JPH03504320A - スブチリシンの結晶化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素の回収及び精製、更に詳しくは結晶化によるスジチリシンの精製法 に関する。

発明の背景 スジチリシンは洗濯用洗剤、銀の回収、魚の餌の製造並びに他の製品及び方法に おける使用を含めて広範囲の用途を有するプロテアーゼである。スジチリシンは 結晶形態のものが色々な理由から好ましい。結晶性スジチリシンは非晶質のスジ チリシンの沈殿のような他のルートで製造されたスジチリシンの他の形態のもの よシ純度が高い。スジチリシンの結晶は目的とされる各種の最終用途のための媒 体及び処方物の選択に融通性を与えることができるのみならず、高度の安定性も 与えることができる。スジチリシンはそれが結晶形態であろうと、沈殿した非晶 質形態であろうと、乾燥することができ、かつ様々の粒体製品又は粉体製品とし て用いることができる。しかし、スジチリシンは更にしばしば液状製品において 使用するための、あるいは液状又は固状製品の製造において使用するための各種 液状製品の形で、例えば水性、グリセリン、ソルビ処方される。結晶性スジチリ シン及びこの結晶形スジチリシンから製造した液状製品には、その高純度の故に 、医用用途や食品製品における用途等の多数の高品質用途がある。

スジチリシンの結晶それ自体は寸法が通常約５ミクロン乃至約５０ミクロンの範 囲である長斜方形板状結晶である。結晶の溶解度は水中で約４グラム／リツター ＣＦｉ／ｌ）、プライン中で約８１１／ＪＪ、プロピレングリコール中で約５０ ０ｇ／Ｊ？以上である。

スジチリシン結晶は他の酵素の結晶を所定の醗酵によシ得る方法とほとんど同じ 方法でバチラススデチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の醗酵によ シ得られていた。

醗酵混合物はまず分離工程に付される。この工程はバクテリアの細胞と懸濁した 固体を除去して固体を含まない溶液即ちブイヨンを形成する工程である。得られ た溶液は目的酵素についである特定の最低濃度水準を得るためにしばしば濃縮さ れる。次いで、通常は種結晶の助けをかシて結晶化が行われ、そして高純度の結 晶性製品が溶液から分離される。

ニュー・ヨーク洲（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）二ニー〇ヨーク市（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ） のコロンビア−バイアープレス社（Ｃｏｌｕｍ−ｂｉａ　Ｖｉｎｅ　Ｐｒｅｓｓ ）刊の７−スラップ（ＮｏｒＬｈｒｕｐ）等著ｒａｔｉｏｎ　　Ａｎｄ　　Ｃｒ ｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ）’　　に おいて論じられているように、蛋白質の結晶生成に対しては濃厚蛋白質溶液、即 ち１〜１０パーセントの濃度が必須である、と言うのは、稀薄蛋白質溶液として の蛋白質は仮シに分離できるとしても困難を伴って可能なだけなのに対して、同 じ蛋白質でも濃厚溶液となると一般に分離がはるかに容易になるからである。ま た、蛋白質を結晶化するには、純度がよシ低い非晶質形をもたらしてしまう沈殿 を形成させずに行う必要がある。この結晶化は溶液中の蛋白質、塩、溶媒及び／ 又は有機溶媒類の相対濃度を調整することによって誘発される。その溶液は、過 飽和が蛋白質のあまシ望ましくない非晶質形の沈殿の形成を促進するので、塩又 は溶媒中で飽和状態となっていないか又は過度に著しく過飽和状態となっていな いことが重要である。従って、結晶性酵素製品を得る最適濃度は極〈わずかな準 飽和！　５ｕｂｓａ　ｅｕｒａ　ｂｉｏｎ）の水準の濃厚塩／蛋白質溶液でちる とされた。

