BE634041A

BE634041A -

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Publication number: BE634041A
Authority: BE
Priority date: 1962-07-03
Filing date: 1963-06-24
Publication date: 1963-12-24
Also published as: GB975492A; CH450628A; DK103557C; ES289379A1; BR6350419D0; US3265588A; NO118146B; FI40378B

Description


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 EMI1.1 
 substance tnt1btottque et proche pour sa préparation. 
 EMI1.2 
 la présent* inventiez concerne une nouvelle substance utile appelé* d<MtM)!yeine et ses procédé* de pré- 4 parat,ton. -Plus particulièrement  elle agace=* des proche- dés 4  préparation do ladite aubit4moo par ftrsientation et des procédés pour la. récupiror et la purifia.

   L'in- vantifn envisage cet agent sattbaet4rten wn ooluttans 41lu-dess sous fora  do concentrés brute# tous tome d< solides purifias, et sous forme cristallin* pure,. la daaocyoine est capable d'empêché)* le diveloppement des bactéries grac-positives, comprenant en particulier les 
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 staphylocoques qui résistent aux autres antibiotiques. 
 EMI1.4 
 Za demomycine n'est pas toxique et a un effet thérapeu- 
 EMI1.5 
 tique chez des souris infectées par des bactéries gram- 
 EMI1.6 
 posiïvea, Za dano#ycine est également utile pour guérit, 
 EMI1.7 
 chez -l'être humain des infections provoquées par les 
 EMI1.8 
 'bactéries cran-positives, par exemple la pneusonie. La danomyoine appartient au groupe des antibiotiques con- tenant du fer.

   La daneayoiae était appelée initialement antibiotique .\'  42µt fin fournit 8"tll#wto iiiirtût It prèsonst Un# 1l'id 6ntlblctiqu#i là 4uà illicaiât pe $ap$ehef le dévéi6ppµ±6 nt due baaldri4o 

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 EMI2.1 
   -positives et qui cet soluble du%* l'eau et insoluble dans l'acétone, qui est de couleur orfflé-rousettret qui donne un résultat négatif aux réactiona à ntnhydrtueu de Tollena et de Fanling, et qui,  ou* forme purifiées fond avec décompouition entre 135* et 18*C., présente dans 10#OM un spectre d'ebaorption der rayona 41triavlolots ayant de* maxlma à 2'1tu 1 * 46;

  , 32S a t4 (sece 1206) et 430  14(geoit m 15,6), et ettybre omtenir b l'analysa 48,82 z 0 ! 7,05 % B ! \ 1,U *9 t 3,3L3 % Il* at'33,. 0 On fournit en outra, suivant la présente inran- tion, la procédé da' préparation d'une substance antibiotique désignée *Que le non do dt<MtOi*ycin*, qui eoMiwtw cultiver une touche da ,$,t".,.3', domo une ra.ut,lou aquauaa d'hydrates de carbone oontanant me substance !)tUtritiT< asotéa dans des conditions de culture aérobies submersée, jusqu'à confértr h la solution une activité importantes l'égard de* baat6rira graah-poeitivaa, puis récupérer ladite danoweln à partir de la solution,, On a Isolé Ilera4atumé produisant l'antlbio- tique de la prénonte invention à partir d'un échantillon de terrain et il a 'agit d'une nouvelle espèce ddait ée par ,'3.pt .. 1. 'du gtnra 9trentaawaae.

   Una culture de Ilorew4ame vivante à laquelle on a donné la désignation de laboratoire NU 13246, a été déposé# à y "lma:; rican Type Culture Collection", à Vaghinstono Duc"? et ajoutée à aa collection perteenente de *40rooremit4mou tout la d4etffltion A.T.C.O. 146980 la nombe repré4intattve Xi 13*46  des z oï les 1''ïi1 'I'l' %<* 

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1. Le   mycélium   aérien est court et ondule. 



    Les      porophores   montrent des boucles ou des crocheta et   forment, rarement     des     spirales   enroulant à gauche. La 
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 atruoture ce la surface des spore*, observe au microscope électronique, est apinifère. 



  2. Gélose de Ozapek ! La croissance est de couleur jaune pile et elle croît en   pénétrant   dans la ge-   loue,   Le mycélium aérien blanc est peu abondant et il ne se forme pas de pigment soluble, 
 EMI3.2 
 3. Gélose glyeérlnée de Czapek t La culture est faible-de couleur   brun- Jaunâtre   pale et elle   crott   en 
 EMI3.3 
 pénétrant dans la gélose, 14 ayeelima aérien blanc est peu abondant, et il donne des pigmenta aolublea brun- jaunâtre légèrement pâles. 



  4. Gélose 3J'od"la'er et au ael dltmtnium t La culture de couleur blanc   jaunâtre,   a une croissance 
 EMI3.4 
 liftée et il ne a* forée pas de mycellun aérien ni de pigment soluble. 



  5. Gélose alycoode et à l'asparagine 1 La cul- ture de couleur brun olive jaunâtre pâle, est brillante et . elle   croît   en pénétrant dans la   gélose.   Le   mycélium   aérien 
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 blanc-ent poudreux et il y a production d'un pigment nolu- ble de couleur jaune abricot. 



   6. Gélose 4   l'amidon :    La   culture de couleur 
 EMI3.6 
 7 brun griettre foncé ne trouve pas de mycélium aérien ni est bril- de pigment soluble. L'amidon est fortement hydrolyse.. lant*# et elle oroit 7. Gélose nutritive la culture de couleur jaun-1 on P#04 trut 1 dans .a pâle a une croissance médiocre et elle croit en pénétrant gélose, m dans la gélose. On ne trouve pas de mycélium aérien ni de pigment eoluble.. 



