BE556052A - - Google Patents

Description

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   La présente invention concerna., notamment, deux nouveaux antibiotiques qui, dans ce qui va suivre, seront désignés parles dénominations "cinérubine A" et "cinérubine B", leurs dérivés et leurs sels et les   mélangea   de ces composés, ainsi que les préparations   pharmaceutiques   renfermant ces   composes.     L'invention   concerne   aussi   un procédé de préparation de ces substances et   mélanges   de substances. 

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   Ces cinérubines se forment lors de la culture d'une nouvelle souche d'actionmycètes de la famille des streptomyces, qui n'est identique à aucune des souches indiquées dans l'ouvrage de Bergey intitulé   "Manual   of Determinative Bacteriology", 6e édition, ou dans l'ouvrage de Waksmann et   Lechevaller   intitulé "Actinomycetes and their Antibiotics" (1953) ; cette nouvelle souche d'actinomycètes sera décrite ci-après sous le nom de "Streptomyces cinereoruber Corbaz et al. var.   fructofermentans".   Elle a été isolée à partir de prises d'essais faites dans le sol du Zoo de Zurich et a été conservée dans les Laboratoires de la Demanderesse et à l'Ecole Polytechnique Fédérale (Zurich, Suisse), Institut de botanique spéciale, sous la désignation A 6143. 



   Le Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans forme un mycélium aérien peu abondant qui, au début, est   blanc   puis gris-blanc, et finalement gris-cendre. Il possède des chaînes de conidies qui sont une caractéristique typique de la famille des streptomyces. Les spores sont lisses. Le mycélium végétatif est rouge et constitue un pigment soluble. 



  La croissance dépend relativement peu de la température et le champignon se développe aussi bien à 18  qu'à 40  toutefois, la croissance optimum se situe entre 25 et 32 . 



   Pour donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance du Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans sur différents milieux 

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 nutritifs. Les milieux nutritifs 1 à 7 ainsi que 11 ont été préparés suivant W. Lindenbein,   "Arch.   Mikrobiol." 17, 361 (1952). 



  Gélose synthétique :Croissance grêle, voilée, incolore au bout de trois jours, plus tard rose; mycélium   àérien   poussiéreux, blanc laiteux ou carmin   pâle   au bout de huit 
Jours, gris-cendre au bout de quatorze jours;un pigment soluble rouge rosâtre se forme au bout de quatre jours. 



    Milieu synthétique liquide : Flocons gris-blanc à rose;   pellicule avec mycélium aérien gris-blanc peu abondant; pigment carmin pâle. 



  Gélose-glucose Croissance punctiforme, incolore ou rouge-corail par endroits au bout de trois jours, rouge chair au bout de huit jours; mycélium aérien peu abondante gris-blanc au bout de huit jours, gris- cendre au bout de quatorze jours, substratum rouge chair au bout de huit jours. 



  Gélose-glucose à   l'asparagine :   Croissance comme sur le gélose-glucose; mycélium aérien pous-   siéreux,   blanc crayeux au bout de quatre 
Jours, plus tard gris-blanc,pigment soluble rouge carmin pâle. 

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    Gélose au malate de calcium : Comme pour le gélose-glucose à   l'asparagine. 



  Milieu gélosé (gélatine) à 18  C : Croissance superficielle jaune blanc à rouge jaune clair, mycélium aérien peu abondant gris blancs pigment soluble brun châtaigne intense à brun   rougeâtre;,liquéfaction   très lente, commençant au bout,de 34 jours, 
0,4 cm au bout de 42 jours. 



  Gélose à l'amidon Croissance punctiforme Incolore; mycélium aérien poussiéreux gris-blanc; hydrolyse de   l'amidon    traces   au bout de 4 jours. 



  Gélose nutritive : Croissance peu abondante, jaune clair; pas de mycélium aérien ? pigment faible, brun rougeâtre.   omme   de terre : Croissance lichéneuse, rouge cuivreux au bout de quatre jours, brunâtre à noir de brai au bout de huit jours, pas de mycélium aérien; substratum coloré en noir bleuâtre. 



  Carottes : Croissance lichéneuse, gris-blanc et car- min pâle; mycélium aérien velouté au bout de huit jours, gris-blanc à   gris-cendre   pigment noir bleuâtre. 

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  Lait de   tournesol :   Croissance annulaire, pellicule brun clair; mycélium aérien peu abondant d'un gris blanc, peptonisation au bout de sept jours;pas de coagulation. 



