BE568907A - - Google Patents

Description

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   La présente invention concerne une solution aqueuse de chymotrypsine qui est caractérisée en ce qu'elle est essentiellement stable sous les conditions ordinaires d'utilisation du commerce. 



   On sait depuis longtemps que la chymotrypsine tend à être instable et à être progressivement inactivée lorsqu'elle est dissoute en solutions aqueu- ses. Cette inactivation se; produit très rapidement sous réfrigération, de même qu'à la température ambiante, de sorte qu'il n'a pas été possible-jusqu'à présent de fabriquer et vendre la chymotrylpsine sous la forme d'une solution aqueuse. 



  Cependant, ces solutions aqueuses présentent des avantages très nets à la fois pour l'application locale et l'application par voie parentérale, mais jusqu'à présent il était nécessaire de préparer ces solutions selon besoin à partir de chymotrypsine cristalline ou de chymotrypsine lyophilisée. 



   L'invention crée une nouvelle solution aqueuse essentiellement sta- bilisée de chymotrypsine qui est satisfaisante pour la fabrication industrielle et la venteo 
On avait indiqué antérieurement que les ions calcium en solutions aqueuses peuvent tendre à ralentir quelque peu l'inactivation de certaines en- zymeso Cependant, aucune proposition de cette nature n'a été faite en ce qui concerne la chymotrypsine. D'une façon générale, l'utilisation de ions de calcium en solutions aqueuses ne s'est pas montrée d'une -valeur particulière pour des préparations industrielles d'enzymes.

   Relativement aux solutions aqueuses de chymo- trypsine, on a déterminé selon l'invention que de nombreux sels de calcium ordi- naires solubles dans l'eau n'améliorent pas notablement la stabilité de la chymo- trypsineo L'invention n'est donc pas basée sur l'utilisation de ions de calcium en eux-mêmes, mais plutôt sur l'emploi d'un sel de calcium particulier, d'acétate de calcium, comme agent stabilisant. On n'avait pas reconnu, jusqu'à la présente invention, l'action stabilisatrice supérieure inattendue de l'acétate de calcium comparativement à d'autres sels de calcium qui rend possible de préparer des so- lutions aqueuses essentiellement stabilisées de chymotrypsine. 



   Dans la mise en oeuvre de l'invention, on préfère utiliser une matière première de chymotrypsine sensiblement pure, c'est-à-dire de la chymotrypsine cris- talline ou amorphe ayant plus de 95% de pureté. La chymotrypsine cristalline peut être préparée comme décrit par Northrop dans l'ouvrage Crystalline Enzymes (2ème Edition   1948).   La principale chymotrypsine décrite dans cette publication est habituellement celle désignée sous le nom de forme alpha de chymotrypsine, mais cette publication décrit aussi la préparation de   chymotrypsines   bêta et gammao Aux fins de l'invention, on préfère la forme alpha de chymotrypsine. 



   La concentration de la chymotrypsine dans la solution aqueuse n'est pas particulièrement critique, mais, pour la plupart des applications rentrant dans le cadre de l'invention, elle rentre dans une gamme de 1 à 10 milligrammes de chymotrypsine par cm3 d'eauo Les formules préférées contiennent de 4 à 6 mg cm3. 



  L'activité protéolytique de la chymotrypsine peut être mesurée par le procédé au substrat d'hémoglobine et, lorsqu'elle est ainsi mesurée, sa moyenne est d'au moins 1000 unités d'activité par milligrammeo Des normes de puissance ont été établies par ce procédé en "unités Armour" (u.A.). 



   Comme précédemment indiqué, l'invention est basée en premier lieu sur l'utilisation d'acétate de calcium comme agent stabiliseur. Cependant, il n'est pas possible d'expliquer le mécanisme par lequel l'acétate de calcium produit la stabilisation désirée. En outre, on ne peut pas expliquer pourquoi l'acétate de calcium est supérieur aux autres sels de calcium. Il semble que cela soit dû à la présence'd'ions d'acétate en combinaison avec les ions de calcium. L'action des ions d'acétate favorisant la stabilisation de la chymotrypsine est complètement inattendueo Selon l'invention, la concentration d'acétate de calcium dans la so- lution aqueuse doit de préférence rentrer dans la gamme de 0,05 à le'2 % en poids. 

