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La présente invention se rapporte à un procédé d'isole- ment et plus particulièrement à un procédé perfectionné pour isoler l'acide gibbérellique de milieux de fermentation aqueux.
Il est connu d'isoler l'acide gibbérellique de ses solu- tions aqueuses, par exemple d'un milieu de fermentation, en l'adsor- bant du milieu de fermentation sur du charbon de bois, en l'éluant et en le séparant de l'éluat.
On a découvert à présent que l'acide gibbérellique peut être isolé d'une solution aqueuse de fermentation, en soumettant cet- te solution aqueuse de fermenta.tion'à une extraction à l'aide d'un solvant organique approprié, par exemple l'acétate d'éthyle, et en séparant ensuite l'acide gibbérellique de ce solvant.
Cela étant,, la présente invention a pour objet un procédé perfectionné pour isoler l'acide gibbérellique d'un milieu de fer-
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mentation aqueux de cet acide, procédé dans lequel on soumet ce mi- lieu de fermentation aqueux à une extraction à, T'aide d'un solvant organique approprié, immiscible à l'eau ou partiellement miscible à l'eau, choisi dans le groupe formé d'esters, de cétones, d'al- cools et d'éthers.
Ce milieu de fermentation aqueux qui contient l'acide gibbérellique et qui sert de matière première peut être obtenu par un procédé quelconque connu, par exemple il peut prendre la forme d'un filtrat aqueux provenant d'un milieu de fermentation contenant de l'acide gibbérellique et préparé par la culture de champignons produisant de l'acide gibbérellique sur un milieu aqueux nutritif approprié. Le champignon Gibberella fujikuroi convient à cet effet, mais on peut utiliser d'autres champignons ou leurs variantes produi- sant de l'acide gibbérellique.
A titre d'exemples de solvants organiques appropriés choisis dans le groupe consistant en esters, cétones, alcools et éthers qui peuvent être utilisés dans le procédé d'extraction de la présente invention, on citera l'acétate d'éthyle, l'acétate de n-butyle, l'acétate d'isoamyle, le carbonate d'éthyle, le propio- nate d'éthyle, le n-butyrate dthyle, le lactate de n-butyle, l' acétate d'isopropyle, l'acétate de p-éthoxyéthyle, l'acétate de méthoxybutyle, la méthyl-n-propylcétine, la cyclohexanone, la di- éthylcétone, la méthylisobutylcétone, la méthylcyclohexanone, la méthyléthylcétone, l'alcool benzylique, le butanol secondaire, le cyclohexanol, le butanol normal, l'éther éthylique et le 1-1-dimé- thoxy-éthane.
Il est évident que ce solvant peut êtreun mélange des solvants, par exemple un mélange composé de n-butanol et d'acé- tate de n-butyle, ou bien un mélange composé d'acétate d'isoamyle et d'acétate de n-amyle, comme c'est le cas pour l'acétate d'amyle industriel.
Les solvants préférés sont l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isoamyle, la méthyl-n-propylcétone et la méthyl-iso-butylcétone.
Le milieu de fermentation aqueux filtré contenant l'acide gibbérellique utilisé comme matière première est de préférence réglé à un pH compris entre 1,5 et 4,0 avant l'extraction à l'aide d'un
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solvant organique approprié. L'acide gibbérellique peut être isolé de l'extrait au solvant organique ainsi obtenu par tout procédé con- nu, et, par exemple; cet extrait peut être concentré et le produit brut obtenu peut être purifié par des procédés connus pour donner l'acide gibbérellique.
Un procédé adéquat de purification de l'acide gibbérel- lique consiste à extraire l'acide gibbérellique du solvant organique en le versant dans une solution tampon au pH 6 à 8. L'extrait au tampon est ensuite acidifié au pH 3 à 4 et l'acide gibbérellique ainsi libéré est ensuite extrait à l'acétate d'éthyle. L'acétate d'éthyle est ensuite desséché à l'aide de sulfate de sodium et réduit à un petit volume, et l'acide gibbérellique presque pur se sépare par cristallisation. On peut ajouter une fraction légère du pétrole pour obtenir un meilleur rendement en matière recherchée.
