BE619532A - - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  "Nouvelles substances de croissance et leur procédé de pré- paration" 
Par ferri-oxamines, on entend des substances de croissance renfermant du fer qui ont été isolées à partir d'organismes végétaux, notamment à partir de micro-organismes (cf. Bickel et ses Collaborateurs, "Experientia" 16, 129 [1960]; Bickel et ses Collaborateurs, "Helv. Chim. Act." 18, 2129 [1960]. Le fer peut être soutiré de ces substances, 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 auquel cas on obtient 1rs desferri-oùDlp08" oorr..poD1antB, A am'Wft'M 7ase << a yT*#fnr T t<t J5 nnnnna6 ant A..."..'ft sont A !W'!!1?'y. Akmwat t!'9t"orm8 en les ferri# oxRaines par addition d'ions fer.

   Sur la base de leur faculté de lier le fers les desferri-composés peuvent Stre utilisés en méde- cine, par   exemple   dans le cas d'un dépôt   pathogène   dame l'organisme de   pigments   ronfermant du fer, tels qu' ils se 
 EMI2.2 
 présentent dans l'hémochrcmatose et 1hmosidéroeeo On a maintenant trouvé de façon surprenante que Isa desferri-ooEamines sont formées par les organismes végétaux et peuvent, par suite, être directement isolées à partir de ceux-ci. En outre, il s'est avéré que 
 EMI2.3 
 la formation des ferri-oxamines et/ou des dsterri-ozsaines dépend à un degré élevé de la teneur en fer du milieu nutri- tif dans lequel les organismes végétaux sont cultivée.

   Un très grand nombre de micro-organismes ne formant des ferri- 
 EMI2.4 
 oxamineig et/ou des desferri-oxamines, ou n'en forment que dans des quantités assez grandes, que lorsqu'ils sont culti- vés avec un manque de fer,   c'est-à-dire   dans des solutions nutritives renfermant moins de fer qu'on n'en utilise   norma-      lement lors de la culture des micro-organismes o Même lors   d'une absence presque complète de fers il se forme une quan- 
 EMI2.5 
 tité notable de de.sterr1-oXli1l\ine o Par ailleurs, à partir d'une certaine teneur en fer,

   on ne produit essentiellement 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 plus de   ferri-oxamines   ou de   desferri-oxamine.   Le maximum de la formation de la ferri-oxamine et de la desferri-oxa- mine se présente pour une teneur en fer très minime du mi- lieu nutritif. S'il   s'agit   par suite, avec un micro-organis me déterminé, d'obtenir un rendement aussi élevé que possi- ble en   desferri-oxamine,   ledit micro-organisme est alors cultivé avantageusement sur des milieux pauvres en fer.

   Le tableau 1 montre la dépendance existant entre la quantité de ferri-oxamine et/ou de desferri-oxamine et la teneur en fer du milieu nutritif dans le cas de la souche   Hocardia   brasi- liensie ETH 27413 formant de la   desferri-oxamine E   et respec- tivement de la ferri-oxamine E. 



   Tableau 1 
 EMI3.1 
 
<tb> Teneur <SEP> en <SEP> fer <SEP> du <SEP> milieu <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> ferri-oxamine
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> nutritif <SEP> en <SEP> moles <SEP> de <SEP> et/ou <SEP> de <SEP> desferri-oxamine
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> sulfate <SEP> ferrique <SEP> par <SEP> litre <SEP> par <SEP> litre <SEP> après <SEP> culture
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> pendant <SEP> 9 <SEP> jours
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> traces <SEP> non-mesurables <SEP> 280 <SEP> mg
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2.5 <SEP> 10-8 <SEP> 520 <SEP> mg
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2,5.