   Le Streptomyces cinereoruber   var.fructofermentans   croît de la façon suivante, d'après la méthode de   T.G.Pridham   et   D.Gottlleb,     "J.Bacteriology"   56,   107    (1948),   lorsqu'on utilise diverses sources de carbone :

   L-xylose .      inuline (-)   L-arabinose   ¯ D-mannite L-rhamnose (+) D-sorbite + D-fructose + dulcite (-) D-galactose        mésoinosite   saccharose (+)   salle ine   maltose + acétate de sodium (-) lactose      citrate de sodium (-)   raffinose   - succinete de sodium (-) 
Les signes ont la signification suivante : + : bonne croissance. utilisation certaine'de la source de carbone mentionnée (+): croissance faible, utilisation douteuse de la source   de   carbone mentionnée        (-)  croissance très faible, utilisation improbable de la source de carbone mentionnée - : pas de croissance, pas d'utilisation de la source de carbone mentionnée. 

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   Le Streptomices cinereoruber var.fructofermentans correspond bien, du point de vue morphologique, au Streptomyces cinereoruber (R. Corbaz, L.Ettlinger,   W.Keller-Schierlein   et H. Zähner,   "Arch.Mikrob.",   en impression), mais se différencie toutefois du point de vue biologique de cette espèce par la faculté qu'il a d'exploiter des sources de carbone différentes. 



   Le Streptomyces cinereoruber   var.fructofermentans   montre en outre certaines analogies avec le S.   purpurascens   
Lindenbein, qui forme toutefois des spores épineuses et montre un spectre absolument différent pour les sources de carbone. Cette dernière constatation est également valable pour le S. Bobiliae   (Waksman   et Curtis)   Waksman   et   Henrici.   



   En ce qui a trait à la préparation des antibiotiques cinérubine A et cinérubine B ou de leurs mélanges, la présente invention n'est pas limitée à l'utilisation du Streptomyces cinereoruber   var.fructofermentans   ou d'autres souches corres- pondant à la description, mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à l'azote. 



   Pour obtenir ces cinérubines, on cultive de manière aérobie une souche de streptomycètes présentant les propriétés du Streptomyces cinereoruber   var.fructofermentans,   par exemple dans une solution nutritive aqueuse renfermant des sels 

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 inorganiques, des composés azotés et, le cas échéant, des hydrates de carbone, jusqu'à ce que cette solution présente une action antibactérielle notable, puis on isole du filtrat de culture la cinérubine A   et/ou   la cinérubine   B   ou des mélanges de ces composés. 



   La solution nutritive renferme comme sels   inorgani-   ques par exemple des chlorures, nitrates, carbonates, sulfates de métaux alcalins ou alcalino-terreux, de magnésium, de   fer,   de zinc, de manganèse. Comme composés azotés, hydrates de carbone et substances favorisant la croissance le cas échéant à ajouter, on citera par exemple   -.

   des   acides aminés et leurs mélanges, des peptides et des protéines ainsi que leurs   hydroly.-   sats, comme les peptones et   tryptones,   des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le maïs et le froment, des résidus de distillation   provenant   de la préparation de l'alcool, des levures, des fèves, notamment de soja, des graines, par exemple de coton, ainsi que du glucose, du saccharose, du lactose, de   1''amidon    etc.   



   La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de   1 air   ou de l'oxygène dans des   flaeons   agités ou dans les fermenteurs connus, de préférence à un pH de 6-8. Comme température, s'avère appropriée une température comprise entre 20 et 40 . 



  En opérant ainsi, la solution nutritive accuse un effet 

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 antibactériel notable en général au bout d'un jour et demi à cinq jours. 



   Suivant la composition de la solution nutritive utilisée, on produit soit un mélange des cinérubines A et B, soit surtout de la cinérubine A ou surtout de la cinérubine E On peut, par exemple, cultiver le Streptomyces cinereoruber   var.fructofermentans   sur des solutions nutritives +enfermant, pour un litre d'eau, les substances suivantes : Solution nutritive   No.     12/41 :   glycérine 20 g, farine de soja 
10 g, chlorure de sodium 5 g, carbonate de calcium 10 g et nitrate de sodium 1 g. 



  Solution nutritive No. 22   1 mannite   20 g, produit connu dans le commerce sous le nom de "Distillers solubles"20 g, chlorure de sodium 
3 g et nitrate de sodium 1 g. 



  Solution nutritive No 19 : mannita 20 g et farine de soja   20 g,   
Lorsqu'on utilise la solution nutritive No. 19, il se forme surtout de la cinérubine   A,   et avec la solution nutritive No.   12/41   essentiellement de la cinérubine B. Avec la solution nutritive No. 22, on produit un mélange des   cinérubines   A et B. 



   Pour isoler les cinéfrubines, on peut, par eremple, se servir des procédés suivants   -. On   sépare le mycélium du filtrat de culture, après quoi on trouve dans   ledit   filtrat 

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 la majeure partie des antibiotiques. Il reste toutefois des quantités notables d'antibiotiques qui sont adsorbées sur le mycélium. Il est en conséquence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage. A cet effet, sont appropriés notamment les solvants organiques au moins partiellement miscibles à l'eau, tels que des alcools, comme par exemple le méthanol, l'éthanol et les butanols, ou des cétones comme par exemple l'acétone et la méthyléthylcétone, ou alors des acides organi- ques ou inorganiques comme les acides acétique ,   chlorhydri-   que ou sulfurique.

