CH636888A5 - Heparines purifiees et leur preparation. - Google Patents
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Description
La présente invention se rapporte à une héparine de qualité injectable sous la forme d'un sel métallique, le métal étant au moins en partie le calcium, et concerne également un procédé pour obtenir ce sel d'héparine dont les propriétés sont améliorées par rapport aux sels d'héparine connus antérieurement.
On utilise couramment pour la préparation de solutions injecta-5 bles d'héparine des sels de sodium de cette dernière (qu'on appelle également héparinates de sodium). Plus récemment, afin d'éviter un certain nombre de réactions vasculaires gênantes dues aux ions sodium, en particulier dans la région de l'injection, on a commencé à utiliser des héparinates mixtes de calcium/sodium ou de calcium/ma-îo gnésium et, avec avantage, des héparinates de calcium.
Les héparinates mixtes, c'est-à-dire les héparinates de calcium/-sodium ou de calcium/magnésium, et les héparinates exempts de sodium, en particulier les héparinates de calcium, sont préparés avantageusement à partir d'un héparinate initial, par exemple l'hé-15 parinate de sodium, par le procédé décrit dans le brevet britannique N° 1471482. Ce procédé consiste à mettre en contact le sel initial simple d'héparine, dans un milieu aqueux, avec un sel du métal qu'on désire substituer, en partie au moins, au métal du sel initial, formant ainsi un sel intermédiaire mixte d'héparine qui contient le 20 métal désiré et qu'on sépare des ions métalliques libres contenus dans le milieu. Si l'on désire obtenir un sel d'héparine plus riche en métal de substitution, on peut à nouveau mettre le sel intermédiaire d'héparine en contact, dans un milieu aqueux, avec un sel du métal voulu. On peut régler, si on le désire, les conditions opératoires de 25 manière à obtenir un héparinate simple du métal de remplacement, exempt du métal contenu dans le sel initial d'héparine.
On a constaté dans certaines occasions que, lorsqu'on conservait des solutions de sel d'héparine contenant des ions calcium, il apparaissait des dépôts ou des précipités, ou une simple turbidité. Natu-30 Tellement, cette tendance à la formation de précipités ou à l'apparition d'un trouble, qui semble d'autant plus forte que les solutions sont plus concentrées en héparine, constitue un inconvénient particulier dans le cas de solutions injectables d'héparine destinées à l'usage thérapeutique et préparées industriellement, notamment sous 35 forme de doses déterminées, par exemple sous forme d'ampoules ou de seringues à utiliser une fois, et qui par conséquent doivent rester parfaitement claires même après plusieurs mois de conservation. La formation de petits dépôts ou même d'une simple turbidité légère rend évidemment les solutions inappropriées à l'administration thé-
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rapeutique.
Ces inconvénients sont particulièrement graves si l'on tient compte du fait que des particules ou des cristaux cessent d'être visibles lorsque leur dimension est inférieure à environ 50 ji, d'une part, 4J et que les vaisseaux capillaires des humains ont des diamètres inférieurs qui peuvent atteindre 1 à 3 fi d'autre part. En outre, la présence dans des solutions injectables de telles particules ou de tels cristaux, même invisibles à l'œil nu, peut être particulièrement nocive lorsque le principe actif injecté est l'héparine, en raison des 50 propriétés anticoagulantes de cette dernière. En effet, les risques d'hémorragie provoquée par ces particules solides injectées au patient peuvent être aggravées par l'activité par ailleurs recherchée de l'héparine.
Le fait qu'une solution d'héparine reste limpide ne suffit même ss pas à prouver qu'il ne s'est pas formé de précipité. En effet, il peut arriver, en particulier dans les cas où la précipitation est très lente, que les cristaux minuscules (en particulier aux dimensions invisibles à l'œil nu, inférieures à 50 n) aient tendance à s'agglomérer en un très petit nombre de cristaux — ou même en un seul cristal relative-60 ment gros — qui, naturellement, n'altèrent pas la limpidité générale de la solution. L'injection d'une telle solution peut être au moins aussi néfaste que dans le cas précédent.
Tous les risques mentionnés ci-dessus sont d'autant plus fréquents que la concentration de l'héparine dans les solutions pharma-65 ceutiques courantes est plus forte, bien que le risque puisse varier selon le type d'injection (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, etc.). Or, on souhaite souvent utiliser l'héparine à des concentrations aussi fortes que possible, de sorte que l'éventualité d'une
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précipitation ou de la présence, en nombre croissant, de particules invisibles à l'œil nu risque de poser des problèmes très sérieux.
On a tenté de remédier à ces difficultés en soumettant les solutions d'héparine fraîches, en particulier les solutions de sels d'héparine et de métaux acceptables pour l'usage pharmaceutique dont, en partie au moins, de calcium, à une conservation relativement longue au terme de laquelle, avant de mettre les solutions dans le commerce, par exemple en ampoules ou en seringues à utiliser une fois, on filtre les précipités qui se sont éventuellement formés.
Il est clair que plus la durée de conservation préalable est longue et plus la production des médicaments est coûteuse.