わずかな準飽和のこのような！Ｉｋ遍条件は往々にして達成困難であシ、そして 常用の結晶化技術を使用しての処理に際しては特に維持困難でるる。更に具体的 に説明すると、酵素の通常の結晶化法は沈殿が正に現われてくるまで硫酸アンモ ニウム又は硫酸ナトリウムのような沈殿剤の添加が必要である。しかし、沈殿は 在住にして溶液が飽和されるか、又は高度に過飽和状態になるまで現われず、従 ってこの処理は常に酵素の非品質形が沈殿で生成するだろうという危険を伴う。

最適のわずかな準飽和が達成される場合でもこのような理想的状態は急速に理想 的でなくなってしまう。

更に具体的に言うと、溶液から蛋白質を結晶形として取シ除くことによって残っ ている溶液はその近飽和濃度を失ってしまい、結晶が更に形成するのがだんだん 困難になる。これは、蛋白質の大部分が上層液に残っている状態であるので、蛋 白質製品の和尚の損失をもたらす。この問題を克服するには、溶液をほとんど全 ての蛋白質が溶液から結晶化するまでわずかに準飽和の状態に保つことができる ように追加量の塩を添加することによって溶液の状態を連続調整することが必要 である。

上記の議論から明らかなように、現在知られている結晶性スデチリシンの製造技 術はしばしば（Ｎ順性に欠け、かつ制御困難なものである。これを実施する人は スデチリシン溶液がわずかに準飽和となる点を測定することができなければなら ないばかシでなく、結晶化が一旦開始したらその溶液系を目的濃度が維持される ように連続ｖ４整して高価なスデチリシン製品が失われるのを回避し、かついか なる高度に過飽和の状態も、またその結果としてのスデチリシンの非晶質形の形 成も回避するようにしなければならない。

公仰の酵素結晶化技術の以上の制限及び欠点から、また上記では言及しなかった その他の不利点から見て、結晶化を起こすための酵素溶液をわずかに準飽和の濃 度に保つことには左右されず、しかも結晶性スデチリシンの効率的で信頼性のあ る製造を可能にする、結晶化によるスデチリ７）の精製法の必要が存在すること は明らかである。本発明の１つの目的は、酵素溶液が準飽和状態であるときスデ チリシン酵素の結晶化を誘発してそのスデチリ７ン酵素溶液が過飽和であるとき に形成する可能性のある非晶質の沈殿の形成を回避する塩を使用する結晶化によ るスデチリシン酵素の精製法を提供することによって上記の必要を実現すること である。

本発明の更にもう１つの目的は、沈殿剤として硫酸アンモニウムを必要とせず、 しかしてこのことによって硫酸アルミニウムの使用に付随する環境問題や廃棄物 処理の問題を回避する゛、結晶化によるスデチリシン酵素の精製法を提供するこ とである。

本発明の他の目的は、原料コスト及び運転コストが低い、結晶化によるスデチリ シンの精製法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、高収率及び高処理量の能力がある、結晶化によるスデ チリシンの精製法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、高純度かつ実質的に微生物を含まないスデチリ７ン製 品を生成させる、結晶化本発明の以上の、及び以下において明らかになる他の目 的、利点及び特徴に関し、本発明の本質は次の本発明の記載、添付請求の範囲及 び図面全参照することによって更に明白に理解できるだろう。

発明の概要 本発明は、１つの面として、次の （１）スデチリシン生成バクテリアの醗酵によって製造される醗酵混合物から細 胞及び懸濁固体を除去することによってスデチリクン溶液を調製し；（１）　　 スデチリシン溶液をスデチリシンが少なくとも約４０Ｅｉ／Ｊ３の濃度で存在す るように濃縮することによって濃厚溶液を形成し； （１ｍ　　ハロゲン化物塩をスデチリシンの結晶を形成させるのに有効な量で添 加し：そして （１ψ　スデチリシンの結晶を形成させる工程を含むスジチリシン結晶の製造法 を提供するものである。

本発明の方法は従来法に比較しである予想外の利点を含めて従来技術を越える様 々な利点を与える。前記の目的を満足する本発明によって与えられる利点に加え て、本発明の方法において与えられる〕・ロデン化物塩の使用によシ得られるも う１つの利点はその塩／スデチリシン溶液が飽和水準に近くないときにスジチリ シン結晶が最良の速度で形成するということでおる。

