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Publication number: BE634836A
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Description


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  Nouveau procédé de préparation de l'acide lysergique. 



   L'invention a pour objet un nouveau   procédé   de   prépara-   tion d'acide   lysergique,   Plus particulièrement, elle a pour objet un procéda   microbiologique   de   préparation   da l'acide 
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 lysergiqus 3 partir d'un compo3d qui est la lysergainide ou 1 t isolysorgar.1ide au i.1oyn -l'une souche de Claviceps purpurea (Fr.) T!Ji. 
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  On 3 ait que l'on prépara I;5,ciie lY5:.u9 par hydro *' lyse alcaline des alcaloïdes de l1eot (l, :0. :hem.u-1ir04, 1934, page 547) ou de l'amide d'acide lysergique (J. :hem. 



  Soc. 1 ,9.3,4. , page 674 et 1936, page 1540), ce qui donne des   conversions   de 30 à 50   %,   
On a trouva qu'une souche de Claviceps purpuras (Fr.) -lui. est susceptible d'hydrolyser le groupe amide de la 
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 lysergsnide ou de J-'isclyserçanide zen dop.n?"1.* ':- ''^'.r¯' carboxyle libre. Le   procède   de l'invention permet   d'atteindre   des rendenents de conversion supérieursà 90   %.   



   Le procédé de l'invention, qui est illustré en détail ci-après, consiste à soumettre un composé pouvant être la 
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 lysergamide ou l'isolysergamide, dissous dns un solvant organique approprié comme la dim1thylformamide et l'éthanole l'action d'une souche de Claviceps purpurea   (Fr.)     Tu.....   

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 cultivée dans des milieux de culture approp a. On peut ajouter directement l'amide au bouillon do pliure ou au   mycélium   que l'on sépare des bouillons de fermentation, et que l'on met en suspension dans une solution tampon de phosphate faiblement acide. 



   Les milieux de culture contiennent une source de carbone une source d'azote et dos sels minéraux. La source da carbone est formée d'amidon, do mannitol, de sorbitol, de saccharose, 
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 de glucose, de maltose, do glyt6rol, d'acide succinique, d'huiles végétales, de farine de c6réales ou d'autres substan- cos généralement utilisées. 



   La source d'azote, outre les substances complexes 
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 citées ci-dossus qui contiennent de l'azote, peut Atre formée de caséine, de sels d'ammonium, de peptonos, do farine de viande et de poisson ou d'autres substances gdndraljmont   utilisas.   



   Les sels minéraux peuvent être des sulfates, phosphate 
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 3t chlorures de sodium, de pcta3siunt de magnésium, de zinc. de -ançsn\s33, de fer, de suivre 9* d'autres 3ols habituelle- niant utilisas. 



  On cultive la souche en culture aérobie ot #submergée, dans des flacons ou des cuves de fermentation, à une   tempé-   
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 rature de 20 à 28 C, de préférence à 2d C. Le pH du milieu de cultura doit <5tre compris entre bzz et 7,0, de prf0renc il est de   5,2. A   ce point, on ajoute au bouillon da culture l'amide d'acide lysergique ou isolysergique, dissoute dans 
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 un solvant organique corno la dim¯-thylf ormamide ot l'thanol et on fait incuber pendant 5 à 10 jours à une température 
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 de 20 40 C, ou bien on ajouta l'anide au myc,lium que l'on a sépare du bouillon de culture et mis en suspension dans une solution tampon de phosphate lZgtr3nQnt acide.

   En pareil cas, on sépare le mycélium par filtration ou   contrifugation,   facultativement on le sèche sous vide et ensuite on le met en 

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 suspension dans une solution tampon à un pH de 5 à 5,5, de préférence un tampon phosphate 0,05 M à un pH de 5,2 ;à la suspension, on ajoute la solution d'amide initiale et on fait incuber la tout pendant 1 à 8 joursà une température de 20 à 40 C, de préférence à 37 C, On suit la conversion de   l'amie   d'acide lysergique ou isolysergique en acide correspondant par les méthodes connues d'analyse chimique ou chromatogra- phique.

   Quand le temps d'incubation est terminé, on isole l'acide obtenu suivant les méthodes d'extraction connues, mais de préférence on opère de la façon suivante on filtre le bouillon do fermentation, on porte le filtratà un pH 4,5 à 5,5 et on   l'extrait à   plusieurs reprises par un solvant organique comme le butanol-n. On recueille les extraits, on les concentre sous vide, on lave le résidu avec un solvant organique dans lequel l'acide lysergique est insoluble, par exemple dans l'éther éthylique, et on la dissout ensuite dans une solution aqueuse diluée d'ammoniac. On décolore la solu- tion et on la filtra sur du charbon activé, puis on la concentre sous vide jusqu'3 un faible volume et l'acide lysergique   cristallise.,   
Les exemples suivants illustrent l'invention,   sans   la limiter. 