La présente invention vise à remédier essentiellement à toutes les difficultés décrites ci-dessus; ainsi donc, l'invention a en particulier pour objet un sel métallique de l'héparine de qualité injectable dont le métal consiste au moins en partie en calcium, utilisable pour la préparation de solutions et en particulier de solutions injectables, à longue durée de conservation. Elle comprend également un procédé pour préparer ces héparines, procédé qui permet d'éviter les conservations préalables dont on a parlé ci-dessus.
En fait, on a constaté que la plupart des difficultés décrites ci-dessus pouvaient être attribuées à la présence, dans les solutions d'héparine de qualité injectable, de sels minéraux de nature variée en quantités variables (jusqu'à 2,5% en poids) selon l'origine du lot de fabrication et les procédés utilisés pour l'extraction de l'héparine à partir des sources naturelles et/ou pour décolorer (ou blanchir) les héparines naturelles obtenues, afin qu'elles répondent aux exigences de coloration habituellement requises des héparines de qualité injectable, et cela bien que ces teneurs en sels minéraux restent dans des limites de tolérance fixées par les prescriptions légales actuelles, par exemple les normes du Codex pharmaceutique français.
La plus grande partie des sels résiduels consiste en chlorates et sulfates qui peuvent représenter respectivement jusqu'à 1%. On trouve d'autres sels, en particulier des carbonates, des sulfites, en plus faibles proportions.
La transformation des sels de sodium de l'héparine en sels contenant du calcium, par exemple selon le procédé dont il a été question plus haut, devrait conduire à une diminution de la proportion de ces sels, compte tenu de la faible solubilité des sulfates, sulfites et carbonates de calcium. En fait, ces derniers devraient pouvoir être séparés à l'état de substances solides de la solution claire des sels calciques de l'héparine.
Or, on a constaté avec surprise qu'à la fin de la transformation de l'héparinate de sodium en héparinate de calcium, en particulier lorsqu'on a opéré selon le procédé mentionné plus haut, la teneur en sels minéraux résiduels dont il est question ici n'est que peu modifiée comparativement à celle de l'héparinate de sodium initial.
Mais on a fait une constatation encore plus surprenante: les sels métalliques de l'héparine dont le métal est constitué, en partie au moins, de calcium peuvent être mis sous forme de solutions aqueuses limpides même lorsqu'ils contiennent encore des quantités mineures, mais non négligeables, d'ions oxaliques. Il s'agit là d'un phénomène tout à fait inattendu car les Oxalates de métaux tels que le calcium sont, comme on le sait, très insolubles dans l'eau. On ne connaît pas encore exactement la raison de ce comportement particulier. Néanmoins, on a pu vérifier qu'il se produisait un changement dans les propriétés normales de solubilité des Oxalates de calcium, en particulier en présence d'un excès de chlorure de calcium. Ainsi, on a constaté que des héparines ou des héparinates injectables du commerce pouvaient contenir des sels résiduels en proportion allant de 1,0 à 2,5% en poids.
De nombreux essais sur de tels échantillons ont indiqué que leur contenu en Oxalates est uniformément supérieur à 90 ppm. Dans un cas, le contenu en Oxalates a été trouvé comme étant de 40 ppm mais ce résultat, plus tard, s'est révélé erroné. En général, dans des héparines injectables disponibles dans le commerce, le contenu en Oxalates est compris entre 90 et 300 ppm, et même quelquefois supérieur.
Il a été trouvé que l'élimination des sels minéraux, et en particulier des traces d'oxalates contenus dans les héparines, conduisait à la disparition des troubles et des dépôts susceptibles de se produire dans les solutions d'héparinate de calcium après préparation de ces dernières. On a en outre constaté que, lors d'une conservation de longue durée, il ne se produisait pas de croissance appréciable de particules invisibles à l'œil nu (mais détectables à l'aide d'appareillages optiques classiques tels que des compteurs de particules capables de détecter des particules à des dimensions de 2 à 50 |i) à condition que la teneur en ions Oxalates de ces solutions ait été suffisamment réduite.
Les solutions d'héparinate de calcium ou d'héparinates mixtes (contenant du calcium) qui ont été purifiées par le procédé selon l'invention tel que décrit ci-après restent claires même après une conservation de plusieurs mois. Il n'apparaît ni dépôt ni trouble. Leur teneur en particules invisibles à l'œil nu n'augmente pas lors d'une longue durée de conservation, de sorte que les risques d'agglomération sous forme de gros cristaux, dont on a parlé plus haut, sont également réduits.
Les héparines ou sels d'héparine selon l'invention ont donc une teneur en sels résiduels, en particulier en Oxalates, suffisamment basse pour permettre la préparation de solutions injectables, plus spécialement de solutions d'héparinate de calcium, aux concentrations observées normalement pour ce type d'administration, qui restent parfaitement claires, même après plusieurs mois de conservation (au moins six mois).
Les sels d'héparine selon l'invention contiennent moins de 70, généralement moins de 30 et de préférence moins de 20 ppm d'ions Oxalates. Ils peuvent être mis sous forme de solutions, en particulier de solutions injectables qui restent parfaitement claires, avec des teneurs éventuelles en particules invisibles à l'œil nu qui restent pratiquement constantes lors d'une conservation prolongée, qui peut durer jusqu'à deux ans, et même trois à cinq ans. Ce stockage se fait à température ambiante, par exemple à 20-25° C.
De préférence, ces héparines et sels d'héparine contiennent moins de 0,5 et de préférence moins de 0,3% de sels résiduels.