従って、その濃度をわずかに準飽和の水準に維持することは必要ない（又は望ま しくさえない）。本発明の方法は、全溶液を飽和に又は飽和近くに保つ必要なし に操作中に塩水率をよシ広い、臨界性の少ない範囲にわたって維持し、調整でき るので、操作及び制御が容易である。

本発明により提供される驚くべきそして予想外の利点は、従来法とは違って、例 えば溶液に過剰量の塩を添加し、あるいは溶液の温度を下げることによってノ・ ロデン化物塩／スデチリシノ溶液が過飽和となってもスデチリシンの非晶質形は 現われないことである。驚くべきことに、２Ｍもの高塩濃度下でも、あるいは４ Ｍもの高濃度下であってさえも、スデチリシンの結晶形しか生成せず、広範な操 作条件範囲にわたって一貫して高純度の結晶性スデチリクンが得られる。

本発明の方法によシ提供されるもう１つの利点はスデチリシンの最適結晶化速度 は飽和よυはるかに低い塩濃度、例えば０．０５　Ｍ〜０．６Ｍで達成されるこ とである。

本発明の方法の融通性によって、ノ・ロデン化物塩は濃縮されたスデチリ７ン溶 液に加えてもよいし、あるいはこの方法のよシ早い時期においてスデチリ７ノ溶 液にそれが濃縮される前に加えてもよい、と言う他の利点が得られる。更に／’ Ｉ　Ｑデン化物塩はこの方法の更に早い時期に、即ち醗酵混合物に添加してもよ い。この方法によれば従ってこのことに関して濃厚溶液から結晶性スジチリシン を製造する本発明の方法を商業的に使用するのに望まれるプロセス設計に依存し て様々の選択肢が与えられる。ハロゲン化物塩の濃厚浴液に対する添加は結晶形 成を更に精密に制御する場合に好ましいだろう。他の場合には、特にハロゲン化 物塩が処理されるスジチリシンに対してこの方法の縮収率を増加させることがで きる安定化効果がある場合に、ハロゲン化物塩をこの方法の早い時期に加えるの が好ましいだろう。

本発明は、もう１つの面として、スジチリシンを溶液から結晶化させるのに有効 な量でハｅｉＪｆン化物塩を含有するスジチリシン溶液を含む組成物を提供する 。

図面の簡単な説明 第１図は本発明方法の好ましい態様の概略流れ図である。

第２図は塩化ナトリウム及び塩化カルシウムの色々な濃度に対するパーセント結 晶回収率を描いているグラフである。

第３図は塩化ナトリウム中でのスジチリシンの結晶成長の時間の関数としての依 存性を描いているグラフ本発明の１態様による結晶性スジチリシンの製造は、Ｂ 、スデチリスの置溝混合物を調製し、醗酵混合物から細胞及び懸濁固体を除去し てスデチリシン溶液全形特表千３−５０４３２０　（４） 成し、その溶液をスジチリシン酵素が少なくとも４０グラム／リツターＣ９／ｉ ＞の濃度で存在するように濃縮し、濃縮された溶液にハロゲン化物塩をスジチリ シン結晶を形成するのに有効な童で添加し、そしてスジチリシンの結晶を形成さ せることによって行われる。

