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Nouvelle* substances activée et procédé pour leur préparation* A partir de matières d'origine biologique, en particulier à partir de micro-organismes * on déjà isolé
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un ........ grand nombre de substances de croissance renfer- jusât du fort par exemple les ferrichremes, le ooprogne étales terri-oxaminea.
On a maintenant trouva qu'on pouvait, , partir de nouvelles touches d'Aspergillus, notamment à partir
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d'Asperg111u. Mlleue H 2853 et d'Aspergillus terreur 4785, obtenir une nouvelle substance de croissance
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renfermant du fer, la ferrichrysino, et le oompopé exempt de fer correspondant, à savoir la desferrichrysine. La présente invention a en conséquence pour objet la terri- chrysine, la desferrichrysine et les dérivés des sels de ces composés, ainsi qu'un procédé pour leur préparation, et également les nouvelles souches d'Aspergillus melleus
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M 2853 et d'Aspergillue terreue k 4785.
La ferrichrysine est une substance cristalline brun-rouge qui est bien soluble dans l'eau et le méthanol, même à froid, et est plus difficilement soluble dans l'éthanol soselu. Le composé présente la composition
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élémentaire suivante : C - 43,37 ; H * 6,06 % ; N - z72 fie 7,09 ; o 26,74 % (cale.). Le spectre ultra-violet dans l'oau présente un maximum à 420 eu (loC S #le' gm 1,4&).
Le spectre infra-rouge dans le bromure de potassium présente entre autres des bandes à 725, 733, 975, 1.060, 1.140, 1.200 cm-1 (épaulement),
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à -1.216 c (épaulement), , 1.237# 1.275 cm"1 (6pu1em.nt). à 1..!.l c.m..1 (épaulement), à 1.36, 1.430 oa1 (épaulement), . à 1.445 cm'"1 (6pnulemont1. à 1.465, 1.45 cm"'1 (épaulement), à 1.517. 1.585, 1.652, a, 950, 3.070 cm'"1 (épaulement), à 3.420 cm-1 (voir figure 1, des dessine annexés).
Les cristaux se décomposent sans fondre à 270*0 environ, en donnant une coloration noire. Dans un chroma- togramme sur papier, on obtient les valeurs de Rf suivant !
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0,26 dans le système I (n-butanol : acide acétique glacial : eau - 4:1:1) et 0,34 dons le système II (butanol tertiaire acide chlorhydrique 00004-normal : solution aqueuse saturé*
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de...chlorure de sodium. 2:1<1 ;
t P"!"t.'1' imprégné avec un- mélange d'acétone, d'eau et d'une soutien aqueuse saturée de chlorure de sodium. 6:3:1).
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Lors de l'hydrolyse acide de la ferrichrysinet il se forme, comme produits volatile, 3 mole d'acide acétique. (L'acide uueoinique et le 1-amino-5-hvdroxyl amino-pentane, qui représentent des constituante essen- tiela des ferri-oxamines, ne sont pas décelables dans le
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mélange d'hydrolyse de la ferrichryaine).
Lora du traitement de la ter1chrysin. par zen bases ou des acides ou par des substances donnant lieu à la formation d'un complexe ferrifôre, comme la 8-hydroxy- quinoléine, le fer est élimina de la molécules ce qui fait qu'il se fora la Cotte dernière est uns
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poudre iaeolore qui, jusqu'à présent, la' a paa encore pu êtj?0 cristallisée. Elle est bien soluble daaa l'eau, 1* wehanol, l'ethanol, plus difficilement solubl* daM le presque 1;)uta.noJtf1nlJo;.ue dans l'acétone, le elorûforwe <t les solvants Itp.oph11es.
L'&nal7se élémentaire fournit les valeurs suivantes t C 46,'6 % ; H 6.98 19 15,65 % 0 31,d1 se qui correspond z une formule brute agH4gNg014* Le spectre ultra-violet n'est pas particulière-
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ment caractéristique et présente simplement une absorption terminale à 214 mu. Dans le spectre infra-rouge (pris dans le bromure de potassium). on peut entre autres voir des
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bandes 2.94 a 3%43 fui 6,10 pl 6.53 bzz fi 7,32 pt 8,10 ex, 8,30 ri 8,62 u, 9,60 u et 10,14 p (voir la figure 3 des dessine annexée).
Lo spectre de résonance nucléaire magnétique
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de la desferrichryeine dans l'acide trifluoracétique présente les signaux suivante ; 2,07 ppm i large maximum correspondant à 4n proton. , groupes CH2.
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2,54 ppm ; 3 S.inglett correspondant à 3n protons lI1'tlqlo dans des groupements acide aceto-hydroxaiBiqwe.
4,00 ppm ; large maximum correspondant à 2n protons.
4,2 à
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5,1 ppm large amoncellement de bandes avec des )<MMci<t rttconnaiaaablaa à 4,33, 4tà3 et 5,00 ps- 1 au total 3n protons environ.
8,02 ppm ; correspondants à 3n protons environ ; un groupe
NH peptidique.
Le nombre n dans les indications et-dessus repré- sente vraisemblablement le chiffre 3,correspondant aux trois unités de base probablement identiques, à partir desquelles la molécule est édifiée.
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Si l'on ajoute du chlorure ferrique à une solude
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ti9n/d'iSterrichrysilie, il se forme alors une intense 0010-. ration rouge-violet. On peut isoler la ferrichryeiaa A partir de la solution réactionnelle. Lorsqu'on hydrolyse de la desferrichrysine avec de l'acide chlorhydrique hexa- normal et hydrogène catalytiquement les produite de l'hy-
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drolyse (en vue de réduire des groupes hydroxylam1nogèn..