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  La gamme de concentration préférée pour une préparation parentérale est de 0,15 à   0, 25   %. 



   Dans la préparation de la solution aqueuse, il est désirable   d'utili-   ser de l'eau distillée stérile, parce que pour l'usage pharmaceutique les prépara- tions finales doivent être stériles et doivent être exemptes de tous contaminants toxiques. Pour obtenir les avantages de l'invention, le pH des solutions doit être sur le côté acide. D'une façon générale, une gamme de pH entre 3,5 à 6,0 convient, mais pour une préparation parentérale un pH dans la gamme de   3,7   à 4,3 est préférable. Divers acides non toxiques, tels que l'acide chlorhydrique, l'acide acétique et analogues, peuvent être utilisés pour effectuer le réglage nécessaire du pH.

   Cependant, on a trouvé que l'acide acétique convient   particu-   lièrement bien parce que, non seulement il règle le pH au niveau désiré, mais il fournit aussi des ions d'acétate supplémentaires. Il semble que l'acide acétique et l'acétate de calcium coopèrent pour augmenter l'action de stabili- sation désirée. 



   Les solutions de chymotrypsine peuvent aussi contenir avantageusement un agent préservatif tel que merthiolate ou glycérine. Cependant, l'utilisation d'un préservatif de ce genre est effectuée simplement selon la pratique bien connue pour les préparations pharmaceutiques et ne fait pas partie de l'invention. 



   L'invention est, en outre, illustrée par les exemples particuliers qui suivent : 
Exemple 1 
Des solutions utiles aux pharmacies de chymotrypsine furent préparées à partir de quatre lots différents de chymotrypsine, chaque lot étant une chy- motrypsine alpha sensiblement pure ayant une puissance d'environ 1100 u.A. cm3. 



  Après la préparation des solutions suivant la formule 1 exposée ci-dessous les solutions furent filtrées stériles et mises dans des flacons de 5 cm3. 



   Formule 1 
 EMI2.1 
 
<tb> chymotrypsine <SEP> (forme <SEP> alpha) <SEP> 5 <SEP> mg/cm3 <SEP> (5500 <SEP> u.A. <SEP> cm3)
<tb> 
<tb> 
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,9 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> acétate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> (comme
<tb> 
<tb> 
<tb> hydrate, <SEP> 2H20) <SEP> 0,22 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> merthiolate <SEP> 0,01 <SEP> %
<tb> 
<tb> 
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> qa <SEP> S.
<tb> 
<tb> pH <SEP> (réglé <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> acétique) <SEP> 4,0
<tb> 
 
Les flacons de solution de   chymotrypsine   préparée comme il vient d'être décrit furent soumis à des essais de durée sur tablettes à la fois à la température ambiante et sous réfrigérationo Les résultats de ces essais sont indiqués au tableau A qui suit :

   

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 Tableau A 
 EMI3.1 
 
<tb> Puissance <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après <SEP> Après
<tb> Lot <SEP> N  <SEP> initiale <SEP> 3 <SEP> m. <SEP> t.a. <SEP> (*) <SEP> 6 <SEP> m. <SEP> t.a. <SEP> 3 <SEP> ma <SEP> réf.(**) <SEP> 6 <SEP> m. <SEP> réf.
<tb> 
<tb> 
<tb> a <SEP> 5900 <SEP> 6030 <SEP> 5650 <SEP> 6300 <SEP> 6160
<tb> b <SEP> 6450 <SEP> 5925 <SEP> 5650 <SEP> 6470 <SEP> 6300
<tb> 
<tb> 
<tb> c <SEP> 6250 <SEP> 5280 <SEP> 5600 <SEP> 5620 <SEP> 6160
<tb> 
<tb> d <SEP> 5960 <SEP> 5200 <SEP> 5370 <SEP> 5500 <SEP> 5600
<tb> 
<tb> 
<tb> moyenne <SEP> 6.140 <SEP> 50608 <SEP> 50550 <SEP> 5.972 <SEP> 60055
<tb> 
 (*) mois à la température ambiante (**) mois sous réfrigération. 



