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Procédé de purification d'antibiotiques amphotères ou basiques.
La présente invention a pour objet la purification d'anti- biotiquea amphotères ou basiques.
Lors de la préparation d'antibiotiques amphotères ou basiques, on soumet un milieu de culture aqueux, contenant l'antibiotique en question en solution, à un procédé combiné de récupération et de purification. Lorsqu'on effectue ce pro- cédé par extraction, le mycélium de l'organisme qui a produit l'antibiotique est habituellement tout d'abord séparé du milieu de culture. Ensuite, on extrait l'antibiotique avec un @ solvant organique à un pH tel que la plus grande quantité
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possible d'antibiotique se dissolve dans la phase organique, le volume de cette dernière étant maintenu sensiblement infé- rieur à celui du milieu de culture. La phase organique obtenue contient l'antibiotique amphotère ou basique sous une forme concentrée.
De plue, une importante partie des impuretés pré- sentes dans le milieu de culture n'est pas transférée dans la phase organique, de aorte qua l'antibiotique est à la fois concentré et purifié préalablement. Ensuite, on ramène l'anti- biotique à une phase aqueuse à un pH auquel il est de loin plus soluble dans cette dernière phase que dans le solvant organique. Tout comme dans la première étape d'extraction, le volume de l'agent d'extraction, c'est-à-dire la phase aqueuse, est maintenu sensiblement inférieur à celui de la phase orga- nique, de sorte que la solution de l'antibiotique devient enco- re plus concentrée.
En même temps, un certain nombre d'impure- tés présentes dans la phase organique sont retenues dans cette dernière. Dès lors, on obtient une solution aqueuse concentrée de l'antibiotique, dont la majeure partie des impuretés initia- lement présentes dans le milieu de culture a été éliminée.
On peut répéter le procédé d'extraction ci-dessus, jusqu'à ce qu'on obtienne une solution contenant l'antibiotique soue une forme suffisamment pure et concentrée, que l'on doit cris- talliser ou précipiter sous une forme pure pour la dernière cristallisation ou combinaison.
En ce qui concerne les procédés d'extraction décrite ci- dessus, on a employé des substances dites supporta facilitant le transfert de l'antibiotique en question de la phase aqueuse dans la phase organique. Lors de la récupération de la ohloro- tétracycline et de la tétracyoline, on a employé, comme support des composés tensioactifs de formule générale R-On-SO2OH, où R représente un radical organique hydrophobe et ou n est égal à 1 ou 0, ou encore des composés d'ammonium quaternaire et on les
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a ajoutés au solvant organique utilisé pour l'extraction de la ohlorotétraoycline ou de la tétracycline du milieu de culture.
En ce qui concerne 1'emploi des composés d'ammonium qua- ternaire comme supports, on a proposé un procédé d'extraction, dans lequel on extrait directement un milieu de culture, conte- nant de la ohlorotétraoyoline et/ou de la tétracycline avec le mycélium d'un organisme ayant produit ces antibiotiques, avec un solvant organique polaire non-miscible à l'eau après avoir ajouté le composé d'ammonium quaternaire, tout en contrôlant aussi bien le pH du milieu de culture que la concentration des ions calcium et magnésium qui y sont contenus. Le procédé d'ex- traction doit être effectué en discontinu car, en pratique, il faut extraire une seconde fois le gâteau de filtre de la première extraction.
Lors de la récupération de la ohlorotétraoyoline et de ses dérivés, de même que lors de la récupération de la strepto- mycine, on a employé, comme supports, des sulfates ou des esters d'acide sulfurique de formule générale ci-dessus. Toute- fois, lorsqu'on emploie ces supports, l'extraction du milieu de culture aqueux n'est pas complète, étant donné que des quan- tités variables d'antibiotique sont retenues dans la'phase aqueuse. De plus, l'extraction de la ohlorotétraoyoline est effectuée par extraction avec un solvant organique, puis en oonoentrant la phase organique par évaporation. Ensuite, on cristallise un sel acide de chlorotétracycline dans la phase organique concentrée, après l'addition dl'acisi chlorhydrique.
Il est difficile d'effectuer ces étapos en continu et il est également difficile de récupérer le support en vue d'une uti- lisation ultérieure.