éventuellements présents), on obtient, à côté de 3 noies d'acide acétique, trois produite qui sont positifs à la
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ninhydrine et qui, dans un chromatogramme sur papier, avec un.mélange de phénol et d'eau (4s1) en tant qu'éluant, présentent les valeurs de Rf suivantes: 0,21, 0,30 et 0,38. L'essai effectué suivant la méthode de Loore et
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Stéin, 1.H. Spackman, 'w.Ii. Stein, S. Moore, "Analytical Chem1stry" 0, 1190 (1958)...7 montre qu'il s'agit d'omi-. thine, de sérine et de glycine dans la proportion molé- culaire de 3:2:1.
Si l'on examine directement le produit d'hydrolyse acide sans procéder à l'hydrogénation cataly,.; tique subséquente, on ne peut alors pas déceler d'orni- thine.
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Pane la terrichryeine, les acides u1n'... savoir la glycine (une mole), la sérine (2 moles) et-la b""'br:1:roxy-orn1th1n. (3 moles), sont liés en un peptide. cyclique. L'hydroxy-ornithine est acétylée sur l'atome d'azote :-1' (6') . sur les trois restes d'acide h14rt±,ú.,
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ainsi formés, le fer est lié à l'état de complexe. La formula globale de la ferrichrysine exempte de fer est par suite :tri-(N-scétyl)-cyclo-[glycyl, (séryl)2' (é-hydroxy-ornithyl)3-7. La séquence des acides Minée n'est pas encore bien déterminée.
Pour une séquence alter- née des restes é-hydroxy-ornithine, on attribuerait à la ferrichryaine la formule structurale suivante :
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La ferrichrysine est une substance de croissance pon différents micro-organismes et peut par suite éven- tuellement être utilisée, lors de la culture de tels orga- nismes.
Le tableau suivant montre la croissance relative du microbacterium lacticum, souche ATCC 8181, mesurée sur la base de l'extinction de la culture, lorsqu'on ajoute au milieu de culture des quantités différente! de ferrichrysine :
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TABLEAU
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mmmmmmm
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heures 'o1chr:81no, *n f pM? lit*** 0 1 10 "., ,6 100 22 0,17? 0,'3t3 0936Z 0,459 OJ'!9 25 0,232 0,280 0,512 0 S02 ' 0,644 ze 0,244 bzz 0,598 01941 0,974 31 0,249 bzz 0,645 1,040 1,115 46 0,257 0,359 0,786 1%346 11503
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La ferrichryeine possède des propri4tés gati- éc1que8 et pcmt par suite être utefée 8=m m641ca#ont . en médecine humaine et vétérinaire* La deaferrlctoysint p08Bàde également de précieuses propriétés phaj")aMOoiqwe<.
C'est ainsi qu'elle aupoche le dépôt? de pigmenta .Ferifte dans les tissus, ou qu'elle provoque, 4kùs'les cas d'un dépôt pathologique de ter dans une 6lt#1&at1on : du 'tort par exemple dans l'hémochromatose et l'b'lI\o.141"..
On peut par suite l'utiliser en thé.put1qu huitaine et
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vétérinaire.
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Tout coma d'autres 8idérnea. la ter.richr1a1a. est également en mesure de supprimer compétitive#ent. vie- à.#ls des agents pathogènes à Gram positif , l'effet anti-
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bactérien des antibiotiques appartenant au Croupe des
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sidëroatycins (action antiaidéroQycin1que).
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En ce qui a trait aux stfots biologique. indiquée la terrichrysine présente' certaines Analoeles avec d'autres oiddraminen telles que, par exemple, les ferrl-oxamtniSi les lerrichromes et le coprogeau, par ogutre, en ce qui a trait z son propriétés pbyai60-*i!&l $que9, 1< e< diffé-
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rencie d'une manière caractéristique de ses substances, comme illustré dans ce qui suit ?
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1) La te;t':donr;YB1ne Me différencie des ferri-
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oxamines produites par des souches non seulement par le fait qu'on ne Peut pas déceler d'acide
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euccinique de la 1-Minoµhydl&aino'''pentan9 dane les produits d'hydrolyse, mais également par S'ta propriété! spectroscopiquea.
Ctent ainsi que 8Q opoctre Infra-rougo est, dans des pointa enaentelu, digèrent de celui des ferri-oxanines et que le iaaaciaus! du spectre ultra-violet se situe, pour la terr1cbYiln. à une longueur d'onde (420 ma) plus courte que dans le 0*0 #94 terri-oxamtnes
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(430 environ).
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2) Le ferriefcrofee qui peut être préparé au cultivant l'Ustilago opbaoro8on4# go go différencie que peu de la terr1ohr,1$1ne du point; 4* vue peotrosoopique.
Dans le spectre infra-rouge, 1# présente à 1.275 cm-1 un maximum d'tntee*té m$#mf qui, chez la lerrichrysine, n'apparaît que goixe %4 jjPw i d'un faible épaulement. Au lieu d'une large 1;tM¯' " 10 0 * chez
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1.* Il y a chez le terri chrome deux maxima \Íl't1 41ut1f1utè à 1.02$ et à 1.068 Dans le apeetre de téobâtadt MÜtIdatro magnétique. la destervichryaine pl'b.t1t. MA :1.&. 1 l'au Maximum pour 4,00 ppm et un larga Mon- .11'm.n. Ai tàandes dans la zone allant de 412 à 511 pput aveu dot taaatima feux 4t33j 4#83 et 5100 ppm# tandis que dans ce domaine1 le err1chrome exempt de ter présente des Mtàtikk à J04ej pptu, a 4$52 ppm (épaulement) et à 4#74 pipa.