   Ces extraits de mycélium sont ajoutés au filtrat de culture soit directement, soit après une concentra- tion préalable sous vide. On extrait avantageusement le mélange à un pH supérieur à 7, à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau, par exemple avec des esters d'acides gras inférieurs, par exemple avec de l'acétate d'éthyle ou de l'acétate d'amyle, avec des hydrocarbures, par exemple avec du benzène, avec des hydrocarbures chlorés, par exemple avec du chlorure d'éthylène, du chlorure de méthylène ou du chloro- forme, avec des cétones, par exemple.avec la méthylpropyl- cétone, la   méthylamylcétone   ou la diisobutylcétone, avec des alcools, comme des alcools butyliques ou des alcools amyliques, avec des éthers, par exemple avec l'éther éthylique, l'éther diisopropylique,

   avec des éthers dibutyliques ou des éthers du glycol, et analogues. A la place de l'extraction des cultures a l'aide d'un solvant, ou en combinaison avec une 

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 telle   extraction   servant d'opération de purification complé- mentaire, on peut aussi obtenir les antibiotiques par adsorp- tion, par exemple à du charbon actif   ou à   des terres activées comme la terre à foulon, et par extraction rubséquente de   l'adaorbat,   par exemple à l'aide d'un solvant organique au moins partiellement soluble dans l'eau, comme l'acétone, le butanol ou la méthyléthylcétone. 



   On peut aussi extraire les cultures directement de la manière indiquée, sans séparation préalable du mycélium. 



   On peut également obtenir un autre enrichissement en extrayant à nouveau les extraits organiques, renfermant les antibiotiques, avec une solution acide aqueuse d'un pH inférieur à 5, la majeure partie de l'activité antibiotique passant dans la phase aqueuse. Une quantité moindre d'activité reste dans la phase organique. Après avoir été réunies, les solutions aqueuses acides sont ensuite de la manière décrite extraites à nouveau à un pH supérieur à 7, avec un solvant organique non miscible à l'eau. On peut répéter cette opération plusieurs fois. Comme solutions aqueuses acides sont appropriés des acides dilués comme les acides acétique, chlorhydrique ou sulfurique, ou des solutions tampons comme les tampons à base de citrate ou de phosphate. 



   La répartition entre une solution acide ou une solution aqueuse alcoolique   et un   solvant non miscible à l'eau constitue un bon procédé de purification et, le cas échéant, 

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 de séparation des nouveaux antibiotiques. La   répartition   a lieu avantageeusement suivant le procédé à contre-courant dans des appareils appropriés. La chromatographie est également appropriée pour la purification et le cas échéant pour la séparation. L'obtention des antibiotiques purs sous forme cristalline a lieu par exemple deas des solvants organiques comme l'acétone, le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, des mélanges d'acétone et de méthanol, des mélanges d'acétone et d'éther, des mélanges d'acétone ot d'éther de pétrole ou dans des mélanges de benzène et de méthanol.

   Pour la recristal- lisation, on se sert des   marnes   solvants ou aussi de solutions organiques aqueuses, par exemple d'alcools   dilué;,   d'acétone diluée, etc. 



   L'antibiotique que constitue la cinérubine A cristal- lise en paillettes renfermant beaucoup de soldant, qui par séchage à l'air ou sous vide se décomposent en une poudre rouge foncé, d'un point de fusion de 155-157 . L'analyse élémentaire fournit les valeurs suivantes: C = 61,12%, H   =     7,03%,   N =   1,91%,   OCH3 = 4,08%. Le spectre d'absorption ultra-violet présente des bandes aux longueurs d'ondes suivantes : 234 mu ( log E = 2,28), 258 mu (log E = 2,36), 292 mu (log E = 1,92), 475 m  (log E =   2,05),   495 m  (log   E =   2,11) et 530 m  (log E = 1,94).

   Dans le spectre infra-rouge, on peut voir des bandes, entre autres aux longueurs   d'ondes   suivantes :2,9   3,4  , 3,5   5,77  , 6,06  , 6,21  , 

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 6,81     7,02     7,06   7,21  , 7,55  , 7,68  , 7,88  ,   8,14   8,56  , 8,88  , 9,05  , 9,56 9,84   10,37  ,  , 10,78  , 11,19  , 11,31  , 11,79  , 12,32  ,   12,71   (bande avec pointe triple), 1µ,la  , 13,49  .   13,75   et 14,21 cinérubinone. 



