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Nouveau nonapeptide-amide et sa préparation.
Là présente invention a pour objet un
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nouveau nonapopiide-amide cyclique, en l'espèce la Ser -Ile -ocytocine, c'est-à-dire le S.S'-déhydro-L- cysté'inyl-L tyroayl-L-isoleucyl-L-séryl-L-asparaginyl L-cyétéinyl-L-ptolyl-L-isoleucyl-glyci.no-amide. C nonapeptide.amide diffère de l'ocytocine connue par la présence du radical L-sérine au lieu du radical L-glutamine a la quatrième position, et par la pré- sence du radical L-isoleucine au lieu du radical L- leucine à la huitième position. Par conséquent ce no- napeptide-amide répond à la formule 1 suivante :
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Le nonapeptide-amide cyclique répondant à la formule précédente exerce une action ocytocique analogue a celle de l'ocytocine.
Par contre, il est pratiquement dépourvu de l'action sur la pression sanguine que présente l'ocytocine, et c'est pourquoi son application, pour diverses indications de cette dernière, semble d'un intérêt tout particulier*
Alors que pour l'ocytocine le rapport entre l'activité ocytocique sur l'utérus isolé du rat et l'effet hypertenseur sur le rat est d'environ 90:1, ce rapport est de 2000:1 pbur la Ser4-Ile-8 ocytocine conforme à l'invention L'action ocytocique sur l'uté- rus isolé du rat est mesurés par la méthode de P.
Holton, Brit. J. Pharmacol.3, 328 (1948) et l'activa té sur la pression sanguine est détorminée chez le rat
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par la méthode de J. Dekanski, Brit. J, Pharmacol. 7, 567 (1952), les activités étant indiquées en unités internationales;
une unité internationale (U.I.) corres- pond à l'action dé 0,5 mg du troisième étalon inter- national isolé du lobe postérieur de l'hypophyse et fourni.' par le "National Institute for Médical Research, Mill Hill, Londres,
Pour préparer le nouveau nonapeptide-amide cyclique on condense un acide aminé - l'un de ceux qui constituent le nonapeptide à préparer -, acide aminé qui est protégé sur l'azote (N-protég@) ou S.N- protégé,ou un dérivé fonctionnel réactif d'un tel acide aminé, avec un dérivé, relativement au groupe carboxylique, de l'acide aminé jouxtant le précédent dans le produit final du côté de son groupe carbo- xyliqué et qui est éventuellement protégé sur l'atome de soufre,
ensuite pu bien on libère le groupe mina dans le dérivé dipeptidique obtenu N- ou S.@-protégé et on le condense avec l'acide aminé contigu au groupe amino dans le produit final, acide aminé dont l'azote et, s'il y en a, le soufre sont protégea, @ avec un dérivé,fonctionnel réactif d'un tel acide, ou bien on condense le dérivé dipeptidique obtenu N- ou S.N- protégé, après l'avoir transformé en dipeptide N- ou S,N-protégé ou en un dérivé fonctionnel réactif de co dipeptide, avec un dérivé, relativement au groupe car- boxylique, de l'acide aminé uni au groupe carboxylique dans le polypoptide cherché,
acide aminé qui est évan- tuellement protégé sur l'atome de soufre, et on répète la condensation du coté du groupe amino et/ou la conden- sation du coté du groupe carboxylique avec les dérivés
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d'acides aminé correspondants, en utilisant le glycine- amide ou en formant ultérieurement le groupe glycineamide, jusqu'à ce que soit édifié le nonapeptide-amide
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S,N.S'-protégé, on libère dans ce dernier le groupe amino et les groupes mercapto et on oxyde le L-cyatéi nyl-L-tyrosyl-L-isoloucyl-L-séryl-L-asparaginyl-Lcyetéinyl-L-ptopyl-L-isoleucyl-glycine-amide obtenu pour le transformer en composé S,St.d3ohydragéné répon. dant à la formule 1 donnée ci-dessus.
Il vient d'être
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dit que l'on "répète" la condensation il faut entendre cela au sons large. On peut on effet accroc cher successivement des restes d'acides aminés isolée
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au dérivé tripoptidiquo éventuellement !- ou Son- protégé, ou encore assembler deux par deux des dérivé.
d'autres acides aminés contigus dans le produit final pour faire des dérivés dipeptidiques, unir entre eux
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doux ou 4vontuñ m9nt tro1t dérives 1peptidjque' do ce genre ou en unir un ou doux avec le dérivé tri- poptidique mentionné ci-dessus ou avec des dérives d'acides aminés isolés pour obtenir des dérivés poly-
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poptidiques, par exemple un dérivé tdtropoptidjquo et un dérivé pontapoptidiquo, et condenser ces derniers pour obtonir lu nonapoptide-amido S ,N,S '-protégé indi- que plus haut*
Comme groupes protecteurs pour les
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groupes aminés on pout envisager dos restes éliminable par hydrolyse acide ou par hydrolyse alcaline, comme la reste tortiobutoxycarbonyle et le restqtr1tyle (triph4nylmdthyle) ou le reste trlfluorac4tYle, des restes éliminables par solvolyse catalycéopar un acide,
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par simple par traitement avec l'acido bromhydrique dans l'acide acétique glacial ou par traitement avec
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l'acide triflumaoétique, comme par exemple des restes alcoxycarbonyl#lnflriou le reste bonzyloxycarbonylo ou à nouveau le reste tertiobutoxycarbonylo, dos restes éliminables par réduction, par exemple par traitement avec un Métal alcalin dans l'ammoniac,
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commolo reste tosylo (p-tolune-8ulfonyle) ou la r te bonzyloxycarbonyl0, ou, dans dos composantes dépourviieti de cystéine, des rastas éliminablos par hydrogénation,
comma' par exemple encore le reste benzyloxycarbonylo.
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Comme7 groupe protecteurs du groupe sulfhydryle on peut .envisager plus particulièrement le reste bonzyle qui peut être éliminé par réduction, par exemple au moyen du sodium et de l'ammoniac liquide, et également par exemple le reste trityle qui peut être élimine au moyen du sodium et do l'ammoniac liquide, do l'acide bromhydrique dans l'acide acétique glacial, de l'acide trifluoracétiquo bouillant ou, mieux encore, au moyen d'un sel d'argent ou do mercure et do la pyridine dans un alcanol inférieur.
Les acides aminocrboxyliquos ou les peptides dont l'azote et éventuellement le soufre ont été protégés sont condensés par exemple avec des déridés d'acides aminés ou des dérivés de peptides comportant un groupe amino libre et un groupe carbo- xylique modifiée par exemple estérifiés au moyen d'un
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carbdl1m1do , par exemple au moyen du N,Nt..dicyclo. hoxyi-carbodiimldo dans le dimthylfaxm4m.da et/ou llacjtonitr11e.