En 66 qUî a ttait à la solubilité, la terricys1Ae et le ïdrriëhtoit ào différencient par contre de façon nette 1 à ïtoâodatto de ce qui est le cas pour la terrichr.1S. lé t4ttiëhté&9 est presque insoluble dans le méthanol. tr¯i4 et Il t1è de dissout qu'après une ébullition prolongé* dstrta Une quantité environ mille fois plus grande de méthanol
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Les produite d'hydrolyse sont également différents. Hydro-
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lyse ayant 46 Iladide chlorhydrique bexanormal et b1drog'.' batAlti4gëteht# le terrichrome exempt de fer ne fournit pas troll, 1, fiai Heulenenb deux produits positifs à la ninhydrihe, à savoir la glycine et l'ornithine. Dans u& chî1ôfflatôgi a4nme sur papier, il y a aussi des différences-$ date lea aystèaes 1 et Il, le fdrrlchx-ome priante des Valoueu do Rt qui sont respectivement de 0,19 et de 0,25.
3) Lu totrichrome AI substance accompagnatrice du t tlêûtf ùme 1 ne présente pas, à 1'encontre de ce qui cot le éun pour la terrichryoine, d'effet anvagonllt.
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t1Ótnb:Le vis*&i8 de la lltt'11'11t41fti. tore il. l'bIü*2.'I.. il ne foutait pas ? o1e 4'a014. aodtï4utf tâtâ 3 1111 d'acide p ,",mJth;yl"61utactoniquc. bats UN hrb..t4i'I.U' eu* . papier dans les syatôatett Ï et 11, le "f1.hr.4' '8.nt. des valeurs de it, qui dont tespèol1Vêmetit 4. eflâ ât de 0,18, et il migre pat 1te . une 41'àn.' qui <tt)t éppï'6* ximâtlvomont la moitié de celle e1bt)s4<t 1 la terri- hr1nê.
Dans une répartition de Oyais, le eit'!<!'i<sh<MM A se oooporto finalement tt'3ad' è là é3,tliitti dans un syatèmo alcool ent11iu. t te\iti6i\ûl fiôtàftl j solution aqueuse saturée de ehl6)ï'$ 46 8t aelUtioa aqueuse r3,,i,r.l,a décida 'hl0hI4iuG (9!t<)t 11 s'enrichit, en 95 6tbdë6t aux .,4' , 1$', tandi que la iorrichrya1ne apparait ddb8 les c3,f , t 6û.
4) Cn no Connaît 10 d80'. itfa.8. al le produits d' dto1Ü' du La composition iléitentaire est toutefois Mt'6w'aMt 4itt4ftU.. de 4élit de la ar,ar. pour le ôpaHt il est indiqua 1 0 . 50,9 Si H III 6. 9 . N 10. { 1I'é 6t? , M coprogène aa d4ùompoâe 44jê à joeed. Pué un 6hï'ûaàtû" Efauntae our papier, le 4Îpeegbalo ptèàünto dds ".tul de Pt qui Sont respectivement dé 0 43 (système Ï3 et de 095 (système II).
La lerr1ohr181n-. la dasttr1ht1.1.. tiiûii
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que les dérivée et les $*le do ces ogmpp#dgl fgat Oteaul en cultivant dans de acmcl.u aerqbtool duo W solu- tton nutritive gq,40voç m±#wJîftrç1j w $Dur%* de e<9 et 414gotet ainsi que des aa do lAnp**1"-, 8Ùu !neHa &t S8 on de i'Afptviillut '<!< 478 ou da ut!!t.9s de ces pomohos gnrogt loi4 e 3-* forma-v tlon 4q on igplmt 14 ot/ota la dt8fftrrj,ohryej.ne 4p flUtr** eo oultpv* otq at ag 1 dhaire, ÇA ,afat,G :ta en If 40oppoï exempt eg eer ou en pr6pgrçLnt des 46rty0a oi dos !6'<lN de 909 componé, Tout 90=0 4*4utvçe 14 * w4 p ohryoine et la aa,hv aa axy eg4;
fmogt eormets en 0*40g gran4pe quantités qa loeequo lis M049404 q" 1*8 pro4utoogt spne oultiv6on r4 un mp qm# de eqrf 4trg 444m 4ça pplOM9 u rit!iv s v#hk|hm|d1[ wtw *# ' top (3 foa 4' .w noï?jmeaijiewii do lu -u±1w d Bieroipfili J-'çw sl9tt i m %qï) x$Hqm$M * , f rat abryal4o et fqn e4 foi, op4t* 04ntoigtx M49 yl LMw 1# tg;;çmr en jf du wtlW 04 4*9, Il aguçbq A'4aïm 11$ ? µ t 4$4 tupléo 4 1141P et 1A ',, 4795 * tno40 4040 l tgrypqe wc CM6<K été oog4orv694 dans les aopati&ipf 4" ia 5 fi,AR4*r#tie et d9 çoux 40 ,'.a 3,-çly1î ii?Hni9ttf|i i zmrt#4$ lagettut do '9a Spectre 89 |s *|P4|?#Pff <K.<tt.
