solide des glandes.est séparé par centrifugation. Une seconde extrae- tion du résidu solide des glandes est alors faite dans 1,5 litre d'éthanol à 70%,
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en agitant pendant 1 heure après quoi le mélange est centrifugé. Lesoattraits sont combinés. Le volume total est de 3300 ml-dt la valeur du pH est d'environ' 2,0.
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Purification de l'extait : On ajoute de l'ammoniac aux extraits combinés-pour
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avoir un pH de 8,5. On enlève par filtration le précipité ansi formé et le filfrat est acidifié, avec de làacide chlorhydrique, au pH 3,0.
Traitement ãr..la chaleur : Afin de détruire les en mes proté\i'1:y-tiques qui ina tivent l'insuline, l'extrait Alcoolique est chauffé, au cours d'une période de 30 minutes, jusqu'à 75 et maintenu à cette température pendant 5 minutes. L'ex- trait est alors refroidi à la température de la pièce endéans 30 minutes.
@ Concentration : L'extrait alcoolique est concentré à 1/10 de son volume par dis tillaion sous pression réduite. Les graisses sont enlevées du concentré et les
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protéines sont précipî.'a au moyen de sels neutres en vue de la récupération et d la pur if ication"ul térieure de l'insuline.
EXEMPLE 2.
Extraction : 5 Kg de pancréas de veau, de boeuf ou de porc sont broyés dans
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8 litres d'éthanol"e,,95% auquel on avait ajouté 1 litre d'au et 175 gr d'acide oxalique (H 2 C 2 0 .2H20. On agite le mélange pendant 5 minutes, à lac température de la pièce et on enlève la matière glandulaire par centrifugation. On soumet aloi la matière glandulaire à une nouvelle extraction avec 7500 ml d'éthanol à 70% et on sépare les résidus glandulaires. On combine les deux extraits.
Purification des extraits:On ajoute de l'ammoniac aux extraits combinés pour av un pH de 8,5. On enlève par filtration le précipité ainsi formé. L'excès d'ions ammonium est enlevé par addition, sous agitation constante d'une échangeur
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de cations sulfoné 1>b't1J'T.?U de nombreuses liaisons transversales tel que le Dowex 50 Dowex" est une marque déposée), la quantité employée étant telle qu'on ait
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un pH final d'environ 2,8 - 3,4 . On enlève l'éëhangeur d'ions. Traitement par la chaleur Afin de détruire les enzymes protéolytiques qui inac vent l'insuline, l'extrait alcoolique est chauffé rapidement, endéans 10 -
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15 -aecondes, à 70 - 75 C et maintenu à cette température pendant 5-10 minutes.
L'extrait est alors rapidement refroidi à la température de la pièce.
Adsorptionet élution : A l'extrait alcoolique on ajoute de l'acide alginique qui a été lavé avec de l'acide chlorhydrique 0,2 N et de l'eau ensuite. L'acide algi- nique doit être humidifié avec de l'eau avant d'être ajouté à l'extrait .La quantité d'acide alginique ajoutée,correspond à 150 gr d'acide alginique sec ou
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30 gr par Kg de pandréas. L'adsorp-3.onsoas agitation continue, à la température de la pièce, se poursuit durant la nuit. On laisse reposer l'acide alginique et on le sépare sur un entonnoir infiltrant. Il est ensuite lavé avec de l'éthanol
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à 95% et de J..1'âthanol absolu, et aéré afin d'enlever 'éthanol.,.1!Tne au,trF1¯adfto,r:p tion est faite avec la même quantité d'acide alginique afin d'enlever l'insuline restant dans le filtrat.
Les adsorbats sont élués séparément chacun 'Rv.èc.', ún:.litre 8,':ai'dez i' .3o.qaze:. 3; Les EéaJr'soMtlaamhinas? aa.1,''c't.l,.na¯s- éc.p'ité ens3a.ti,r,st1'.t Ia.uekf:idiD est alors purifiée selo les procédés habituels. EXEMPLE 3 Extraction Un Kg de pancréas de boeuf est broyé dans 1,8 litre d'éthanol à 95% auxquels on avait ajouté 200 ml d'eau et 100 ml d'acide acétique glacial. L'ex- traction se fait à la température de la pièce, durant 4 heures, sous agittion
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ooimsa. Le résidu solide des glandes est séparé par centritation ou filtration après pressage dans de la gaze. Le résidu gland&ire solide est soumis à un seconde extraction pendant 1 heure dans 1 5 litre!3d'ithanol à 70% contenant 5 ml d'acide acétique glacial, après quoi le mélange est centrifugé et filtré.
Les fil trats sont combinés. Ba valeur du pH des filtratsçodmbinés est d'environ 4,0. Le v volume total s'élève à 3300 ml.
Traitement par la chaleur : Le traitement par la chaleur se fait conformément à l'exemple 2.
Purif ication des extraîts On ajoute de l'ammoniac aux extraits combinés pour
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avoir une valeur de.pE de 8.5. On .enlève par filtration le précipité ainsi formé. L'excès d'ions ammonium est enlevé par addition, sous agitation, :¯d'un échangeur de cations sulfoné pourvu de nombreuses liaisons transversales, tels que le
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Dowex 50 ("Dowex" eg une marque déposée la quantité employée étant telle qu'on obtienne un pH final'S'environ 2,8 - 3,4 On enlève 1' êchangeur d'ions.
Adsorption et élution 6Q gr déacide alginique ayant été lavé avec de l'acide
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ch1mhydrique 0,2 N et ensuite, plusieurs fois, avec de l'eau distillée, sont ajoutées, encore humides, à l'extrait et agités pendant 2 heures à la tempéra- ture de la pièce. L'acide yinique est recueilli sur un entonnoir filtrant et é- lué avec environ 600 ml d'aide chlorhydrique 0,3 N, en agitant pendant 20 minu- tes. L'insuline est précipitée en saturant l'éluat avec du chlorure de sodium.
EXEMPLE 4
Extraction : Un Kg de pancréas de porc est broyé dans 1,8 litre d'éthanol à
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95% auxquels on avait ajouté 0,2 litre d'eau et 75 gr d'acide citrique (C6Ha07H20).
Le mélange est agité pendant 5 heures à la température de la pièce et les re- sidus glandulaires sont enlevés par centrifugation. La matière glandulaire solide est alorssoumise à une seconde extraction avec 1,5 litre d'éthanol à 70 % et en- levé par centrifugation.
Les deux extraits sont combinés.
Traitement :Par la chaleur : Le traitement par la chaleur se fait conformément à l'exemple 1.
Purification des extraits On ajoute de l'ammoniac à l'extrait chauffé pour avoir une valeur de pH de 8,5. On enlève par filtration le précipité ainsi formé.
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On acidifie l'extrait avec .d l'acide sulfurique jusqu'à un pH 2,8-3, et on con- oentrer; pan distillation sous pression réduite, à 1/10 de son volume pour un trai- tement subséquent comme dans l'exemple 1.
REVENDICATIONS
1. Procédé pour la préparation de l'insuline, qui comprend l'extrac-
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tion de pancréas avec deyl5,,.cool acidifié, le chauffage de l'extrait alcoolique pour inotiver les enzymes protéolytiques y contenus et le traitement subséquent de l'extrait alcoolique pbur récupérer l'insuline.
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2. Procédé suivant la revendication 1, 4,,utlnomprend la purification de l'extraàtiaiooolique après chauffage par addition d'ammoniac jusqu'à un pH