Comme dérivés fonctionnels réactifs
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d'acides aminée ot plus spécialement do peptidos Conte-
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; nant un groupa omin, protégé, conviennent par exemple leurs azides, corps quo l'on peut obtenir facilement par exemple par réaction dos esters correspondante, comma l'ester méthyliquo, avec l'hydrazine ot traite-
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Ttont des hydrazidoa par l'acide nitreux, On peut en outra envisager,'on particulier commo dérivés d'amino- acides isolée N-protdgdt égâlement leurs esters réac..
tifs, comme par exemple leurs esters p-nitro-phényliquos, et loura anhydrides mixtes formes avec dos acides
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alcoxy-formiques inférieurs, tels qu'ils sa forment par exemple à partir dos acides libres sous l'action do chlorotoxm1atosd,.lkyle.: On fait réagir cas dérivés fonctionnels réactifs d'amro-acidos ou do poptidos N-protégés par exemple avec, cornue dérivés de poptl- des ou d'amino-acides relativement au groupe carboxy-
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liquo, des esters alkylipuas inférieurs do peptides ou d'amino *scido8, avec des ,sols do poptides ou d'amino-acidos ou avec des hydrazidos N2protégéa par exemple avec dos 2-tortiobutoxycarbonyl-hydrazidoS)
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de poptidos ou d'amino-acidos dont le groupe hydraz1do protégé pout dtre transformé en groupe hydrazido ! j libre aprbe la réaction, p4,r exemple par solvolyae catalysée par un acide,
au moyan do l'acide trifluor- acétique ou au moyen de l'acide chlorhydrique dans un alcanolt
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Une suite do,- réactions conforme à l'in- vontion comprendra par exemple les étapes décrites ci-Apr'" D'une paet pour préparer lo dérivé ponta. poptidique qui devra s'unir par son groupe amino
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terminal au dérivé tétrapoptidiquo, on transforme un
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ester alkylique ou aralkyliquop par exemple l'ester méthyliquo connu, de la N-bvnzylpxycaxbanyi-L- a.spara ginYÏ-5-bonzyl-L,-cystélnop par traitement avec lhy-. drazi.no, en hydrazido de la N-bonzyloxycarbonyl-L- aspaginyl-S-benzyl-L-cysté1ne, on transforme co
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dernier, au moyen do l'acido nitreux, en nzido corres.
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pondant du dipoptido S.N-protégé, on fait réagir cet azido avoc le L-prolyl-L-isoloucyl-glycino-amide connu,
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ou bien on condense la N-benzyloxycarbonyi-L-aspara-
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ginyl-S-bonzyl-L-cystéine connue avoc le trlpop'>ido- amide mentionné au moyen d'un cnrbodi1mlck' , par exemple au moyen du N.N-dicyclohexyl-car:odi.i.mida , et on transforme le N-bonzyloxycllrbonyl-L...asparngil1' j....
S bonzyl-L-cy8téinyl-L propyl -L-isoloucyl-glycino-
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amide obtenu dans les deux cas, par traitement avec l'acide bromhydrique dans l'acide acétique glacial chaud
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ou avec l'acide trifluorncétiqud', on Lsparn9Jnyl- benzyl.L-cystinyl-L-propyl-L-isoloucyl-91ycine-amid.
D'autre part, pour préparer le dérivé Utrapept1dlql',)
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qui doit s'unir par son groupe carboxylique terminai au dérivé pentapeptidique précèdent, on fait réagis
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un dérive fonctionnel réactif do la N-benzyloxycarbonyl.
L-1s61eucino. par exemple l'anhydride mixte formé avec un acide alcoxyformiqua inférieur ou l'ostor p-nitro-phénylique do la N-bonzyloxycarbonyl-L-loo.
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loucino, avec un ostor alkyliquo ou aralkyliquo du la
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t-sérino, par exemple avec l'ester méthyliquo,do la t-serine, pour obtenir un ester de la N-bonzyloxy. carbonyl-L-isoleucyl-L-sérino, par exempla l'ester
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mdthyliquo, ou avec un hydrazido e-protdgé do la serine, comme par l'exemple le N2.tertiobutoxYCarbO- nyl-hydrazide do la L-sérino, pour obtenir le N-dérive correspondant do l'hydrazide- da la N-bonzyloxycarbonyl- L-isoloucyl-L-sérino, on traite cet hydrazide ou l'oster m.rnt3onné plus haut,'avec do l'hydrogène cata- lytiquomont activé, on condense l'o8r formé, par oxompe l'ostor m6thyl1quo, ou lo N2...cMdv' de l'hydra-.
zido formé do la Li.solaucyi-L-srinos avoc la S- bonzyl-N-tosyl-L-cyst'inyl-L.tyro81ne connue au moyen d'un cOrbodi1mlde , par exemple nu moyon du N.N1 dicyclohoxylcarboditolde , pour obtenir raspoctivo- mant un octer, par exemple l'ester méthylique, do la S-b6nzyl-N-tosYl-L-cystinyl-L-tyroGyl-L-i$olaucyl" L-sdrin6, ou le N2-ddrivd d'hydrazide du t6trapoptido
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correspondant protdgd sur le soufre ot l'azote, on
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transforme lo premier par traitement avec l'hydrazino ou le second par solvolY8Q catalysée par on acide on, hydrazide do la S-bQnzyl -N-to8yl-L-cy8téinyl-L-tyrosyl L-isoloutyl-L-sérino que l'on convertit, par action
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do l'acido nitroux,
on azido do la S-bonzyl-N-tosyl-
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L-cyat6inyl.t-tyrosyl-L-ieoloucyl-L-sdrinOt On fait en8ite réagir cet azido do t3trapoptido protégé sur f! lo soufra ot l'azote avec lo pontapoptido-umido S-protégé obtenu ci-dessus pour obtenir lo S-benzyl- N-to,yl-L-cystinyl.L.tyrosyl-L-1Goloucyl-L-sryl-L- Q.paraginyl-S-benzYl-L-cY8tinYl"L.prolyl-L-isoloucyl- glycino-amido, on élimine do co corps lus doux rastas 9bon:
.ylos ot lo reste N-tosylo par réduction, par
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exemple par traitement avec un métal alcalin dans
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l'ammoniac, ot on transforme le L-cyst6inyl-L.tyroeyl-
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L-1-toloucyl-L edril-L-asparaginyl-L-cystdinyl-L-prolyl- L 14,010ucyl giycino-emido obtenu par oxydation, par exemple au moyen do l'oxygène ou du forricynnure do potassium, on composé S#Stdéohydrc>gdr-49 c'est-à-diro on Ser 1o8..ocytocino*
Les exemples suivants illustrent la
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préparation conforme à l'invention de la Ser4.Jle8. ocyocine, mais ils ne représentent pas la seule
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forrée de réalisation possible de cotte préparation Toutes les températures sont données en degrés cnâ grades et les painte de fusion sont donnés corrigés.