On notera que l'expression sels n'est pas limitée aux sels d'acides minéraux tels que l'acide sulfurique ou l'acide chlorhydrique, mais désigne également les sels d'acide tels que les acides oxaliques ou carboniques, ou même les sels d'acides organiques à bas poids moléculaire comme l'acide acétique. Tous ces sels peuvent être considérés comme n'étant pas des sels d'héparine.
On a constaté que ces sels d'héparine pouvaient être utilisés pour la préparation de solutions injectables qui pouvaient elles-mêmes être conservées en magasin ou en rayon pendant des durées prolongées, même dans le cas où le métal du sel d'héparine consiste, en partie au moins, en un métal qui, comme le calcium, forme des Oxalates insolubles dans l'eau.
L'invention concerne donc également un procédé pour préparer les héparines purifiées selon l'invention en partant de produits du commerce, y compris des produits fortement décolorés tels qu'obtenus par les techniques classiques de décoloration, en particulier les techniques par oxydation qui, comme on a pu le constater, sont susceptibles d'accroître la teneur en Oxalates des héparines.
Le procédé selon l'invention, applicable à une préparation d'héparine de départ à purifier ou, plus généralement, à un mélange d'héparine et d'autres sels, en particulier des sels minéraux, met en jeu une précipitation sélective exploitant la différence de solubilité entre les sels d'héparine et les sels résiduels; il est défini à la revendication 6.
Il est même prévu d'obtenir de l'héparine ne contenant que des traces d'ions Oxalates détectés par les techniques disponibles à l'heure actuelle.
L'héparine utilisée est sous forme de sel métallique, par exemple de sodium, de lithium ou de potassium, dont les Oxalates sont solu-bles. On peut substituer au moins en partie un autre métal, en particulier un métal tel que le calcium, dont l'oxalate est insoluble dans l'eau, ou éventuellement le magnésium, au métal de l'héparine purifiée obtenue finalement et pratiquement débarrassée de ses Oxalates.
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La concentration de la solution d'héparine mise en œuvre pour ce traitement peut varier dans des limites étendues. Pour des raisons pratiques, il est préférable que la solution ne soit pas trop diluée, car le volume d'éthanol à utiliser est proportionnel à celui de la solution soumise au traitement. Pour une quantité égale d'héparine, plus la solution est diluée et plus forte est la quantité d'éthanol nécessaire. Par contre, la concentration des solutions d'héparine ne doit pas dépasser un certain niveau, car la viscosité augmente rapidement et l'héparine précipitée de ces solutions pourrait éventuellement entraîner une proportion importante des impuretés initiales qu'on désire précisément éliminer.
Compte tenu de ces conditions, le procédé est avantageusement mis en œuvre sur des solutions dont la concentration est de l'ordre de grandeur de celle des solutions habituellement utilisées pour les injections, c'est-à-dire qu'elles contiennent environ 40 à 250 g/1 d'héparinate de sodium (correspondant à environ 5000 à 30 000 Ul/ml).
Le pH de la solution a une influence sur les résultats de la purification. Avec une solution acide, les sels, en particulier les Oxalates, ont tendance à rester en solution et par conséquent la séparation est améliorée.
Cependant, l'héparine peut être affectée par les acides forts. On travaille avec une solution dont le pH est supérieur à 3,5, et de préférence compris entre 5 et 7.
A la solution d'héparine ainsi obtenue, on ajoute de l'éthanol en quantité suffisante pour que pratiquement toute l'héparine précipite, cependant que les autres sels restent dans la solution hydroalcoolique. Pour 1 volume de solution d'héparine, on utilise de préférence de 0,5 à 1,5 volume d'éthanol. On utilise de préférence un alcool neutre pratiquement pur à 99-100° GL.
Le précipité d'héparine séparé du liquide surnageant est malaxé et lavé jusqu'à élimination de toutes les traces résiduelles de solution. Le lavage est de préférence effectué avec de l'alcool absolu. L'héparine est ensuite filtrée et séchée.
Si ces premières séparations étaient incomplètes, on pourrait renouveler le traitement du précipité d'héparine jusqu'à obtention de sels d'héparine répondant aux exigences spécifiées ci-dessus.
La plus grande partie de l'héparine initiale est récupérée dans le cours de la précipitation; le reste se trouve dans la solution hydroalcoolique. Cette dernière peut alors être traitée par des compléments d'alcool qui provoquent une nouvelle précipitation d'héparine.
Le procédé de purification selon l'invention est applicable dans tous les cas pour l'élimination des Oxalates libres contenus dans les héparines du commerce, quelle que soit leur source.
Cependant, bien que ce procédé permette en toute certitude d'éliminer des quantités quelconques mesurables d'oxalates libres, donnant des héparines qui contiennent moins de 30 et même moins de 20 ppm d'oxalates, on a constaté que, lorsqu'on l'appliquait à un sel d'héparine d'un métal tel que le sodium, dont l'oxalate est soluble dans l'eau, il arrivait dans quelques cas que lors de la conversion, en partie au moins, de ce sel d'héparine en un sel de métal tel que le calcium, dont l'oxalate est insoluble, le produit obtenu finalement contenait des quantités importantes d'oxalates libres.