   <SEP> 10-7 <SEP> 170 <SEP> mg
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2,5 <SEP> 10-6 <SEP> inférieure <SEP> à <SEP> 5 <SEP> mg
<tb> 
 
Le nouveau procédé d'obtention des   d&sferri-   oxamines est caractérisé par le fait que la oulture eet ef- fectuée dans une solution nutritive avec un manque de fer, 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 jusqu'à   ce qu'il'se   soit formé une quantité notable de desfferri-oxamine, qu'on transforme la ferri-oxamineéven- tuellement présente en desferri-oxamine par addition de substances capables de lier le fer et qu'on isole la   desferri-oxamine   de la solution nutritive., 
On utilise comme substances de départ des micro-organismes convenant à l'obtention des ferri-oxamines 
La solution nutritive renferme les sources usuelles de carbone et d'azote, par exemple dugLucose,

   du saccharose, du lactose, de l'amidon, des alcools comme le mannitol et le   glycérol,   des acides aminés, par exemple l'ornitheine, des peptides, des protéines et leurs produits de dégradation comme la peptone ou la tryptone, dea ex= traits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le mais ou le   froment,   des rési- dus de distillation provenant de la préparation de l'alcool, des levures, des graines notamment de colza et de soja, des graines de coton, des sels d'ammonium, des nitrates Comme sels inorganiques, la solution nutritive renferme par exemple des chlorures, des carbonates, des sulfates, des nitrates de métaux   aloalins   et   alcalino-terreux,   du magné- sium, du zinc ou du manganèse, La teneur en sel de fer ne doit pas, en général,

   dépasser 10-7 mole par litre, mais la teneur optimale doit être déterminée pour chaque organisa   Lorsqu'on utilise l'eau du robinet pour préparer la. solu- 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 tion nutritive, on doit tenir compte de sa teneur en fera 
La culture a lieu de manière aérobie,   c'est-à-   dire par exemple en culture de surface au repos ou, de pré- férence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans dos flacons agités ou dans les fermenteurs connus.

   Comme température, convient une température comprise entre 18 et 40 C. de préférence une température de   27 Co   Dans ce cas, la solution nutritive présente en général au bout de 4 à 10 jours un effet notable analogue à celui de la   desferri-oxamine   Mesuré en tant qu'activité   ferri-oxaminique   après transformation des desferri-oxamines en   ferri-oxamines   à l'aide d'un sel de fer- (III)7. 



   L'activité   ferri-oxaminique   peut être déterminée par voie   miorobiologique   à l'aide du test de Bonifas modifié (cfo Zähner et autres, "Arch   Mikrobiolo"   36. page 325 et suivantes [1960], Comme solution-test, on utilise une solu- tion de   ferrimycine   d'une teneur de 0,01 mg par centimètre- cube, sous la forme d'une souche test de Staphylecoscue aureuso 
On peut également déterminer par voie optique la concentration en   ferri-oxamine   de la solution de culture. 



  A cet effet!)on secoue pendant 5 minutes 5   car   du liquide de culture avec 1,5 g de chlorure de sodium, un centimètre cube   d'une   solution à 0,1   %   de sulfate ferrique et 5   car   

 <Desc/Clms Page number 6> 

 d'alcool   benzylique,   sépare par   centrifugation,   filtre la phase organique et détermine l'extinction de la phase orga- nique à 410 m . Comme échantillon de comparaison, on se sert d'un extrait préparé de la même manière à partir d'une solution nutritive non-ensemencée. 



   Pour l'isolement des desferri-oxamines, on peut se servir des méthodes connues. La   ferri-oxamine   présente dans le milieu de culture est transformée en desferri-oxa- mine par addition de substances formant des complexes ferri-   fères,   par exemple de 8-hydroxy-quinoléine. 



   Cela peut avoir lieu soit directement après la fin de la fermentation dans la bouillie de culture, soit cependant dans un stade ultérieur du traitement, pour éli- miner également des ions de fer-(III) éventuellement en- traînés par les agents utilisés. 



   Les méthodes suivantes conviennent particulière- ment pour l'isolement des desferri-oxamines. 