Les. pouvoirs rotatoires spécifiques sont déterminée clan,4 un tuba de 10 cm de longueur M'aide du polaii- mètre de Lippich de la Société Schmidt et Haonsch.
Les chromatogrammes en couche mince utilisés pour étudier la pureté des produits réaction- ne la sont obtenus sur gel de silico Kieselgol G de la Société "Merck", par la méthode de E. Stahl décrite
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dans Chemikee-Zettung 82, 323 (1958) (voir également M* Brenner et Au Niederwieserp Expetiontîa 16, 378 (!9)). On prépare lessystèmesde solvants en mélan- geant les composantes dans les rapports volumiques indiqués* Pour détecter les produits réactionnels on utilise les méthodes suivantes
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a) méthode à la ninhydrine s se pratique comme à 3.'out- inairo b) méthode au chlore t d'après H.N. Rydon et P.W.G.
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Smith, Nature (Londros) 69,, 922 (1952), modifido par P. Reindel et W. Hoppe, Otem. Bers 87# 1103 1954)
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c) méthode de Folin d'aptes 0, Folin ot V. Ciocalteu,
J. biol. Chem. 73, 629 f1927).
EXEMPLE 1 :
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1) Ester méthylique de la 44-bonzyloxycarbonyla-loo isoloucyl-L-44rinoé On dissout 3214 9 ( 0,122 mole) de N- btnlyloxyc.rbonyl-L-1eoleucne (préparée par exomple d'après Po.,A. Jaquonoud ot R.A. Bol'80nnal,Helv. Chia.
Acta.i4.1 113 (4961)) dans 320 ml do tétrahydrofuranne absolu, on ajoute 17,2 ml (0,124 mole) de triéthyl-
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er4n* et on refroidit à -10 C, A cette solution on ajoute goutte à goutte, -IOOCO 12,1 ml (0,126 mole) 7, de chloroformiate d'éthyle#-Au bout do 15 minutes on ajoute en 5 minutes une solution, refroidie à -5 C, de 19,67 9 (0,12 mole) de chlorhydrate d'ester méthy.
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lique de la L-.4r1no (prépara par exemple d'après Ste Guttmann et R.A, eaiaaonnas, Helv.
Chime Acta a1, 1852 (1958)) et 16,9 ml (0,122 mole) de trithylamine dans du chloroforme absolu. Après avoir agité pondant 4
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heures à OOC on évapora le mélange réactionnel A siccité* sous pression réduite et entreprend le résidu dans 1200 ml d'acétate d'éthyle et 200 ml d'eau. La solu- tion dans l'acétate d'éthyle-est soigneusement lavée à l'eau, puis avec de l'acide chlorhydrique normal, avec de l'eau, avec de l'hydrogéno-carbonate de sodium
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à 5 % et à nouveau avec de l'eau, et elle est séchée sur sulfate do sodium.
Aprhs concentration de la solu- tion et addition d'éther do pétrole, l'ester dipepti dique brut cristallise 1 il fond à 179 - 180 C.
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Pour la purification on recristaliise le produit deux fois dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole. Il fond alors'180,5 -181,5 C.
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JTs7q # + 3,9 (c =. 5 dans le diméthylforrAmide)*- La chromatographie en couche nince dans le-système benzène/acétone 7t3 montre que le produit est bien défini* La détection se fait par la méthode au chlore. b) Chlorhydrate do l'ester méthylique de la L-iso-
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>ucyl-L-sérinau On dissout 26,0 g(71 millintoloa) d'ester méthylique de la N-bonzyloxycarboriyl-L-isoloucyl-L- sérine dans 380 ml de méthanol et 6,25 ml d'acide
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chlcirhydriquo concentré et on hydrogène c:
ans un ce '* nt d'hydrogène en présence de 5 g d'un catalyseur au palladium sur charbon (à 10 % de Pd) jusqu'à ce qu'il ne se dégage plus de gaz carbonique. Aprs avoir éli- miné le catalyseur on évapore la solution réactionnolle à siccité sous pression réduite et on recristallise le résidu à deux reprises dans un mélange de Méthanol et d'éther et une fois dans un mélange do méthanol, d'acétone et d'éther. Point de décomposition :
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203,.. 2040C J:a:fo40 . + 12,6 (0 . 3,01 dans le méthanol)* 12,60 3#01 dans Par chromatographie en couche mince
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dans les systèmes n-butanol/acide acétique 91ac1l1/o12U 3:1:1 et méthyl-4thyl-cétone/pyridinefiau 65t5t2O le produit se révèle unique.
La détection se fait par la méthode au chlore et par la méthode à la ninhydri- ne,
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c) Bâter méthylique de la 8-bonzyl-H-tosyl-L-cyotdi.* nyl-tyro.yl-L-1801Guc1-L-.4rino.
(13,2 millimoles) On dissout 3,55 g/de chlorhydrate
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d'ester méthylique de la L-iloloucyl-L-14rlno . la température ambiante dans 3n ml do diméthyl-formamide, on refroidit la solution a 0 C, on lui ajoute 1,85 ml
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(13,2 milllmolel) de tr14thylamina et on l'abandonne pendant 10 minutes en la secouant frequefntnontt Après quoi on sépare par filtration la chlorhydrate de tri- éthylamine qui a précipité et on le lave avec 5 ml
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do dim6thyl-fortnQmide On ajoute à la solution de l'eator dipeptidiquo libre une solution de 6?98 9 (13,2 millimoles) de S-bonzyl-N-tosyl-L-cyotéinyi-L. tyrosine (préparée d'après V.
DuVignoaud, M.I? Bartlett et A, Johi, .T.Am.ChemSoc 9, 5572 (1957 dans 35 ml déac4tonltriloo On refroidit la solution r4aotionnoll. limpide a 10*C, On ajoute 2,72 g (13,2 milllmole8) de N.N.dicyclohoxyl-carbodiimide t pou do temps après la NN'-dicycloboxyl-uréo et l'ester tétrapeptidique commencent à précipiter.
