BE572919A

BE572919A -

Info

Publication number: BE572919A
Authority: BE

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE PROPERDINE PURIFIEE.

Lettre rectificative jointe pour valoir comme de droit à la date du 19.1.59.

- page 2, ligne 43, il faut lire " 42 C " au lieu de " +2 C ".

La présente invention est relative à un procédé de production de pro- perdine purifiée à partir de substances en contenant, telles que des.fluides humains ou animaux, notamment à partir de sang complet et de substances analo- gues. L'invention concerne, plus particulièrement, un procédé de production de properdine purifiée à partir du produit, dérivé de sang humain ou animal, qui est connu des spécialistes sous l'appellation de "fraction I de Cohn".

On a proposé jusqu'à présent diverses méthodes pour produire de la properdine purifiée, mais ces méthodes étaient sujettes à des limitations, en ce qui concerne le degré de concentration et de purification, ainsi qù'en ce qui concerne la facilité et la rapidité avec lesquelles le produit peut être préparé.

La présente invention a pour objet un nouveau procédé simple pour produire de la properdine purifiée. L'invention a encore pour objet un procédé pour augmenter la concentration en properdine par rapport à sa concentration dans le sang ou des fluides analogues, ainsi que pour purifier cette properdine.

L'invention a aussi pour objet un nouveau procédé permettant d'obte- nir un produit à base de properdine de qualité supérieure.

La properdine est une protéine du plasma qui, avec d'autres facteurs, est responsable de l'activité bactéricide des sérums. Il a été observé jusqu'à présent que la présence du système properdinique dans le sang des êtres humains ou des animaux parait être une cause sérieuse de l'immunité que présentent les êtres humains et les animaux vis-à-vis de diverses formes d'activité bactéricide et autres. Il a été observé, par exemple, que les cobayes sont très sensibles à des infections et que leurs sérums contiennent des quantités relativement fai- bles de properdine. Par contre, le sérum des rats, qui résistent aux infections, contient une proportion très élevée de properdine, cette proportion étant la plus élevée que l'on ait mesurée chez les animaux à sang chaud.

La properdine est normalement présente dans le torrent sanguin des êtres humains et peut être mobilisée par le système humain. Elle parait être partiellement responsable de la résistance aux attaques des bactéries et le sys- tème properdinique parait constituer essentiellement un mécanisme procuré par la nature pour assurer la défense contre les attaques bactériennes, pendant le temps où des anti-corps ne se sont pas encore formés. En conséquence, il est de la plus haute importance de disposer d'un produit à base de properdine présen- tant une concentration et une pureté grandement accrues et sous une forme con- venant pour être introduite dans le sérum des animaux à sang chaud.

D'autres objets et avantages de la présente invention ressortiront de la description suivante.

Conformément à la présente invention, on soumet du plasma sanguin au procédé bien connu de fractionnement à l'éthanol froid de Cohn, en suivant des techniques standard, de manière à obtenir une pâte bien connue des spécia- listes sous la dénomination de "Fraction I de Cohn". Cette pâte est mise en suspension dans un tampon glycine-citrate à une température inférieure à 0 C en- viron, et, après agitation, le fibrinogène est séparé par centrifugation à basse température, notamment à une température inférieure à 0 C environ. Le liquide surnageant est additionné, à une température dépassant légèrement 0 C, d'une solution d'acétate de zinc, de manière à obtenir une concentration finale d'environ 0,02 M.

La solution d'acétate de zinc est, de préférence, ajoutée lentement en agitant vigoureusement et la solution finale est laissée au repos pendant environ 18 heures. Le précipité de zinc est recueilli par décantation et/ou par centrifugation.

Le complexe zinc-protéine ainsi obtenu est dissous à température am- biante dans de l'acide éthylène-diamine tétracétique. Le zinc et l'acide éthylè- ne-diamine tétracétique sont ensuite éliminés de la solution, de préférence par dialyse, et le liquide résultant est additionné de tétramétaphosphate de sodium,

après quoi on en réduit le pH, de manière à précipiter une quantité considérable de matière, qui est alors séparée par centrifugation ou autrement.

Le liquide surnageant provenant de la précipitation au métaphosphate est alors ajusté jusqu'à un pH voisin de la neutralité et la solution est lyophi- lisée. La matière lyophilisée-est mise en suspension dans un petit volume d'eau et dialysée vis-à-vis de chlorure de sodium ou d'une substance analogue. La so- lution dialysée est clarifiée par centrifugation et filtrée, en sorte que l'on obtient une solution finale stérile, qui est riche en properdine.

L'exemple spécifique suivant illustre plus en détails un mode d' exécution préféré de l'invention.

EXEMPLE.

Préparation de properdine à partir de la fraction I de Cohn.