本発明方法のこの態様は第１図に概略図示される総合プロセスで例示、説明され ている。第１図はスジチリシン生成バクテリアの醗酵、細胞及び懸濁固体の醗酵 混合物からの分離、及び得られたスジチリシン溶液の目的水準への濃縮の各基本 工程を示す。これらの醗酵、分離及び濃縮工程はこの技術分野では周知であシ、 その実施に際しては常用の方法が本発明のこの態様の実施に関連して用いること ができる。次に、この態様においては結晶のスラリーを形成する結晶化工程を行 うためにハロゲン化物塩と種結晶が加えられる。結晶は次いで常用のフィルター プレス法で回収することができ、洗浄されて目的の製品を与える。この製品は乾 燥粉末形又は同粒体形を取ることもできるし、あるいは細胞、糧々−の懸濁固体 、及びスジチリシン製品の巨砲及び懸濁固体をスジチリシン溶液から分離するた めに処理される。これに関しては、濾過、遠心分離、ミクロ濾過、回転真空濾過 及び同様の方法等の常用の固−液分離技術を用い−ることができる。通常約３〜 ２０１／−１３の濃度で存在する溶解スジチリシンを含有する溶液即ちブイヨン から細胞及び固体が一旦除去されると、次に溶液中のスジチリシンを少なくとも 約４０ｇ／ノ、好゛ましくは少なくとも約６０ｇ／ｌ、更に好ましくは少なくと も約ＢＯＦｉ／Ｊｊの濃度まで濃縮することが必要である。約４０ｇ／Ａ以下の 濃度は通常貧弱な又は不満足な結晶化収率をもたらしてしまうのでちまり望まし くない。この方法は一般的にはそれよシ高濃度で最良かつ最も効率的に作用する のである。結晶化工程で使用される濃縮溶液に達成可能なスジチリシンの最高濃 度を採用するのが好ましい。しかし、約１００９／Ｊ３よシ高い濃度は多くのス ジブリシン溶液には達成困難である。はとんどのスジチリシン溶液に対して実施 時の最適操作範囲は通常約９０〜約１００９／ｉ、又はそれ以上である。溶液の 濃縮は限外濾過、蒸発、抽出、クロマトグラフィー、又は沈殿とそれに続く再溶 解を含めて種々の常用技術によって達成することができる。使用すべき濃縮技術 又は同方法の選択は一部は本発明によジハロゲン化物塩が醗酵混合物に又は濃縮 されるべき溶液に加えられているかどうかによって影響されるだろう。

所定の条件の組について結晶化工程の完結後の棄却される母液中に残っているス ジチリシンの量は結晶化工程に供給される濃厚溶液においてよシ高出発濃度のス ジチリシンが用いられるときに減少されることが観察された。即ち、結晶化の初 めにおいて濃厚溶液中のスジチリシンの出発濃度が高いほど結晶化によって回収 される全スジチリシンの割合は大きくなシ、それによって結晶性スジチリシンの 縮収率が最高となシ、かつ母液中（て残っている未結晶化スデチリ７）の損失が 最低となる。１例を示すと、１００ｆｊ／Ａのスジチリシン濃度を有する結晶化 装置の供給原料溶液は、結晶化後、約１５９７ｉの残留スジチリシン濃度を有す る平衡している母液中に懸濁したスラリーとして約２２％ｖ／ｖの結晶固体を生 成させる。これは約１００−（１００−２２）（１５／Ｉ　Ｄｏ）の最大回収率 、即ち縮収率８８．３％を与える。比較すると、ＢＯ；ｌ／−ｅのスジチリシン 濃度を有する供給原料溶液は結晶化工程で約１８ｇ／−ｅの残留スジチリシン濃 度を有する平衡母液中に約２０％ｖ／ｖの結晶固体を生成させる。これは約１０ ０−（１００−２０）（１８／８０）の最大回収率、即ち８２％の縮収率を与え るものである。

濃厚溶液からのスジチリシンの結晶化はスジチリシン結晶を形成させるのに有効 な童のノ・ロデン化物塩を添加することによって達成される。本発明において有 用なハロゲン化物塩に塩化ナトリウム、塩化カルシウム、臭化ナトリウム、沃化 ナトリウム、塩化カリウム、沃化カリウム、弗化すトリウム、並びに結晶化され ているスジチリシンと相溶性があるその他のハロゲン化物塩及びそれらの混合物 がある。現在商業的使用に好ましいハロゲン化物塩は塩化ナトリウムと塩化カル シウムでちる。スジチリシン結晶を形成させるのに有効なハロゲン化物塩量は使 用されている特定のハロゲン化物塩又は塩類に加えて、溶解している特定のスジ チリシン、その溶液中に存在する他の物質、及びその溶液中のスジチリシンの濃 度に依存して変わ得る。本発明の方法について少なくとも有効量の、かつ最適量 のハロゲン化物をどう選択するかは本発明の教示に従い、これらの因子を考慮す れば当業者には明らかになるはずである。一般に、塩濃度は少なくとも約０．０ １　Ｍ（１０ｍＭ）であるべきであり、好ましくは約０．０１〜約２Ｍ、更に好 ましくは約０．０２〜約１．５Ｍ、最も好ましくは約０．０３〜約１Ｍである。