Après avoir agité pendant 55 heures a -10 C on sépara par filtra- tion les produits qui ont précipités et on les lave avoc un peu d'un mélange froid de diméthyl-formamido
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et d'açton1tril0 (1<1) et avec de 11406tonitrile, Pour éliminer la N,N-dicyci4hexyl-urfo on reprend le produit brut par 80 ml de diméthyl-formamide et on le maintient à 0 C pendant 2 heures.On sépare l'urée par filtration et on précipite le produit ré- actionnel dans le filtrat on ajoutant 700 ml d'acé-.
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tate d'éthyle chaud.
Après trois rocristallisntiono dans le méthanol, l'ostor tdtrapoptidique S.Nprot'g4
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so montre pur au chromatogramme en couche mince rcali.-
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té dans les système* bonzene/ocetono 1, chloroforme/ méthanol/ammoniaque à 17 % 2=2=t n-butanol/acido acétique glacial)ou 3:1:1. La détection se fait par la méthode au chlore et par la méthode de Folin.
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Le point de fusion est do 219 .. 221 "Cf la 210"C il se produit un frittage ; ,,"a5 .. 59050 (c - 0,99 danltllcidu formique); Ca,30 . - 16,2 (c . 3,3 dans la pyridine). d) ,Nydrazida de la S-benzyl-N.toIYl-L-cy.t1nyl-L" tyro.yl"L-180leucyl-L-s6rine.
On dissout 5,57 g (T,5 millimolos) d9ost,i mdthJyliquo de la S-benzyl-N-tosyl-L-cyat61nyl-L- tyz"yl-L-looloucyl-L-adrine dans 154 ml do dinthyl- ,.,J formemîdet On refroidit la solution 4ÔOCp on lui ajoute 4,5 ml d'hydrate d'hydrazine (92,2 millimolos) et on laisse reposer le tout à 0 C pondant 45 heures.
Apres quoi, en refroidissant bien par de la glace, on Ajoute à la solution réactionnelle 400 ml d'oau glacée. Le produit réactionnel apparaît alors sous forma d'un précipité gélatineux. Après avoir abandonné le produit pondant 2 heures au réfrigérateur on sépare
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1'hydrazldo brut par filtration, on lo lave à l'eau et pn le sèche sous pression réduite mur anhydride phnPhOr1que. On purifie la produit brut en le recrit- tallisant deux fois dans un mélange do dimôthyl-t'orthO- ' midé et d'acétonitrile, Le produit obtenu se fritte à 222 C et il fond avec décomposition à 226 - 229"C.
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"a 0 s 69,2 (o mlt79 dans l'acide formique), Cri.fô30 on + ?2 (o a 1,99 danVdim!5thyl-formomido).
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Dans la chromatographie on couche mince
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effectuée avec les systémo-n-butanol/acide acétique glacialau 3111 1 et méthyl-cthyl-c6tonaf pyxidine%au 65:5:20, le produit so révèle bien définit La détection se fait par la méthode au chloro ot par la méthode de Folin.
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0) Tdtrapeptido-'azido t azido do la S-benzyl-N-toayl L-cy,túlnyl-L-tyrosyl-L-l.o1oucyl-L-iÓrino.
On dissout 0,966 g (1,3 millimolo) d'hy drasido do la S-bonzyl-N-tosyl-L-cystdiiiyl-L-tyrQeyl- L...lIo!8ucyl-L"'8Jr1ne dans 35 ml do d1thyl-formam.ide ot 3,9 ml d'acide chlorhydiquo normal,on refroidit à -10 C et on ajoute lentement 0,29 ml d'une solution pontanormalo de nitrito de.sodium. On agita pondant 10 Minutes, puis on précipite l'azido, à uno tompéra- turo comprise entre -8 ot -5 C, avec 45 ml d'oau glacée.
On sépare le produit gélatineux par essorage, on lo lave bien à l'eau froide, puis avec une solu- tion a 3 % d'hydrogène-carbonate de sodium et à
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nouveau avec do l'eau froide, ot on lo sèche à '000 sous vide poussa pondant 4J heures* La composa obtenu fond à 244 246"C ( avocr décomposition). Spectro infrarouge t bande prononcée à \ 4,75 lA ( M.N 3)4 f) Hydrazide do la N-bonzyloxycarbonyl-L-sparaginyl1" S-bonzyl-L-cystinot On dissout 4ans 250 ml do dimuthyl- formamide 19,2 g (30 milU!"ol08) d'ester mdthyliquo do la N-bonzyloxycnrbonyl.L-aaparaglnyl-5.bonzyl-L. cystéino (préparée par oxemplo d'après M. Bodansky et V. DuVignoaud, .I, Am, Chom.
Soc#8j|,, 5688 (1959) a
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on refroidit la solution à 0 C et on lui ajoute 7,3 ml d'hydrate d'hydrazino (150 millimolos). On laisse
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reposer la solution rnct1onnollo 0 C pendant 55 heures. Pour isoler l'hydrazido on ajouta à la solu-
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tion 1800 ml d'ethanol, co qui provoqua la précipita- tion do l'hydrazido sous forme do produit brut fondant à 2lé - 215 C (avec décomposition) Apr*J8 deux rccris- t111J)sat1ons dans un mélange do dimuthyl-formamldo ot d'Qc'1ronitrilo son point de fusion s'élève à 21-t,t 215,5OC (avec décomposition). ,a5 . 33,9" (c 118 2,01 dans l'acide formiqueh Ca..fr,5 . - 2>r70 (cl 0,52 dans la diméthyl-formamido).
La chromatogràphie on couche minco, effectuée dans lo sysHMo n-butanol/acfdo acétique glacial/eau 3:1:1 montre que le produit ost unique.
La détection so fait par la méthode au chlore.
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g) Azide do la K-bonzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-S" benzy1.L-cystd1ne.
A une solution do 7,103 g (15 millimolos) d'tîrazido do la N-bonzyloxycarbonyl-L..c1I...a.:nqinYl-5... bonzyl-L-cystdino dans 135 ml do clim6thyl-formamido ot 45 ml d'acido chlorhydriquo normal, on ajoute goutte à goutta, à -10 C, sous agitation, 3,6 ml
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(18 millimolos) d'une solution pontonormnio do nitri- to do sodium préalablement refroidie. L'azido préci-
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pite' au bout d'environ 2 minutes l'état cri±t1:iG6.
Aprs avoir agité pondant 15 minutes à -10 C on ajoute avoc précaution 80 ml d'eau pour précipiter complètement l'azido. On sépare le précipite par filtration, on le lavo d'abord à l'eau froido, puis
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avec uno solution froide k2 % d' hydrogène-carbonate do sodium ot oncoro une fois à l'oou et on le sèche
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pondant 26 heures a 0 0 sous vido poussé. La composé obtenu tond' 124 C (avec décomposition).