   Lors de l'hydrolyse avec des acides minéraux dilués, l'antibiotique que constitue la   oinérubine   A se décompose en deux composants glucidiques réducteurs et en une aglycone neutre ayant un effet antibiotique, la à Cette dernière forme des cristaux rouge-brillant fondant 220 . 217 - C - L'analyse élémentaire fournit les valeurs suivantes 63,70%. (C)CH3 = H = 5,38%, 3,42%, OCH3 spectre   =     7,27%   et hydrogène actif = 1,26%. Dans le : ultra-violet, on peut voir des bandes aux longueurs d'ondes suivantes 234 m  E = (log 3,01), m  258 E = (log m  2,68), 294 E = (log 2,25), 470 m  495 m  (log   E -     2p30),   E = (log 2,34), m  515 m  (log   E -     2,28)   et 530 = (log E cinérubine   2,20).   



   La 181 . B forme des cristaux orange-brillant qui fondent à 180 - élémentaire L'analyse :C fournit les valeurs suivantes = =   59,76%,   H 6,50%, 30,44%, 0 = N - = 6,38%.   1,78%,   OCH, =   4,54%,   C-CH- 235 m  Le spectre ultra- violet présente des bandes aux longueurs d'ondes suivantes 
1% E (log 1 cm =   2,77),   258 m  (log E =   2,46),   291 m  (log E -   2,03),   297 m  (inflexion), 394 m  (inflexion), 415 m  (inflexion), 471 m  (inflexion), 488 m  (log   E -     2,24), '     497   (log   E .   2,27), 519 m  (log   E .   2,16) et 533 m  

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 (log E = 2,la).

   Dans le spectre infra-rouge, on peut voir des bandes, entre autres, aux longueurs d'ondes suivantes : 
 EMI13.1 
 S,83 Me 3,38 Me 3,58 e, 5,71 ee 6,16 me 6,78 7,02 Me 7â47 Me 7,60 Me 8,06 9, 8,48 g, 8,75 go 9s1 9,72 Me 9,90, 10,18 me 10,62     11,62     ,     12,15     12,43   et   12,85 ,   
 EMI13.2 
 Lorsqu'on hydrolyse de la elnérublne B avec des acides minéraux dilues, il se forme la même   aglycone, à   savoir la cinérubinone, que lorsqu'on hydrolyse de la cinérubine A. 



   Les cinérubines présentent une certaine analogie 
 EMI13.3 
 avec les rhodomycines A et B (H. Boaicmann et collabos,tus,   "Chem.   Berichte" 88,   1792    [19551   et communications antérieures qui y sont citées), mais se comportent toutefois de façon différente lors d'une chromatographie sur papier. En outre,   l'aglycone   obtenue à partir des cinérubines A et   B, à   savoir 
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 la oinérubinone, se différencie de 1,Srhodomycinone par son point de fusion, sa composition analytique et surtout par son spectre d'absorption infra-rouge. 
 EMI13.5 
 



  Les sels de la cinérubine A t de la c1nérub1ne B dérivent des acides inorganiques et   organiques   connus, par exemple de l'acide chlorhydrique, des acides sulfuriques, des acides acétique, propionique, valérianique, palmitique ou oléique, des acides succinique, citrique, mandélique, glutami- que ou pantothénique. Ils constituent des sels neutres ou acides. On les prépare en faisant agir les acides correspondants sur la base libre ou par double décomposition de leurs sels, par exemple du sulfate de cinérubine et du   pantothénate   de calcium. 

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   Les antibiotiques que constituent les cinérubines A et B possèdent une efficacité antibiotique   vis-à-vis   de divers organismes-tests. Si   l'on   utilise comme méthode-test in vitro des séries de dilution (par puissances de 10) dans du bouillon   glucose.   incubées à 37  pendant 24 heures, on a alors les concentrations suivantes qui sont encore inhibantes :

   
 EMI14.1 
 
<tb> Organismes-testa <SEP> Concentration <SEP> inhibane
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> . <SEP> àn <SEP>  g/cm3
<tb> 
<tb> 
<tb> Cinérubine <SEP> A <SEP> Cinérubine <SEP> B
<tb> 
 
 EMI14.2 
 Miorococcus pyogenes, var 0, . 10 M1crococcus pogxes,var.guru pénicillino-résistant 1 10 
 EMI14.3 
 
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,01 <SEP> 0,01
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> 
<tb> Corynebacterium <SEP> diphteriae <SEP> 0,001 <SEP> 0,1
<tb> 
<tb> Baclllus <SEP> megatherlum <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb> 
<tb> Candida <SEP> vuklgais <SEP> 0,1 <SEP> 1
<tb> 
<tb> Endomyces <SEP> aibicans <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb> 
 
 EMI14.4 
 Mycobacterium tuberculosis zij 1 10 Entamoeba histolyt1ca.

   ++) 33 100 +) Cultivé dans le milieu synthétique de kirchner avec de   l'albumine bovine à 5  100; ; examen de la croissance   au bout de 2 semaines. 
 EMI14.5 
 



  ++) Cultivé dans un milieu de acc-namobs9 examen de l'effet aminbicide au bout de 24 heures. 