Bien qu'actuellement on ne dispose d'aucune explication scientifique de ce phénomène, on suppose qu'une partie des Oxalates contenus dans les héparines du commerce, provenant de certaines sources, se comportent comme s'ils étaient absorbés ou fixés sur les molécules d'héparine qui fonctionnent apparemment comme échangeurs d'anions. Dans un tel cas, les sels d'héparine obtenus finalement peuvent à nouveau être impropres à la préparation de solutions injectables pouvant être conservées pendant des durées prolongées.
Cependant, on a en outre trouvé qu'on pouvait remédier à cette difficulté conformément à un procédé perfectionné selon l'invention, procédé qui se caractérise en ce que l'on met l'agent précipitant non ionique de l'héparine en contact, dans les opérations de purification décrites ci-dessus, avec une solution aqueuse initiale de l'héparine à purifier (ou du mélange héparine/sels) contenant des sels hydrosolu-bles autres que les Oxalates à une concentration suffisante pour favoriser une séparation des Oxalates, y compris les Oxalates apparemment fixés ou absorbés à l'origine, qui sont alors libérés et restent dans la solution aqueuse au moment de la précipitation des sels d'héparine.
Ainsi donc, certains des autres sels présents dans la solution d'héparine à purifier peuvent, avec un réglage approprié de leur concentration dans la solution lorsque c'est nécessaire, participer à l'extraction plus complète des ions Oxalates.
Par conséquent, dans les modes de réalisation préférés du procédé selon l'invention, il sera habituellement nécessaire d'ajuster au préalable la concentration de ces autres sels solubles dans l'eau dans la solution aqueuse initiale d'héparine avant de mettre cette dernière en contact avec l'agent précipitant non ionique spécifié.
En effet, on a constaté qu'à une concentration suffisante en particulier des sels d'anions divalents et de préférence également d'anions monovalents, ces sels semblaient provoquer le déplacement des Oxalates éventuellement absorbés sur l'héparine ou fixés à l'héparine.
En cas de nécessité, il y aurait alors avantage à répéter les opérations de précipitation en remettant en contact une solution de l'héparine recueillie et de sels solubles dans l'eau autres que les Oxalates, à une concentration réglée comme décrit ci-dessus, jusqu'à ce que la concentration des Oxalates totaux dans l'héparine finale soit inférieure à 30 et de préférence inférieure à 20 ppm.
De préférence, le ou les métaux des sels d'anions divalents autres que les Oxalates, qui sont contenus dans la solution initiale d'héparine ou éventuellement ajoutés à la solution initiale d'héparine, sont choisis parmi les sels contenant des métaux dont les Oxalates sont solubles dans l'eau. Les carbonates, et en particulier le carbonate de sodium, se sont révélés particulièrement efficaces dans le procédé selon l'invention.
De préférence également, l'héparine contenue dans la solution est à l'état de sel d'héparine du même métal que les autres sels. On évite ainsi toute possibilité d'échange entre les métaux de ces sels et le métal du sel d'héparine, et on conserve une possibilité étroite de contrôle sur la teneur en métaux des sels d'héparine purifiés.
La concentration de ces autres sels dans la solution qui doit être mise en contact avec l'agent précipitant non ionique, tel qu'un alcool, sera avantageusement réglée à un niveau de 0,3 à 2,5 et par exemple d'environ 0,5% en poids de l'héparine.
Avantageusement également, la solution initiale contient également des sels d'anions monovalents d'au moins un métal dont l'oxalate est soluble dans l'eau. Le chlorure de sodium constitue un exemple de ces sels. Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, la concentration de ce sel monovalent est — ou est réglée — à une valeur de 10 à 70 et par exemple d'environ 25 g par litre de solution.
Il est avantageux, quoique non indispensable, que le pH de la solution mise en contact avec l'agent précipitant non ionique soit situé entre 7 et 10, par exemple de l'ordre de 8,5. Ce pH est en réalité celui qui s'établit spontanément lorsque le sel d'anion divalent qu'on utilise est le carbonate de sodium.
Les sels d'anions divalents et/ou monovalents peuvent ensuite être éliminés facilement dans le stade final du procédé selon l'invention, par exemple dans un stade de contact final entre la solution d'héparine et l'agent non ionique. Le pH sera alors réglé avantageusement en milieu légèrement acide, suffisant pour décomposer les carbonates, et en particulier à un pH de 3 à 7, à l'aide d'acide chlor-hydrique. Au moment où le sel d'héparine final est précipité, les ions chlorure restent dans la solution aqueuse.
On obtient ainsi des compositions d'héparine, en particulier des sels d'héparine, qui sont pratiquement exempts d'oxalates et qui conviennent:
— soit directement à la préparation de compositions pharmaceutiques, en particulier de solutions injectables ou perfusables à longue durée de conservation, même lorsque les cations métalliques de ces sels d'héparine consistent, en partie au moins, en métaux dont les Oxalates sont très insolubles, comme le calcium;
— soit à l'utilisation comme sels d'héparine de départ à partir desquels on peut remplacer en partie avec avantage, quoique non néces5
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sairement, les cations métalliques contenus en exploitant le procédé du brevet britannique N° 1471482 précité, formant ainsi d'autres sels d'héparine pratiquement exempts d'oxalates qui sont ensuite mis sous forme de compositions pharmaceutiques à longue durée de conservation.