   8.   Gélose   de   Bennett   la culture de couleur 

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 brune olive jaunâtre, a une croissance modérée, le myce- lius aérien poudreux ou velouté   ,et   blanc ou teinté légèrement en brun et il y a production d'un pigment so- lubie brun olive   Jaunâtre.   



   9.   Gélose   au flocons d'avoine et au soya : la culture de couleur brun olive jaunâtre, a une   croissance   modérée : le mycélium aérien blanc   cet   poudreux ou velou- té, et il   y   a production d'un pigment soluble de couleur   olive.jaunâtre.   



   10. Tampon de   pomme@   de terre :la culture de couleur brun jaunâtre pâle   est   brillante mais de   croie-     aance   médiocre, et il ne se forme pas de pigment soluble ni de mycélium aérien. 



   11. Culture en profondeur dans   la   gélatine une colonie blanche croit sur   la   surface et il ne se   forme .   pas de mycélium aérien ni 4e pigment soluble. La liqué- faction de la gélatine est modérée. 



   12.   Culture   en profondeur   dana   de la   gélatine   contenant de la levure et de la tyrosine on observe   un*     croissance   nous forme de colonie ondulée jaune pale, un mycélium aérien peu abondant, et un pigment soluble jaune. 



   13.   Lait :  on observe une croissance annu- laire brun   palet   pas de mycélium aérien ni de pigment soluble  Le lait   n'eot   pas digéré. 



   14. Solution de nitrate Une casse de graina incolores croit sur la surface et il ne se forme paa de mycélium aérien ni de pigment soluble. La vérification de la réduction du nitrate en   nitrite   donne un   résultat   néga- tif. 

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    15. Milieux   de formation de la meranine 
 EMI5.1 
 une culture de eaMicMr pale a Une croissante tocTe #t elle arait $a pénétrant dans la gélose. Il ne 40 ferçe pas de myseritun aérien ni de pigment aoïutre. 



  16. On a vérifié par la méthode de fridhan   l'utilisation   des   sources   de carbone et on a obtenu   les résultats     suivante   : 
On a   remarqué   une bonne   utilisation   avec 
 EMI5.2 
 l'arabinoee, le xylose, le gludose, le ga3aetse, le fructose, le cellobloed, le lctMe, le maitosa, le raffines e, 1* sorbi. tel, l'inoeitol, le mannitol, le rha=oaet le citrate de sodium et le suçcinate de aoo dium* les utilisations du corbons, du saccha-   rose   et de l'inuline ont été douteuses ou   négatives.   



    Lorsqu'on   compare avec un certain nombre   d'en-   
 EMI5.3 
 pècte de streptomyces signaléon.juaqulb présent, il exi$- te plusieurs Bouchon qui reaaeablent aux 3. albaduncua aoua certaine rapports, comme les 3  alboflavuai âlasqu- 9Q"IU2199 et ât Èiµ901U- Kaie, il est possible de   différencier   ces espèces de la présente souche en 
 EMI5.4 
 raison de la morphologie des aporophores, des structures superficielles des   spores,   des résultats de la culture et   êtes   propriétés physiologiques eu biochimiques comme   décrit   en détail ci-après. 
 EMI5.5 
 



  Le µ1 alboflavua présente un mycélium aérien droit ou roattis et ce fera' presque pas d# âpirea, 
 EMI5.6 
 #2 0I111yyy #* 1 0ltli' iit  jrutUui Î11  t 11 J aunit rt vzw t,.... If o'u.1' .,..1$\&1 a4,1.11 11.,.0 aW1At'.. 



  !lal 1 VOIl,J,fIt..', MNttaMt d. fii111¯r1lilI U réduit fUI il 1. (it'.t. fA .."it., It 1. p.ton1..t1on du lait  et 

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 positive sans coagulation.   Ces   propriétés le différencient de la présente souche. Le S.paeudogriseolus présente de nombreuses spirales dans ses aporophores, et la couleur du mycélium aérien est jaune mat teinta de   gris.   La coagu-   lation   ou la peptonisation sont toutes les deux   positive$   sur le   lait:.   En outre, on trouve des   différences   dans   .l'utilisation   du citrate de sodium, du raffinose et du sorbitol.

   Le S.griseolus présente de courte sporophores droits avec des branches ondulées et ne présente pas de spires typiques qui sont analogues à la présente souche, mais on observe   des   différences dans la surface lisse   des     spores,   la couleur grise ou grise mate du mycélium sé- rien sur la gélose de Ozapek et sur la   gélose   gluosée contenant de l'asparagine, et en-particulier, par sa production de pigment soluble brun lorsqu'il   croît   sur   de*   milieux organiques. 



   Les streptomycètes présentent une propriété commune à savoir que leur   comportement   sur le milieu de culture change spontanément ou peut être modifié d'une façon artificielle. Par conséquent, on obtient   quelquefois   à partir du terrain ou sol ou par conservation des espèces mutantes ou variantes qui diffèrent considérablement de la souche originelle.   On   trouve également ces propriétés dans le cas des   souches   utilisées dana la présente invention. 



   Lorsqu'on provoque des mutations   artificielles   dans la souche originelle afin d'améliorer la productivité, on observe des caractéristiques de croissance et une couleur du mycélium aérien fortement changées due   les   espèces mutantes, qui cependant donnent   encore   de   la   danomy- cine, fume pressus destinés à   provenir   artificièliement une mutation, il existe   diverses voles     physiques   ou chimiques 

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 EMI7.1 
 coaae 1* Irradiation aux rayons 1 ou aux rayon* Ml<yx< 1.t., et par d  traitement* avec les produit  cà1aiq.ue. comme aoutard l'M9tw* le  deux souches suivantes  ont des Ixemplta de wutation provoqué par irradiation avec les tlrars ou les rayons ultraviolets t '9\t9 K' 6-9 Soueh.