若干の溶液／塩の組み合せの最適範囲は約０．０２〜約０．１８　Ｍの範囲にあ るが、一方他の組み合せの場合は約０．１〜約０．７Ｍの範囲にある。塩のこれ らの量又は濃度はスジチリシンを溶液から結晶化させるのに有効であるので、等 しく本発明の組成物に適用可能である。

理論で限定される訳ではないが、本発明によシ使用されるハロゲン化物塩は硫酸 アンモニウムのようなスジチリシンの従来からの沈殿剤とは違った様式でスジチ リシンの結晶化を誘発すると考えられる。更に具体的に説明すると、硫酸アンモ ニウムのような沈殿剤は溶液の濃度が飽和水準に近いときにスジチリシン結晶の 結晶化を誘発する。それよシ高い水準ではそれら沈殿剤は非晶質のスジチリシン を沈殿させる可能性がある。従来からの沈殿剤とは対照的に、本発明によシ使用 されるハロゲン化物塩は比較的低い塩濃度でスジチリシンの結晶化を誘発する。

更に、前記のように、本発明によるハロゲン化物塩の使用は２Ｍもの高塩水準で も、あるいは４Ｍであってもスジチリシンの非晶質形の沈殿を誘発しない。非常 に高い塩濃度では、スジチリシンの結晶化は弱まるが、それぞれ結晶性スジチリ シンしか生成せず、非晶質のスジチリシンは沈殿しない。本発明はスジチリシン の非晶質形を沈殿させる危険を取シ吟＜ものである。以上の説明から分かるよう に、本発明の方法において最適結晶化はよシ低い塩濃度で起シ、これに対して総 収率は非常に高い塩濃度でより低くなる。

従来の沈殿剤の場合その水準を上げると、最後には非晶質スジチリシン沈殿物の 沈殿を引き起す可能性があるのに対して、本発明のハロゲン化物塩ではその水準 を上げると結晶の形成を最適点まで高め、その点を越えると結晶形成を徐々に減 少させる。しかして、第２図を参照すれば分かるように、塩化ナトリウムの場合 的２００〜６００　ｍＭで、また塩化カルシウムの場合は約５０〜２００　ｍＭ で結晶回収率が最大となった。これらの塩濃度はこれら特定の塩の、結晶化スジ チリシンの収率を最良となす最適塩濃度範囲である。第２図のデーターは限外濾 過による濃縮物（スデチリシ７８０１１／Ｉ！Ｊまで濃縮）からの供給原料に基 づく。この濃縮物は・・ロデン化物塩と種結晶の添加前に４倍容量の脱イオン水 でディア濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｙ）　して塩を除去したものであった。第２図 に見ることができるように、塩化ナトリウムはよシ広い操作範囲にわたってよシ 高い可能収率を遅成し、従って本発明の方法の好ましい塩である。これら特定の 塩のこれら最適範囲を越えると、結晶化スジチリシンの回収率は減少する。しか し、これら塩のいかなる濃度においても非晶質スジチリシン沈殿物の形成は認め られなかった。

塩化ナトリウムの最適濃度は約２００〜約６００　ｍＭの範囲であることができ 、好ましくは約４００〜約５００　ｍＭである。これらの濃度は、言い換えると 、それぞれ約１．２〜３．５チ、好ましくは約２．３〜約２．９−である。塩化 カルシウムの濃度は約５０〜約２００ｍＭ、好ましくは約１００〜約１５０ｍＭ 、言い換えると、それぞれ約０，７〜約２．９俤、好ましくは約１．５〜約２． ２チであることができる。