L'invention concerne donc par exemple, parmi les compositions d'héparine exemptes d'oxalates, les sels métalliques de l'héparine, à savoir soit les sels simples d'héparine tels que les sels de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium, soit les sels mélangés contenant au moins deux des cations métalliques mentionnés ci-dessus dans des proportions relatives quelconques, tous ces sels d'héparine étant pratiquement exempts d'oxalates, leur teneur en Oxalates étant inférieure à un seuil de 70 ppm dans un certain nombre de cas et pouvant être inférieure à 30 et de préférence inférieure à 20 ppm. Ce sont ces produits qu'on désigne dans le présent brevet sous le nom d'héparines exemptes d'oxalates. Parmi les sels mélangés, on citera la classe préférée consistant en ceux qui contiennent du sodium et du calcium.
L'invention comprend également des préparations pharmaceutiques dans lesquelles l'héparine exempte d'oxalates est associée à un véhicule pharmaceutique, et plus particulièrement les préparations d'héparine exemptes d'oxalates, de préférence incolores, ayant une activité d'au moins 120 et de préférence de plus de 150 unités internationales (UI) par milligramme, exemptes de substances pyrogènes, ainsi que des solutions concentrées d'héparine utilisable en thérapeutique pour le contrôle de la coagulation sanguine, en particulier les solutions exemptes d'oxalates, de préférence incolores, convenant pour l'injection sous-cutanée et contenant de 5000 à 35 000 Ul/ml d'héparine, de préférence de 20 000 à 30 000, par exemple 25 000 Ul/ml, ou les solutions exemptes d'oxalates convenant pour l'injection intreveineuse et contenant de 1000 à 10000 et par exemple 5000 Ul/ml d'héparine, et les préparations analogues.
L'héparine de ces préparations est sous forme de sel métallique acceptable pour l'usage pharmaceutique. Les préparations pharmaceutiques peuvent être avantageusement présentées sous forme de seringues à utiliser une fois, prêtes à l'emploi au moment approprié.
On peut administrer au patient une dose efficace de l'héparine exempte d'oxalates selon l'invention, par exemple 13 000 à 50000 UI, par voie sous-cutanée, deux fois par jour, selon l'état trombolique du patient, ou 20 000 à 50 000 UI/24 h par voie intraveineuse, en répartition régulière sur la journée, avantageusement par des perfusions ajustées, ou encore 5000 à 10000 UI, trois fois par semaine, par voie intramusculaire.
L'héparine purifiée selon l'invention peut être utilisée directement pour la préparation, par exemple, de solutions injectables aux doses et aux concentrations usuelles. Un tel produit pourrait également être utilisé comme produit de départ de la préparation d'autres sels tels que des héparinates de calcium ou des héparinates mélangés de calcium/magnésium, de calcium/sodium, par exemple selon le procédé décrit dans le brevet britannique N° 1471482 précité.
On décrira maintenant un premier exemple de mode de réalisation appliqué à la purification de l'héparine.
Dans un mode opératoire préféré de purification par fractionnement à l'alcool d'un héparinate de sodium injectable, on part d'un héparinate de sodium de qualité injectable, d'origine bovine ou parcine.
On dissout cet héparinate dans l'eau déminéralisée (présentant une résistivité de 300 000 à 800 000 îî/cm, de préférence de 500 000 fì/cm.
On règle la concentration de la solution d'héparinate entre 5000 et 30000 Ul/ml, de préférence à 25000 Ul/ml. Afin d'empêcher les contaminations, on ajoute 0,3% de métacrésol. On maintient le pH de la solution entre 5 et 7, de préférence à 6,5, par addition d'une solution d'hydroxyde de sodium pur 5N ou d'une solution d'acide chlorhydrique pur 5N. La conductivité de la solution reste entre 7000 et 15 000 (iS/cm.
A la solution d'héparinate obtenue on ajoute 0,7 volume d'alcool éthylique neutre (à 99-100° GL). On laisse déposer le précipité et, si nécessaire, on ajoute une petite quantité de chlorure de sodium.
On sépare le précipité du liquide surnageant. On le redissout dans l'eau déminéralisée aux propriétés ci-dessus, à une concentration d'environ 12 500 Ul/ml, si nécessaire, on règle le pH à 5,5 à l'aide de la solution d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique 5N. On filtre la solution sur une membrane Millipore 0,3 |i. On ajoute sous agitation 1,2 volume d'éthanol neutre (à 99-100° GL) par volume de solution. On laisse reposer le précipité en ajoutant le cas échéant une petite quantité de chlorure de sodium.
La précipité d'héparine obtenu ci-dessus est déshydraté par broyage dans l'éthanol absolu puis filtré sous vide sur buchner industriel lavé à l'alcool absolu et séché sous vide de 1 mmHg à 35-40° C.
Si de nouvelles précipitations étaient nécessaires, on les réaliserait de la même manière que la seconde précipitation, c'est-à-dire à une concentration en héparine de 12 500 Ul/ml, à pH 5,5, avec 1,2 volume d'alcool absolu par volume de solution.
On décrira maintenant un second exemple d'application d'un mode opératoire.
