BE544916A - - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   La présente invention est relative à un procédé d'obtention d'in- suline hormonale antidiabétique en partant d'un extrait alcoolique acide des glandes du pancréas des porcs, des bêtes à cornes et des chevaux par exemple, sans concentration préalable de l'extrait alcoolique par distilla- tion. 



   Suivant   l'invention,   ceci est rendu possible en traitant l'extrait alcoolique avec un échangeur de cations. Cet échangeur peut consister en un échangeur de cations, de poids moléculaire élevé, synthétique ou naturel, contenant des groupes carboxyliques, tels que   l'oxycellulose,   l'acide pec- tique, l'acide alginique ou l'Amberlite IRC 50 (fabriquée par Rohm & Haas, 
Delaware, U.S.A.)   L'extraction   est, de préférence, réalisée avec un acide en une quantité telle que la valeur finale du pH de l'extrait est d'au moins 3. 



   Suivant la présente invention, on obtient non seulement   l'avanta-   ge que la concentration de l'extrait alcoolique par évaporation peut être évitée mais également que la graisse constituant souillure reste dans   l'ex-   trait alcoolique. 



   L'alcool utilisé peut être du méthanol ou de l'éthanol en une concentration mentionnée dans la littérature. La valeur du pH est d'au moins 3, comme mentionné ci-avant, et est donc un peu plus faible que jus- qu'à présent; elle est obtenue en ajoutant à l'alcool une plus petite quan- tité d'un acide   inorganique   ou organique, tel que de l'acide   chlorhydrique   ou de l'acide acétique. Alors que, suivant les méthodes antérieures, on ajoutait 35 à 60 ml d'acide chlorhydrique concentré par kg de glande,, on ajoute suivant la présente invention 16 à 20 ml d'un tel acide. Lorsqu'on utilise de l'acide acétique, on en ajoute environ 40 ml par kg de glande. 



  L'extraction des glandes hachées congelées est réalisée à la température   am-   biante pendant 4 à 5 heures. 



   Une centrifugation et une   filtration   de la matière glandulaire sont effectuées plus facilement de sorte qu'on obtient un extrait clair, si l'alcool est acidifié avec un acide organique, tel que de l'acide acétique, de l'acide citrique ou de l'acide oxalique. 



   Avant le traitement avec l'échangeur de cations carboxylique, on ajoute, de préférence de   l'ammoniaque   à l'extrait jusqu'à une réaction neu- tre ou faiblement alcaline, afin de précipiter les impuretés protéiques et les sels neutres. Lorsqu'on utilise certains acides organiques, une quanti- té considérable de l'acide est éliminée comme sel d'ammonium insoluble dans de l'alcool à   70%.   



   Afin d'éliminer les ions d'ammonium restants et d'éviter la forma- tion de sels lorsqu'on règle la réaction acide nécessaire pour l'adsorption ou la concentration de l'insuline brute sur l'échangeur de cations   carboxy-     lique,l'extrait   alcoolique est traité, de préférence par phases, avec un échangeur de cations, à fortes liaisons transversales, sulfoné, du type Do- wex 50 (fabriqué par la Dow Chemical Company) en une quantité telle qu'une valeur de pH   d'environ   3 soit obtenue. 



   Par ces processus, la concentration sur l'échangeur d'ions carbo- xylique est facilitée de sorte qu'on obtient un beaucoup meilleur rendement d'insuline et qu'on peut utiliser une plus petite quantité d'échangeur   d'ions   carboxylique. 



   Une suspension aqueuse d'acide alginique en une quantité de 40 à 60 gr d'acide alginique par kg de pancréas s'est avérée être l'échangeur d'ions préférable. La concentration sur l'échangeur de cations est réalisée à la température ambiante pendant deux heures. Un enlèvement préalable de 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 la graisse et des protéine,.- par refroidissement de l'extrait jusqu'à -5  C et centrifugation facilite la concentration sur l'échangeur de cations. 