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   Le développement du virus de l'influenza sur des membranes isolées de chorioallantois du poulet provenant d'oeufs ayant 14 jours d'incubation est encore inhibé par les cinérubines A et B à une concentration inférieure à 1  g/cm3, tandis que le tissu de chorioallantois   lui-même   n'est pas toxiquement endommagé par 100  g/cm3. 



   De plus, les   cinérubines   exercent une forte ac- tion d'inhibition sur la croissance des tumeurs; c'est ainsi que la croissance d'une tumeur de   souris,   l'adénocarcinome EO 771, est fortement inhibée. 



   En dehors du procédé de préparation des antibio- tiques cristallins dénommés cinérubine A et cinérubine B et de leurs sels neutres et acides, la présente invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les com- posés indiqués proprement dits, notamment les sulfates, chlor- hydrates, acétates et   pantothénatea   de ces cinérubines, ainsi que les produits de leurs transformations obtenus par hydro- génation ou oxydation, ainsi que les produits de scission tels qu'on les obtient par exemple par hydrolyse des cinérubines A et B. 



   Les antibiotiques   dénommés   cinérubine A et ciné- rubine B, leurs sels et dérivés, les produits de transformation et de scission indiqués ci-dessus, ou des mélangea   correspon-   dants peuvent être utilisés comme médicaments. 

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   Par exemple sous la forme de préparations phar- maceutiques renfermant les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, appropriée pour une application entérale, parentérale ou locale. 



  Comme matières de support, entrent en ligne de compte les substances ne réagissant pas sur les nouveaux composés, comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyl-   tques,   des gommes, des polyalcoylène-glycols, la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus. Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter, par exemple, sous la forme de comprimés, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes, de suppositoires ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances au- xiliaires, telles que des agents de conservation, de stabili-   sation,   des agents mouillants ou émulsifiants.

   Elles peuvent encore renfermer aussi d'autres substances thérapeutiquement précieuses. 



   L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Dans ces exemples, les températures sont indiquées en degrés centigrades. 

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   Exemple 1 
On prépare une solution nutritive de la composition suivante: 20 g de farine de soja, 20 g de mannite et un litre d'eau du robinet, puis l'ajuste à un pH de 7,8. On transvase cette solution ou un multiple de cette dernière dans des fioles coniques d'un volume global de 500 cm3 (remplies chacune avec 100 cm3 de solution nutritive) ou dans des fermenteurs de 500 litres (remplis chacun de 300 litres de solution nutri- tive), puis stérilise pendant 20 à 30 minutes sous une pression de 1 atmosphère. On ensemence ensuite avec jusqu'à 10% d'une culture végétative, partiellement sporulante, de Streptomyces cinereoruber var.   fructofermentans   et incube, tout en secouant bien ou en agitant, dans les fermenteurs, à 27 , en faisant passer de l'air (environ un volume d'air stérile par volume de solution nutritive et par minute).

   Après 70 à 120 heures de croissance, on filtre les cultures, en ajoutant un adjuvant de filtration, suivant le volume soit à travers un entonnoir filtrant, soit à travers un filtre-presse ou un filtre rotatif, et débarrasse ainsi du mycélium et d'autres composants solides la solution aqueuse antibiotiquement active qui renferme es- sentiellement de la cinérubine A. 



   Exemple 2 ----------- 
Si l'on utilise à la place du milieu indiqué dans l'exemple 1, les solutions nutritives a, b, c, d, ou e décrites ci-après, on obtient après avoir, d'une manière analogue, 

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 stérilisé ensemencé avec du Streptomyces cinereoruber var. fructo èrmentans,   incubé '  à 27  et filtré, des solutions aqueuses anti- biotiquement actives, les solutions nutritives a, b, c, et e permettant d'obtenir un mélange de cinérubine A et de cinérubine B, et la solution nutritive d permettant d'obtenir essentiel- lement de la cinérubine B. a) 10 g de glucose brut,   5   g'de peptone, 3 g d'ex- trait de viande (Oxo Lab Lemco), 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stérilisation:

   7,5. b) 10 g de glucose brut, 10 g de "Distillers solubles", 1 g de nitrate de sodium, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium et 1 litre d'eau du   robinet,   pH avant stérilisation :   7,5.   c) 10 g de glucose brut, 20 cm3 d'eau de gonflement du mats (corn steep liquor), 2 g   d'hydrophosphatu   secondaire de potassium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stérilisa- tion : 7,5. d) 20 g de glycérine, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium, 1 g de nitrate de sodium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant sté- rilisation : 7,5. e) 20 g de mannite, 20 g de "Distillera solubles", 3 g de chlorure de sodium, 1 g de nitrate de sodium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stérilisation :  7,8.   