La présente invention est illustrée, sans y être limitée... par les exemples suivants : EXEMPLE 1.-
On règle au pH 3, 3 litres de filtrat de culture, dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 117 mg, et on les soumet à une triple extraction à l'acétate d'éthyle en utilisant chaque fois 1,5 litre. On combine les premier et deuxième extraits et on les évapore à 100 cm3 et on les extrait deux fois à l'aide d'une solution tampon de phosphate (136 g de phosphate monopotas- sique et 24 g d'hydroxyde de potassium.et eau distillée pour faire 1 litre ; pH 6,3) en utilisant 25 cm3 chaque fois. Les extraits au tampon sont combinés, réglés au pH 3,5 - 3,8 et extraits deux fois à l'acétate d'éthyle en utilisant chaque fois 70 cm3 d'acétate d' éthyle.
On réduit ensuite les extraits à l'acétate d'éthyle combinés à un petit volume et on y ajoute une fraction légère du pétrole, @ et l'acide gibbérellique cristallise. On obtient ainsi 72 mg d'acide gibbérellique, point de fusion 233-235 C, avec décomposition.
EXEMPLE 2.-
On règle au PH 3, 1 litre d'un filtrat de culture, dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 39 mg, et on l'ex-
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trait deux fois à l'acétate de butyle en utilisant chaque fois 1 litre. On évapore les extraits combinés et on purifie le produit brut comme dans l'exemple 1. On obtient ainsi 8 mg d'acide gibbérel- lique, point de fusion 233-235 C avec décomposition.
EXEMPLE 3.-
On règle au pH 3,2 litres d'un filtrat de culture, dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 378 mg et on les ex- trait deux fois à l'acétate d'éthyle en utilisant chaque fois deux litres. On évapore les extraits combinés et on purifie le produit brut comme dans l'exemple 1. On obtient ainsi 268 mg d'acide gibbé- rellique, point de fusion 233-235 C avec déconosition.
EXEMPLE 4.-
On règle au pH 3, 2 litres d'un filtrat de culture dont la teneur en acide gibbérellique est estimée entre 690 et 886 mg et on les extrait trois fois à l'acétate d'éthyle, en utilisant respectivement 1 litre, 2 litres et 1 litre d'acétate d'éthyle.
On combine les premier et deuxième extraits et on les évapore jusqu' un volume de 100 cm3 qu'on extrait deux fois à l'aide d'une solution tampon de phosphate (136 g de phosphate monopotassique et 24 g d' hydroxyde de potassium et eau distillée pour faire 1 litre; pH 6,3) en utilisant chaque fois 25 cm3. Ces extraits au tampon sont combi- nés, réglés au pH 3,5 - 3,8 et extraits deux fois à l'acétate d' éthyle, en utilisant chaque fois 70 cm3. Les extraits à l'acétate d'éthyle combinés sont alors réduits à un petit volume et une frac- tion légère du pétrole est ajoutée et l'acide gibbérellique se cris- tallise. On obtient ainsi 708 mg d'acide gibbérellique, point de fu- sion 233-235 C avec décomposition.
Le troisième extrait du filtrat de culture, purifié d'une façon semblable, donne encore 38 mg d'acide gibbérellique.
EXEMPLE 5.-
On extrait à l'aide de 2 litres d'éther éthylique, 2 litres d'un filtrat de culture dont la teneur en acide gibbérellique.est estimée entre 690 et 886 mg. On extrait ensuite l'extrait éthéré
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à l'aide de 280 cm3 d'une solution tampon de phosphate (136 g de phosphate monopotassique et 24 g d'hydroxyde de potassium et eau distillée pour faire llitre; pH 6,3). On extrait de nouveau le fil- trat de culture au même éther éthylique et on extrait de nouveau l' extrait éthéré à la même solution tampon. On répète quatre fois en tout ce procédé, L'extrait au tampon est ensuite réglé au pH 3,5- 3,8 et extrait deux fois à l'acétate d'éthyle en utilisant 350 cm3 d'acétate d'éthyle chaque fois.
On réduit les extraits combinés à un petit volume et on y ajoute une fraction légère du pétrole et de l'acide gibbérellique cristallise. On obtient ainsi 558 mg d'acide gibbérellique, point de fusion 233-235 C, avec décomposition.
En utilisant 2 litres d'éther/éthylique frais et 280 cm3 de solution tampon de phosphate fraîche, on reprend le procédé d'extraction et de purification précité à l'aide du filtrat de cul- ture. On obtient ainsi encore 226 mg d'acide gibbérellique, point de fusion 233-235 C, avec décomposition.