必ず必要とされる訳けではないけれども、この結晶化ズロセスを促進するために スジチリシンの種結晶を溶液の重量に基づいて約１０重量−以下の量で添加する のが好ましい。種結晶の使用は結晶化の動力学的挙動をよシ有利なものとなし、 これは結晶性スジチリシンの総合収率を増加させると思われる。結晶化を促す表 面特性を有する結晶化用容器を用意することによっても核形成を促進することが できる。この性質は当業者には周知のものである。所与のスジチリシン溶液、運 転規模、工程条件等について種結晶の最低有効量の使用は、従来の結晶化方法に おける通シ、当業者には明白であろう。また、本発明の方法を連続法として実施 する場合、結晶化装置中に存在する結晶はその装置に入って来る新しい濃厚溶液 の供給原料に対して種結晶として作用する。結晶の成長は通常結晶化容器をおだ やかに攪拌することによって更に促進される。当業者であればまた、目的の結晶 化度が達成されてしまうまでは、本発明の方法における溶液に結晶化を抑制する かもしれないいかなる物質も、例えばプロピレングリコール、蟻酸ナトリウム、 硫酸ナトリウム等を添加すべきでないことは分かるだろう。

結晶化中の温度は一般に約１〜約１０℃、好ましくは約３〜約５℃である。結晶 化が行われるーは酵素の種に依存するが、酵素が安定である範囲でなければな５ ．２〜５．８、好ましくは５．３〜５．６である。約５．２よシ低い、又は約５ ．８よシ高い一水準では、そのスジチリシンは不安定となるだろう。この結晶化 プロセスが実質的な完結まで、あるいは目的の平衝状Ｂまで進むための所要時間 は勿論種々の工程条件だけでなく、種結晶が使用されているかそれとも使用され ていないかにも左右される。種結晶を便用しない場合、平衡に達するのに約４８ 時間の時間が典形的には必要とされる。

ここで、この平衡は溶液中の残留スズテリシンの濃度約２０ｇ／、、ｅ未満に相 当する。種結晶を使用する場合、時間は同じ平衡に達するのに約１８時未満まで 減少する。

第３図は約Ｂｏｇ／Ｊｌのスズテリシンを含有する濃厚溶液から結晶化させたス ズテリシンの典形的な結晶化対時間曲線を例証するものである。この場合、塩化 ナトリウムを沈殿用塩として濃厚溶液に加え、また種結晶を使用した。約１６時 間抜追加の結晶成長量は実質的になかった。

結晶化が本質的に完結すれば、通常の結晶回収技術が用いることができる。しか して、製品は結晶含有スラリーから遠心分離、沈降又は濾過で回収することがで きる。別法として、スラリーは固体製品を製造する方法への供給原料として使用 してもよい。

固体−ボール遠心分離及び板−フレームフィルタープレスでの濾過が製品の大規 模回収に適した２つの周知の技術である。両技術において、結晶スラリーは、粘 度を下げ、母液からの分離を良くするために、水でまず稀釈される。遠心分離法 においては、結晶はボール内の緻密なケーキとして採収され、そのケーキは次に これ全水中に再悪濁し、再遠心分離することによって洗浄される。得られたケー キは、典形的には、望ましい液状製品形態のスズテリシンを与えるために、プロ ピレングリコール、蟻酸ナトリウム及び水を含む処方物に再洛解さｎる。

フィルタープレス回収法においては、まず濾過助剤を稀釈された結晶スラリーに 加え、この混合物を予備被覆済みの板−７ンームフイルタープレスに送る。濾液 としての、結晶を含まない母液は捨てられる２次いでフィルタープレースを通し て数倍容量の水又は緩衝液を送ることができ、それによって結晶はほぼプラグ− フローの条件下で効率的に洗浄される。十分に高い洗浄用緩衝液流量においては 、そのプロテアーゼ結晶の水中溶解度が低い（３〜Ｂ’ｌ／、、ｅ）ことから酵 素活性の損失量は些少である。結晶性酵素はプロピレングリコール、蟻酸ナトリ ウム及び水を含有する緩衝液を用いて回収される。これらの化学薬品は、結晶ケ ーキの効率的洗浄と併せて、製品中の微生物量を非常に低くすることが見い出さ れた。