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   Exemple 3 ----------- 
Avec 25 litres d'acétone, on agite le résidu de filtration d'une charge de 50 litres obtenue suivant l'exemple 1 ou 2, puis filtre à nouveau. On répète cette opéra: tion deux fois, après quoi on réunit les solutions acétoniques renfermant l'antibiotique, les concentre sous vide à 5 litres et les réunit au filtrat de culture-. On extrait alors cette solution à un pH de   8,5   avec 70 litres d'acétate d'éthyle dans un extracteur "Westfalia", la totalité de   l'activité   anti- bactérielle passant dans la phase organique. On lave ensuite l'extrait à l'eau, concentre sous vide à 5 litres et extrait ensuite à plusieurs reprises avec de l'acide acétique demi- normal.

   La solution d'acétate d'éthyle montre   maintenant   une activité antibactérielle minime, tandis que la majeure partie de l'activité est trouvée dans les solutions   acétiques.   Ces solutions teintées en rouge-orange sont réuniesamenées à un pH de 8,5 à l'aide d'une solution binormale de carbonate de sodium, ce qui fait que la teinte vire au violet, puis elles sont extraites à nouveau à l'acétate d'éthyle. On extrait à nouveau l'extrait obtenu à l'acétate d'éthyle avec de l'acide acétique demi-normal, après quoi celui-ci est, comme décrit,   alcalinisé   et extrait. Finalement, on sèche la solution d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium et l'évapore sous vide.

   On obtient ainsi les bases brutes, colorées en rouge foncé, qui ont une forte activité antibactérielle. 

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   L'extrait d'acétate d'éthyle qui, après le traite- ment décrit à l'acide acétique   dilué,   présente encore une activité natibactérielle relativement minime est lavé à l'eau, séché sur du sulfate de sodium et évapore sous vide. On obtient une huile rouge, fluide. On traite cette dernière avec de l'éther de pétrole, ce qui fait qu'on obtient une poudre rouge qui, suivant la solution nutritive utilisée, est constituée par de la   oinérubine   A, par de la cinérubine B ou par des mélanges de celles-ci. 



   Exemple 4 
On soumet 2,95 g des bases brutes obtenues suivante les exemples 1 et 3 à une répartition à contre-courant com- portant 120 stades, en utilisant le mélange de solvants sui- vant : 5 parties en volume de tétrachlorure de carbone, 4,5 parties en volume de méthanol et 0,7 partie en volume d'eau. 



  Après évaporation sous vide, à 30 , du contenu des divers réci- pients de répartition, on trouve dans les stades 7,51, 63, 88 et 115 de petits maxima de substance et d'activité, tandis que,la quantité principale de la substance et de l'activité est enrichie au stade 22. On réunit les fractions 14 à 35 et obtient 1,61 g de cinérubine A qui, par chromatographie sur papier, s'avère unitaire. On la recristallise dans un mélange d'acétone et de méthanol, et elle forme des paillettes renfer- mant beaucoup de solvant qui, par séchage, se décomposent pour 

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 donner une poudre rouge foncé, d'un point de fusion de 155-157 . 



  Analyse : C 61,12%, H   7,03%,   N   1,91%,   OCH3   4,08%.   Spectre d'absorption ultra-violet dans l'alcool absolu: on observe des bandes à 234 mu (log E = 2,28), 258 m  (log   E .   2,36), 292 m  (log   E =   1,92), 475 mu (log E = 2,05), 495 m  (log E= 2,11) et 530   m   (log E = 1,94).

   Spectre d'absorption   Infra-   rouge dans le nujol : on observe des bandes,entre autres, aux longueurs d'ondes suivantes :  1 2,9    , 3,4  , 3,5  , 5,77  , 6,06  , 6,21  , 6,81  , 7,02  ,   7,06    ,   7,21    ,   7,55    ,   7,68    , 7,88  , 8,14  , 8,56  , 8,88  , 9,05  , 9,56  , 9,84  ,   10,37    , 10,78  , 11,19  , 11,31  ,   11,79    ,   12,32    , 12,71  , (bande avec pointe triple), 13,10  ,   13,49    ,13,75   et   14,21    . 



   Dans un chromatogramme sur papier avec filtre rond et le système de solvants   benzène-forma ml de,   la cinérubine A montre une valeur de RF de 0,55. Dans les   marnes   conditions, la   rhodomycine   A et la   rhodomycine   B restent au point d'impact des gouttes. 



   Exemple 5      
On chauffe pendant 20 minutes à 100  une solution de 50 mg de cinérubine A dans 10 cm3 d'acide sulfurique normal. 



  Il se sépare alors des flocons rouges..Après refroidissement, on extrait la solution rouge à l'acétate d'éthyle, ce qui fait que la teinte passe dans   'la   phase organique. 