   1) On peut utiliser des agents d'adsorption, par exemple des charbons actifs comme la norite, des terres acti- vées comme la franconite, la terre à foulon ou la floridine, ou des adsorbants résineux comme   l'asmite.   L'élut ion des adsorbats a lieu avantageusement avec des mélanges aqueux de solvants organiques miscibles à l'eau, par exemple avec de des mélanges d'eau et méthanol, d'eau et de pyridine, d'acide acétique dilué et de méthanol, ou d'eau, de méthanol, d'acide 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 acétique glacial et de butanol. Un mélange de 4 parties en volume d'eau et d'une partie en volume de pyridine s'est avéré particulièrement approprié pour   l'élution   d'un adsor- bat de franconite et de   norite.   



   2) On peut de plus soutirer les desferri- oxamines d'une solution aqueuse à l'aide de solvants orga- niques. Pour ce procédé d'extraction, des alcools organi- ques supérieurs, par exemple l'alcool benzylique ou l'alcool   isopropylique ,   se sont avérés particulièrement appropriés Dans ce cas, on ajoute avantageusement à la phase aqueuse des eels inorganiques, par exemple du sulfate d'ammonium ou du chlorure de sodium* A partir des extraits organiques obtenus, les   desferri-oxamines   peuvent être obtenues sous forme enrichie soit par évaporation du solvant, soit par précipitation à l'aide d'un solvant organique convenable, par exemple l'éther, l'éther de pétrole ou l'acétate   d'éthyle.   



   3) Une autre méthode d'enrichissement des   desferri-oxamines   consiste à les répartir entre une solution aqueuse et une solution de phénol dans le chloroforme, la teneur en phénol de la solution   chloroformique   pouvant   variero   
4) Une autre méthode pour l'enrichissement et/ou la séparation des   desferri-oxamines   est constituée par la chromatographie, par exemple une chromatographie 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 d'adsorption sur différentes matières, par exemple sur de la norite, de l'oxyde d'aluminium, des silicates de magné- sium, du gel de silice, du sulfate de calcium, ainsi qu'une chromatographie de répartition   avec   de la cellulose, de l'amidon, du gel   de silice,

     de la   célite   et analogues comme substances de support, ou toutefois une ohromatographie sur des résines échangeuses d'ions, par exemple sur du Dowex-50. de l'Amberlite IRC-50 et analogues. 



   5) Une méthode utilisable pour l'enrichissement et/ou la séparation des   desferri-oxamines   consiste également dans une extraction à l'aide d'échangeurs de cations liqui- des qui sont dissous dans des solvants organiques non misci- bles à   l'eauo   Comme échangeurs d'ions, on peut utiliser des acides carboxyliques d'un poids moléculaire de 200 à 1000, par exemple l'acide di-linoléique, ou des orthophos-   phates   de dialcoyles d'un poids moléculaire de 200 à 600   en-   viron, par exemple l'orthophosphate de bis-2-éthylhexyle, qui peuvent être mis en oeuvre sous la forme H+ ou sous la forme saline, de préférence la forme   Ne.+,   ou dans un mélange des deux.

   Comme solvants, conviennent des alcools non- miscibles à l'eau qui comportent de 4 à 8 atomes de carbone, de préférence l'alcool amylique normal et le 2-éthyl-n- butanol. L'extraction a lieu dans un domaine de pH de 5,0 à 8,5, de préférence entre   7)5 et   8,0. A partir des ex- traits, les desferri-oxamines peuvent à nouveau être trans- 

 <Desc/Clms Page number 9> 

 férées dans la phase aqueuse à l'aide d'alcalis ou d'acides ou de tampons alcalins ou acides, dans les zones de pH su-   périeures   à 8,5 ou inférieures à 3,0, de préférence à un pH de 10,5 à 11,0 ou de   1,5   à   2,0 ,   en obtenant à nouveau par   là   un enrichissement et une purification. 



   6) De plus, les desferri-oxamines peuvent être enrichies par une répartition à contre-courant suivant Oraig entre deux phases   solvantes   non-miscibles. Le système solvant suivant s'est avéré particulièrement avantageux n-butanol :alcool   benzylique :  acide chlorhydrique millinormal :solution aqueuse de chlorure de sodium saturée à 19  (9:9:15:5). 



   L'invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus. 