   13246-24 f .,. !np PAYOUO u:a.t:.rtol,1:.. R"Q" x PTt..TM' bcSent1qu8 la lICN8be eri,ds..sl 'q8' i+,o,, ,t . ',, croissance de couleur Croissance de coul.\1I' brun ttm$tM vieil or .,0.11\18 aérien blanc Kyo'l1ua aérien b1uo btit- nitxs pigment aa3,ubtr brun pigment .01'1\)1. y1.11 or 
 EMI7.2 
 jaunâtre paît 
 EMI7.3 
 Lél$49 il OïUMMmeo) de couleur crise Croissant* de couleur alivt 
 EMI7.4 
 fonde pâle 
 EMI7.5 
 Mlo'11ua aérien blanc Nyoél1u# aérien gris clair pas de pigment soluble, Pigment soluble olive PU* OÓ19t -de 'f1n,ti CroiM<ne de couleur brun- Cro.as,saar de coulour brun,  Jaune criait" toac4., 1\18'- jà\1JlAtn. eI11,- aérien lus aérien gris, pigaent gris brunâtre clair, eanMt soluble brun jaunttre soluble brun sttrs 11\0.8 avec ,. ,t 1) .e .. 



  Croiaaruance de couleur brun croissance de couleur brun-. 
 EMI7.6 
 Jaune grisâtre, mycélium Olive Jaunâtre, mycélium 
 EMI7.7 
 .'r1ea sr1't pipent brun aérien blanc, pigment 30 jaunâtre pile lubie de couleur vieil or. lN' 'u1et la présente invention eepy<4, dehors des espèces ci-dessus# des   Pèo*o variées tglo-P lien du terrain, des espèces autant,. engendrées à par'1 
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 de ce  espèces par des agents de mutation comme les rayon* 

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 EMI8.1 
 l, 1.. rayons ultraviolet , les produits 'qU8', wte., et toute, souche i*o3.ir du sol sur la bas* des résultat* 4* la présente invention pour autant quelles 
 EMI8.2 
 satisfassent aux conditions nécessaires. 
 EMI8.3 
 



  L* 4=ogyotne *et ua antibiotique qui contient du fsr dans 3* maldoult pesa  décrit plus ut. 
 EMI8.4 
 Par conséquent. en * comparé la souche produisant la 
 EMI8.5 
 danouyaine avec plusieurs aoucats de strtptosjrcètts dont on a signalé qu'elles fournisatnt eu# apt1boi1.U8' contenant du tore ce=* la ,1a61ao, 1'I%HQc1n., le -1t-22665- et la t.r.r1o1a.. 



  1e ?. <Taeua. un producteur 4 s cr1,'ue. diffère dans une grande mesure 4e la présent  eauebt 
 EMI8.6 
 du fait que le mycélium aérien présente une couleur 
 EMI8.7 
 vert 4'.au. caractéristique, les sporophores sont droite 4LVOO 4.. touffes et il ne ne fera* pas de spirales type- ,ta,.. 



  'lú.1a espèce* de <tt]F<pt tt<yeM<M come '1.. 3f rftellfyiio. It C,UGI. 38 ÜYtlW1f. a ft- AtSt' 9,t '''tù9hlU, " 9nlPt" ,,, .9t"t'1\f et , JQt;yçN:9I:1}ee'U. sont désignés 808111. producteurs 4'... t1b1ott,u.. contenant du fer et au différencie ces ""0" 4* la façon suivante 8 Le " ml!,tJ1aI présents due *ror4gbnr*r droite et ramifiés )Mnopod<Mt et ne forme pas 4# spiral** typique , La couleur de la culture est brun rou eâtrs ou orangé, sur la  419 * de gaapok et Jaune citron sur la 841080 glucoses contenant de 1 t aepv.,1a4t. xs..673t présente dois aparophores M- 81f14. 80"0,04,. tarso des spirales ouvertes irrégulières. 

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 EMI9.1 
 ta structura auperttâtotle des sporas ##* 118;ml 04 la eoulaw aa Za culture *et carmin à rougi garalil aur à edlose da 08*vok au g3ef. 



  Ir .3"n,a. a ' présente ds long* speropfeorira raaifiéa eonopodta avob de courtes spirale  r*mB80ë  du TYPO dartrraua, est le <cyo4H.ue aérien <et de aar3.e l Tand  sur 1 plupart due w4lieux,, 3  ypauqi Présente une fiurtaae 4'o apese ##lu   t produit ra planent aoluble bru , 14 8* Yla??hr?aofir?ftTff pr<atntt de n 5 br u M #piral    t produit un pigment eotubl< Snm. 



  9f Y présente de longuea aF.aias et r 4YO41tut Aérien gTi< cendré à pte ova5 elair but Xi ailes@ de Czapek. 



  Lw outato2imo présente des apiràles ou - #artaa at tome un mycélium aérien  ria cendré ou griw Une* <w dt la ailoae ,giucovée contanarit de l'MpiraiM.. gens]' priomte un myoditua a4rien' cansln paie 4 carmin* Coups décrit ct..degauur ou a comparé" la aoueâ, . la danoaycine avec de* èbpàooo apparentée, du paixfit da Vue de la taxinoaie OH de l'antibiotique obtenue, et on en a conclu que la présente  Ouche cana tttuo une 1 Moelle Mpece de etreptotuyûetea ! elle été 44al n*a par atraptaayyf, ,1.Bnf| aselle eapese.

   itlo,p du1 eu Oon4t$ionï 3Pr,r dome dnewdmo" Oa pr4par# un 11 de tuéso4satf 9,0 t " 4&0#q#"f M 'rlll'é'! 411 41*,Ptg ft 44 syaollum do $*flflfMlitM | r 4iâiiat la 4ane.yeiM dana un tuiez pMprte, puio ee suintant daaa daa cenditiena ,rrôisie,, 

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 EMI10.1 
 Pour la production de la àanoaryaiaie, un  culture sur un milieu solide est possible,   maie   pour   un      production   en grande quantité, une culture en milieu liquide   est   préférable.