     EXEMPLE   2 
Des essais furent de nouveau effectués comme décrit à l'exemple l, sauf que la solution fut préparée suivant la formule 2 indiquée ci-dessous : 
Formule 2 
 EMI3.2 
 
<tb> chymotrypsine <SEP> (forme <SEP> alpha) <SEP> 5 <SEP> mg/cm3 <SEP> (5500 <SEP> u,A. <SEP> cm3)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> acétate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> (comme
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> hydrate, <SEP> 2H20) <SEP> 1,0 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> glycérine <SEP> 1,3 <SEP> %
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> merthiolate <SEP> 0,01 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q.

   <SEP> So
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> pH <SEP> (réglé <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> acétique) <SEP> 5,0
<tb> 
 
De ces essais, un seul lot de chymotrypsine alpha sensiblement pure fut utilisée Les résultats obtenus par un essai de durée sur tablettes s'étendant sur quatre mois avec des échantillons du produit à la fois à la température   ambian-   te et sous réfrigération sont indiqués au tableau B : 
TABLEAU B 
 EMI3.3 
 
<tb> Puissance <SEP> Après <SEP> Après
<tb> initiale <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> toao <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> réf.
<tb> 
<tb> 



  5200 <SEP> 5030 <SEP> 5910
<tb> 
 
EXEMPLE 3 
Un nouvel essai fut effectué comme à l'exemple 1, sauf que l'on uti- lisa un pH de 4,5. La préparation   résultante     faut.maintenue   sous réfrigération pendant neuf mois et, à la fin de cette période, on constata qu'il n'y avait pas de perte de   pui @@@nce   pouvant être déterminée. 



   EXEMPLE 4 
Dans un autre essai, effectué comme décrit à l'exemple 1, un pH de 4,0 fut utilisé et la préparation résultante fut soumise à l'essai sur tablettes à la fois à la température ambiante et sous,réfrigérationo Au bout de sept mois et demi, il n'y avait pas de diminution de puissance pouvant être mesurée tant pour les échantillons placés à la température ambiante que pour ceux placés sous réfrigération. 



   Bien que l'on ait donné dans ce qui précède certains exemples parti- culiers de l'invention, il est évident que diverses modifications peuvent y être apportées et que d'autres réalisations peuvent être faites sans sortir de son cadre.

Claims (1)

1. REVENDICATIONS.

   1 - Solution aqueuse de chymotrypsine essentiellement stabilisée, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,05 à 1,2 % en poids d'acétate de calcium, cette solution étant à un pH entre 3,5 et 6,0 et ayant une concentration de chymotrypsine rentrant dans la gamme de 1 à 10 mg cm3.

   2 - Solution aqueuse suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la chymotrypsine est la forme alpha de chymotrypsineo 3 - Solution aqueuse de chymotrypsine essentiellement stabilisée, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,15 à 0,25 % en poids d'acétate de calcium et de 4 à 6 mg de chymotrypsine alpha par cm3 d'eau, cette solution étant à un pH de 3,5 à 6,0.

   4 - Solution aqueuse de chymotrypsine essentiellement stabilisée, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,05 à 1,2 % en poids d'acétate de calcium et de 4 à 6 mg de chymotrypsine alpha par cm3 d'eau, le pH de cette solution étant réglé à la gamme de 3,5 à 6,0 avec de l'acide acétique.

   5 - Solution aqueuse de chymotrypsine essentiellement stabilisée, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,15 à 0,25 % en poids d'acétate de cal- cium, de 4-à 6 mg/cm3 de chymotrypsine alpha et suffisamment d'acide acétique pour porter le pH de cette solution dans la gamme de 3,7 à 4,3.