Premier fractionnement alcoolique:
On dissout un sel de sodium d'héparine de qualité injectable, d'origine bovine ou porcine, dans de l'eau déminéralisée ayant une résistivité de 300 000 à 800 000 fi, et de préférence de 500 000 fì, à une concentration en héparine de 5000 à 30000 et de préférence de 25 000 Ul/ml. On ajoute du métacrésol à une concentration de 3%o. On règle le pH de la solution entre 7 et 10, de préférence à 8,5, par addition d'une solution de carbonate de sodium en quantité correspondant à une proportion de 0,5% de carbonate de sodium anhydre en poids par rapport à l'héparine initiale.
La conductivité de la solution se situe alors entre 7000 et 15 000 |xS/cm. On ajoute à la solution du chlorure de sodium cristallisé en quantité de 25 g/1. On ajoute ensuite sous agitation 0,7 volume d'éthanol neutre à 99-100° GL pour 1 volume de solution d'héparine. On recueille le précipité d'héparine après 6 h de repos.
Deuxième fractionnement alcoolique:
On redissout le précipité d'héparine dans de l'eau déminéralisée aux mêmes caractéristiques que ci-dessus, à une concentration voisine de 12 500 Ul/ml. Le pH est d'environ 8,5. On ajoute du chlorure de sodium cristallisé en quantité de 25 g/1 de solution. On ajoute ensuite sous agitation 1 volume d'éthanol neutre à 99-100° GL.
On laisse reposer pendant 12 h. On sépare le nouveau précipité d'héparine.
Cette opération de second fractionnement alcoolique est répétée trois fois dans les mêmes conditions que ci-dessus, ce qui fait donc au total quatre opérations de fractionnement. Le précipité obtenu après le quatrième fractionnement alcoolique est redissous dans l'eau déminéralisée aux caractéristiques ci-dessus, à une concentration d'environ 12000 Ul/ml. On règle le pH à 3, par l'acide chlorhydrique, sous agitation vigoureuse. On agite pendant encore 15 min. On règle le pH à 5,5 par l'hydroxyde de sodium 5N. On ajoute du chlorure de sodium cristallisé en quantité de 25 g/1 et on filtre la solution sur une membrane Millipore 0,3 |x. On ajoute au filtrat, sous agitation, un volume d'éthanol neutre à 99-100 GL par volume du filtrat. On laisse reposer pendant 12 h.
Le précipité d'héparine obtenu est déshydraté par broyage dans l'alcool éthylique absolu et filtration sous vide. Finalement, on lave le précipité dans l'alcool absolu et on sèche à 35-40° C/l mmHg. On obtient ainsi une solution injectable du sel de sodium de l'héparine dans laquelle la proportion des autres sels totaux est inférieure à 0,5% et la teneur en Oxalates totaux est inférieure ou égale à 20 ppm.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention, sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf mention contraire.
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Exemple 1:
Dans cet exemple, on part d'un héparinate de sodium du commerce à 160 Ul/mg.
La teneur en sels totaux est de 2,5% et la teneur en Oxalates est de l'ordre de 220 ppm (soit 0,022%).
On dissout 10 kg de cet héparinate dans un réacteur en acier inoxydable de 3001 par addition de 201 d'eau déminéralisée présentant une résistivité de 500000 £1/cm, filtrée au préalable sur une membrane Millipore 0,22 |i.
La dissolution est complète après 1 h d'agitation. On mesure le pH et on le règle à 6,5 par addition de NaOH 5N ou de HCl 5N. On porte le volume total à 641 à l'aide de la même eau déminéralisée. La conductivité mesurée est de 15 000 (iS/cm. On maintient la température entre 15 et 30° C.
On ajoute 192 ml de métacrésol fraîchement distillé et 0,7 volume d'éthanol neutre à 99-100° GL par volume de la solution initiale, c'est-à-dire 44,8 1. On abandonne au repos jusqu'à apparition d'un précipité; si nécessaire, on ajoute une petite quantité de chlorure de sodium. On recueille séparément le liquide surnageant et le précipité d'héparinate de sodium. La teneur en sels minéraux de ce dernier est inférieure à 0,5% mais il reste toujours 200 ppm d'ions Oxalates dans ce précipité.
On redissout l'héparinate de sodium dans 50 ml de la même eau déminéralisée à la conductivité de 500000 ß/cm; si nécessaire, on règle le pH à 5,5 par addition de NaOH 5N ou de HCl 5N.
La conductivité mesurée est de 15 000 |iS/cm. On porte le volume total à 128 1 par dilution avec la même eau déminéralisée, on ajoute 384 g de métacrésol fraîchement distillé et on abandonne toute la préparation pendant 24 h à température ambiante. On filtre la solution d'héparine sur filtre Millipore CWSS 0,3 |i. On recueille le filtrat. A 251 du filtrat on ajoute lentement, sous agitation, 301 d'alcool éthylique neutre (à 99-100° GL) c'est-à-dire 1,2 volume par volume. On abandonne ensuite au repos jusqu'à apparition d'un précipité. Si nécessaire, on ajouterait une petite quantité de chlorure de sodium.
On recueille séparément la liqueur surnageante et le précipité d'héparinate de sodium. On déshydrate ce dernier par l'alcool absolu, on triture et on filtre sous vide industriel sur buchner; finalement on sèche et lyophilise. On obtient ainsi 9400 g d'héparinate de sodium, soit un rendement de 94%. Cet héparinate titre 160 Ul/mg. Sa teneur en sels minéraux est de 0,15%, y compris 30 ppm d'ions Oxalates.