   On peut faire varier la température de culture 
 EMI10.2 
 dans une large gae comprise entre 20* et 35*0 ' tant la- quelle l'organisme peut crqUre, . mai. on préfère W\8 température comprise   entre.25'et   30 C   et   un pH neutre* Dans la fermentation aérobie submergée de   l'organisme        pour la production de la   danoayoine,   le milieu   contient   
 EMI10.3 
 co=e source de carbone une' huile de glycéride 41.pen1- ble dans le commerce ou un hydrate de carbone ok=e le glycérol  le glucose, le =Iton## le saccharose, # le lactose, la dextrine, 114ztdant etcoe k l'état pur ou brut, et comme   source   d'azote,

     une     matière     organique     cornue   de la farine de   soya,   des   produit    solubles de die-   tillerie,   de la farine   d'arachide,   de la farine de        graines   de coton, des extraits de viande,   des   peptone , de la farine de poisson, de l'extrait de levure, de l'extrait soluble du maês   etc.,  et lorsqu'on le délire, des sources minérales d'azote comme   des     nitrates et     des   
 EMI10.4 
 sels d'a=.,oniuz, et des sels minéraux comme le chlorure de sodium, le chlcrure de potassium, et le sulfate de ma* gnés1um,

   et des agents tampons comme la carbonate de cal" clam ou des phosphates et des traces de sels 4...m6t.u lourds: ces   ingrédients   de milieux   comprennent     ceux   
 EMI10.5 
 indiqués dans le brevet canadien Ut 5139324 du 31 Ma1. 



  1955 et dans les brevets brttMStqMM 1! 79e<!41 du 18 Mati, 1552 ot Ni i.Ix"4J 414 1 lfIl1llP' 19JÎ 9% dan. Ut brevets in 1'4ri 4. Nos !.691.t18 du 12 Octobre, 1954   2.658.018   du 3 Novembre, 1953   2.653.899   du 29   Septembre,   1953 

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 EMI11.1 
 1 2.586.762 du 19 Février, 1952 Ng' 2.516.CE30 du 18 Juillet 1950 2T 2..83.62 du 4 Octobre, 1949 1 2.6C9.329 du 9 Septembre, 195S et N  2.709.672 du 31 Mai, 1955   Dans--une   culture submergée   aérées   on utilise   un agent   
 EMI11.2 
 antiaousse coone une paraffine liquide, des huilée grasses ou   une     silicono.   On peut utiliser plus d'une sorte de   source   de carbone,

   de source d'azote ou d'agent antimousse 
 EMI11.3 
 pour la production da la danoayoine. En général, on pour- suit la culture jusqu'à ce qu'il n'accumule dans le milieu au Moins plusieurs centaines de micrograornea de 4=ozy.. cinepar millilitre de milieu. lsa processus 6444raux sonret pour isoler et purifie):' une faible quantité d'un cstcpeae actif à ' partir d'une bière ou liqueur de fermentation peuvent $#appliquer 4 la danoayoine. Par exemple, en utilisant la différence des coefficients   d'adsorbabilité,   de   solubilité   et de répartition entre le composé actif et les   impuretés     contaminantes,   on peut   isoler la   
 EMI11.4 
 danoclycine.

   Par exemple, la danomycine du filtrai du bouillon est adsorbée par le charbon actif, lavée à   l'eau   et du méthanol aqueux ou à l'éthanol aqueux   puis     est élude     avec   du butanol aqueux ou de   1 'acétone   aqueuse. 
 EMI11.5 
 Ees eluata sont groupes, concentres sous vide b aicaitêt et on obtient une poudre brune.   En   utilisant une chroma- torgaphie sur du carbone et un collecteur de fractions, on peut encore purifier le   compose   actif. En ajoutant une grande quantité d'un solvant   organique   approprié comme   l'acétone   au concentré aqueux des fractions, actives, 
 EMI11.6 
 on peut précipiter et séparer la danoaycine.

   On précipite 

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 et   élimine   les   impuretés   de   contamination   en   ajoutant   
 EMI12.1 
 un solvant organique approprié comme lo aithanol ou loitbanal à un concentré aqueux des fraction  active*, On peut aussi utiliser unxtract1Qn par de* Suivante organiques pour purifier la danomyointe 
Par   exemple$   on peut extraire le   composé   actif par   des   mélanges de   solvant*   approprié. comme des mélanges de phénol et de chloroforme ou d'alcool benzy-   il que   et de butanol.

     On   peut transférer   les     extraits   obtenus avec ces solvant*, après les avoir lavés   avec   une eau acide, une eau alcaline, et de   l'eau     dans   de   l'eau   en ajoutant   de*   solvants organiques aoa polaires appre- prias comme un éther ou des hydrocarbure*. 



   On peut aussi appliquer les technique de répartition à   contre-courant   pour la   purification   de 
 EMI12.2 
 la 4anoc1Q.. Par exemple par un  r'part1t1 entre à système te rraaàtg conteanet $u pbd4ott tu ogim. reforme et un agent tanpea à Ma pu de 6,0 (1j9î10) eu contenant de l'alcool b,n.7114'. du u*an91,4. 194*ege cb.lQrbl4r1q. X/100 g t à jeu &l4. , ?O " (20.10,':30), on peut obtenir de 4*nQRWQ4.ne. 4* grande pureté. 