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Lors de la culture eu 1 p I.1tnp ;f. t 'I\f' 11 de malt et de gélose, les deux sogobso le QP,qp;4,ap par un mycélium végétatif constitué par 49fl P'i Mggoleooç et yaaifiéea, à partir des cellules 4 .t/I 4qJfC!Up poussent des porteurs de conidies sous fQR 4 pçt4tpo tîntes arronr dies. Les petitea têtpa 3P9ip1ftî 4poii0 serrée des cellules fertiles, do q T A t+ia 4que18, dans ' le.3 chaînes nonrif1. t ffàffmQt) QV épopées par formation d'une purpi :PApttq'ij;J. Da Dg fait, les deux souches sont influai, HW1 P'1ij'$6oe cornue appartenant à la tQm*10 VA9|ffUXvil .11 1.729 (voir Thon et Cimq%t l''n\1 'PJI.:ttt" tit"me... 1926).
#L'autre c.s,c, ,- fff*J*j#l u\'n- TÀ03 et Râper "A oanual ouf the 4"'IU\", .,,. 15. La détermination de V &&|Wr<|<!tftWtyM W fijp' pi atre effec- tuée soit sur la 9 de sj d9 f Ul w soit sur la base do ".'.^ jjP hn deúx vole$ indiquent qe la 9 RJ fi-p f*1?iff *î au UPQ de 1.Aaperg11u$ ohraea '4'fi 4i B de l'Aspergillus ChA'QI, fMf|4l9|9Pnt t It. surtout auy la base de la teinte 4 jnip AftQ, ., 1 forma- tion des sclrot1 , fflfpiie 4 'Oft4t', La. souche 4 2853 est, par 9H9>*f 4f lu 9 jaunâtre des têtes de conidies, de 4 , ,.'rhii I ae ''I''J'fà8 et du caractère ,, o 4pf9ee $91\ qf)j).aa, surattdri-
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sée Aspergillus melleus.
Les caractéristiques de couleur et les caracté-
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rîntîquot morphologiques de la souches 4?85 indiquent son appartenance au groupe de l'Aspergillus terreua et, ë l'in- tôrieur de ce Groupe, à la catégorie.de lliupereillus terreua de 3'ho'Nt tour la culture de 1 ieper.llus melleus L. 2653 ou.de l'Aspergillus terreus i.
4785, on envisage, comme source de carbone et d'azote, des hydrates de carbone,- par exemple le glucose, le sacharose, le lactose, l'amidon
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des alcools* comme le mannitol et le glyev'rolt les acides aminée, par exemple l'ornithine, des peptides, des protéinec et leurs produits de dégradation comme la peptone ou la tryptone, des extraits de viande, des .fractions de céréales solublea dans l'eau, comme le mais ou le froment, des résidus de distillation provenant de la fabrication de l'alcool, des levures, des graines, en particulier dé colza et de soja, dû coton, des sels d'ammonium,
des nitrates et de l'urée. Dans les sels inorganiques, la solution nutritive peut renfermer, par exemple, des chlorures,- des ,
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c-arbonateb# den sulfates, des nitrates de métaux alcaline, dj8 métaux tilcalino-terreux, du magnusium, du zinc et du cîftnganèB0, ainsi que des traces de fer (moine de 14' aolt. par litre $ ,
La culture a lieu de manière aérobiec'est-à-
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dire par exemple en culture de ourtaoo au ropodt ou de préférence de manière '!.itl.li91'g6e. avec secouage ou agita- tion avec de l'air ou de 1 ' oxygène dans des flacons ogttde ou dans les termenteurs connue Comme température , éon- Vient une température comprise entre 16 et 4000t dé prêt'..
rence une température de 2700â Dans ce cas la solution nutritive présente en cénéral un effet forrîchryoînique notable au bout de 4 il 1 J,. jours.
L'activité ferriehrysiniquo peut être déterminée par voie iîcrobiologîque à l'aide du test de Benitas modifié Z-erb 2ah er el: ses collaborateurs, "Areh< lfii}i..flob101.'' 22. pages 325 et suivantes (1960)7' On utilise, f comme
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solution-test, une solution de ferrimycine d'une teneur
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de 0,01 m5 par litre, et comme sôuthé-testî le StaphylocoecttB aurcus.
On peut aussi 4Jterlnr par voie optique la concentration en de 16 solution dit culture à cet effet, on secoue pendant 5 minutes 5 car du liquidé de culture avec 1t5 g do chlorure do sodium, avec un contai- mf.1t:ru cube d'une solutîoneà 0.1 r" de sulfate tcrJ1(j\l' tt avec 5 CM3 d'alcool bensylique, s?pnro par oentr1fucation.
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filtre la phuse organique .et détermine l'extinction de
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cette dernière z 420 Me.
Óomme échantillon de comparaison,
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on se sert d'un extrait préparé de la même manière à partît
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d'une solution nutritive non'*ea86meneoet
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Au bout de 4 à 12 jours, les sulfurée acquièrent un* activité correspondant à une quantité de 300 à 400 mg
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de ferriehryeine pure.
On ajoute à la culaure, gar litre un grima de chlorure ferrique. L'addition de fer peut aussi avoir lieu
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vers la fin de la fermentation. On sépare 1.. aqo6U.u du filtrat de culture, après quoi la lIajnur. pu,;,t1. de la sidéraalne S8 trouve dans le filtrat (le Q.11 ttU'.. Q,piI14ú1;. des quantités notables de cette substance restent adhérente
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sur le mycélium.