   L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non-limitatifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centigrades 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 
 EMI10.1 
 3 G *#.- 1 -.jtA .1. .<14-t<-. ####jt# -# uw.vwav la J-tMOJM cw vaâsvw.v t) M)00, vit üul- tive une souche de Streptomyces pilosus NRRL   2857   dans une solution nutritive renfermant,   par   litre d'cau du   robinet,   20 g de farine de soja et 20 g de   mannite.   L'eau du robinet renferme de 20 à 30 de fer par litreo La solution   nutri-   tive est stérilisée dans les ballons d'ensemencement ou dans les fermenteurs pendant 20 à 30 minutes sous une pression d'une atmosphère effective. Elle présente alors un pH de 7,2 à 7,6.

   On ensemence alors avec jusqu'à 20 % d'une cul- ture végétative, partiellement sporulante, de la souche ci- dessus Tout en secouant bien ou en agitant, on incube à 
 EMI10.2 
 24-30 , en faisant passer dans les cultures, dans les fer-aen- teurs, environ deux volumes d'air par volume de solution et par minute. Après 96 heures d'incubation environ, la solu- tion de culture a atteint la teneur maximale en desferri-   oxamines.   On détermine cette teneur à l'aida d'un test à 
 EMI10.3 
 1 lantisydéraiayoine. 



  A 3400 litres d'une bouillie de culture active 
 EMI10.4 
 de Streptomyces pilosus 1ffiRL 28j?7, on ajoute 8%) g de 8--hydroxy-quinoléine en solution dans 16 litres de méthanol. 



  Au bout d'une heure, on sépare le mycélium par filtration, en ajoutant 2 % d'Hyflo-uperael en tant qu'auxiliaire de filtration. En vue d'éliminer la 8-h1drox)'-qu1noléine en excès, on percole le filtrat à travers une colonne, avec 

 <Desc/Clms Page number 11> 

 45 litres d'Amberlite   IR-45   sous la forme OR-. Le pH du produit de percolation est ajusté à 7,5 par addition d'acide chlorhydrique. La solution de culture active ainsi obtenue est ensuite envoyée de bas en haut à   travers   une série de quatre colonnes échangeuses   d'ions   montées en série, d'un diamètre de 15 cm.

   Chaque colonne renferme 25 litres d'Amberlite   IRC-50   soue la forme H Le contenu de chaque colonne est, avant l'adsorption, amené à 25 % environ sous la forme sadique, par traitement avec 780 g d'hydroxyde de sodium dans de l'eau. La vitesse de l'ad- sorption est de 150 litres par heure. Le contrôla biolo- gique des traversées des diverses colonnes à l'aide du test à l'antisidéramycine montre que la colonne N  1 est complètement chargée, la colonne N  2 partiellement   char-   gée et que les colonnes N  3 et 4 ne sont pratiquement pas chargées.   Pour   l'élution, la colonne ? 1 est soustraite à l'opération et l'on ajoute après la   colonne ?   4 une colonne remplie d'une résine fraîchement régénérée et traitée avec de l'hydroxyde de sodium. 



   Après la fin de l'adsorption, la colonne N  1 est rincée à fond avec de l'eau désionisée. La substance active adsorbée est éluée avec de l'acide chlorhydrique   0;2'-normal,   en percolant l'agent d'élution de haut en bas à une vitesse de 15 litres par heure On réunit les 200 litres d'éluats actifs, ajuste à un pH de 5,0 avec une 

 <Desc/Clms Page number 12> 

 solution d'hydroxyde de sodium, sature de chlorure de   sodiur     et extrait dans un rapport de 20 :

  1 de l'alcool benzy-   lique dans un extracteur à   contre-courante   L'extrait obte- nu à l'alcool benzylique est clarifié par essorage après avoir été agité avec un kilogramme   d'Hyflo.   Dans le fil- trat limpide, on détermine le fer lié de manière complexe, ajoute un excès de 100 % environ de la 8-hydroxy-quinoléine nécessaire pour l'élimination, puis agite pendant deux heu- res. A la solution maintenant de teinte noir verdâtre, on ajoute deux parties en volume de méthylisobutylcétone et extrait avec de l'eau dans un rapport de 5:1 sur un ex- tracteur à contre-courant.