  Par casnr'llaa 4e  proja-ilt*  '1eo",""',, ques et biologique  .péew de 4& 'Q1ne avec 9<W  de* autres antibiotiques connus, la #4nmWetXt s'avère ttfw un- nouvel ¯t-1.'U.,u. 1& danwayeine rrsta , la ; prieEin, l 'amrci, i la t¯n1.JaJc1n.. au -LA¯5352" et -autre 1t1"Gt.i,l e¯I\\1;,.... fer ce qui  on  cerne  a propriété 4 'être eoluble tan. l'eau et .. 8 . , leur OI'8D;i..r'UB.'J"'.

   Hais, l"''lulen    par  le spectre antibactérien do la di!)e0) aves ceux des autre  M- 

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 EMI13.1 
 1'b1ot1,u.., 1& 4u..,Ota. '1ttl" do la gr3sdianr et , 4. l'alloqyoaao jar #  #4,%&viti contre les bactrieo 4r*m-négativoup de la t.rr1lJJotn. *4otre le 3, ?.'- XIM et du *1±-5352* omtre les !trtC9' bàa2lytIo tactt deM<t que la dano8aJcut est prinoipale- ment act1Y' contre lois bactéries ,ru-p08Uive., on l' a comparée pu cbJIoutogra,h1' sur papier avecd' aatroa an- tibidiquM rtrra* du four, aoMt la ferriffline et le OU-53520 qui sont ....L pr1ne1palement actif* contre 1.. taotlritt 'p'""p081Uv... Comma repr<seat< ot-4...oua, 1& 41ft08fè1M diffère de con antibiotiques. 



  Valeur de tt 
 EMI13.2 
 Sptltlle solvant D=Omy- Ferri- *I*-53521' oint m,yc1nt solution à 3 de N94 01 0095 0,60 0,00 ; 0,35 Acétone aqueu*. à 50 % ' 0,85 0,65 0,60 820 1,00 0,05 0005 Butanol-4cid8 oétiqNt- ' fl20 (4tlt$) 0,23 0,40 0,40 :Butanol-4014. acétique 920 (2:11) 0150 0," 0,75 Bthanol-H20 (3sl) ceat8A8.Dt 2 % de Naci ' 0#45 ' 
 EMI13.3 
 Dune son spectre aux rayons infrarouges, 1 4ano=1 1ne pr4.ent.... t=a caractéristiques d'absorp- tion à l3.6C'.U65, 665-880, 910 et 680*690 nnT1 qui M #µ trourent pas de'M !#  spectres de la ttl'l'Ú!1c1n. ou du #Ul-535211. 



  Lol"8qu' 8*" a..par. dame l'ultl'a-Y101tt 1. 8. x" ci, li 4UOlQ'oia.  vtt Mlui 4t o.,tu", 1\1"" MU" bi"'t''', 2.1 '1I,".iIt difftr* 4..."tr.. 4. 2.& ftçea . 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 
 EMI14.1 
 



  4rq 1 4" VXl cr1811818 265 -tA- 420 at'" sibat3a 270 . **# 40 M t'n"o1n. 228 ., 319 -P.425 eu "3352" . NIant deoiomyolna 270 miAt 325 ..4;o !a 
 EMI14.2 
 les exemples suivante tent donnât à titre 
 EMI14.3 
 llluatratif et non limitatif de la pr4nonte invention. 



  Exemples . 
 EMI14.4 
 
<tb> 



  Constituante <SEP> du <SEP> milieu <SEP> 
<tb> 
 
 EMI14.5 
 Farine de soya 15 g Cralorurs de sodlua 0,5 t sang de cheval séchd 5 a 341tate de ss8aésiuu 0*5 4 Amidon eolublw 50 t 4h.our do calcium 0,S Phosphatt de potaasiuai dibMiqM 1   àu ordinaire 3.000 e PU 
 EMI14.6 
 On at<!riliae un milieu de culture (100 al) con- tenant loe composant)!) ci-dessus dans un ballon ai 500 111, 4. capacité, on l'inocula avec une culture de aetMnoM , 4. Streptomyçes a3.bndunas, et cultive à 27 % 1*0. pendant 8 jours en secouant, apr&a quoi ,la production de 4anoG1n.. dans le bouillon de fermentation atteint 240 ac/m,, 
 EMI14.7 
 Exemple 2 
 EMI14.8 
 Cqnl'ty.t8 dq m9i : Parin. dt 80)'1. 25 1 Sufto dt JU6I14.1wa 0,5 < Amidon 8olubl, 65 g 4h.,or 4. oalo1wa 0,5 g phosphate 4. pQt...1\U1 a.1bas1cu. 1.

   Eau or41nÙJ"8 1000 CIl ONl't .t iodlua 2.. pl, ',a 

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On   stérilise   100 ml d'un milieu de   culture     contenant les     composante     ci-dessus   dans un ballon de   500   ml de capacité, on l'inocule avec une culture de semen-   ce   destreptomyces albaduncus,et eultive à 27 ¯ 1 C. pendant   8' jours   en   secouant,     après   quoi la. production de la danomycine dans le bouillon de fermentation atteint   440   mcg/ml. 



    Exemple ;!      On   filtre le bouillon de fermentation, le règle à un pH   compris   entre 7 et 8 et   adsorbe   sur   0,5 %   de charbon actif* On lave le charbon à   l'eau,   puis avec une solution aqueuse à 505 de méthanol et on élue la   danomycine   avec de   l'eau   saturée avec le n-butanol. On concentre   l'dluat   actif à siccité, et on   dissout   la danco- myoine solide brute   ainsi   obtenue dans de   l'eau   et la purifie par chromatographie dans une colonne de charbon. 