A présent, on a trouvé que l'on pouvait avantageusement employer certains esters organiques d'acide phosphorique et d'acide phosphoreux comme supports dans le procédé combiné de
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récupération et de purification des antibiotiques amphotère. ou basiques, lorsqu'on dissout ces esters dans un solvant orga- nique peu ou non-miscible à l'eau, avec lequel on extrait le milieu de culture après ou sans élimination du mycélium.
Afin d'être utiles pour l'objet de la présente invention, les estera organiques précitée doivent répondre à certaines conditions.
En premier lieu, il importe que les esters contiennent au moins, dans leur molécule, un atome dissociable de métal ou d'hydrogène, c'est-à-dire que les esters doivent être des esters acides ou des sels d'esters acides* Par exemple, dans le cas d'esters organiques de l'acide ortho-phosphorique, seuls les monoesters et les diesters ou leurs sels sont des esters organiques utiles, tandis que les esters d'acide phos- phoreux doivent 4tre des monoesters ou leurs sels.
En second lieu, le radical organique constituant une partie de la molécule d'ester doit avoir une nature hydrophobe telle que le caractère hydrophile de la fraction d'acide phos- phorique ou phosphoreux de la molécule d'ester soit euffisam- ment supprimé pour rendre les esters solubles dans le solvant organique, auquel on désire transférer l'antibiotique de la phase aqueuse où il est présent en solution, en vue d'une puri- fication et d'une dernière récupération. On a trouvé que cette condition était remplie lorsque le radical organique contenait au moins 4 atomes de carbone.
Dans le procédé de la présente invention, on transfère l'antibiotique impur dans un solvant organique peu ou non- miscible à l'eau en présence d'un support et la caractéristique du procédé de l'invention consiste en ce qu'on utilise, comme support pour l'antibiotique, un ou plusieurs esters organiques d'acide phosphorique ou phosphoreux, la molécule de ces esters contenant au moins un atome d'hydrogène ou de métal dissociable,
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tandis que le ou les radicaux organiques de ces enter* ont une nature hydrophobe suffisante pour rendre les esters solubles dans ledit solvant organique.
Les diesters utiles d'acide ortho-phosphorique de formule générale
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sont ceux où R1 et R2 désignent un groupe aliphatique contenant ! au moine 4 et au maximum 10 atomes de carbone. Parmi ces estera, il y a par exemple les dibutyl-, dipentyl-, dihexyl-, diheptyl- et dioctyl-esters, comme par exemple les di-2-éthyl- hexyl- et dinonyl-esters d'acide orthe-phosphorique. Toutefois, il n'est pas nécessaire que R1 et R2 désignent le mime groupe aliphatique.
Si R1 et R2 désignent un groupe lauryle, l'ester ne sera pas complètement soluble dans le solvant organique et il n'agira pas comme support approprié pour les antibiotique . La même remarque s'applique aux diphényl- et dibenzyl-eatera d'acide ortho-phosphorique.
Dans le cas des monoesters d'acide phospheirque ou d'aciae phosphoreux, la radical R1,faisant partie des esters, peut être un groupe aliphatique contenant plus de 10 atomes de car- bone, comme par exemple un groupe stéaryle ou un groupe lauryle, ou encore un Croupe aromatique, comme par exemple un groupe phényle ou benzyle.
De même, on peut employer les esters correspondants de l'acide pyrophosphorique.
En règle générale, des tests expérimentaux à petite échel- le montreront si un ester d'acide phosphorique ou phosphoreux choisi est utile pour l'objet de la présente invention.
La quantité des estera précités à employer comme supports
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pour les antibiotiques dépend de l'antibiotique envisagé, de sa concentration et de la quantité des impuretés présentes.
Pour obtenir des résultats utiles, l'ester doit être présent en une quantité d'au moine 1% en poids, calcula sur le solvant organique utilise; avec une concentration croissante de l'anti- biotique, il faut des quantités oroissantes de l'ester Du point de vue économique, il ne convient pas d'employer l'ester dans des quantités supérieures à 15-20% en poids, calculés sur le solvant organique utilisé* Les différents antibiotiques amphotères ou basiques néces- sitent des quantités différentes des estera, pour obtenir une purification optimum.