   En vue d'éliminer la   8-hydroxy-   quinoléine en excès, on soumet alors les extraits aqueux à une extraction au chloroformée Cette solution aqueuse de teinte orange-jaune,d'un volume de 30 litres, renferme environ 500 g de substances solides. Pour isoler le chlor- hydrate de   desferri-oxamine   B, on concentre de façon ménagée la solution aqueuse sous vide jusqu'à un volume de 1,5 li- tre, le produit désiré   commençant   déjà à   cristalliser-   La cristallisation est complétée en laissant reposer à + 4 , après quoi on sépare le produit par essorage et le lave en- suite avec un mélange froid constitué par une partie en vo- lume de méthanol et par une partie en volume   d'eau.   



   Le point de fusion du produit brut est de 162-165 . Par recristallisation dans un mélange d'eau et 

 <Desc/Clms Page number 13> 

 de méthanol dans le rapport le.9 et dans un mélange d'eau et d'acétone (1:4), le point de fusion passe à 169-171 . 



   Effectuée de la   marne   manière, l'élution de la colonne N  2 fournit un éluat renfermant 220 g de substan-   ces solides o La cristallisation du concentrât aqueux four-   nit 112 g d'un point de fusion de 168,5-171 . La cristal- lisation de la liqueur-mère fournit encore 40 mg d'un point de fusion de 164-165.5 . La recristallisation des deux cristallisais dans un mélange d'eau et de méthanol et dans un mélange d'eau et d'acétone fournit à l'état pur le chlorhydrate de   desferri-oxamine   B fondant à 170,5-172 . 



     EXEMPLE   2 
Après addition de 90 kg   d'Hyflo-Supercel,   on filtre à travers un filtre-presse 3000 litres d'une bouillie de culture obtenue comme décrit dans l'exemple 1 et pompe le filtrat à un pH de 6,1, à une vitesse de 150 litres par heure, de bas en haut, à travers quatre colonnes montées en série, d'un diamètre de 15 cm et d'une hauteur de 3,5 m, qui sont chargées chacune de   25   litres d'Amberlite   IHC-50   sous la forme H.

   Le traitement des adsorbats a lieu comme décrit dans l'exemple lo Le contrôle biologique des raffi- nats fournit le même résultat que dans l'exemple lo 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 
EXEMPLE 3 
A une vitesse de 150 litres par heure, on fait passer de bas en   haut, à   travers deux séries de quatre co- lonnes échangeuses d'ions, 3200 litres d'une bouillie de culture qui a été débarrassée du mycélium comme décrit dans l'exemple 2, les colonnes de la première série présentant un diamètre de 10 en et une hauteur de 2,5 m, et celles de la seconde série un diamètre de 15 cm et une hauteur de 3,5 m.

   Les colonnes de la première série sont chargées   cha-   cune de 3 litres d'Amberlite IRC-50 sous la forme H. et celles de la seconde série sont chargées chacune de 25 li- tres d'Amberlite   IRC-50   sous la forme H. Le traitement des   adsorba ts   a lieu comme décrit   ddans   l'exemple 1. Le contrôle biologique des raffinais montre que les colonnes N  1 à   4   de la première série n'ont absorbé que peu   d'acti-   vité, tandis que les colonnes N  1 à   4   de la seconde série se sont comportées d'une manière analogue à celle décrite dans les exemples 1 et 2. 
 EMI14.1 
 



  H!'l1i!UPT .1i! ZL Sur 25 couches différentes d'aotlncmy côtes ohoi- sies de façon quelconque, deux souches seulement (à savoir les souches de Streptomyces ETH   21748   et ETH 21798) forment des   ferri-oxamines   qui sont décelables dans le test antago-   niste, lorsqu'on utilise la  solution nutritive suivante :   

 <Desc/Clms Page number 15> 

 
 EMI15.1 
 
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 20 <SEP> g <SEP> Solution <SEP> saline <SEP> :