Il est en coastèquence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage. Conviennent par exemple à cet effet l'eau et/ou des alcools aqueux, comme le méthanol aqueux*
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Pour isoler la ferrichrvoino à partir du fil- trat de culture, on paut procéder 13uira4t des rth04.. connues 'D..11.....4.....t utiliser, par exemple, l'un. des méthodes opératoires ou oobina1eo. qui on* Indiquât* ci-apràs 1) On peut utiliser des ageata 4'''.011>1''-. par exemple dos eharbona actifs comme la J1O:
rlt.. de terre$ activ4es tome la tzoancQ1\itl. la terre à foulon ou la tloridîne, ou des adsorbants résineux comst Ilanattes L'élut ion des adsorbate a lieu avantageusement avec des Mélangea aqueux de solvants organiques miscibles A l'eau,, par exemple avac des mélangea d'eau et de méthanol, d'eau
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et de pyridine, d'acide acétique dilué et de méthanol, ou d'eau, de méthanol, d'acide acétique glacial et de butanol.
Un mulange de 4 parties en volume d'eau et d'une partie on volume de pyridine s'est avéré particulièrement approprié pour l'élution d'un adsorbat de franconite et de norite.
2) On peut de plus soutirer la ferrichrysine d'une solution aqueuse 4 l'aide de noyvants organiques, Pour ce procédé d'extraction, des accola organiques supérieure, par exemple l'alcool benzylique ou l'alcool isopropylique, se sont avérée particulièrement appropriés* Dans ce cas, on ajoute avantageusement à la phase aqueuse un sel inorganique, par exemple du sulfate d'ammonium ou du chlorure de sodium.
A partir des extraite organiques obtenue, la ferrichrysine peut être obtenue soue tore* enrichie soit par évaporation du solvant, soit par préci- pitation à l'aide d'un solvant organique convenable, par exemple l'éther* l'ther de pétrole ou l'acétate d'éthyle.
3) Une autre méthode d'enrichissement de la ferrichrysine consiste à la répartir entre une solution aqueuse et une solution de phénol dans le chloroforme, la teneur en phénol de la solution chieroformique pou- vant varier.
4) Une autre méthode pour l'an-ichissement de la
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ferrichryaine est constituée par la chromatographie, par exemple une Chromatographie d'adsorption sur différentes ratières, par exemple sur de la norite, de l'oxyde d'alu- Minium, des silicates de magnésium, du gel de aillée, du
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sulfate de ealoiua, ainsi qu'une chromatographie de réper- tition avec de la cellulose, de l'amidon, du gel de Billot, de la célite et analogues comme substances de support, ou toutefois une chromatographie sur des résines échan-
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seuaes d'ions, par exemple sur du Dowex-50,, de l'Acberlite IRC-50 et analogues.
5) En outre, la ferrichrysine peut être enrichie par une répartition à contre-courant suivant Craig entre
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deux phases sol vantes non-miscibles. Le système solvant suivant s'est avéra particulièrement approprié t n-outanolt alcool benzylique : acide chlorhydrique millinormal ! sosolu- tion aqueuse de chlorure de sodium saturée à 19" (9 : 9 :
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5 : s 5., La deaferrichrysine est formée, à cote de la. jrerriehrysine, par l'Aspergillus melleus 2853 et l'Aspergillus terreus 1a 4785, et peut par suite également être isolée directement du filtrat de culture.
Lors de l'isolement, on élimine avantageusement le fer présent dans le filtrat de culture, par exemple par addition de
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subetajwsea formant des complexes ferrlfères, par exemple la fldrôxqu,na.ns ou l'acide Mthylene-'diamine-' tétracétique.
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On peut, doctement après la -fin de la dermen- tation, ajouter à la bouillie de culture les substances donnant lieu à la formation de complexes ferrifères.
L'addition a lieu avantageusement dans un stade ultérieur du traitement,pour éliminer également des tous de fer- éventuellement entraînés par les agents utilités*
L'Isolement de la desferrichrysine à partir de la solution de culture. lieu suivant les méthode* mentionné$$ pour l'isolement de la feriichrysine.
t'invention concerne également, à titre de produits industriel* nouveaux, la composés obtenue par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.
L'invention *et décrit* plus en détail dans les exemples non-limitatif. qui suivent* data lesquels les températures sont indiqué.. en degré$ centigrade
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EXEMPLE 1
La souche d'Aspergillus melleus L 2853 est cul- tivée de manière Immergée à 27 , dans une culture bien aérée. On utilise une solution nutrosive renfermant, par litre d'eau du robinet, 20 g de glucose, 5 g de L-Aspara- gne, un Gramme de phosphate secondaire de potassium,
un gramme de sulfate de magnésium Cristallisé (mgSO4, 7 H2O),
0,5 g de chlorure de calcium et 2 mg de sulfate de zinc.
La teneur en fer de l'eau du robinet est de 20 à 30 ± par litreLa solution nutritive est stérilisée pendant 20 minutes à 120 . On ensemence avec une suspension is spores renfermant de 150 à 180 millions de spores par litre.
Au bout de 4 à 8 jours, on ajoute aux cultures un grammes par litre de chlorure ferrique et filtre en .ajoutant 2 % de célite. On ajoute alors au filtrat de culture 300 g par litre de chlorure de sodium et extrait la solution limpide & trois reprises avec un volume dix tolu moindre d'alcool benzylique.