    On   lave la colonne avec de l'eau et du méthanol aqueux à 50 %, et on   l'élue   de façon fractionnée avec de   l'acétone   aqueuse à 60   %.   On dissout de nouveau la préparation plus pure ainsi obtenue dans une faible quantité d'eau, et en ajoutant 10 volumes   d'acétone,   la danomycine pré-   cipite,   puis on l'extrait encore avec de   l'éthanol   à 95 % pour   éliminer   une faible quantité   d'impuretés   con- taminantes.   On   dissout la danomycine brun rougeâtre   ainsi   obtenue   dans   de l'eau, et l'extrait avec un   mélange   sol- vant de phénol et de chloroforme (1:1).

   On lave l'extrait, obtenu grâce aux   solvants,   avec une solution aqueuse à 0,5   %   de   bicarbonate   de sodium, de l'acide chlorhydrique   9/100   et de l'eau   successivement,     pute   on le   transfère   dans de l'eau en ajoutant de l'éther et de l'éther de pétrole. On obtient ainsi une préparation   pure de   la adno-   myoine   en   séchant   par congélation, 

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 Exemple 4 
 EMI16.1 
 On peut purifier la danoayeine par ripa- talion a contre-courant.

   Dana un système solvant d'ai. cool bontylique, de n-butanol, d'acide chlorhydr1que 9/100 et d'une solution aqueuse a 20 % de chlonu-8 de sodium ,(2O.*lOs3t3O), on repartit la 4e.nol:2,)l'c1Jl.e autour d'un   tube a   maixma N  9 en 35   transferts*   On   recueille   le contenu   des   tubes actifs et on obtient une préparation 
 EMI16.2 
 pure de danomycina par séchage par congélation, U pu-      raté de la   danomycine   ainsi obtenue a été confirmée par la parfaite concordance entre   non   courbes de répartition, tracée*   grâce   aux valeurs de titrage biologique et aux coefficients d'absorption à 420 m  et la courbe théori- que. 
 EMI16.3 
 



  La danoaycine est un antibiotique de couleur   orange     rougeâtre   qui contient du fer dans sa molécule. Bile 
 EMI16.4 
 est soluble dans l'eau, dans l'ethanel aqueux à 50 . dans le Méthane! aqueux a 90 % et **ne un M414r4g solvant - de phénol et de obler.t,,",' (1:1) et *et l's'roment soluble dans le aotaanol à 95 $ et dans l'ithanol à 95 %o mais   .et   insoluble   dans   l'acétone et autres   solvants   or- 
 EMI16.5 
 U1qUOlh Les réactions à la ninhydrine, 4  Tollene et de Jeh11n8 sont testée négatives,, mat@ plusieurs substances' 'lWIhydrine.1>Q11i1v.. oont reconnues par ÜN.#atorapb1. au papier dans I*bydrolyoat acide de la 4.anoalô!n..

   On applique la technique de r4pan1t1o+ contre-courant la danoaycine dans Io système comprenant l'alcool ben- zylique, le n-butanol, HOl tf/100, et une solution aqueu- ne à 20 % de Ne,01 (2OilOt3s3O) pour obtenir une prépara- tion pure. La danomvotne ainsi obtenue fond entre 135 et   138 0. avec     décomposition.     Analyse.   Trouvé : 

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 EMI17.1 
 Ut 48,82 ,t 5< ,0$ 9 Xe 781 ) e 3,3.3. Sur la &ise de ces deiané** el3tiauea et en supposant que la aWI4. ouïe us contient queux atome de fer, on calcule, 3.sto'lt brute de -la danoayeint qu est ,â,2t.oe et le 
 EMI17.2 
 poids moléculaire qui est de 1791. 
 EMI17.3 
 



  ±# apeetre d'absorption de lumière ultra- violette 4# la 4anoay*a# 4a   l'ou présente des staximar dabeorioa 2,m'.a 4$), & 325 m (- 3.,6 ,et à 43t!-m B' 1.6). te spectre d'absorption de rayons infrarouges de la daneaycine pastillée dans 10 bro- 
 EMI17.4 
 aura de potassium présente des bandes d'absorption carac- 
 EMI17.5 
 éristiques aux longueurs d'ondée suivantes 
 EMI17.6 
 3200-3286, 2920, 1720-1725, 1630-1640, 1570-1580, 1495-1500, 
 EMI17.7 
 1455-1470, 1220-1230, .1.6-1ô5, 1010-1040, 865-680, 610, 755 et 680-690 az7le 
 EMI17.8 
 lorsqu'on effectue une chromât graphie sur 
 EMI17.9 
 une bande de papier dans divers ayotbmen solvants, on obtient les valeurs suivantes de Ra pour la danomyciae ! n-butanol aqueux, 0,05 ; solution aqueuse à 3 ?6 de chlo- rure d'amaoniuat 0,95 t phénol a 80 zur 0,95 acétone aqueuse à 50 %, 0,85 :

   mélange de n-butanol,de méthanol et d' esu s 1 s 2 + 1, 5 de mdthyl-cranges Q, 51? ; mélange de n-butanol, de méthanol et d'eau (4:ls2),, 0#30 mélange de benzène et de méthanol (4:1), 0,05 eau 1,0 ; mélange de n-butanol, d'acide acétique et d'eau (4;1:5)# 0,23 ; 
 EMI17.10 
 mélange de n-butanol, d'acide acétique et d'eau (4:1:2), 
 EMI17.11 
 0,35 ! #élaage de n-butanol, d'acide acétique $ d'eau (tilil), 0, 0 f mmµ* d'éthmet os d'itu (9tl) 0 9 0 de #Uorrd <t< µmwi I *4%m$*   twbutwoi, d'e- thtoêii MMe ué%iiw   d'au (Wj  3j47)  6 fi5. 