Contrôle
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dans le spectre infrarouge s bande nette , # 4,fi5 /u (.M.N3) 1 mo après qu'on l'a abandonné pondant 10 jours la tompuraturo ambiante, on no décèle toujours pas d'110cyannto ( À . 4,5 <u). h) Chlorhydrate do l'ester thyliquo de la L-isoloucyl-glycino On dissout 1593 g (44 milllmolos) d'ester dthyliquo do la N..banxyloxyczxbcsnrl.G-isolaGyl glycine (prdparé d'âpre P.-A.
Jaquenoud ot R,A, fflogoennap Holv. î4 e 113 (1961 dons eoo 01 d'acide acétique glacial et on traite par de l'hydrogène en présence do 1,1 équivalent d'acide chlorhydrique concontrd et 5 g d'un catalyseur au palladium sur
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charbon (a 10 % de pnllndium) à la température ans binnto pondant 7 heures ot demio, On chasse de la solution rédactionnelle les constituants volatile , l'huile restante cristallise lorsqu'elle a été trio- turdo plusieurs fois avec de l'éther anhydre. Après
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doux rocristallientions dans un mélange li5 d#6thanol et d'éther le produit rdactionnol fond a 136 - 137OC.
-c40. + 13,9 (c m 3,0 dans l'ethnnol absolu).
Par chromatographio on couche mince dans le système n-butanol/cido acétique glacial/eau
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3=1:1, le produit sa rovelo bien ddfin1. tu réactif utilisa pour le détecter est la ninhydrino.
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if Ester éthylique de la N-bonzyloxycarbonyl-L-prolyl- .
L1.o1oucyl-01yçlnot On dissout 12,15g (48 millimoles) de
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chlorhydrate d'ester éthylique do la L-isoleucyl'- glycine dans 120 ml do chloroforme absolu, on refroi- dit, la solution à 0 C et, à 0 C,en ajoute 7,4 ml
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(52.8 millimolos) do triâthylamina et une solution de 22,2 g (60 millimolos) d'ester p-n1tro-ph&nylique de'la N-banzyloxycarbonyl.L-prolino (préparé d'après M..Bodanszky et V. DuVignoaud, J. Am. Chem. Soc. !il, 5688 (1959)) dans 40 ml do chloroforme absolu. On agite la solution réactionnelle jaune pondant 20 her res à température ambiante.
Pour le traitement complé- montaire on la dilue avec 400 ml do chloroforme, on l'extrait à trois reprises avec chaque fois 90 ml d'acide chlorhydrique normal, quatre fois avec chaque fois 90 ml d'ammoniaque normale et trois fois avec chaque fois 90 ml d'eau, et on la sèche sur sulfate
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do'sodium. On élimine lo solvant sous pression réduite et on rocristallise le résidu cristallin doux fois dans l'acétate d'éthyle, Le composé obtenu fond à
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159 - 160 C. C"fë4 .. - 86,4 (c " 1,99 dans le méthanol).
Par chromatographio en couche mince effectuée dans les systèmes benzine/acétone 7:3 et
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n-Wtanol/noido acétique glacial,/batt 3:1:1, le pro- duit se montre bion défini. La détection so fait par la méthode au chlore.
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j ) N-bonzylgxycnrbonyl-L-prolyl-L-l.o1eucyl-glycino- amidon
On dissout 15,5 g ( 35,7 millimolos)
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d'ester éthylique de la N=benxyloxycarbonyl-L-pxolyh L-1eoloucyl-glycine dans 400 ml de méthanol et on fait passer, a 0*,un courant de gaz ammoniac soc jusqu'à saturation.
Après avoir laissé reposer la solution rdactionnollo à la tumpérature ambiante pondant 30 heures on l'évaporé à siccité à 30 C soue pression
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réduite et on racristallitfé le résidu cristallin dans un mélange lt3 do méthanol et d'eau. Le produit fond à 183 - 184, . ,,"a",44 65,7 (c ,90 dans lo méthanol).
Il so montro bien défini dans la chro- matographie on couche mince réalisée avec les systèmes benzène/acétone 3:7 et n-butanol/acide acétique glacial/ 'eau 3:1:1. La détection se-fait par la méthode au chlore*
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k) L-prolYl-L-18010uOyl-oycin8-a.1de.
On dissout 9rt35 g (22,3 millimoles)) de N-bonzYloxYcarbonyl-L-propyl-L-isoleucyl-glycine antide dann 200 ml de mithanol, on ajoute 1,1 équi- valent d'acide chlorhydrique aqueux et on traite par de l'hydrogène pendant 5 heures on présence do palla- dium sur charbon (à 10 % de palladium), On sépare le catalyseur par filtration et on évapore la solution '
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rdactionnolle à 3b C sous pression réduite@ Le résidu incolore, analogue à une mousse, est rocristalli8 uno fois dans methancl-chloroformo et deux fois dans aothanol/acetate ddthylo, Lc chlorhydrate du triw
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poptide-amido ainsi obtenu fond, après frittage a 214Ce, . 215,5 - 218 C avec décomposition. -a-lD * .. 42-,4 (c= 2,1 dans l'éthanol à 95 %).
Pour libérer la base on dissout le chlorhydrate procèdent dans 50 ml do méthanol et on filtre la solution à travers une colonne échangeuse d'ions de 100 g de Dowex-21K (forme OH) préalablement traitée par du méthanol* La colonne est ensuite lavée avec au total 400 ml de méthanol et ltéluat dépourvu
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do chlore est évapore à siccité à 30 C scus pression réduite. Le tripeptido-amide rosto sous formo co faisceaux d'aiguilles fondant à 171,5 . 173 C.
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a 40 m -65,5 (c m 2,02 dans l'acide acétique glacial),
Par chromatographie en couche mince
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gdaitado chan. loi tyttbmot n.o'.nol/Ac1C10 10($Uq"e t;
acial/eu3 t s t, mJthyl-éthyl-cétone/pyxidina/éau bbs5s24, le produit sc montre bien défini. La détec- tion se fait par la méthode à la ninhydrine.
Le tripopttde-amide précédent fut ddjb préparé par P.-A. Jaquenoud et R,A. Ballonnas, Helv.
Chim. Acta 44, 113 (1961), par une suite de réactions analogue qui s'écarte do la synthèse indiquée ci-dessus
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par l'enlèvement dos groupes benyloxycarbonylo. au moyen de l'acide bromhydriquo dans l'acide acétique glacial et par l'utilisation de l'nhydrido mixte
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formé par la N-bonzyloxycarbonyl-prolino et l t l&t:i 'Jo dthoxy-formiq4o au lieu de l'ester p.nitro-phnylique do la N-bonzyloxycarbonyl-proline 1 la tripoptido-amido obtenu par ces auteurs fond à 118 C etun pouvoir
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rotatoire epéciFique,L'"apew63s * 10 (o . 2 dans l'acide acétique glacial), 1) N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L''
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cystéinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycine-amide.