Le procédé de fractionnement à l'éthanol froid de Cohn a été appliqué à environ 1400 litres de plasma citrate, de manière à former 20 kilos de fraction I en pâte (fibrinogène brut). Cette "pâte a été mise en suspension dans 10 volu- mes (200 litres) de tampon froid (-3 C) à la glycine à l'aide d'un mélangeur Waring.

Ce tampon avait, de préférence, la composition suivante :
EMI3.1

<tb> - <SEP> Citrate <SEP> de <SEP> sodium. <SEP> 6 <SEP> H2O <SEP> 1,91 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 13,6 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> - <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> sodium. <SEP> 3H2O <SEP> 7,94 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> - <SEP> Glycine <SEP> 75,07 <SEP> g
<tb>
<tb> - <SEP> Ethanol <SEP> 3A <SEP> 73,3 <SEP> ml
<tb>
<tb> - <SEP> Eau <SEP> q.s. <SEP> ad. <SEP> 1 <SEP> litre
<tb>
<tb>
<tb> - <SEP> Ajuster <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 6,0 <SEP> avec <SEP> de <SEP> l'acide <SEP> acétique <SEP> 0,4 <SEP> M.
<tb>

La suspension a été agitée pendant 2 heures à -3 C et le fibrinogène a été séparé par centrifugation à basse température (-3 C). Le liquide surnageant a été abandonné à -3 C pendant 3 jours, pour précipiter un peu de matière analo- gue au fibrinogène. Cette matière a été éliminée par centrifugation à -5 C. Le précipité a été jeté.

Une fraction riche en properdine a été précipitée dans le liquide surnageant à 42 C, par addition d'une solution 1,0 molaire d'acétate de zinc, jusqu'à obtenir une concentration finale d'environ 0-,02 M. (20 ml d'acétate de zinc 1M par litre de liquide surnageant).

La solution d'acétate de zinc a été ajoutée lentement en agitant vigoureusement et la solution finale a été laissée au repos pendant 18 heures à -2 C. Le précipité de zinc a été recueilli par décantation de la masse du li- quide surnageant, puis par centrifugation du résidu à -2 C. Le précipité de zinc obtenu pesait 650 g.

Le complexe zinc-protéine a été dissous à température ambiante dans 10 litres d'acide éthylène-diamine tétracétique 0,25 M à un pH de 7,2. Cette dissolution a été obtenue en agitant pendant environ 30 minutes. Le zinc et l'acide éthylène-diamine tétracétique ont été éliminés par dialyse avec du chlorure de sodium 0,15 M à +2 C. (Trois fractions de 200 litres de saumure ont été utilisées en l'espace de 72 heures). Une petite quantité de matière insolu- ble présente après la dialyse a été éliminée par centrifugation.

Le liquide surnageant dialysé a été purifié davantage par addition de tétramétaphosphate de sodium en solution à 10% (100 ml par litre) et par ad- dition d'acide chlorhydrique à 5% jusqu'à obtention d'un pH de 3,5 à 4,0. Une quantité considérable de matière a précipité dans ces conditions et la solution a été laissée au repos, pendant 3 à 4 heures, à -2 C, pour assurer une précipi- tation complète. Le précipité a aisément été séparé par centrifugation.

Le filtrat de la précipitation au métaphosphate a été ajusté à un pH

de 7,0 à 7,2 à l'aide d'une solution 1M de bicarbonate de sodium et la solution a été lyophilisée. La matière lyophilisée a été mise en suspension dans trois li- tres d'eau distillée, en agitant pendant 30 minutes à -2 C.

Cette suspension a été dialysée vis-à-vis de NaCl 0,15 M à +2 C. Deux fractions de 100 litres de saumure ont été utilisées en l'espace de 48 heures.

La solution dialysée a été clarifiée par centrifugation à +2 C et con- tenait 250 unités de properdine par millilitre (600 unités par milligramme d' azote protéinique). Cette solution a été filtrée sur un .tampon de stérilisation, tel que celui dénommé "Republic n S-6".

La solution finale contenait 150 unités de properdine par millilitre avec une activité spécifique de 340 unités par milligramme d'azote protéinique.

Le volume final de la solution était de 4 litres.

Diverses autres voies pour obtenir de la properdine . à partir du filtrat de la précipitation au métaphosphate ont été essayées avec des degrés divers de succès. La précipitation à l'aide de sulfate ammonique (à plus de 50%). suivie d'une dialyse du précipité résultant à donné une matière ayant une activi- té spécifique de 300 à 400 unités par milligramme d'azote protéinique, avec des rendements voisins de 75% par rapport à celui obtenu au départ du filtrat de la précipitation au métaphosphate. Par ailleurs, la précipitation à l'alcool (15%) n'a donné qu'un rendement de 40%. La purification globale obtenue jusqu'à ce jour a été.multipliée environ par 400 pour le produit final.