Pour la récupération de l'héparinate restant dans les liqueurs hydroalcooliques surnageantes, on poursuit le traitement de la manière suivante:
A 1 volume du liquide surnageant de la première précipitation alcoolique, on ajoute sous agitation 1 volume d'alcool éthylique neutre à 99-100° GL. Après 24 h de repos, on envoie le liquide surnageant clair, légèrement opalescent, à la récupération de l'alcool.
Le précipité séparé est traité dans l'alcool éthylique absolu, déshydraté, trituré et séché.
A la liqueur surnageante de la seconde préparation, on ajoute sous agitation de l'alcool éthylique neutre à 99-100° GL, en proportions de 0,5 volume par volume de la liqueur, et on abandonne au repos pendant 24 h.
On récupère l'héparinate de sodium dans des conditions identiques à celles décrites pour la première liqueur surnageante.
L'héparinate de sodium ainsi récupéré est utilisé dans la préparation du sel de calcium.
Cette préparation est réalisée selon le procédé du brevet britannique N° 1471482 précité.
En résumé, le traitement consiste à ajouter du chlorure de calcium à une solution d'héparinate de sodium de manière à obtenir un héparinate enrichi en calcium, à éliminer les ions sodium libérés, et à ajouter à nouveau des ions calcium de manière à obtenir un héparinate enrichi en ions calcium.
On obtient par ce procédé un sel de calcium de l'héparine à 160 Ul/mg, 10,3% de calcium, 0,2% de sodium et 20 ppm d'ions Oxalates.
Exemple 2:
On traite un héparinate de sodium préparé comme décrit dans l'exemple 1, titrant 160 Ul/mg et contenant 30 ppm d'oxalates, comme décrit dans le brevet britannique N° 1471482 précité pour la préparation d'un héparinate de sodium/calcium. Dans cet exemple, on ajoute le chlorure de calcium une fois seulement à la solution d'héparinate de sodium et on élimine ensuite les ions sodium libérés.
On a ainsi préparé un héparinate de calcium titrant 160 Ul/mg et contenant environ 7% de calcium. La teneur en ions Oxalates de ce sel d'héparine est de 18 ppm.
Une solution de cet héparinate de calcium/sodium titrant 25 000 Ul/ml, conservée en ampoules pendant plusieurs mois, ne contient aucune trace de précipité.
Exemple 3:
On répète l'opération de l'exemple 2 mais, cette fois, on transforme complètement l'héparinate de sodium en héparinate de calcium par le procédé du brevet britannique N° 1471482 précité.
L'héparinate de calcium obtenu titre 160 Ul/mg, il contient environ 10,4% de calcium et moins de 0,1% de sodium. La teneur en sels minéraux est de 0,4%, y compris 20 ppm d'ions Oxalates, et les solutions préparées dans ces conditions, titrant 25 000 Ul/ml, présentent à la conservation les mêmes caractéristiques que la solution de l'exemple 2.
L'exemple illustre la préparation d'un sel de sodium injectable de l'héparine, titrant 160 Ul/mg, utilisable pour la préparation d'un sel de calcium.
La teneur en sels minéraux est de 2,5% et la teneur en Oxalates de 1000 ppm. On dissout 10 kg de cet héparine dans 501 d'eau déminéralisée présentant une résistivité de 500000 fi, et pralablement filtrée sur une membrane Millipore 0,22 |i dans un réacteur en acier inoxydable de 3001.
On agite la solution pendant 15 min et on porte à volume final de 641 par addition d'eau déminéralisée. La concentration est de 25 000 Ul/ml. On ajoute 192 ml de métacrésol fraîchement distillé, puis 50 g de carbonate de sodium à l'état de solution aqueuse, et finalement 1600 g de chlorure de sodium cristallisé. On agite à nouveau pendant 15 min. Le pH qui doit être de 8,5 est vérifié; en cas de nécessité, on l'ajuste à cette valeur à l'aide d'une solution de carbonate de sodium. On ajoute 441 d'éthanol neutre à 99-100° GL, sous agitation (soit 0,7 volume d'alcool par volume de la solution initiale). On abandonne au repos pendant 6 h et on recueille le précipité d'héparine. On soumet ce précipité à un second fractionnement alcoolique, après redissolution dans 1101 d'eau déminéralisée aux caractéristiques indiquées ci-dessus, la solution ayant alors une concentration d'environ 12 500 Ul/ml. On agite pendant 15 min puis on complète à volume de 1281 par addition d'eau déminéralisée. On ajoute 384 ml de métacrésol fraîchement distillé. On règle le pH à 8,5 à l'aide d'une solution de carbonate de sodium. On ajoute 2300 g de chlorure de sodium. On agite la solution pendant 15 min. On ajoute de l'éthanol neutre à 99-100° GL à raison de 1 volume par volume de solution d'héparine, sous agitation. On abandonne au repos pendant 12 h. On recueille le précipité d'héparine après séparation du liquide surnageant.
On répète encore trois fois le fractionnement alcoolique dans les mêmes conditions qu'à la deuxième fois, en partant du précipité d'héparine obtenu à chaque fois dans l'opération de fractionnement précédente.