On diaut dans 150 ml de d1thyl- formamide froid le N-benzyloxycarbonyl-L-asparaglnyl- S-benzyl-L-cystine-azide préparé noue g) et on ajoute la solution à une solution de 4,264 g(15 milli- moles) de L-prolyl-L-looloucyl-glycine-amicla (voir le)) et 2,1 ml (15 millimoles) de tridthylamine dans 50 ml de diméthyl-formamide. On agite la solution réactionnelle pendant 56 heures à 0 -3 C, Au bout de ce lapa de temps la bande azide à 4,75 microns a disparu du spectre infrarouge.
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Pour isoler le produit r6uctionnel on re- t1d1t la solution à -10 C et on précipite le pro- duit *ou% tOf d'una rs,Elsae 941*t&MQUOO en joutant avoc précaution 750 ml d'eau glacée. On sépare le précipité par essorage, on le lave bien avec de l'eau froide nt on le sèche sous vide en présence d'anhydri. de phosphorique, Pour éliminer les impuretés on triture intimement le produit brut finement pulvérise,
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à trois rQpr168 avoc chaque fois 40 ml d'un mélange 411 d'acdtonitrile et do méthanol, et on filtre, Après doux recristallisations dans un mélange 1(4 do dim<3thyl-formamide et d'acétonitrile on obtient le pentapeptidp-nmlde S,N-potégd qui fond à zou ( avec décomposition).
ra -51,3 (c w1,03 dans' le diméthyl-formamidoh a5, 79,30 (c ml dans l'acide acétique glacial).
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Par chromatographio on coucho mince réa- lisée .dans les systèmes n-butanol/acide acétique
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giaci.,su 3:1 t , m<3thyl-ethyl-c<!tone/pyridino/îau 65<5t2<0, méthanol/chloroforme 21l, le produit sa révèle bien défini. La détection se fait par la cathode au chlore.
On peut également obtenir le môme pontapoptide-amide protégé en condensant la N-benzyl-
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0}(ycar)BonYl-'L-'asparaginYl-S"bonzyl'-L-.cyat(!ino (prépa- réa par exemple dliprès R.A. Boissonnas, St.Guttmr-rir., P..'Ji1quonoud ot 3.P, Waller, Helvg 38, 1491 bzz avoc le L-prolyl"L-i8olQUcyl-glycine'-amido dans un mélange 1t4,4 de diméthyl-formamido et d'acétone à l'aide' du N.N'-dicyclohoxyl-carbodiimide. m) Pentapoptldo-omido i L..aspaxaginyl.5-benxyx...
CYateinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycino-amido* A 2,01 g ( 2,78 millimolos) de N-bonzyl- oxycaxbonyl-L-.aspa raginyl..S-banzyl-L-ays t inyl-L.. prolyl-L-isoloucyl-glycire-mide on ajoute 12 ml d'acide bromhydriquo binormal dans de l'acide acétique glacial* Au bout do 40 minutes le composé benzyloxycarbony- liquejest complètement dissous. Après avoir agité pondant 2 heures ot demie 20 C on ajoute à la solution jaune foncé 35 ml d'éther absolu, co qui fait précipiter le bromhydrate du pentapeptide-amido S- protégé sous forme d'une masse résineuse.
Après avoir été trituré plusieurs fois avec de l'éther absolu la précipita devient grenu.On le sépare par filtration
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et one roprécipite à deux reprises dans méthanol/ dthor'
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On obtient le même bromhydrate en uti- lisant l'acide bromhydrique dans l'acide trifluoracé- tique, tandis qu'on utilisant seulement l'acide tri-
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fluoracétique à la température du reflux on obtient le trifluoracétato correspondant.
Pour 1 ibéror le pentapeptide-amide 5-protégé on dissout 2,46 g(3,66 millimoles) de bromhydrate du L-asparagioy-S-benzyl-L-cyst41nYl- L-prolyl-L-1Io10ucyl-g1ycine-amdde dans 30 ml de méthanol et on filtre.a travers une colonne 4chan- de
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gouso d'ions de 60 g/Dowox1K (forme OH) préalable- mont traitée par du m6thonoit On élue le pontnpoptide amide libre avec 250 ml do,m6thanol ot on évapore 114luat dépourvu de brome jusqu'à alocité, à 30 C , sous pression réduite et à l'abri do l'humidité.
On repr6ciplto le résidu uno fois dans un mélange d'6tha. nol et d'éther absolu et une fois dans un mélange d'acétone, d'acétate d'éthyle et d'éther, On obtient
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le pontapeptide-amide S.protgé tous forma d'une pou- dre incolore hygroscopique qui pout être utilisée directement pour l'union avec le tétrapoptide-azide S.N-protégé obtenu selon c).
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n) S-bonzy.1-N-tosyl-L-cystéinyl-L-.tyrosyl-L-isoloucylm Zrsdryt-L-asparaginyi-S-benzyl-L-cystdinyl.-L-prolyl.
L-1,01eucyl-glyclno-am1de.
On dissout le, tétrapoptide-azide S.N. protégé préparé sous e) dans 35 ml de din,.4thyl. formamido refroidi à -10 0'ot on ajoute In solution une solution, refroidie a -10 C, do 0,769 g (1,3 mil. limolo ) de L-asparaginyl.*S-honzyl-L-cynt6inyl-L. prolvl-L-1801oucyl-glycino-amide (préparé comme décrit
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sous m) et 0,18 ml (1,3 millimole) do triéthyl-amine dans 5 ml do diméthyl-fotmamido, On laisso la tempé-
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rature monter entre -7 et -5 C et on agite la solu-
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tionrréactionnolle à cotte température pondant 22
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heures, Au bout de co laps do temps on ne trouve
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plus dans la spectre hfrarougo la bande azido <n r ac- te ri,s tique à 4,75 microns.
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On précipite le nonapeptido-amido
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N,S.SI¯protégé on ajoutant avec précaution 130 ni
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d'eau glacée, on le sépara par filtration, on le
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lave avec do l'oau froide, avec de l'aclce chicrhy- drique 0,5-n, avec do l'eau, avoc uno solution à 3 % dhydrogcno-carbonate de sodium ot avoc oo l'oau, ot on 10 sèche sur anhydride phosphoriqun sous pression réduite, Le produit se fritto à 245 C ot il fond à 211 - 217"C< Pour le purifier on le roprectpîto quatre fois dans un mélange 1:6 do dimithyl-fonramido et d'acetonitrile et on la lave à chaque fois avec dimëthyl-forma)Hide/acetonitrlle lt7, méthanol/ acdtonitrile 1;5, acétonitrile,acétate d'éthyle et éther.