On sèche la phase orga- nique avec du sulfate de sodium et y ajoute trois volumes d'éther* On extrait le mélange d'alcool benzylique et. d'ther avec une petite quantité d'eau distillée jusqu'il ce que la phare aqueuse ne présente plus qu'une coloration rouge pâle* On lyophilise l'extrait aqueux, ce qui fait qu'il se forme une poudre rouge,avec un rendement de.300 à 400 mg par litre, qui renferme 80 % de l'activité de la matière de départ.
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On soumet 18,9 g du mélange brut de ferrichrysine à une répartition de Craie en 95 stades, en plaçant la substance dans les sept premiers récipients d'un appareil- lace automatique de répartition (contenu des récipients 25 cm3 par phase). Comme système de répartition, on se sert d'un mélange d'alcool benzylique, d'alcool n-butylique, d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium et d'une solution aqueuse millinormale d'acide chlorhydrique dans le rapport volumétrique 9:9:5:15.
Le colorant brun-roue est essentiellement scindé en un composant principal et en un composant secon- daire qui ont leurs maxima de répartition dans les trac- tions 46 et 75. Cela correspond à peu près à des coeffi- cients de répartition de 0,9 pour K1 et de 3,8 pour K2.
On rassemble les fractions 36 à 60, y ajoute un volume double d'éther et sépare la phase aqueuse, On extrait la couche organique encore à trois reprises avec un peu d'eau, réunit lea extraits aqueux, les sature ap- proximativeaent à moitié de chlorure de sodium et les extrait à plusieurs reprises avec un mélange de phénol et de chloroforme (un kilogramme de phénol par litre de chloroforme). On luvè les extraits avec une solution semi-saturée de chlorure de sodium.
La solution louche au début est clarifiée sur une courte colonne de colite, diluée ensuite avec un volume double d'éther et extrait*
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à plusieurs reprises avec peu d'eau, le colorant rouge- brun passant à nouveau dans la phase aqueuse.
Après avoir lavé à plusieurs reprises les extraits aqueux avec de l'éther, on les évapore sous vide et sèche le résidu. On obtient 8,2 g de ferrchryaine purifiée. Pour la cristallisation, on dissout 16 g d'un tel résidu d'évaporation dans 200 cm3 environ d'éthanol absolu chaud (distillé sur du sodium). La cristallisation démarre rapidement et il se forme 11,6 g de ferrichrysine cristalline sous la forme de bâtonnets d'un brun-rousse On évapore les liqueurs-mères à sec et dissout à nouveau dans de l'alcool absolu. On obtient ainsi à nouveau 0,9 g de cristaux* iour l'analyse, on recristallise à nouveau une prise d'essai dans de l'alcool absolu.
Les bâtonnets de teinte brun-rouge deviennent noirs à 270 , sans fondre Analyse i trouvé t C 43,37 % H 6,08 % Ye 7,09 % N 16,72 %,.
Spectre d'absorption dans l'eau : #max " 415 mu log E 1 % 1@ = 1,48. @ /
Lorsque l'alcool pour la cristallisation m'est pas totalement sec, il se forme en partie des hydrate$ amorphes et en partie des hydrates cristallisant en fragments irréguliers.
La ferrichrysine est aussi bien soluble dans
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l'eau que dans le m4thacol >.OÏde On peut encore tien reprendre aussi la ferridhryeine amorphe (Jusqu'à 5 %) dans de l'alcool 6thyl$QUO absolu. La ttrrithrléldt 86
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sépare toutefois rapidement d'une telle solution $OU
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la forme de courts bâtonnets de teinte ou.-brun qui feutrent z peine sur '.ntonno1tl1trant.
Ces cristaux ne se dissolvent plus que d1tt1cil..nt..t après un chauffage prolongé, 4an.'1'éthol absolu, Le spectre infra-rouge présent* entre #ut"# des bandes à 725, 783t 9?5t 1.060, 1.140 1.200 êâ"l (6pauleoent), à 1.518 C1 (6paul.m.nt)..2?' de, (6pm* leaient),/. ce' (6pau18ment),' l.e68, 1.4JÛ de' (épaulement), à 1.445 ou-41 (6pau1oment).. 1.465t 1.9' on"1 (épaulement), à 1.517. 1.58e* 1.652, 2.930, 3.070 ce, (6paulemont), à .420 oa"1, 8 Orb tîg. 1.
Le cbromatograifime sur papier foulait d"b 16 système Z (butanol normal acide acétique glatir i eau, 4t/!}')1 une valeur de Rt de 0,20 et, dant le eyattttw lx (buta*,! tertiaire acide chlorhydrique OvC4-hôtAal solution aqueuse saturé µ de chlorure 4..o41. 2c1.1, le
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papier étant imprègne avec un mélange d'acétone, d'eau et
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d'une solution aqueuse saturée de chlorure de 40dium 6:3:1), une valeur de nt4' 0,34.
La ferrichrysine est également forsèe lotbquoeu cultive la souche d'Aspergillus terfcus k 478 et $a isole Xû, substance de croissance.
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EXXhtTLE 2 On dissout 4 g de fwyrie Qr11.a.'.