   On neutralise la phase aqueuse avec une solution binormale d'hydroxyde de baryum; filtre et évapore sous vide. 

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  Le résidu renferme au moins deux   glucides     réducteurs   qui, dans un chromatogramme sur papier, avec un Mélange de butanol et d'acide acétique glacial   (9:1)   saturé d'eau, présentent respectivement des valeurs de RF de   0,13   et de 0,38. 



   Les extraits d'acétate d'éthyle colorés en rouge sont   lavés à   l'eau, séchés sur du sulfate de sodium et évaporés sous vide. Dans un mélange de benzène et de méthanol, on ob- tient la   cinérubinone   en cristaux rouges brillantspoint de fusion = 217-220 .Analyse : C 63,70%, H 5,38%   (C)CH3     3,42%.,   OCH3   7,27%,     H   act.   1,26%.   Spectre d'absorption ultra-violet dans l'alcool absolu: on observe des bandes à 234 m  (log E = 3,01), 258 m  (log E = 2,68), 2,94 m   (log   E =   2,25),   470 m  (log E =   2,30),   495 m  (log E = 2,34)515 m  (log E = 2,28) et 530 m  (log E = 2,20).

   Spectre d'absorption infra-rouge dans le bromure de potassium: on observe des bandes, entre autres, à 2,87  , 3,00  , 3,25  , 3,43  , 3,52   .   5,78  , 6,06  , 6,24   ,   6,88  , 7,07  , 7,55  , 7,69 8,30   8,13    ,  , : 8,54  , 8,84 9,34   9,06    ,  , 9,56  , 9,75  , 9,98  ,   10,07   10,28  ,   10,47    ,   11,01    ,   Il..59    ,   11,87    , 12,02   ,   12,72  ,   13,31    ,   13,88   14,10    . et   14,49   : 
Dans un   chromatogramme   sur papieravec le système de solvants   benzène-formamide,   la   cinérubinone   pr sente une valeur de Rp de 0,8.

   Avec   3.'acide   sulfurique concentré, elle donne   une teinte   d'un bleu pur. 



   La cinérubinone exerce un effet antibiotique vis- à-vis de certains organismes-tests. 

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   Exemple 6 ----------- 
On soumet 16 g des bases brutes obtenues suivant les exemples 2 (solution nutritive d) et 3, à une répartition à contre-courant en.300 stades, en utilisant le mélange de solvants suivant; 7,5 parties en volume de tétrachlorure de carbone,   6,375   parties en volume de méthanol et 1,125 partie en volume d'eau. Le contenu des divers récipients de réparti- tion est évaporé sous vide à 30 .A coté d'assez petits maxima d'activité et de substance, par exemple aux stades 260 à 295, la cinérubine A se trouve dans les stades 54 à 70 et la ciné- rubine B dans les récipients 17 à 37. On réunit les solutions de ces récipients et y ajoute 500 cm3 d'eau. On sépare ensuite la phase Inférieure et extrait encore la phase supérieure à deux reprises avec chaque fois 200 cm3 de tétrachlorure de carbone.

   On réunit les extraits, les lave avec un peu d'eau, les sèche sur du sulfate de sodium et les évapore sous vide. 



  On dissout le résidu dans 50 cm3 de benzène et ajoute à chaud un peut de méthanol. En laissant reposer, la cinérubine B se ..sépare sous la forme de cristaux de couleur orange. On les recristallise dans le même mélange de solvants et ils fondent à   180-181 .   Analyse : C 59,76%, H 6,50%, 0 30,44%, N   1,78%,   OCH3   4,54%,   C-CH3 6,38%.

   Le spectre d'absorption ultra-violet dans l'alcool absolu présente les bandes suivantes :   #   max (m  235 258 291 297 394 415 Log E 1% 1cm 2,77 2,46 2,03 2,025 1,56   1,67   

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   # max   (m ) 471 488 497 519 533 log E 1% 2,17   2,24   2,27 2,16 2,10 
1 cm Spectre infra-rouge (dans le bromure de potassium): on observe des bandes, entre autres, à : 2,83  , 3,38  , 3,58   ,   5,71  , 
 EMI24.1 
 6,16 go 6,78 go 7sO2 go 7e47 go 7,60 go 8,06 go 8,48 go 8,75 9, 9,41 go 9,72 /1, 9,90 go 10,18 /1, 10,62 go 11,62 go 12,15 go   12,43   et 12,85   .   



   Exemple 7      
On chauffe pendant 20 minutes à 1000 une solution de 50 mg de cinérubine B dans 10 cm3 d'acide sulfurique nor- mal, puis traite comme décrit dans l'exemple 5. La substance obtenue à partir des extraits d'acétate d'éthyle est identique à la cinérubinone décrite dans l'exemple 5.