Après frittage b 211 C le composé fond à 2255 - 228,5 OC avec décompofition.1 "û2 7 (c 7 1,44 dans le dimethyl-formandde)* 0)', S.S '-déhydro-L-cye téinyI-L"'11 rosyl-L-holeucyl- G..séry 1-L-a s pa raginy 1-L. cys téi nyl-L-prolyl-L.
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isoleucyl-glycine-amide. (Ser-Ile -ocytocine) .
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On dissout 100ml (0,767 millimola) de N-tos yt..
Swbenzyl-L-cystéinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-séryl- L-asparaginyl-5-benzyl-L.cystéinyl-L-prolyl-L-iso- l6U(:vl-glycine-atnido dans 150 ml d'ammoniac liquide
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(distillé sur sodium) et on introduit du sodium dans la solution 'jusque ce que la coloration bleue persiste pendant 5 minutes,On détruit l'excès de sodium par du chlorure d'ammonium, on évapore l'ammoniac et on chasse du résidu les derniers restes d'ammoniac dans le dessiccateur à vide sur acide sulfurique concentre, On dissout le résidu dans 200 ml d'eau glacée, on
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porte la solution à pH 6,6 - 6,8 avec de l'acide acétique binormal et on fait passer un courant d'air
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jusqu'à ce que la réaction au nitçoprussinte de sodium soit négative,
On porte ensuite la solution réactionnelle à pH 4 avec de l'acide acétique bi- normal, on la filtre à travers un filtre Hyflo et on la lyophilise. On purifie le produit brut par partage à contre courant d'après Craig L.C. Craig,
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An:lyt1.c. Cheaistry, 22, 1346 (1950)7 dans le sys- tème butanol secondaire/acide acétique 0,017-ne La fraction principale, qui a un coefficient de partage K de 0,53 à 25 C, exerce sur l'utérus isolé du rat une activité ocytocique d'environ 130 U.I./mg.
EXEMPLE 2
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eJ ) 1 (N.benzy loxycarbonyli..-aé ryi2-.( t.-butoxycarbonyl hydrazine.
On dissout dans 35 ml de méthanol 3,59 g
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(15 millimoles) de N-benzyloxycorbonyl-L-sérine prpar4e par exemple d'après les indications de St. Guttmann et R.A. Oolsonn8, Holv. lui, 1852 (1950) ou de E. Boer et J. M:-urul(<.1e, J. Biol, Chem. xl2e 25 (19f)!)J7 et 2,16 g ( 16,5 millimoles) de t-butoxycnrbonyl-hydrazine L'obtenue pnr exemple
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d'âpres les indications fournies par L.A. Carpino,
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J. ArhChom.Soc. ,79, 98 et 4427 (1957) et L.A. Carpino, c Cizo et B.A, Carpino, ibid. , 955 (19597, et on ajoute a la solution en 1 heure, à C1 0, une solu- tion de 6,99 g (16,5 mil11moles) do î-cyclohexyl-3- .aorpholinyi (4)thy-carbodüm.da- méthyl-p- toluène-suifonate dans 15 ml de méthanol.
Après avoi: laissé reposer le mélange pendant 20 heures à 0 C on chasse le méthanol par distillation sous pression réduite et on reprend l'huile restante dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'eau. On lave soigneu- sement la phase acétate d'éthyle avec de l'eau, avec de .1'acide citrique binormal, avec de l'eau, avec une solution à 5 % d'hydrogéno-carbonate de sodium et,avec de l'eau, et on la sèche sur sulfate de sodium* Après élimination de l'acétate d'éthyle sous pression réduite il reste le produit sous forme d'une huile qui-, cristallise lorsqu'on la triture avec de l'éther,, On ecristallise le produit brut dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane t il fond alors à
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99.,
1010C ou 112-113 0 (polymorphies identité des spectres infrarouges en solution, même activité optique, même comportement à la chromatographie en
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couche mince). Ca.fü50 ..... 25,9 (c m 2,11 dans le méthanol). Le rendement est de 56 % (2,95g).
Le produit se révble bien défini lorsqu'on le soumet à une chromatographie en couche
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mince dans les systèmes benzène/acétone 6t4t mdthyl- étüyi aétone/pyridineau 65=5z20 et n-butanol/acide acétique glacial/6eu3t1:1t La détection se fait
<Desc/Clms Page number 26>
par la méthode au chlore, .
Au lieu du méthanol on peut également utiliser l'acétonitrile comme solvant et on peut
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remplacer le l..ayciohexyl,'-marpholinyl-(4)- <*' dthyj7-carbodiimide par le N.N..dicyciahaxyl carbodilmide. b) Benxene-aulfonate de la 1-(L.aryi)--(tbutoxy carbonyl)-hydrazinet On dissout 14,8 g (41,9 millimoles) de 1-(N-benzyloxycarbûnyl-L¯Qéryl)-2-(t¯butoxycarbonyl)- hydrazine dans 250 ml de méthanol et on hydrogène dans un courant d'hydrogène en présence de palladium sur charbon (à 10 % de Pd). On sépare le catalyseur par filtration et on concentre la solution réaction- nelle sous pression réduite. On extrait l'huile restante à deux reprises avec de l'éther absolu et on sèche sous pression réduite.
Le produit, qui t'obtient sous forme d'une, mousse solide, est sou- mise directement aux opérations ultérieures.
Pour le caractériser on transforme
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le produit brut en benzèné-sulfonate cristallisé en opérant de la façon suivante ;on dissout 2,8 g d'acide benzène-sulfonique dans 6 ml de méthanol, on
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refroidit a 0<'C et on ajoute la solution à une solu.. tion glacée de 3 g (13,7 iiillimoles) de 1-(L-s4ryl)- 2-(t-butoxycarbonyl)-hydrâaine dans 6 ml de méthanol* Le benzne-8ulfonate précipite sous forme d'une huile lorsqu'on ajoute 150 ml d'éther anhydre, huile que l'on fait cristalliser en grattant. On sépare le produit par filtration, on le lave avec
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uiv mélange de méthanol et d'éthor et on la purifie on le recristallisant deux fois dans un mélange
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d'thanol et d'éther. Il fond alors à 151,-153,50C, (avec décomposition). 50 = + 14,4" (c a 1,96 dans le méthanol).
Sur le chromatogrammo on couche mince le produit ne donne qu'une soûle tacho dans
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les systèmes benzhne/éthanol 7t3g méthanol/chloro- forme/3 a 17 % 2:2:1 et n-butanol/pyridine/acido acétique glacial/eau 90:60:18!72. La réactif analy- tique utilisé est la ninhydrino,
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c) 1-(N-bonzyloxycarbonyl-L-isoloucyl-'<seryl)--2-- (t-butoxycarbonyl)-hydrazino.