次の実施例は例示説明のために与えられるもので、いかなる意味でも開示されか つ特許請求される主題を限定すると解してはならない。

固体を除去、部分的に濃縮されたスズテリシンのブイヨン又は溶液を生成させた 。このスプチリシンゾイヨンｔ−９００ｍ／のファーマシアーセファデックス― （Ｐｈａｒｍａｃｉａ　’５ｅｐｈａｄｅｘ’）　Ｇ　−２５カラムで脱塩し、 そして１４ｍＭ（０，２ＣＩ６％）の塩化カルシウムニ水和物と平衡させた。元 のゾイヨ７の導電率は４４ｍ５／ｃｒｎであったが、脱塩後は３−９　ｍｓ／ｃ ｍに落ちた。この溶液を水でスズテリシン１５．ｆｌｌ／−ｅから１２．６ｇ／ 、、ｅまで稀釈し、次いでアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）攪拌済みτＴＦセル中でｃ ′ｍ縮して約６５Ｆ！／Ｊｌのスズテリシン酵素を含有する濃厚物を製造した。

この濃厚物の試料１ゴを水浴中に入れたミクロフユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ） 管に入っている色々な量の塩化ナトリウム及び塩化カル７ウムとマ）　ＩＪラッ クス様組み合せ、攪拌せずに静置した。

結晶化したスズテリシンを含むミクロフユージ管を医用遠心分離機中で約５００ ０　ｒｐｍで４〜５分間回転させ、その上層液をパスツールピペット（ｐａｓ！ ｅｕｒｐｉｐｅ　ｔ；　ｔｅ　）を用いてデカンテーションにより除去した。

そのペレットヲまず１００％プロｔレンゲリコールに吸収させ、次いで十分量の １４ｍＭの水性ＣａＣｌ２を全体で２０％のプロピレングリコールを与えるよう に加えた。上層液及びペレットの容量は重量で測定した。

結果を次表に示す。

スズテリシン６５１ｙ＃を含有する溶液からｋＪａ、ｃｌ又はＣａＣｉ　２沈殿 剤を用いて回収２５０　　　　　　３８　、０ ５００　　　　　　６９．４ １０００　　　　　　６６．０ １５００１３．９ ２５０　　　　　　６１．８ ４００　　　　　　１５．３ ５００　　　　　　１２．４ 上記の表において、ダッシュ記号（へ）は結晶化製品の有意量の回収はなかった ことを示す。

上記の実施例は、この場合の塩化ナトリウム及び塩化カルシウムの最適濃度はそ れぞれ約５００　ｍ、Ｍ及び約２５０　ｍＭであることを証明している。

プロテアーゼ・Ｂ、アミロリクイロファシエ７スの変種酵素（スデチリシン分子 中の位置２１７においてアミノ酸のロイシンを置換することによって製造）を実 施例１の方法と同じ方法で醗酵させ、濾過し、濃縮し、結晶化させた。

この場合は、プロテアーゼの細胞不含溶液を限外濾過でスデチリシン６９ｇ／ノ までａ縮した。濃厚物に色々な水準の塩化ナトリウム及び天然酵素の種結晶を加 えた。この結果、次の処理済み酵素結晶の収率が達成された。

Ｕ　　　　　４００　　　　４１ 実施例３ 限外濾過によシ得られたスデチリシン溶液を９９ｇ／Ｊまで濃縮した。この常用 溶液に種々のノ・コデン化物塩を４００　ｍＭで加え、かつ１　％　Ｖ／Ｖの酵 素種結晶を添加した。４℃で６日間イン中ユペーションした後に得られた結晶回 収率は次の通シであった。