On comprendra que le présent procédé vise à préparer de la properdine à partir de la fraction I de Cohn par un procédé, dans lequel une solution de zinc est utilisée pour précipiter une fraction riche en properdine, dans lequel le traitement au tétramétaphosphate de sodium est appliqué pour éliminer les pro- téines inertes, et dans lequel l'excès de matière inorganique est concentré et éliminé. Ce procédé est beaucoup plus facile à mettre en oeuvre et beaucoup moins coûteux que les procédés connus jusqu'ici. On savait jusqu'à présent que la properdine est une protéine présente à l'état de trace dans le sérum, qui est adsorbée de manière quasiment spécifique par le zymosan qui constitue la matière de la paroi des cellules de levure, matière qui est très coûteuse.

Ce mode d'isolement dépend de l'utilisation de plasma ou de sérum frais, qui con- tient du magnésium et d'autres composants de complément à une concentration appro- priée et dans des conditions de température sévèrement contrôlées.

Contrairement au sérum frais, la matière de départ pour la mise en oeuvre du procédé suivant la présente invention est une solution de lavage rési- duaire peu coûteuse de la fraction I de Cohn, contenant 7% d'alcool et de la glycine molaire. Dans cette solution, la proportion de properdine varie consi- dérablement avec la concentration initiale du plasma dont elle est dérivée, mais même avec de fortes variations en ce qui concerne ce facteur, une concentration multipliée par plus de 100 peut être aisément obtenue par le procédé selon 1' invention.

L'utilisation de zinc comme agent de précipitation assure une concen- tration très substantielle de la properdine. L'emploi de tétramétaphosphate de sodium est extrêmement utile dans le processus de concentration. Alors qu'on aurait dû s'attendre à ce que la properdine précipite dans une gamme assez large de valeurs de pH, on a constaté, au contraire, que la properdine n'est pas pré- cipitée dans la gamme des pH allant de 4,2 à 3,2, cette properdine se retrouvant dans la solution surnageante. Le stade de précipitation au tétramétaphosphate de sodium peut, dès alors, être exécuté dans la mise en oeuvre de la présente invention, à un pH compris entre 4,2 et 3,2. Une grande quantité de protéine iner- te est éliminée par le stade de précipitation au tétramétaphosphate de sodium, ce qui améliore grandement la pureté de la properdine produite.

Alors que le brevet américain n 2. 726.235 accordé le 6 décembre 1955 décrit la séparation de la protéine du plasma à l'aide de tétramétaphosphate de

sodium et alors que ce brevet semble indiquer que la properdine (qui est désignée dans la littérature sous l'appellation de bêta-glubuline") doive être précipitée en même temps que les autres bêta-glubulines, la demanderesse a constaté, au contraire, que la properdine reste dans la solution surnageante dans une gamme relativement large de valeurs de pH.

L'utilité de la présente invention est claire. Le système properdini- que a été décrit comme étant une protéine qui, en même temps que les quatre com- posants de complément et le magnésium, se trouve normalement dans le sérum des êtres humains et d'autres animaux. In vitro, ce système a la faculté de produire une lyse des érythrocytes anormaux, de détruire les bactéries, de tuer certains protozoaires et d'inactiver certains virus. Cette substance utile peut, grâce à la présente invention, être préparée à des frais considérablement moindres que jusqu'ici.

La demanderesse a constaté que son procédé fournit une solution de properdine contenant plusieurs centaines d'unités de properdine par millilitre, cette properdine ayant une pureté pouvant atteindre plusieurs centaines d'unités par milligramme d'azote protéinique.

La préparation de la fraction I de Cohn est bien connue dans la technique et est décrite dans le "Journal of the American Chemical Society", Vol. 68, page 459 (1946).

REVENDICATIONS.

1. Procédé de production de properdine purifiée et concentrée à par- tir de la fraction I de Cohn, caractérisé en ce qu'on traite cette fraction avec une solution d'un sel de zinc et on élimine les précipités de zinc.

Claims

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la frac- tion I de Cohn est traitée avec une solution d'acétate de zinc.

3. Procédé de production de properdine purifiée et concentrée à partir de la fraction I de Cohn, caractérisé en ce qu'on met cette fraction I de Cohn en suspension dans un tampon alcool-glycine à une température inférieure à 0 C environ, en élimine le fibrinogène insoluble de cette suspension à une tempéra- ture inférieure à 0 C environ, et on élimine le précipité de zinc.