4&Ut.. 100 OU3 d' M, <tjeMte 3 g d# & !t4&O3C7*qulia&e'lA dons J6 0*3 de m6thîmel et Site pendant 24 lieurs à 1. température Ambiante* On wépare ensuite par fllfratlon le précipité agir et extrait le t11t:r..at aveppâl trois roprteso avec du chlo-roforae p<w éliminer le réactif en çxçèep On évapore la pb.aa,' e.q'.10U.. sous vide* On obtient 3,3 S 40 4cu.feJ':r1cb.178;L1\. l 2655 mous la tome 4'un résidu phoque incolore. 9110 *et bien aolvii* 4440 l'eau, la méthanol, l'éthanol, plus <Li.f±*çi3,t gt ii$ pXuï l# dans 1 butaaol, proeque 111801 ubl. 4MI l'acétone, le QblO3."oto::rm- et les zolvaate ltpophlle*.
L'analyse 414 mom taire fournit les valeur$ suivantes 1 C 46,'6" , a 6,98" t\1 15,65% i 0 51,01 Si (calculé), ce qui correspond à la formule brute 02934,0,"Cj'14' Le spectre ultra-violet n'est pas particulièrement carao1l,.t1u. et présente simplement une absorption terminale à 214 wp.
Dans le spectre utraw1'Ougl (pris du* le bromure de potassium), en obse)''Y1 entre autres des bandes à ;e,94 ït, ',4' p, 6,l0u, 6,53 f** 7,04u, '1.'2 f' Ô 1O u, 8,30 p.
U.62 F# 9#60 p et 10,14 p (et* fi8o 3)* Le spectre de résonance nucléaire magnétique de ce composé dans l'acide trilluoracétique pré8.te 1**
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signaux suivante t
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2*07 ppm ! large maximum Correspondant à 4a protons ; groupes CHa.
2v54 ppm ; 1 singlett correspondant à 3n protons ; m3tbylo dans des groupe monta acide aC0thydroxam1que.
4,00 pPm ; large maximum ca= ^e;r.,ïn . 2n protons.
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4,2 . à
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5,1 ppa ; large amoncellement le Oill,0 .. avec des maxima visibles à 4,33 * "'5 fJ1, .,:0' ypm j au total environ 3n pacotons, 8,02 ppm ; correspondant à 3z protons t1n'rlron ; NH pepti-
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dique.
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Le nombre n dans les indications ci-dessus repr6- sente probablement le chiffre 3, eorrsspondant aux trois unités de base vra18.mbla:@mnt identiques î partir des- quelles la molécule est '6 '1..f1éfl" QSriFLE 3 L 1 Aspergillus m( - 1 o u a id. 2853 ast 4ul1v'Q 9 oui- vant le procédé de cul t.urt j uittrgéa, dans une solution nutritive renfermant, par lïtre d'eau glu robinet, 20 g de glucose, 5 g de L-A8p14 ,gin, un gramme de phraphate secondaire de potassium, un g!"(,.1.IDte de sulfate de magné- sium cristallisé (b 0,, ' if 3p O85 S de chlorure de
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calcium et 2 mg de sulfate de ne* On stérilisa la
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solution nutritive pendant go 30 minutée Bout- un?
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pression d'une atmosphère effective,
dans les flacons d'ensemencement ou dans les fermenteurs.On ensemence ensuite avec une suspension de spores comme dans l'exemple
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le Tout en secouant bien ou en agitant, on Incube à 2?', en aérant les cultures dans les fermenteurs avec deux volumes d'air environ par volume de solution et par mi- auto* Après 96 heures environ d'incubation, la solution
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de culture a atteint la teneur maximale en de8èrrichr.78La1 Cette teneur est déterminée à l'aide du test antiB14'ro- iînîque. Etant donné que la solution nutritive re.t.1'7I' de petites quantités de ter, la desferrichryaine fonte* et présente sous la forme de son complexe ferrifère.
340 litres d'une bouillie de culture active d'Aspergillus melleua it 2853, on ajoute 85 g de 8-hMM.roxr quinoléine en solution dans 1,6 litre de méthanol. Au bout d'une heure, on sépare le Mycélium par filtration, en ajoutant 2 % d'Hyflo-Supercel comme auxiliaire de fil-
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tration.
En vue d'éliminer l'excès de 8-hydroxy-quinoléïaob on percole le filtrat à travers une colonne avec 5 litres 4' Aaaberlite IR-45 sous la forme OH*** On ajuste le pK du produit de percolation à une valeur de 7,5 par addition d'acide chlorhydrique. On sature ensuite avec du chlorure de sodium la solution de culture active ainsi obtenu* et l'extrait à l'alcool bensylique. Après avoir évapore les
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extraits, on obtient la 4..terrichr181ne sous la forais
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d'un* poudre âiltaene.aun&tra.
Avec un dontuètre cube d'acide blOh1dr1Qu' b.xanÓrM1. on chauffe pondant $ heures 20 me de de.terri- éhfyèitte U1..pt'. âlfoir diagdub le ré.tAu d,4v&poration tan! de 1''had1 t on hydrogène ah présence d'un &ta6e & ltO4. d.1'tlh. (A4am.). Dans le produit tââêtiothtl, oh tout 4'Ó'1. trois prodUits qui lont poui- titi 4 Id d1Ah4tlrt. et qui, dâüd un Chtôe6togradme ew pépier, &Vdâ ut d1arlg"4. phénol et d'tau (481) coma.
61u&rlt. pedbontett Ittt !a1tur. dé Rt 8ul.antes 1 0,21, 0.$0 t 0,38.