  Lû ta" -tin# présente loft propriétés tus-aentiennées, et 

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 lorsqu'on compare ces   propriétés   avec celles   d'entre*        
 EMI18.1 
 antibiotiques contenant du fer,' comme la griedint, l'<t3.-' bomyoine, le "LA-5352" et la ferrieycine, la danooyelne peut être différenciée de ces autres   antibiotiques*   
 EMI18.2 
 Zoo propriété$ biologiques de la dancoycine sont les suivantes 
 EMI18.3 
 1.

   Spectre antimicrabien On a déterminé les concentrations   minimales   de 
 EMI18.4 
 la danomyoine pour inhiber les bactéries cram-poaitiveet gram-négatives, acido-reeiatantea et les a3ampigracae, par une   technique   de dilutions   successives   dans la gé- 
 EMI18.5 
 loue. les résultats sont indiqués au Tableau 1, 3.s! dane- mycine   est   efficace contre les   staphylocoques     coagulas*-     positifs   comprenant les   souches résistant   aux   antibio-   tiques couramment   utilisée.   



   Tableau 1 
 EMI18.6 
 
<tb> concentration
<tb> 
 
 EMI18.7 
 Organisme d'essai Inhibitrice mi- n tractc/m}.) 4 Escherichia coli NIHJ 50 Klebaietlq pngumonia Jultanelle.,rype k 50 Salmon2lla .tYJm1 50 Shipell yaenteriae A 50 Neleserl2 op. (CP*-R) 50 Stanb±loc2ccun aureus FDA 209- 0,039 Stjâ2bZloc22cus aureu PDA 209-F (3T-R) 0,039 -Staph,ylococeus aureus FDA 209-P'(NB-8) 0,078 Stachvloccoua aU8 1 52-'4(tO,BM,aK,lo,SM-I) 0,078 &:&&bXîegaffl #IVI eeucht if ataith OfO79 aticulgamu âum 193 (Poo VA) ,C7$ .Mu<. 1ti1'U le) (pet Mi W-31) giclé µtph!!.opûccua albus 2PÔÎ 1200 50 

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 EMI19.1 
 Irsblemi.1 (oulte) 
 EMI19.2 
 O.r-.<i, inhibitrice mi &Imm m/ml)## 3&yci!ta t PSI 1001 ,0,33.3 fclgrpcftcçys AVU OtM-9 Bacille eubstilis FOI 219 09039 8C Llâ '19 lCtt 122 0,02 b ailu, aiithraala, J 115 0*02 B22illu& cereua ACCO 10702 z Corbactï-iw µt6 ;

   i 53-K-l 0,01 Streptococcus faecalls 5-40203 50 gtreotpcocga 2.3. Douche de Stok 50 |>it)Ioéoccu3 ±D2=0,nIne DP-3-5A OtOO24 . net an Type 11 ' 0,0024 Kvobcrium 12bercQlaolg V. he3lail 8yyStr 50 yçobacterix tubercXoaia 607 fsperp-illus nifar 50 Qanda, aXbicanp 50 
 EMI19.3 
 . Abréviations t -R   Haletant QP ohloroamphém.oo1 s2 < etreptcthricia* M ovob10c1n. 



  T3 1tétracycline EH t 4rytbrosxycin9 OJ1 : carbomycinrm Po : Pénicilline SM s straptc#acaie 2. Effet du pU aur l'activité antibactérienne : 
 EMI19.4 
 On * examiné l'effet du pH par une méthode de 
 EMI19.5 
 dilution dans des milieux liquidée, l'inoculum étant une dilution .. 107 d'une culture de 16 heures des #s* 

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 EMI20.1 
 or&aniwBM d'.a8Û. reprdegat4 am 'tableau Zr Ilaatt- v1t4 de la danomye1nt .,. pu 't4 Wlueno4. p le pN du 
 EMI20.2 
 milieu. 
 EMI20.3 
 tatituj 
 EMI20.4 
 rn18m d"8S Oonconirat1on j.nh!b1tr1ce ?4.- , (#uJJ!* pK.. H 7,a pH-8,2 ,h²19CÇ2P aurcuq  !<99 QO}9 0,039 ,"ï8 Staphylococeus aureua 193 0,078 0,078 0,078 Staohyloeoccus aureua 3owh<t 4. Smith 0,070 0,078 0,07 , Bc1!}I' t 3. 0,039 0,039 0,070 
 EMI20.5 
 3.

   Effet d'w aërua eur l'activité ant1.Qt6r1.nn. 1 
 EMI20.6 
 On a examiné  et effet par une méthode de dilution 
 EMI20.7 
 du bouillon. Comme re".4a.""U au Tableau 3e le.*4r..xo n'a aucun effet sur 1* activité de 14 4&n.,.1Q.. r,be,,* 1 
 EMI20.8 
 0;'l'8,!'111Ri < ltt8# Gpl'A#lfi'1lt.Ei74 tRhtttae 
 EMI20.9 
 
<tb> Témoin <SEP> avec <SEP> 501$ <SEP> 
<tb> 
 
 EMI20.10 
 de adrm ta h ig. >ur ua a. 1,1? 0,e78 Staphylpeoqcwji ureua C,078 0,078 #Stttphy.lptiqe.cjsi , lh 9<m.ttt 0,639 0,078 
 EMI20.11 
 4.