  Exemple 1. - 
Avec une culture de 7à 10 jours de Claviceps purpurea   (Fr.)     Tul.   obtenue dans des tubesessais contenant un milieu de glucose, de pomme de terre et   d'agar   -agar. on inocule deux flacons Erlenmeyer da 300 cm3 contenant chacun 60 cm3 du milieu végétatif suivant 
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 mannitol 5 % acide succinique 1% %PO4 0,1 % AtgS04. 7t-i0 0,03 % farine do pois chiches z % 

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 FeS04.7H20 0,001 % ZnS04, 7i.20 0,001 % tvinS04.4i-2C 0,0001 eau du robinet 
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 pH 5,2 avec NH40H ;   stérilisation à 120 C pendant 20 minutes.   



   On fait incuber les flaconsà 24 C pendant 7 jours sur 
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 une secoueuse rotative à 220 tr/,m avec une course de 6 cm. 



   Les bouillons de culture obtenus servent inoculer huit flacons de 300 cm3 contenant chacun 60 cm3 du milieu nutritif suivant, pour la production t 
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<tb> mannitol <SEP> 5 <SEP> %
<tb> 
<tb> acide <SEP> succinique <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
 
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 KH2PO4 0,1 % MgS04,7rt20 0,03 % 
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<tb> FeS04.7H20 <SEP> 0,001
<tb> 
<tb> ZnS04.7H20 <SEP> 0,001
<tb> 
 
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 J",nS44.4H20 0,0001 eau du robinet ;      
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 pi :)2 4 stérilisation à '20OC pondant 20 minutas,   On   inocule chaque flacon avec 6 cm3 du milieu végétatif et on le fait incuber pendant 6 jours à 24 C sur une 
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 secoueuse similaire à colle qu'on a décrite ci-dessus.

   On dissout 430 mi d'isolysergamido dans 4 com de dim:thylfozm- amide ot on ajout  le tout à la culture ci-dessus raison de 60 mç peur cha-;es flacon, Au bout de 7 jours d'incubation   à 24 C,   on recueille les cultures   t   on les filtre. On rôtira 31 cm3 du bouillon filtre pour vérifier la teneur en acide 
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 l'fsergÍé:ue. On effectue la vérification ccmmj suit % on alcalinise 10 cm3 du bouillon avec une solution   diluée   d'hydroxyde ou de carbonate alcalin au pH 11 environ, on élimine les substances   étrangères   alcalines en les extrayant 

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 par la chloroforme et on titre l'acide lysergique de la phase aqueuse par la méthode Voigt ( Microch'im. Acta 195% 
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 page 619).

   On trouve que le titre est de 54fg/c , calcu' on acide lysergique monohydraté. 



   On porte à % le pH du bouillon de culture filtre au 
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 moyen de H2504 5 % et on extrait doux raorises par 250 -r ' de butanol-n, On recueille les extraits, on les clarifie par :      centrifugation et on les concentra sous vide jusqu'à ce qu'on obtienne un résidu solide pesant 1,210 g. 
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  On lave le résidu l'éther 6thyli!e et on le reprend par 50 cm3 d'eau et 5 cm3 de solution concentrée dtommoniaque. On décolore partiellement la solution opalescente obtenue en la traitant trois r10risQs à 60-?0 C par 20 mg de charbon   activé à chaque fois ot en filtrant finalement sur 100 mg do   charbon activé. On évapore le filtrat sous vide jusqu'à 12 
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 cm3 3t on le maintient une nuit -en réfrigérateur* 
On recueille les cristaux d'acide lysergique   monohydraté @   qui précipitent et on les sèche sur du chlorure de calcium ; ils posent 125 mg ; point de fusion 224 C (avec décomposition);' 
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 j"\¯7o = +37,4Q (à 0, 5 ;6 dans la pyridine). 



  Exemple 2.- 
On effectue la préparation comme dans l'exemple 1, avec cette différence que l'alcaloïde ajouté au bouillon de culture est l'amide d'acide lysergique. On obtient une conversion de 80 %. 



    Exemple 3.-   
On effectue la préparation comme dans l'exemple 1, avec cette différence qua le milieu nutritif utilisé pour la pré- paration présente la composition suivante : 
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<tb> sorbitol <SEP> 5 <SEP> %
<tb> 
<tb> acide <SEP> succinique <SEP> 3 <SEP> %
<tb> 
 
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 KH2P04 0,1 % 'I¯ 804. ?H20 0,03 % 

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<tb> FeSO4.7H2O <SEP> 0,001 <SEP> %
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 0,001 <SEP> %
<tb> 
<tb> MnSO4.4H2O <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> cool <SEP> %
<tb> 
<tb> eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> ; <SEP> 
<tb> 
 pH ajuste,à 5,2 avec NH40H, 
On obtient un rendement d'acide lysergique de 55 %. 



    .Exemple. 4 ¯    
On effectue la préparation   corme   dans l'exemple 1, avec cette différence qu'avant d'introduire l'alcaloïde, on recueille le mycélium par centrifugation et on le met en suspension dans un tampon phosphate 0,05 M au pH 5,4, pour obtenir la moitié du volume initial. 