EXEMPLE 6.-
On règle au pH 2,5 par de l'acide phosphorique, 7,2 li- tres de filtrat de culture dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 450 mg par litre et on les extrait trois fois à l'acé- tate d'éthyle en utilisant chaque fois 3,6 litres de solvant. On concentre à 1 litre les extra.its combinés et on les extrait ensuite trois fois avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium de façon à obtenir un pH 7 dans la phase aqueuse, en utilisant respecti. vement 500 cm3, 150 cm3 et 150 cm3, On règle l'extrait aqueux au pH 3,5 et on l'extrait ensuite trois'fois à l'aide d'acétate d'éthyle.
On combine les extraits et on les concentre sous vide. L'acide gibbérellique qui cristallise est séparé par filtration, lavé avec de l'acétate d'éthyle et séché sous vide. On obtient ainsi 2,55 g d'acide gibbérellique, point de fusion 233-234 C avec décomposition
On reprend le procédé décrit ci-dessus excepté que tout au long du processus on remplace l'acétate d'éthyle par de l'acétate
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d'amyle comme solvant. On obtient ainsi d'une façon semblable, 2,33 g d'acide gibbérellique, point de fusion 233-234 C avec décomposition.
EXEMPLE 79-
1125 litres d'un filtrat de culture dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 400 mg par litre, sont soumis à une extraction à l'acétate d'éthyle à l'aide d'un extracteur Podbielniak au pH 2,8. On concentre à l'extrait (54 litres) sous vide jusqu'à un volume de 35 litres. On extrait le concentré ainsi obtenu à l'aide d'une solution aqueuse de tampon, on règle après mélange au pH 5,9 en utilisant successivement 10, 5 et 2 litres. Le premier extrait (10 litres) est extrait trois fois à l'aide d'acétate d'éthyle (en utilisant respectivement 5, 2,5 et 1,25 litres) après réglage au pH 3 après mélange au solvant. On combine le deuxième et le troisième extrait au tampon (total 5 litres) et on les extrait deux fois (2,5 et 1,5 litres) à l'aide d'acétate d'éthyle.
Tous les extraits d'acétate d'éthyle sont combinés et filtrés à travers un auxiliaire de filtration de terre d'infusoire et ils sont partielle- ment desséchés à l'aide de sulfate de sodium anhydre. On concentre sous vide les extraits combinés en deux parties. Quand le volume est tombé à 750 cm3, la cristallisation de l'acide gibbérellique commence et on arrête la concentration. On refroidit le mélange, on le filtre et on lave le résidu solide avec de l'acétate d'éthyle et on le laisse ensuite sécher à l'air. La concentration des liqueurs mères donne d'autres récoltes de matière solide. La quantité totale d'acide gibbérellique ainsi obtenu s'établit à 313,2 g, point de fusion 234- 235 C avec décomposition.
EXEMPLE 8.-
Le rendement de l'extraction de l'acide gibbérellique d'un milieu de fermentation aqueux par différents solvants est établi par le procédé décrit ci-après.
Une solution aqueuse d'acide gibbérellique préparée en dissolvant 0,5 g d'acide gibbérellique très divisé dans 250 cm3 d'eau distillée est filtrée pour éliminer la matière éventuellement non
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dissoute. On titre ensuite 25 cm3 de cette seiation avec une solu- tion aqueuse d'hydroxyde de sodium N/100, en utilisant comme indi- cateur la phénolpltaléine, et le volume de la solution d'hydroxyde de sodium requis est note. (X)
25 cm3 de la. solution diacide gibbérellique sont alors agités pendant environ 1 minute avec 25 cm3 de solvant à l'essai, dans un entonnoir séparateur bouché.
On déverse ensuite la phase aqueuse, on la titre avec une solution aqueuse d'hydroxyde de so- dium N/100 en utilisant comme indicateur la phénolphtaléine, et on note le titre (Y).On effectue alors une détermination à blanc à l'aide de 25 cm3 d'eau distillée et 25 cm3 de solvants On déverse encore une fois la phase aqueuse-et on la titre avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium N/100 et 'on note le 'titre du petit échantillon à blanc (B).