   Activité afctiteaetérieana << la 4ano jreine oontrt des stspilox tuelds en altatque On fxa&iné e Aetivt<6a <<< 1 eut de.sept entibtetiquoo  !<tt)a<tat<m$ iâa, *outre zut1 gaz. ohM de etaphy-lecoques qui ont été isolés chez des malades de p3A<n<M hôpitaux, 100 réaiatata sont résumée et présentée m 3'<<MM 4. Ça z; 9bo*rv4 1* réparti* tison assez grande dr 4*wb** réaiatafit aux antibietiquea couramment utla3, t<tie la répartition des souche 

 <Desc/Clms Page number 21> 

 
 EMI21.1 
 #Hsiatant à la danQ#101ne 0#0$t aY4ri n#itr* qut dO 3.,7. 
 EMI21.2 
 Tableau 4 
 EMI21.3 
 Concentra..

   Répartition de" atachwlMoauew routants ($\ ' :1;- Dan Ill1- DSl'ot 13 To OP Po lia NE n1mum (zée/ oint 9:') ¯¯¯¯¯¯1 Êmmmmmmmm 100 1,7" 55,2 0 52,5 0 30 0 0 100 0 10,4 0 6o$ 1,7 43,5 7,1 1#7 10 , 0 22.4 3,3 1,T 98,5 11,7 0 1,7 1 10 .12,193,532,20 3,3 97 5205 0,1 07 0 3,3 6.8 0 0 0 44 0,01' 1,7 0 0 0 0 11,3 0 0 
 EMI21.4 
 S Abréviations t DSK dihydroatreptoayeine KK kananycine Ta s tétracycline OP ehloraisphénieol Po s pénicilline 0 M ér,tâ-rautc,ra NB t novobiocize 
 EMI21.5 
 
 EMI21.6 
 - 5, Toxicité - la toxicité de la danomyoine ont extrêmement faible, la N'ea par voie intraveineuse (dose entral- cant la -mort de la moitié des animai étant de 3250 cd ka chez.les sourie.

   Il ne se produit aucun eaa mortel à une dose intraperitoneale de 5000 mg/1g pour les 
 EMI21.7 
 souris* On a examiné la toxicité chronique chez des 
 EMI21.8 
 rats ; mime lorsqu'on a injecté 100 mg de dan M oine pa 1 if rat, par Foie rsnire sr jour.' fêtàmîM jour4# fia S't pu rowqw d'ttl#u ni4otbloi sur froisaute ou le Obaporteriertte 

 <Desc/Clms Page number 22> 

 
6. Effet   chimiothérapeutique   à rencontre d'une infection expérimentale chez les sourie !   On   a infecta des souris par vois intrapérito- 
 EMI22.1 
 néale avec une souche de Staohylococoua aur-ou Saith, l'1nooulua: étant 100 fois égal à la DI0 d.e l'agent pathogène, et on a administré la danoaycine par voie nous. cutanée après l'attaque bactérienne.

   La dose curative moyenne après une seule injection (DC50) s'est avérée 
 EMI22.2 
 on être de 0,04 !ag/k. A titre de comparainonea exaaicé ' la pénicilline sodique G ctSté-..a3té et la valeur de DC50   a'eat   avérée être de 0,3   mg/kg,  
L'antibiotique de la présente invention est un agent utile pour déceler une contamination par des 
 EMI22.3 
 bactéries gram-ngat1ve$. des champignons, des levure$ ou ferments, ect.. au coure de la production industrielle 
 EMI22.4 
 d'une enzyme amylacé, par fermentation de . @btla. 



  Ainsi l'addition de 1 à 1000 mog/Q1, et de préférence de 10 mcg/ml environ de l'antibiotique a une partie aliquote du milieu inoculé, suivie par une incubation, 
 EMI22.5 
 permet le développement des contaminant inopportuns et leur détection visuelle.

Claims

RESUME EMI22.6 Il. Procédé de production d'une substance antiDie.. tique désignée sous le nom de danomycine, procédé caractérisé par les points suivants séparément ou en combinai.

on ! 1. Il consiste à cultiver une souche de Strepto- EMI22.7 mycon albaduncus. dans une solution aqueuoe d'hydrate de carbone contenant une substance nutritive azotée dans des conditions de culture aérobie submergée, jusqu'à ce que soit conférée à la solution contre des bactéries <Desc/Clms Page number 23> gram-positives, puis & récupérer ladite danomycine à partir de la solution.

2. L'organisme est le Streptomyces albaduncus A.T.C.C. 14698.

B. Substance antibiotique, la danomycine. qui est efficace pour empêcher le développement des bactéries gram-positives, caractérisée en ce qu'elle est soluble dans l'eau et insoluble dans l'acétone, en ce qu'elle est de couleur orange rougeâtre, en ce qu'elle donne des résultats négatifs aux réactions à la ninhydrine, de Tollens et de Fehling, et en ce qu'elle tond noue forme purifiée entre 135 et 138 C. avec décomposition! elle présente dans l'eau un spectre d'absorption de rayons ultraviolets ayant des maxima à 270 m (E1 cm 48), à 325 m (E1 cm= 12,6) et à 430 m (e1cm = 15,6) elle *'avère contenir à l'analyse 48,82% 0 ; 7,05% H;7,81% N: 3.13% Fe et (par différence)33,19 %0;

et lorsqu'elle est pastillée dans le bromure de potassium, elle présente des bandes d'absorption caractéristiques clan. la région des rayons infrarouges du spectre à 3200- 3260, 2920, 1720-1725, 1630-1640, 1570-1580, 1495-1500, 1455-1470, 1220-1230, 1160-1165, 1010-1040, 665-080, 810, 755 et,680-690 cm -1