   On ajouta alors à chaque flacon 20 mg d'amide d'acide isolysergique dissoute dans   0,5   en 3 de diméthylforamide; on poursuit l'incubation pendant 120 heures. On obtient des rendements de conversion de 65 % d'acide lysergique. 



    Exemple 5.-    
On effectue la préparation comme dans l'exemple 1, avec cette différence qu'après l'addition de l'alcaloïde, on fait incuber les bouillons de culture   à 37 C.  u lieu do 24 C. On obtient des rendements de   95 %   d'acide lysergiquo. 



    Exemple..6. -    
On cultive le mycélium comme dans   l'exemple   1 ; à 6 jours   d'age,   on filtre 4 flacons, on lave le mycélium à trois reprises sur la filtre avec 100 cm3 d'eau chaque fois et on le met en suspension dans 500 cm3 d'acétone anhydre   préala-   blement refroidie   à -10 C. Aer@s  -vo.r filtré la suspension, on lave le résidu deux reprises, sur le filtre, avec 100 cm3 d'acétone froide   t   on   sèche   sous vide* On obtient 3,600 g de poudre sèche.

   On met en suspension   900   mg do cette poudre dans 10 cm3 de tampon phosphate 0,2 M au pH 5,2 et on y 
3 ajoute 10 mg d'amide d'aoide lysergique dissoute dans 0,2 cm de dimetthylformamide ; l'amide est alors convertie en acide 

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 lysergique à raison de plus de 95 % au bout de 120 heures d'incubation à 37 C.    



  Exemple 7.-   
On cultive le mycélium comme dans l'exemple 1. A 6 jours :   d'âge,   on filtra 4 flacons et on lave le mycélium à trois reprises sur le filtre avec 100 cm3 d'eau froide. On refroidit le tourteau à -20 C, puis on le   dégelé,   on le divise dans un ballon avec 5 g de poudre de verre pendant 15 minutes et on y ajoute 10 cm3 de tampon citrate au pH 5,2. 



   Puis on ajoute 20 cm3 de tampon citrate analogue et on centrifuge le tout à   5000     tr/.in   pendant 30 minutes. On 
3 effectue toutes les étapes à environ 0 C. On ajoute 4 cm de la phase ci-dessus, puis 1 cm3 de solution tampon au pH 5,2, 5 cm3 do H20 et 10 mg d'amide d'acide lysergique dans 0,2   ci 3   do   dimthylformamide,   et au bout de 120 heures d'incubation à 24 C on obtient une conversion en acide lysergique do 55 %. 



  Exempel 8. -   On   stérilise à   120 C   pendant 60 minutes, dans une cuve de fermentation de laboratoire de 5 litres, 3 litras du 
3 milieu végétatif de l'exemple 1 et on inocule avec   300   cm do bouillon de culture obtenu dans un flacon sur un milieu vJgdtatif comme celui do l'exemple 1, puis on fait incuber pondant 7 jours 24 C sous aération correspondant   à 300     tr/nn   d'un agitateur à 4 pales et sous une aération do 3 litres par minute. 



   On stérilise 3 litres du milieu de production de l'exemple 1 dans une cuve do fermentation de laboratoire de 5 litres et on inocule avec 300 cm3 de bouillon de culture obtenu comme ci-dessus. Les conditions d'aération, sous agita- tion avec un agitateur à 4 pales, sont de 400 tr/mn et    'aération est de 3 litres par minute.   

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   Au bout de 4 jours d'incubation, on ajoute 3 g d'amide d'acide isolysergique dissoute dans 25 cm3 do diméthylform- amide, et on effectue l'incubation à 37 C pendant 5 jours. 



  On obtient une conversion de 85 % on acide lysergiquo.

Claims

RESUME L'invention a pour objet 1 ,- Un procédé microbiologique pour la préparation d'acide lysergique, qui est caractérisa par les points suivants, considères séparément ou en combinaison t a) - on soumet la lysergamide ou l'isolysergamido, en solution dans un solvant organique, par exemple la dim6thyl- formamide ou l'éthanol, à l'action enzymatique d'une souche de Claviceps purpuroa (Fr.) Tul., dans dos conditions aéro- bies, et l'on isole l'acide lysergique obtenu on l'extrayant par un solvant organique, par exemple le butanol-n ;

b) - on ajoute l'amide en solution dans le solvant organique au bouillon de culture contenant la souche de microorganisme, et on fait incuber à 20-40 C, de préférence à 37 C, et à un pH de 4,5 a 7,0, de préférence de 5,2 c) - on ajoute l'amido on solution dans le solvant organique au mycélium filtré du microorganismo, en suspension dans une solution tampon phosphate à un pH de 5 à 5,5 et on fait incuber à 20-40 C, de préférence à 37 C, et à un pH de 4,5 à 7,0, de préférence de 5,2.

2 . - L'acide lysergique préparé par le procéda ci-dessus.