En ce qui concerne la tétraoyolino, il est préférable d'employer l'ester en une quantité de 2 à 5% en poids du solvant organique, tandis qu'en ce qui concerne la polymyxine, il est préférable d'employer des quantités de 1,5 à 2% en poids et, avec la streptomycine, on emploie, de préfé- rance, des quantités de 5 à 10%.
Les esters indiqués ne sont pas tous des supports effica- ces pour tous les antibiotiques amphotères ou basiques Tandis que l'acide di(2-éthylhexyl)-ortho-phosphorique et l'acide di- nonyl-ortho-phoaphorique sont des supports utiles à la fois pour la tétracycline, la streptomycine et la polymyxine, l'aci- de di-butyl-ortho-phosphorique est uniquement un support utile pour la tétracycline.
Le solvant organique utilisé dans le procédé de purifica- tion de la présente invention peut être l'un ou l'autre solvant organique non ou peu miscible à l'eau et agissant comme solvant pour l'antibiotique envisagé. Ces solvants sont bien connus dans la technique. Il y a, par exemple, la butyl-acétate, le chloroforme, l'alcool amylique et la méthyl-isobutyl-cétone.
L'extraction des antibiotiques indiqués, où l'on utilise un des esters ci-dessus comme support, donne des rendements
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élevés de 1'antibiotique, étant donné que le support provoque une très forte modification du rapport de distribution de l'antibiotique au profit de la phase organique contenant le support. Dès lors, un pourcentage élevé de l'antibiotique du milieu de culture est transféré dans la phase organique*
Suivant une forme de réalisation de la présente invention, on transfère l'antibiotique présent en solution avec les impu- rotée en milieu aqueux dans le solvant organique contenant un ou plusieurs des esters mentionnés. Cette forme de réalisation est utile pour tous les antibiotiques soumis aux essais et elle est préférable à l'échelle industrielle.
Suivant une autre forme de réalisation de l'invention,
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concernant la purification de la tétracycline on précipite la tétraoyoline impure d'un milieu aqueux en présence d'un ou plusieurs des esters précités, puis on extrait le précipité obtenu avec le solvant organique. Il semble que cette forme de réalisation permette d'obtenir des rendements légèrement supé rieurs à la première, mais elle ne convient que pour des opéra- tions à charges discontinues et elle n'est pas d'une réalisa- tion facile.
Après la purification suivant la présente invention, on peut récupérer les antibiotiques de façon connue en sci.
Les exemples suivants illustrent la purification suivant l'invention de solutions brutes et impures de tétraoycline , de polymyxine B et de streptomycine.
Exemple 1
Après avoir séparé le mycélium par filtration, on a extrait successivement 300 ml du liquide de fermentation d'une fermentation de tétracycline avec 3 portions de 30 ml d'une
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solution de 2 d'acide di-(2-éthylhexyl)-ortho'-phosphorique et de 0#5% de tris-n-butyl-phosphate dans du butyl-acétate. On a maintenu le pH à 6,20 par addition d'hydroxyde de sodium. Le
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résidu aqueux contenait moins de 0,5% de l'activité de la tétracycline dans le liquide de départ. On a mélange les phases organiques et on les a extraites deux fois avec des portions de 15 ml d'eau, ayant un pH de 1,20, que l'on a obtenu en ajoutant, à l'eau, de l'acide chlorhydrique concentré,, avant l'extraction.
Le volume des deux extraits était de 30 ml, ce qui correspond à une concentration décuplée du liquide de départ. Les extraits contenaient plus de 95% de 1'activité de la ,tétracycline dans le liquide de départ, tandis que la phase organique contenait moins de 5% de l'activité.
Exemple 2.
On a extrait 32 litres de liquide de culture filtre, pro- venant d'une fermentation de polymyxine B contenant 50x10 unités de polymyxine B, avec 6,4 litres, puis avec 3,2 litres
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d'une solution de 1% d'acide d.-(2-dthyxhexy.)-oxtho-phaephor.- que dans du butyl-acétate, à un pH de 7,0. Le résidu aqueux contenait 1,5x10 unités de polymyxine B (3%) et on l'a écarté.