   <SEP> 
<tb> 
 
 EMI15.2 
 Itn nn it e 20 g (1fH4) 4 100 g 
 EMI15.3 
 
<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> cm3 <SEP> KNO3 <SEP> 50 <SEP> g
<tb> 
 
 EMI15.4 
 Solution saline 110 cm3 ueo4- Il 7 0 25 g 
 EMI15.5 
 
<tb> Citrate <SEP> ferrique <SEP> 10 <SEP> g
<tb> 
<tb> ZnSO <SEP> . <SEP> 7 <SEP> H2O <SEP> 5
<tb> 
<tb> MnC2 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> 
<tb> CoC12 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> 
<tb> CuSO <SEP> . <SEP> 5 <SEP> H2O <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb> 
<tb> H3BO3 <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> 
 dans 5 litres d'eau 
 EMI15.6 
 Sur 73 souches différentes d'aotinamyoètes choisies de façon quelconque, toutes forment des ferri- oxamines lorsqu'on utilise la solution nutritive ci-dessus sans addition de sel ferrique.

   Les souches examinées sont : 22.794.   streptomyces     glaucescens,     240457,   Streptomyces albus, 
 EMI15.7 
 27=001, analogue au Streptomyces vïolageoniger,   27o002,   analogue au   Streptomyces   fradiae. 



  27.005. Streptomyces   sp.,   27.007,   Streptomyoes   spo 27.009,Streptomyces   galilaeua,     27.010,   Streptomyces antibiatieus, 27.013, Nocardia   bras-4.14 et   27.015, Nocardia   spo,   

 <Desc/Clms Page number 16> 

 
 EMI16.1 
 27o025 et 27o028, analogues au Streptomycea gal1la:f)US, 27.033.

   Streptomyces   viridochromogenes,   27.053, Streptomyces   polychromogenes.   
 EMI16.2 
 270054, Streptomyces antibioticus, 270059, 8trepta,yces griseoflavusp 27?067t Streptoayees antibioticus, 27.068, Streptomyces   olivaceus,     27o070,   Streptomyces   venezuelae,   27.074, Streptomyces   olivaceus,   
 EMI16.3 
 27'6077, Streptomyces antibioticus, 2?au83., Streptomyces griseoflavus, 27oOE3) Streptomyces antibioticua, 2?e090 9 Streptomycea viridochromogenes, 27.093, Streptomyces grisous,   27o094,   Nocardia   brasiliensis,   27.106, Streptomyces olivaceus, 27.113.

     Streptomyoes   aureofaoiens, 27.116, Streptomyces   olivaceus,   
 EMI16.4 
 27ol22, Nocardia bxasiliensi$9 27ol32, Streptomyces gr1seus, 27.140, Streptomyces   antibioticus,     27cl50,   Streptomyces olivaceus, 27.151, Streptomyces grisous, 27.152, Streptomyces lavendulae,   270164"   Nocardia   brasiliensis,   

 <Desc/Clms Page number 17> 

 
 EMI17.1 
 2701?5, Streptomyces noursel, 27ol88, Streptomyoes eohiuatua, 27.216, streptO!D1ces hirsutus, 27o217, Streptomyces hlrsutua, 27.2209 Streptomycea gris eus , 
 EMI17.2 
 27o232, Streptomyces sp. 
 EMI17.3 
 



  27o269< Streptomyoes epo, 27o273t B aptomcaa veeur3ae, 270299, analogue au Streptomyces fradiae, 27o303, Nooardia brasilienais, 27o507  Streptomyoea aureofpriens, 27.362, atreptomyaes fravieslmus, 
 EMI17.4 
 27o364, Streptomyces griseus, 
 EMI17.5 
 27-377, Streptomyoes rotiouli, 27o380, Streptomyces ep., 27-3829 Streptomyces grieeus, 2?fol390, Nooardia brasilisnsie, 27o413, Nocardia brasiliensis, 27o440, Nocardia astéroïdes, 2? a 4l.2 , 8 trept ormya e a aureofaciena, 27bzz  Streptomyoes vir3dochromogsncje, 270465, Streptomyoea polyohromogenea, 2?04?2, lfooardla asteroides, 270479, Btreptomyoee antibiotioue, 2? 0 490 , 8 treptomrces ep 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 27.499,   Nocardia     astéroïdes,   
 EMI18.1 
 27o509f Streptc#yces ech1Da:

  tuB 2/o5iû, S zrept omo se à.ivaaeu8 , 27,5169 Nocardia astéroïdes, 27o525, 8*,reptosparangium roaeum, 27<>5<taô, Streptomyces griseus, 270549 Streptomroes aureofaciens, 2'7.556 Mioromonospore. fusca, 27o559, StreptoBqrces spo+, 27o590, Streptomyces gris eus + , 27.596,   Streptomyoes     galilaeus.   



   +Ces souches   étalant   négatives dans le premier essai,mais le   contrôle   ultérieur montre qu'elles sont 
 EMI18.2 
 toutes appropriées à la formation de sidéram)"aine 
Les souches ont été déposées sous les numéros indiqués à l'Ecole Polytechnique Fédérale à Zurich. 



   EXEMPLE 5 
On cultive en culture immergée, à 27 , la sou- 
 EMI18.3 
 che ETH 2?0413 Nocardia brasiliensis, dans la solution sui-   vante :   
 EMI18.4 
 
<tb> glucose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> 
<tb> asparagine <SEP> 5 <SEP> g
<tb> 
 
 EMI18.5 
 MgSO4 - 7 H20 1,0 g 
 EMI18.6 
 
<tb> CaC12 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> 
<tb> 
<tb> K2HPO4 <SEP> 1,0 <SEP> g <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> 1000 <SEP> car,
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 et en plus quantités variables de sulfate ferrique. 



  Après 9 jours   d'incubation à   27 , on détermine 
 EMI19.1 
 la quantité de ferri-oxamim E (resp. de desferri-oD';J1e) qui s'est formée (test antagoniste et détermination optique à 440 m ). On sépare la culture par filtration, ajoute un milligramme de FeC13 par centimètre-cube et extrait la même quantité d'un mélange de chloroforme et de phénol (une par- tie en volume a une partie en poids), puis mesure l'extinc- tion dans la phase organique filtrée. 
 EMI19.2 
 



  Teneur en terri-oaamine B au bout de 9 jours (ou de desf erri-oxawi ne E) 
 EMI19.3 
 
<tb> sans <SEP> sulfate <SEP> ferrique <SEP> 280 <SEP> mg <SEP> par <SEP> litre
<tb> 
<tb> 2,5 <SEP> . <SEP> 10-8 <SEP> moles <SEP> de <SEP> sulfate <SEP> ferrique <SEP> 520 <SEP> mg <SEP> par <SEP> litre
<tb> 
 
 EMI19.4 
 2,5   1.0-7 moles   " " 1?J mg par litre 295 - 10 moles" " " moins de 
 EMI19.5 
 
<tb> 5 <SEP> mg <SEP> par <SEP> litre
<tb> 
 EXEMPLE 6 
 EMI19.6 
 la souche de Streptomyoea piloous ETE 210748 (NRRL 2857) est cultivée de manière immergée pendant 10   jours dans la solution nutritive suivante :   marmite 2 % farine de soja 2% eau du robinet et quantités variants de chlorure ferrique. 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 



   L'eau du robinet renferme de 20 à 30 de fer par litre      
La détermination de la formation de ferri-      examine (il se forme principalement de la ferri-oxamine B) a lieu dans le test   antagoniste.   