Le précipité final d'héparine est redissous dans l'eau déminéralisée à une concentration d'environ 12 500 Ul/ml, et la solution a alors un volume de 1281. On règle le pH à 3 par l'acide chlorhydri-que sous agitation vigoureuse. On poursuit l'agitation pendant 15 min. On règle le pH à 5,5 par de l'hydroxyde de sodium 5N. On ajoute 384 ml de métacrésol fraîchement distillé, puis 3200 g de chio-
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rure de sodium cristallisé. On filtre la solution sur membrane Millipore 0,3 (i. Toutes ces opérations sont effectuées à une température de 15 à 30° C. On ajoute au filtrat, sous agitation, 1 volume d'éthanol neutre à 99-100° GL par volume de filtrat. On abandonne au repos pendant 12 h. Le précipité final d'héparine obtenu dans ces conditions est déshydraté par trituration dans l'éthanol absolu, fil-tration sous vide et lavage répété avec de l'alcool absolu, puis séchage de 24 h à 35-40° C/l mmHg. La poudre est broyée et à nouveau séchée pendant 24 h à 40°C/l mmHg, de manière à éliminer les dernières traces de solvant. On obtient 9100 g d'un sel de sodium de l'héparine contenant moins de 0,5% de sels minéraux et moins de 20 ppm d'oxalates. Le rendement en cette fraction est de 90,3%. Le titre récupéré est de 157 Ul/mg. Les dosages des ions Oxalates dans les héparines purifiées ont été réalisés après extraction par le mode opératoire de J.R. Helbert et M.A. Marini, «Biochem. 5 J.» (1963) 2 (5) pp. 1101-1106, avec les modifications ci-après: les ions Oxalates présents dans les héparines ont été extraits en présence d'un excès de carbonate de sodium avant absorption sur la résine anionique IRA/400 dont l'utilisation est recommandée par les auteurs. Après élution de la résine, les ions Oxalates ont été dosés io par la méthode fluorométrique de P.M. Zarembski et A. Hodgkin-son, «Biochem. J.» (1965) 96, 717-721.
Claims (12)
- 636 8882REVENDICATIONS1. Héparine de qualité injectable sous la forme d'un sel de métal, caractérisée en ce que le métal est constitué au moins en partie par du calcium et en ce qu'elle a un contenu en ions Oxalates inférieur à 70 ppm.
- 2. Héparine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient moins de 30 et de préférence moins de 20 ppm d'oxalates.
- 3. Héparine selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle contient moins de 0,5 et de préférence moins de 0,3% de sels minéraux.
- 4. Héparine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle présente une activité d'au moins 120 et de préférence de plus de 150 unités internationales par milligramme.
- 5. Solution concentrée injectable d'une héparine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient de 1000 Ul/ml à 35000 Ul/ml d'héparine, et en ce qu'elle convient pour l'injection par voie soit sous-cutanée, soit intraveineuse.
- 6. Procédé pour préparer un sel de métal de l'héparine selon la revendication 1, dont le métal consiste au moins en partie en calcium et dont la concentration finale en Oxalates est inférieure à 70 ppm, caractérisé en ce que l'on ajoute un agent précipitant non ionique à une solution aqueuse d'une héparine, sous la forme d'un sel d'un métal dont les Oxalates sont solubles dans l'eau, que l'on règle la quantité d'agent précipitant non ionique, de manière à provoquer une précipitation sélective des sels d'héparine, cependant que les sels minéraux restent dans la solution aqueuse, que l'on recueille un sel d'héparine et que l'on répète cette séparation sélective sur une nouvelle solution aqueuse concentrée du sel d'héparine récupéré, jusqu'à ce que la concentration en Oxalates du sel d'héparine final soit inférieure à 70 ppm, et en ce que l'on remplace le métal du sel d'héparine finalement obtenu, en partie au moins, par du calcium.
- 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les séparations sélectives susdites sont répétées jusqu'à ce que la concentration en Oxalates du sel d'héparine récupéré soit inférieure à30 ppm et de préférence inférieure à 20 ppm.
- 8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que le sel de métal de l'héparine, initialement mis en œuvre, consiste en un héparinate de sodium.
- 9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que, dans la solution aqueuse initiale, avant contact avec l'agent non ionique, la concentration des sels minéraux autres que les Oxalates est suffisante, ou est réglée à une valeur suffisante, pour favoriser la séparation des Oxalates, y compris les Oxalates apparemment fixés ou absorbés qui sont alors libérés et restent dans la solution aqueuse lors de la précipitation aubséquente de l'héparine par l'agent non ionique.
- 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse contenant les sels minéraux à une concentration suffisante contient au moins un sel d'un anion divalent et d'un métal, dont l'oxalate est soluble dans l'eau, tel qu'un carbonate, de préférence le carbonate de sodium, de préférence dans une concentration de 0,3 à 2,5 et avantageusement d'environ 0,5% du poids de l'héparine.
- 11. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que ces sels contiennent également des sels d'anions monovalents, tels qu'un chlorure d'au moins un métal, tel que le sodium, dont l'oxalate est soluble dans l'eau, la concentration du sel d'anion monovalent dans la solution aqueuse étant de préférence comprise entre 10 et 70 g et de préférence égale à 25 g par litre de la solution.
- 12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que l'agent précipitant non ionique consiste en un alcool, de préférence l'éthanol.
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