Le rendement en % de l'extraction est calculé d'après la formule:
Rendement % = [X-(Y-B)]X 100
X
Le % de rendement de l'extraction pour un certain nombre de solvants est donné ci-après:
EMI7.1
<tb> Solvant <SEP> utilisé <SEP> Rendement <SEP> de <SEP> l'extraction
<tb>
<tb>
<tb> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> éther <SEP> éthylique <SEP> 32
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> diéthylcétone <SEP> 74
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthyl <SEP> n-propyl <SEP> cétone <SEP> 79
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthyléthylcétone <SEP> 57
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthylisobutylcétone <SEP> 72
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1:
1-diméthoxyéthane <SEP> 19
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> carbonate <SEP> de <SEP> diéthyle <SEP> 39
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alcool <SEP> benzylique <SEP> 86
<tb>
<tb>
<tb> sec. <SEP> -butanol <SEP> 85
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alcool <SEP> n-amylique <SEP> 91
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cyclohexanone <SEP> 95
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthylcyclohexanone <SEP> 87
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cyclohexanol <SEP> 98
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> propionate <SEP> d'éthyle <SEP> 54
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> n-butyrate <SEP> d'éthyle <SEP> 39
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lactate <SEP> de <SEP> n-butyle <SEP> 89
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> d'éthyle <SEP> 71
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> d'isopropyle <SEP> 57
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> de <SEP> ss-éthoxyéthyle <SEP> 88
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> de <SEP> n-butyle <SEP> 54
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> de <SEP>
3-méthoxybutyle <SEP> 88
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> de <SEP> n-butyle <SEP> + <SEP> 10% <SEP> n-butanol <SEP> 73
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> d'amyle <SEP> 68
<tb>
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EXEMPLE 9.-
5350 litres d'un filtrat de culture provenant d'un fer- mentateur industriel, dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 1170 g, est soumis à une extraction à l'aide d'acétate d'éthyle au pH 2 à l'aide d'un extracteur Podbielniak. L'acétate d'éthyle séparé (4050 litres) est concentré sous pression réduite < jusqu'à 247 litres, On extrait ensuite 243 litres de ce concentré successivement avec 22,5, 18 et 18 litres d'eau contenant respecti- vement 1100, 100 et 25 g de bicarbonate de potassium, de façon que les extraits aqueux aient un pH 6,3.
La quantité de bicarbonate de potassium utilisée au cours de la première extraction est déterminée par le titrage d'une partie dé l'extrait concentré avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium N/10 en se servant comme indicateur de phénolphtaléine, ce qui montre que l'extrait concentré contient , des acides équivalents à 0,68 N/10 d'acide, La quantité de bicarbo- nate utilisée pour la première extraction est équivalente à deux tiers de la quantité calculée d'après le titrage. Les trois extraits au bicarbonate sont maintehus séparés et débarrassés de solvant à l'aide d'un séparateur centrifuge. Le troisième extrait est acidifié par de l'acide chlorhydrique aqueux et extrait deux fois à l'aide de 7,6 litres d'acétate d'éthyle, en réglant après mélange le pH à 3,3.
Le second extrait est ensuite extrait successivement à l'aide des deux extraits à l'acétate d'éthyle ci-dessus, en acidifiant de la même façon, et puis à l'aide d'un troisième lot d'acétate d'éthyle (4,5 litres). Le premier extrait au bicarbonate est ensuite extrait successivement avec les trois extraits à l'acétate d'éthyle utilisés précédemment et puis à l'aide d'encore 4,5 litres d'acétate d'éthyle, la phase aqueuse étant de nouveau réglée au pH 3,3. Les extraits à l'acétate d'éthyle combinés (36 litres y compris les liquides de lava- ge) ont une couleur brune et ils sont concentrés sous pression ré- duite jusqu'au moment où l'acide gibbérellique se sépare par cristal- lisation.
L'acide gibbérellique est séparé par filtration après l'a-
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voir laissé reposer pendant plusieurs heures et le solvant est concentré davantage pour donner encore de l'acide gibbérellique.
L'acide gibbérellique est soigneusement lavé avec de l'acétate d'éthyle pour le décolorer; il est obtenu sous la forme d'une matière solide cristalline blanche, point de fusion 234-235 C.
Son poids après séchage sous vide à 40 C s'établit à 947 g ou 81% de la matière présente dans la solution initiale.
REVENDICATIONS
1.- Procédé perfectionné pour isoler de l'acide gibbé- rellique d'un milieu de fermentation aqueux qui le contient, carac- térisé en ce qu'on extrait ce milieu de fermentation aqueux à l'aide d'un solvant organique approprié immiscible à l'eau ou partiellement miscible à l'eau choisi dans le groupe esters, cétones, alcools et éthers.