   Teneur en   ferri-oxamine   au bout de 10 jours   (activité     correspondant   à mg de   ferri-oxamine   B   par   litre 
 EMI20.1 
 
<tb> sans <SEP> chlorure <SEP> ferrique <SEP> 480 <SEP> mg
<tb> 
<tb> 10 <SEP> mg <SEP> de <SEP> chlorure <SEP> ferrique <SEP> par <SEP> litre <SEP> 150 <SEP> mg
<tb> 
 
 EMI20.2 
 lOOmg" il nn 5 mg 1000 m;

   moins de 1 mg/litre| 
 EMI20.3 
 
<tb> 
<tb> 
   EXEMPLE 7    
 EMI20.4 
 Après addition de 60 kg d'Eyflo-qSupercel et 1 ajustement du pH à une valeur de 4,5 avec 2 litres environ d'acide sulfurique, on filtre sur un filtre rotatif 3400 litres d'une bouillie de culture obtenue comme décrit dans l'exemple lo A l'aide d'un extracteur à contre-courant, on extrait les 3000 litres de filtrat limpide avec une solution 
 EMI20.5 
 à 5 % d'orthophosphate de bis-2-éthylhezyle (sous la forme sodique) dans du   2-éthyl-n-butanol   (dans le rapport 4:1), en ajustant constamment le pH avec une solution   0,4-normale   d'hydroxyde de sodium à une valeur de 7,6 à 7,8.

   Après l'extraction, la phase aqueuse présente un pH de 8,0 et ne renferme plus que de l'ordre de 2 % de l'aotivité de départ, L'extrait formé (750 litres) est lavé dans le rapport de 

 <Desc/Clms Page number 21> 

 5:1 à contre-courant avec une solution à   0,75 %   de chlorure de sodium et est ensuite agité avec de l'acide chlorhydri- que   demi-normal,   de sorte que la valeur de pH de l'extrait aqueux obtenu en retour est de   1,7 à   1,9. Le rapport d'extraction est de l'ordre de 3:1. L'ajustement de l'équi- libre   exige   de l'ordre de 15 à 30 minutes.

   A partir des 250 litres de l'extrait aqueux obtenu en retour renfer- mant de 80   à 90 %   de l'activité de départ, on peut obtenir quantitativement la desferri-oxamine B avec une grande pureté, par exemple par extraction avec de l'alcool benzy- lique, comme décrit dans l'exemple 1, ou par extraction avec un mélange de chloroforme   et   de phénol (1:1).

Claims (1)

1. Revendications .

   Io- Un procédé de préparation de desferri- oxamines par utilisation de micro-organismes appropriés à l'obtention de ferri-oxamines, caractérisé par le fait que la culture a lieu dans une solution nutritive, avec manque de fer, jusqu'à ce qu'il se soit formé une quantité notable de desferri-oxamine, qu'on transforme la ferri-oxamine éventuellement présente en desferri-oxamine par addition de substances capables de lier le fer et qu'on isole la desferri-oxamine de la solution nutritive.

   Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants : 1) On cultive dans une solution nutritive ren- fermant au plus 10-7 moles par litre de sels de fer.

   2) On cultive des micro-organismes de la classe des actinomycètes.

   3) On cultive des micro-organismes de la famille des StreptomyceSo 4) On cultive des micro-organismes de la fa- mille du Nocardiao 5) On cultive le Streptomycespilosus NRRL 2857.

   6) Lors de l'isolement des desferri-oxamines, on ajoute des substances formant des complexes de fero 7) On ajoute de la 8-hdroxy-quinoléine. <Desc/Clms Page number 23>

   8) On adsorbe les desferri-oxamines sur des échangeurs de cations.

   9) On utilise des échangeurs de cations renfer- mant des groupes carboxyliques.

   10) On utilise des échangeurs de cations liquides EMI23.1 11) On élue les desferri#examines adserbées à l'aide d'acides dilués ou de solutions de chlorure de sodium.

   12) On extrait les desferri-oxamines à l'aide d'un mélange de phénol et de chloroforme.

   13) On extrait les desferri-oxamines à l'aide d'alcool benzylique <Desc/Clms Page number 24> 14) On purifie les desferri-oxamines par : par.. tition à contre-courant dans un système d'alcool besylique de butanol nouai, d'une solution saturée de chlorure de sodium et d'acide chlorhydrique 0,001-normal (9:9:5:15).

   15) On combine deux ou plusieurs des procédés indiqués sous 8) à 14).