Claims (1)

1. Revendications.

   I, Un procédé de préparation de nouveaux antibiotiques, caractérisé par le fait qu'on 'cultive une souche de strepto- myces présentant les propriétés du streptomyces cinereoruber Corbaz et al. var. fructofermentans jusqu'à ce que la solution nutritive présente un effet antibactériel notable et qu'on en isole ensuite la cinérubine A et/ou la cinérubine B ou des mélange de ces composés, Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants: 1) On cultive la souche dans une solution nutritive aqueuse renfermant des sels inorganiques, des composés azotés et, le cas échéant, des hydrates de carbone, dans des condi- tions aérobies, de préférence en culture immergée.

   2) La solution nutritive renferme des substances, favorisant la croissance.

   3)' On utilise comme solution nutritive une solution favorisant la formation de cinérubine A.

   4) On utilise comme solution nutritive une solution favorisant la formation de cinérubine B.

   5) La culture a lieu pendant 36 à 120 heures, à une température comprise entre 20 et 40 6) On extrait du filtrat de culture, à un pH supérieur à 7, à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau, la <Desc/Clms Page number 26> cinérubine A et/ou la cinérubine B qui sont des antibiotiques.

   7) On extrait la cinérubine A et/ou la cinérubine B du mycélium séparé, à l'aide d'un solvant organique au moins partiellement miscible à l'eau.

   8) -On extrait la cinérubine A et/ou la cinérubine B du mycélium séparé, à l'aide d'un acide organique ou Inor- ganique.

   9) Les antibiotiques sont purifiés par adsorption, de préférence à l'aide de charbon actif, et par extraction de l'adsorbat à l'aide d'un solvant organique au moins partiel- lement soluble dans l'eau, puis le cas échéant ils sont séparés.

   10) Les antibiotiques sont purifiés par répartition entre une solution aqueuse et un solvant organique non mis- cible à l'eau, puis le cas échéant ils sont séparés.

   Il) La répartition a lieu suivant le procédé à contre- courant.

   12) On obtient la cinérubine A et/ou la cinérubine B dans un solvant organique, sous-forme cristalline.

   13) Les antibiotiques sont préparés sous la forme de leurs sels cristallins avec un acide inorganique ou or- ganique en faisant agir cet acide sur les bases libres des antibiotiques ou par double décomposition d'un sel des anti- biotiques et d'un sel de l'acide correspondant.

   II. A titre de produits industriels nouveaux <Desc/Clms Page number 27> 14) Les nouveaux antibiotiques dénommés cinérubine A et cinérubine B, leurs dérives et leurs selsainsi que les mélanges de ces composés.

   15) Le nouvel antibiotique cristallin dénommé ciné- rubine A.

   16) Le nouvel antibiotique cristallin dénommé ciné- rubine B.

   17) Les sels cristallins du nouvel antibiotique dénom- mé cinérubine A, obtenus avec des acides inorganiques ou orga- niques .

   18) Les sels cristallins du nouvel antibiotique dénom- mé cinérubine B, obtenus avec des acides Inorganiques ou or- ganiques 19) Les sels acides du nouvel antibiotique dénommé cinérubine A, obtenus avec des acides inorganiques ou organiques.

   20) Les sels acides du nouvel antibiotique dénommé cinérubine B, obtenus avec des acides inorganiques ou organiques.

   21) Les sulfates de la oinérubine A.

   22) Les sulfates de la cinériubine B.

   23) Le chlorhydrate de la cinérubine A, 24) Le chlorhydrate de la cinérubine B.

   25) Les acétates de la cinérubine A.

   26) Les acétates de la cinérubine B.

   27) Les pantothénates de la cinérubine A.

   28) Les pantothénates de la cinérubine B. <Desc/Clms Page number 28>

   '29) Les produits tels qu'on les obtient en oxydant ou en réduisant les antibiotiques dénommés cinérubine A et cinérubine B.

   30) Les produits de scission tels qu'on les obtient lors de l'hydrolyse des antibiotiques démommés cinérubine A et cinérubine B.

   31) Le produit de scission hydrolytiqyue dénommé cinérubinone.

   32) Les préparations pharmaceutiques renfermant de la cinérubine A et/ou de la cinérubinecomprimés, B. ou des produits qu'on peut en obtenir par oxydation, réduction ou hydrolyse, des sels de ces composés ou des mélanges de ces substances.

   33) Les préparations pharmaceutiques se présentant sous la forme de cim de dragées, en ampoules, sous la forme d'onguents,de crèmes,de poudres, de suppositoires, de' solutions, de suspensions ou d'épuisions renfermant de la ciné- rubine A et/ou de la rubine B, ou des produits qu'on en obtient par oxydation, réduction ou hydrolyse et/ou des sels de ces composés ou des mélanges de ces substances, III. L'utilisation, pour préparer la cinérubine A et/ou la ainérubine B, d'une souche de streptomyces présentant les propriétés du streptomyces ci erecrober Corbaz et al. var. fructofermentans.