   L'échangeur d'ions carboxylique est recueilli sur un entonnoir- filtrant etl'insuline est   êluée   avec un acide minéral dilué, tel que de l'a- cide sulfurique ou de l'acide chlorhydrique.Si on utilise de l'acide algi- nique comme échangeur de cations, l'élution peut s'effectuer à la tempéra- ture ambiante en utilisant environ 100 ml d'acide chlorhydrique 0,3N pour 10 gr d'acide alginique L'insuline est précipitée de   l'éluat   par satura- tion avec du chlorure de sodium, et ensuite le précipité obtenu est soumis à une purification suivant les méthodes traditionnelles. 



    EXEMPLE   1 Extraction 
1 kg de pancréas de veau est broyé dans 2 litres d'alcool éthyli- que à 95%, contenant 200 ml d'eau et 12 ml d'acide chlorhydrique concentré (densité de   1,19).     L'extraction   est réalisée à la température ambiante pen- dant 4 heures avec agitation.Le résidu des glandes est séparé par centri- fugation, et le liquide est filtré et éclairci sur un entonnoir-filtrant après addition d'une petite quantité d'Hyflo-supercel (terre à diatomées). 



  La valeur du pH de la solution est de 4,8. 



   Une autre extraction du résidu des glandes est alors réalisée dans 1,5 litre d'alcool éthylique à 70%, contenant 4 ml d'acide chlorhydrique concentré, avec agitation, pendant 1 heure, et ensuite une centrifugation et une filtration sont effectuées. Les filtrats sont combinés. Le volume total est de 3300 ml et la valeur du pH est de 4,7, Concentration sur 1' échangeur d'ions et élution   L'échangeur     d'ions   utilisé est de l'acide alginique lavé avec de l'acide   chlorhydrique   0,2,N et de façon répétée avec de l'eau distillée, puis séché avec de   l'alcool.   On ajoute 60 gr de la poudre sèche en suspension dans de l'eau distillée, à l'extrait, avec agitation, pendant 2 heures,

   à la température   ambiante..   L'acide alginique est recueilli sur un entonnoir filtrant, après quoi une alution est effectuée avec une quantité totale de   600   ml d'acide chlorhydrique   0,3N,   avec agitation, pendant 20 minutes, à la température ambiante. 



   A l'éluat par acide chlorhydrique, on ajoute du chlorure de sodium jusqu'à saturation en vue de la précipitation de l'insuline. 



    EXEMPLE 2.   



  Extraction 
1 kg de pancréas de cheval est broyé dans 2 litres d'alcool éthyli- que à 95% contenant 200 ml d'eau et 40   ml   d'acide acétique glacial.   L'ex-   traction est réalisée à la température ambiante pendant 4 heures avec agita- tion. Le résidu des glandes est séparé par centrifugation ou filtration après pression contre un treillis La valeur du pH est d'environ 4,8. 



   Le résidu des glandes est réextrait pendant 1 heure dans 1,5 litre d'alcool éthylique à 70% contenant 5 ml d'acide acétique glacial, après quoi une centrifugation et une filtration sont effectuées. Les filtrats sont combinés. La valeur du pH des filtrats combinés est d'environ 4,8. L'ex- trait obtenu est refroidi jusqu'à -5 C et le précipité est séparé par filtra- tion grâce à une petite quantité   d'Hyflo-supercelo   Le volume total s'élève à environ 3300   ml.   

 <Desc/Clms Page number 3> 

 



   Concentration sur l'échangeur d'ions et   élution   
L'échangeur de cations utilisé est de l'acide alginique qui a été lavé avec de l'acide chlorhydrique   0,2N   et plusieurs fois avec de l'eau dis- tillée, puis ensuite séché avec de l'alcool, 60 gr de la poudre sèche sont mis en suspension dans de l'eau et ajoutés à l'extraite et une agitation est effectuée pendant 2 hueres àla température ambiante, L'acide alginique est recueilli sur un entonnoir filtrant. Une élution est réalisée avec en- viron 600 ml d'acide chlorhydrique 0,3N. avec agitation pendant 20 minutes. 



   L'insuline dans l'éluat est précipitée par addition de chlorure de sodium jusqu'à saturation. 



   EXEMPLE 3. 