Les phases organiques (8,8 litres) contenaient 50x10 unités (100%) et on les a tout d'abord extraites avec 600 ml d'eau, puis aveo 200 ml d'eau à un pH de 2,0, que l'on a obtenu par addition d'aoide chlorhydrique concentré à chaque portion d'eau. On a obtenu 880 ml d'une solution aqueuse concentrée contenant 49,3x10 unités de polymyxine B (99%) et un résidu organique contenant 0,1x10 unités (moins de 1%). On a employé ce résidu dans l'extraction suivante du liquide de oulture.
Exemple 3.
On a extrait successivement 400 ml de liquide filtré de fermentation de streptomycine, contenant 4850 unités de strep- tomycine par ml avec trois portions de 50 ml d'une solution
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de 5% d'acide di-(2¯éthylhexyl)-ortko-phosphori<3ue et de 0,5% de tris-n-butyl-phosphate dans du chloroforme à un pH de 6,3O# Le résidu aqueux contenait 167 unités par ml (3,5), tandis que
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les extraits de chloroforme (35 ml contenant 21400 unités par ml, 48 ml contenant 15100 unités par ml et 43 ml contenant 5000 unités par ml)
contenaient 86% de l'activité de la strep- tomyoine. On a extrait les phases organiques deux fois avec deux portions de 20 ml d'eau à un pH de 2,0, que l'on a obtenu en ajoutant de l'acide chlorhydrique concentré à chaque portion d'eau. Le résidu de chloroforme oontenait moins de 100 unités de streptomycine par ml, tandis que la phase aqueuse contenait 79% de l'activité de la streptomycine dans le liquide de départ, la pureté étant supérieure à 50%.
¯'Exemple 4.,
On a extrait 100 ml d'une solution impure de tétracycline contenant 4700 unités par ml avec trois portions de 25 ml d'un mélange de 10% de di-n-butyl-phosphate dans du chloroforme. De la sorte, on a obtenu un extrait de 62 ml contenant 420 mg de tétracycline (89%), tandis que le résidu aqueux contenait 690 unités par ml (15%), ./Exemple. 5,.
Après avoir filtré le mycélium d'un liquide de culture de fermentation de tétracycline, on a extrait trois fois 250 ml du filtrat avec 30 ml d'un mélange constitué de 90 ml de butyl- acétate et de 10 ml de "Lensodel A", fabriqué par "Shell" en Angleterre, ce mélange contenant, comme composant actif, du dinonyl-phosphate de sodium, tandis que le pH du filtrat a été réglé à 5,5 par addition d'hydroxyde de sodium* Le résidu aqueux contenait moins de 50 unités d'activité de tétracycline par ml. On a trouvé la majeure partie de l'activité de la tétracycline dans la phase organique, d'où. elle a pu être transférée dans une phase aqueuse, comme décrit à l'exemple 1.
Exemple 6.
A 5 litres de liquide filtré de culture de tétracycline, on a ajouté 50 g de kieselgur et 50 g d'acide di-(2-éthyl-
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hexyl)-ortho-phophorique, tout en agitant vigoureusement et tout en ajoutant de l'hydroxyde de sodium, afin d'obtenir un pH de 8,5. On a filtré le mélange et on a rincé le précipite avec de l'eau. On a écarté le filtrat contenant 3% de l'aoti- vité initiale. On a dispersé le précipité dans 800 ml de butyl- aoétate, on l'a filtré, rincé avec 50 ml de butyl-aoétate et rediaperaé dans 250 ml de butyl-acétate, puis on l'a. à. nouveau filtré et rincé avec 50 ml de butyl-acxtate.
Au total, on & obtenu 1270 m1 d'extrait de butyl-aoétate contenant 92% de l'activité initiale.
La tétracycline peut être transférée de l'extrait de butyl-aoétate dans une phase aqueuse, comme déorit à l'exem- ple 1.
REVENDICATIONS.
1.- Procédé de purification d'antibiotiques amphotères ou basiques, où l'antibiotique impur est transféré dans un solvant organique peu ou non-miscible à l'eau en présence d'un support, caractérisé en ce qu'on emploie, comme support, un ou plusieurs esters organiques d'acide phosphorique ou phospho- reux, ces esters contenant, dans leur molécule, au moins un atome dissociable de métal ou d'hydrogène, tandis que le ou les radicaux organiques de ces esters ont une nature hydrophobe suffisante pour rendre las, esters solubles dans le solvant organique.