ＮａＣ＃　　　　２３　　　　　２２　　　　６８Ｎａｌ　　　　　２５　　　 　　２３　　　　　７６ＫＣ＃　　　　　２７　　　　　２５　　　　　８４Ｋ Ｉ　　　　　　２６　　　　　２５　　　　　８１本明細書には好ましい態様だ けを具体的に例証したけれども、本発明には、その精神と意図された範囲から逸 脱しない限シ、上記の教示に照して添付請求の範囲内で多くの改変及び変更が可 能であることが分かるだろう。

手続補正書（自発） 平成　２年／ＱＡ／６日

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）スプチリシン生成性バクテリアの醗酵により製造された醗酵混合物か ら細胞及び懸濁固体を除去することによつてスプチリシン溶液を調製し；（ｉｉ ）スプチリシン溶液をそのスプチリシンが少なくとも約４０ｇ／ｌの濃度で存在 するように濃縮することによｚて濃厚溶液を形成し； （ｉｉｉ）ハロゲン化物塩をスプチリシン結晶の形成を引き起こすのに有効な量 で添加し；そして（ｉｖ）スプチリシンの結晶を形成させる工程を含むスプチリ シン結晶の製造法。
2. ２．醗酵混合物にハロゲン化物塩を添加する、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．スプチリシン溶液にハロゲン化物塩を添加する、請求の範囲第１項に記載の 方法。
4. ４．濃厚溶液にハロゲン化物塩を添加する、請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．濃縮工程（ｉｉ）をスプチリシンの濃度が少なくとも約８０ｇ／ｌとなるよ うに実施する、請求の範囲第１項に記載の方法。
6. ６．塩が塩化ナトリウム又は塩化カルシウムである、請求の範囲第１項に記載の 方法。
7. ７．塩が塩化ナトリウムであり、該塩を約４００〜約５００ｍＭの塩化ナトリウ ムを含有する溶液を形成するように添加する、請求の範囲第４項に記載の方法。
8. ８．塩が塩化カルシウムであり、該塩を約５０〜約２００ｍＭの塩化カルシウム を含有する溶液を形成するように添加する、請求の範囲第４項に記載の方法。
9. ９．濃厚溶液にスプチリシンの種結晶を添加する工程を更に含む、請求の範囲第 １項に記載の方法。
10. １０．スプチリシン結晶を形成する工程（ｉｉｉ）を約５．２〜約５．８のｐＨ で実施する、請求の範囲第１項に記載の方法。
11. １１．バクテリアがバチラスである、請求の範囲第１項に記載の方法。
12. １２．バチラスがＢ．スブチリスである、請求の範囲第１０項に記載の方法。
13. １３．スプチリシンの１濃度が約８０〜約１００ｇ／ｌである、請求の範囲第５ 項に記載の方法。
14. １４．塩が沃化ナトリウムである、請求の範囲第１項に記載の方法。
15. １５．塩が塩化カリウムである、請求の範囲第１項に記載の方法。
16. １６．塩が沃化カリウムである、請求の範囲第１項に記載の方法。
17. １７．スプチリシン溶液にハロゲン化物塩を添加する工程を含み、その際ハロゲ ン化物塩の量は該溶液からスプチリシンを結晶化させるのに有効な童である、ス プチリシンの精製法。
18. １８．スプチリン濃度が少なくとも約４０ｇ／ｌである濃厚スプチリシン溶液を 形成する工程を更に含む、請求の範囲第１７項に記載の方法。
19. １９．溶液中のハロゲン化物塩の濃度が約０．０１〜約２Ｍであり、溶液中のス プチリシン濃度が少なくとも約４０ｇ／ｌである、請求の範囲第１７項に記載の 方法。
20. ２０．スプチリシン溶液を含み、該スプチリシン溶液はハロゲン化物塩を該溶液 からスプチリシンを結晶化させるのに有効な量で含有している組成物。
21. ２１．溶液中の塩濃度が約０．０１〜約２Ｍであり、溶液中のスプチリシン濃度 が少なくとも４０ｇ／ｌである、請求の範囲第２０項に記載の組成物。