.#î.Ë 4 D"18 2 etie "ool dth111qu', on disait 70 8C dé dB8fëfHchï?y l.n t idlange avec 40 18 dt chlorure toktï4ù* ttiâtmilîodï 4MS a tite d'alcool méthylique* Il Wb fomi ,Uj1,61 watt lolôrfit1ou d'un violet-noix foncé qui vîtè du rougo-otange par addition d'un peu d'acétate
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(le eediuà li'ta114", On évaporé Cette solution à nec téus Vide extrait le résidu avec de l'alcool absolu chaud et .'par. le chlôture di sodtup par filtration.
On évapora le filtrât reprend le iàoîdu dans 0,5 ce* environ d'alcool absolu, filtre et laisse eristallioor à 00* On obtient b3 te 46 ter1.hry"1ne i8tl11sé. qui s'avère unitaire
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dan8 à or6àMt *ur papier dans deux ayetàmea
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solvant% et est identique la f w fcirçrili .36 on dissout 20 99 40 eywiyw 4W8 5 bzz d'acide eM.o)'hydyque 1 9*aQ9 f& et okaufft P*$4*Ab 5 mtea au Mt< lââ,e a 091,gt04, veusombffl ai± dt % devtent glovs proqqje 5' 0 40' cec bous vida.
Dgas 3,< réaidu, on ae 44t&tf ni Acide succinct 1 i*wrt *}W j iqriw 4 e*y #*Mii 0A Ç44u;to , ', 40 mg &t f<$ey< < ' de l'acide sylturttlug 6, 30 çe iW? , 3,4; *<?iv*3ion d'hydrolyse, eg 4Uw a* * u XUff !:w!! $0 ftt,l4t$ Avec une solution 1'' dµ no#4.VD P4 jHNSanHWM 4 pnôaolpî ti 3,éS,nt <!9'!nae 3radi a%fîw <!e'!.0< la filtrat qui *et 1.. fa sffffJPOldiiRdWi* et Fonto"mo les acides volatil , put$ |v | oft * fgvo V44e# ,faisant résetr lt #4 td i sup 4m >,vom"o, go rwp,%44Â on obtient! los pI',k de4git4l 40 p ]|ih44lr|AAWiaA correspondant à !Mi *0| i 45 jÎ'i'r 11 Mdk'II cheuff p daa<! ) fU9*# f 4f diif # #!- °, 19kA avec un centiflètr ew d'*fid M.9af'iam hexenormal et hyteoskne le réi4dw d'év Pe**tipn M p é eace d'un eye 3.'Qwyd yilint CM f) *??# lfi?Hf i,,Q1,:
dabe do 7. r19,1, ,I !W le ,1.' ratton- Bel, on petit déceler troi pppdwj,t gui aa psaitîAf à la aiyde et qui dans mg 9aM fui1 W***1.. avec <<!e 1 e') d!e$) tf4 q,4"4vmtp
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présentent les valeurs de R suivantes s 09219 4,3C! et 0, 38.
EXMLE5 t!.#######
Avec un centimètre cube d'acide chlorhydrique concentré et avec un centimètre cube d'eau, on chauffe
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pendant 20 heures, à 110*, 25 mg de terrlchrysine exempte de ter. Le résidu obtenu en évaporant la solution d'hy- drolyae est dissous dans peu d'eau, puis dilué avec 20 car d'alcool absolu. On hydrogène cette solution en présence de 20 mg d'oxyde de platine préalablement hydrogéné, afin
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de réduire les groupes hydroxylamine en groupes aminogèneet Le produit d'hydrogénation est examiné suivant la méthode
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de oore et Stein ,'l.ri. Soackman, Cr.H'.
Stein, S. àoore, "Analytical Chemistry" 30, 1190 (1958)¯7. On décèle la présence,dans la proportion moléculaire de 3:2:1, des
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acides aminés que sonV1'ornithine, la serine et la glycine.
.EXEMPLE 6
On cultive la souche Aspergillus melleus à 2853 sur la solution nutritive suivante
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<tb> Glucose <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> aparagine <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
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L1gS04' 7 J'20 1,0 bgSO4, ? HgO 1>0
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<tb> CaCl2 <SEP> 0,5 <SEP> g <SEP>
<tb>
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<tb> K2HPO4 <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb>
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ZnS04 t 7 B20 a titi
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<tb> eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> 1.000 <SEP> car
<tb>
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en ajoutas t des Quantités variables de .ù1'-'te terrique.
Au bout de 2 et de 5 jours respectivement, on détermine
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la teneur en f'1'1'1011178in. dans un tout antagoniste et par Maure de l'extinction à 410 mu (on sature les cultures de chlorure de sodium, ajoute un milligramme de chlorure ferrique par centimètre cube et extrait avec la mine quantité d'alcool benzylique, l'extrait étant utilisé pour la mesure), tandis qu'on effectue parallèlement uns détermination du poids du mycélium* Les résultats sont rassemblée dans la fige 2 des dessine annexée.
En abois*** on a porté la quantité, exprimée en [gamma] par litre, du sul- fate ferrique ajouté à la solution nutritive, et en ordon- nées, l'activité, exprimée en millimètres, du test de BOnifas modifié. La ligne en trait plein est relative aux valeurs au bout du cinquième jour, et la ligne de tirets%à celles au'bout du deuxième jour.
En ajoutant 80 \ (par litre de sulfate ferrique,
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on fait tomber la formation de t.rr1oU7'' de 30 a par litre à nota@ de 5 mg par litre..