4. Procédé de production de properdine purifiée et concentrée à par- tir de la fraction I de Cohn, caractérisé en ce qu'on ajoute à cette fraction une solution d'un sel de zinc, on élimine le précipité de zinc, on dissout ce précipité dans de l'acide' éthylène-diamine tétraacétique, on ajoute de l'acide chlorhydrique jusqu'à un pH d'environ 3,2 à 4,2 et on élimine le précipité, de manière à obtenir de la properdine purifiée et concentrée.

5. Procédé de production de properdine purifiée et concentrée à par- tir de la fraction I de Cohn, caractérisé en ce qu'on met un volume donné de fraction I de Cohn en suspension dans environ 5 à 10 volumes d'un tampon alcool- glycine, on élimine le fibrinogène insoluble de cette suspension, on ajoute une solution d'acétate de zinc au liquide surnageant, on agite, on élimine le préci- pité de zinc, on dissout ce précipité dans de l'acide éthylène-diamine tétracé- tique, on élimine le zinc et l'acide éthylène-diamine tétracétique par dialyse vis-à-vis de chlorure de sodium, on ajoute du tétramétaphosphate de sodium au liquide surnageant dialysé, on ajuste le pH du liquide à environ 3,2 à 4,2, on élimine le précipité, on règle le pH du liquide surnageant résultant à environ 7, on lyophilise la matière résultante,

on dialyse vis-à-vis de chlorure de so- . dium environ 0,15 molâire et enfin on clarifie et on filtre de manière à produire la properdine purifiée et concentrée.

6. Procédé de production de properdine purifiée et concentrée à par- tir d'une liqueur de lavage à l'aide d'un tampon alcool-glycine de la fraction I de Cohn, caractérisé en ce qu'on élimine le fibrinogène insoluble de la sus- <Desc/Clms Page number 6> pension de lavage en question, on ajoute une solution à base de zinc au liquide ' surnageant, on agite, on élimine le précipité de zinc, on dissout ce précipité de zinc dans de l'acide éthylène-diamine tétracétique ayant un pH d'environ 7,2, on élimine le zinc et l'acide éthylène-diamine tétracétique par dialyse, on ajoute du tétramétaphosphate de sodium au liquide surnageant dialysé, on ajoute de l'acide chlorhydrique de façon à obtenir un pH d'environ 3,2 à 4,2, on élimine le précipité, on amène le pH du liquide surnageant résultant à environ 7, on lyophilise la matière résultante,

on procède à une dialyse vïs--vis de chlorure de sodium 0,15 molaire' environ, et enfin, on clarifie et on filtre de manière à produire la properdine purifiée et concentrée.

7. Procédé de production de properdine purifiée et concentrée à partir de la fraction I de Cohn, dans lequel procédé on met un volume donné de cette fraction I de Cohn en suspension dans environ 5 à 10 volumes d'un tampon gly- cine-citrate de composition suivante : EMI6.1 <tb> - <SEP> Citrate <SEP> de <SEP> sodium,.' <SEP> 6 <SEP> H2O <SEP> 1,91 <SEP> g <tb> <tb> <tb> <tb> <tb> - <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 13,6 <SEP> g <tb> <tb> <tb> <tb> <tb> - <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> sodium. <SEP> 3 <SEP> H2O <SEP> 7,94 <SEP> g <SEP> <tb> <tb> <tb> <tb> <tb> - <SEP> Glycine <SEP> 75,07 <SEP> g <tb> <tb> <tb> <tb> - <SEP> Ethanol <SEP> 3A <SEP> 73,3 <SEP> ml. <tb> <tb> <tb> <tb>

- <SEP> Eau <SEP> q. <SEP> s. <SEP> ad. <SEP> 1 <SEP> litre, <tb> le pH de ce.tampon étant ajusté à 6,0 à l'aide d'acide acétique 0,4M, à une température; inférieure à environ 0 C, on élimine le fibrinogène insoluble de cet- te suspension à une température inférieure à 0 C environ, on ajoute une solution d'acétate dé zinc environ 1 molaire au liquide surnageant, on agite, on élimine le précipité de zinc, on('dissout ce précipité de zinc dans de l'acide éthylène- diamine tétracétique à une concentration environ 1/4 molaire et à un pH d'en- viron 7,2, on élimine le zinc et l'acide éthylène-diamine tétracétique par dia- lyse vis-à-vis de chlorure de sodium approximativement 0,15 molaire, on ajoute du tétramétaphosphate de sodium au liquide surnageant dialysé, on ajoute de 1'.

acide chlorhydrique de façon à obtenir un pH d'environ 3,5 à 4, on élimine le précipité, on règle le pH du liquide surnageant obtenu à environ 7, on lyophilise la matière résultante, on dialyse vis-à-vis de chlorure de sodium approximative- ment 0,15 molaire, et enfin on clarifie et on filtre, de manière à produire la properdine purifiée et concentrée à l'état stérile.