   Extraction 
5 kg de pancréas de veau ou de bétail sont broyés dans 9 litres d'al- cool éthylique à 95% contenant 1 litre d'eau et 375 gr d'acide citrique ou   150 gr d'acide oxalique (H2C2O4 .2H20) dissous dans 1 litre: d'eau. Le mélange est agité pendant 5 heures à la température ambiante et est ensuite   passé à travers une toile. La matière glandulaire est réextraite avec 7500 ml d'alcool éthylique à   70%   et ensuite filtrée à travers une toile. Les deux extraits sont combinés. La valeur du pH de la solution est d'environ 3,4 Purification des extraits 
On ajoute une solution aqueuse d'ammoniaque aux extraits combinés jusqu'à une valeur de pH de 8,5, et le précipité formé est enlevé par fil- tration.

   L'excès d'ions- d'ammonium est enlevé par addition, pendant agita- tion, d'un échangeur de cations sulfuré ayant de fortes liaisons transver- sales, tel que du Dowex 50 sous la forme 'hydrogène, en une quantité donnant un pH final d'environ 3. 



  Concentrationsur l'échangeur d'ions et élution 
L'échangeur d'ions sulfoné est enlevé et lavé avec de   l'alcool   éthy- lique à 70% A l'extrait et à l'eau de lavage, on ajoute 75 gr d'acide al-, ginique sec lavé avec de l'eau et de l'acide chlorhydrique. La concentra- tion sur l'échangeur d'ions carboxylique est réalisée pendant agitation à la température ambiante durant la nuit. On laisse déposer l'acide alginique et on le sépare sur un entonnoir filtrant. Il est alors recueilli sur un filtre, lavé avec de l'alcool éthylique à 95% et de l'éther, et aéré pour enlever l'éther. Une autre concentration sur la même quantité d'acide algi- nique est effectuée. Les précipités d'acide alginique sont élués séparé- ment, chacun avec 1 litre d'acide chlorhydrique 0,3N avec agitation pendant! 2 à 3 heures à la température ambiante.

   Les   éluats   sont combinés et l'insu- line est précipitée avec du chlorure de sodium. 



   L'insuline est alors purifiée suivant les processus traditionnels. 



   REVENDICATIONS. 



   1. Un procédé   d'obtention   d'insuline à partir des glandes du pan- créas, -comprenant un traitement d'extraction des glandes avec un alcool aci- difié, le traitement de l'extrait alcoolique avec un échangeur de cations, et ensuite   l'élution   de l'insuline à partir de l'échangeur de   cations.  

Claims (1)

1. 2. Le procédé suivant la revendication 1, dans lequel on utilise un échangeur de cations, synthétique ou naturel, de poids moléculaire élevé, contenant des groupes carboxyliques, tel que l'oxycellulose, de l'acide <Desc/Clms Page number 4> pectique ou de l'acide alginique.

   3. Le procédé suivant les revendications 1 et 2, dans lequel l'ex- traction est réalisée avec un acide, tel que de l'acide chlorhydrique, en une quantité telle que la valeur finale du pH de l'extrait soit d'au moins 3.

   4. Le procédé suivant les revendications 1 à 3. dans lequel l'é- change d'ions est réalisé avec de l'acide alginique, et l'élution avec un acide minéral dilué, tel que de l'acide chlorhydrique ou de l'acide sulfu- rique 5. Le procédé suivant les revendications 1 ou 2, dans lequel les glandes sont extraites avec un alcool acidifié avec un acide organique.

   6. Le procédé suivant la revendication 5, dans lequel l'extraction est réalisée avec un alcool acidifié avec de l'acide acétique, de l'acide oxalique ou de l'acide citrique.

   7o Le procédé suivant la revendication 6, dans lequel de l'ammonia- que est ajoutée à l'extrait jusqu'à une réaction neutre ou faiblement alca- line pour précipiter les sels neutres et les impuretés protéiques.

   8. Le procédé suivant la revendication 7, qui comprend l'addition, de préférence par phases, d'un échangeur de cations sulfoné, à fortes liai- sons transversales, du type Dowex 50, à l'extrait, après le traitement avec l'ammoniaque, jusqu'à obtention d'une valeur du pH d'au moins 3, et ensuite la concentration de l'insuline sur l'échangeur d'ions carboxyliqueo 9. Produit obtenu grâce au procédé suivant l'une quelconque des re- vendications précédentes