On agite pendant 48 heures à 13-14 C une solution de 2,7 g (12,35 millimoles) de 1-(L-
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séryl)-2-(t-butoxycarbonyl)-hydrazlne et 4,77 g ( 1^3l5 m!11!molel) d'ester p-n1tro-ph.nliquo dt la N-enzyloxycarbonyl-L-isoleucine (prépare par exemple d'aprbc M. Bodanszky et V. DuVigneaud, .Am. Chemt Soc, il, 56GB (195Q), dans 24 mi diacélate d'éthyle.
Au bout d'environ 7 heures le dipeptidb protégé commence à précipiter. Pour finir on refroidit le mélange réactionnel à 0 C. on sépare le produit par figuration et on le lava soigneusement avec de l'acé-
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taste d'éthyle froid. Après deux rer.riatallilationa dans l'acétate d'éthyle chaud le composa fond zur 187-1880C avec décomposition. ,'a5 a -36 (c -a,01 dans le mëthitnol).
La chromatographie on couche mince réalisée dans le système bonzèno/éthanol 713 montre qu'il s'agit d'un produit bien défini. La détection se fait par la méthode au chlore.
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d) 1-(L-isoloucyi-Laéryl)-(t-butoxycarbony- hydrazino.
On hydrogène 13,4 g (28,8 millimolos)
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do 1-(N-bonzvloxycarbonyl-L-isoloucvl-L-séryl)-2- (t-butoxycarbonyl)-hydrazine dans 300 ml de méthanol
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en présence do palladium sur charbon (à in % de Pd).
Après avoir éliminé le catalyseur on évapore le méthanol sous pression réduite. On traite le résidu
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liuileux b plusieurs reprises avec do l'6thor et avec un mélange d'éther et d'éther de pétrole et à chaque
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fois on chaise le solvant par dictillations Le réel. du pulvérulent est ensuite trituré avec de'l'acétate d'éthyle et il est séparé par filtration,' Pour le
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purifier on rocriatall1ae le produit deux fois dans Ilacdtonitrilet Il fond alors à 133 - 134 C (décom- position pâttift dt 131). a6'. - 36" (c= 1,99 dans le méthanol).
La chromatographie en
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couche mince réalisée dans le système benzène/éth4nol
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t2 montre qu'il s'agit d'un produit bien d4fir!., La détection se fait par la méthode b la,ninhy.la, e) 1-(S->bonzyl-4l-tosyl-L-cystdinyl-L-tyrosyl-L-. isoleucyl-L-sryl).2-(t-butoxycarbonyhydrazlne.
On ajoute 0,89 g (4,3 millimoles) de N.N'-
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dicyclohexyl-carbodiimide à une solution, refroidie '"j & -10 C, do 2,22 g (4,2 millimoles) de S-bonzyl-N- tosyl-L-cystéinyl-L-tyr081ne (préparée d'après V.
DuVignoaud, r4,F. Bartlett et A, J8hl, J.Am. Chem, Soc. 799 5572 (1957)) et1,41 g (4,2 millimoles) de 1-(L-isoleucyl-L-séryl)-2 (t-butoxycarbonyl)-hydra- zino dans 22 ml d'un mdlinge de parties égales de diméthyl-formamide et d'acétonitrile, et on agite
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le mélange pendant 52 heures à -10 C. Au court de
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la réaction la N,Ni-dicyclohoxyl-urde et le tétra- peptide-hydrazide protège précipitent, On ajoute au mélange réactionnel 70 ml d'eau glacée, on sépare le précipité par filtration et on le lave soigneuse-. ment avec de l'eau, avec une solution à 3 % d'hydro-
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géno-carbonate de sodium et pour finir encore une fois(avec do l'eau.
Pour éliminer la N.N'-dicyclo-
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hoxy-1-uae on reprend le produit brut dans 8,3 ml de dimthyl-formamide. April avoir laissé reposer le mélange pendant 2 heures a 0 C on sépare l'urne par-filtration# on la lave avec 1,5 ml de diméthy!- formamide et on ajoute au filtrat 50 ml d'acétoni- tri le. Le tÓtrapeptldo-hydrazido protégé précipite alors sous forme d'une masse gélatineuse* On le sépare par essorage, on le lave avec de l'acétoni-
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triJLo froid et avec de l'éther et on le recristallisa doux fois dans un mélange de dimdthyl-formamido et d'acdtonitrilo. Il fond alors à 227-2290C (avec
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décomposition), --'D - 30,2 (c = 1,96 dans la pyridine).
Le produit se révèle être un composa bien défini dans la chromatographie on couche mince
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réalisée avec les systèmes J méthyl-éthyl-c6tono! pyrldine/eau 65s5$20, benzène/éthanol 8t2, n-butanol, pyrldine/acide acétique glacial/eau gOsb0:18s''2.
La élection se fait par la méthode au chlore et par,la méthode de Folin.
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f) S-benzyl-N tocyl-L-cye'télnyl-L-tyrosyl-L-looloUcyl-o L-edrine-hydrazide. ' On dissout 0,506 g (0,6 millimole) do 1.(Sbonzyl-N-tosyl-t-cystéinyl-L-tyrosyl-L- ieoleucyl'-L-<oryl)-2-(t-butoxycarbonyl)-hydrazino dans 10 ml d'acide trifluoracetiquo froid à 90 % et on abandonne la solution pondant 1 heure et quart à la température ambiante. Après quoi on refroidit
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la solution réactionnelle" O*C et on précipite lo produit par 65 ml d'eau glacéeOn le sépare par filtration et on lo lave avoc de l'eau, avoc une
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solution à 3 % d$hydrog4o-carbonate de sodium, avoc de l'eau et pour finr avec do l'4cêtonitrile.
Aprw cristallisation dans diméthyl-formamide/ac4to- nitrilo ou dans dlmthyl-lormamide/m4thanol, ce ttrapeptido-hydrazido a les mdmes propriétés (point do fusion, comportement dans la chromatographie on couche mince et activité optique) que l'hydrazido obtenu par hydrazinolyso.de l'ester méthylique de
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la S-benzyl-N''toayl-L-cy<teinYl-L-tyro8yl<Lisoloucyl< L-edrine (voir exemple 1 d). Point do fusion s 124 - 128 C, décomposition h 230.31 C,,'"'6 . 6030 t (c # 2, Î dans le dimSthyl-formamida).,D6 .69#3" (c . 2,06 dans l'acide formique).