BE635859A

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Publication number: BE635859A
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Description


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  Procédé pour la préparation de monolucoB1des cardloact1r 

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 La présente invention a trait à un procédé pour la 
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 préparation de monogluconides cardioactito. Ce procédé est caractérisé par le fait qu'on dégrade, par fermentation, les   diglucosides   extraite de Digitalis canariensis L. sous forme d'un mélange afin d'obtenir les monosides correspondants   et.,le   cas échéante qu'on sépare les uns des autres les mono- sides contenus dans le mélange obtenu. 



   Digitalis   canariensis   L. est une digitale croissant sur les îles Canari eu. Ensemble avec Digitalis isabelliana (Digitalis   oanariensis   L. var.   isabelliana),   qui ne se trouve que sur Cran Canaria, elle constitue le sous-genre Isoplexis. Ce dernier se distingue des autres digitales herbacées (sous-genre   Eudigitalis)   par son aspect frutescent et son feuillage persistant, 
Digitalis   canariensis   L.est caractérisée par sa teneur élévée en glucosides cardioactifs; en moyenne, la teneur est 10 fois plus élevée que celle de Digitalis purpuraa. 



  On a trouvé que le glucoside principal de Digitalis cana-   riensis   L. est basé sur une aglucone inconnue jusqu'à 
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 présent, qui est dénommée ci-après .oanarigén1ne.. Elle est représentée par la formule générale   suivantes -   
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Dans le glucoside principal, cette aglucone   (#4 -   3ss, 14-dihydroxy-card-20(22)-énolide) est liée avec du digitoxose, qui   est à   son tour attaché au glucose. 



   Le mélange de glucosides utilisé comme substance de départ peut être obtenu d'après des méthodes   connues,   par exemple par le procédé d'extraction décrit dans Helv. Chim. Acta 42. p. 1014 (1959). On peut, par exemple, procéder de la manière décrite ci-aprèsla plante, en particulier les feuilles séchées, est extraite   à fond   avec des mélanges alcool aqueux/eau et/ou avec un alcool (tel que le méthanol ou l'éthanol). On fait précipiter les substances secondaires, se trouvant dans l'extrait obtenu, au moyen d'acétate de plomb basique.

   Finalement, on répartit les substances de l'extrait entre la phase aqueuse et différents solvants organiques, par exemple succesivement dans de l'éther, du chloroforme, un mélange chloroforme/éthanol   (4 il),   chloro-   forme/éthanol   (2:1) et chloroforme/éthanol (3:2). Lorsqu'on utilise cette méthode de travail, presque toutes les substances cardioactives passert dans l'extrait chloroforme/éthanol (4:1). 



  Le mélange de glucosides, qui se trouve dans cet extrait, con-   stitue   par conséquent une substance de départ préférée. Ce- pendant, on peut également utiliser comme substance de départ, par exemple, le mélange de glucosides se trouvant dans la phase aqueuse lorsqu'on n'extrait qu'avec de l'éther et du chloroforme. 



   La transformation, par dégradation fermentative, des diglucosides (biosides.' se trouvant dans le mélange de gluoo-   @   aides en les   monoglucosides   correspondants (monosides) peut se faire, d'après des méthodes connues,avec l'utilisation d'enzymes 

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   provoquant   la séparation du   glucose   terminal de la molécule de bioside. De tels enzymes sont, par exemple.la digilanidase 
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 (de Digitalis lanata), la d1gIpurpIdaee ( de Digitalis purpurea), la seillarénase ( de Soilla maritima), la takadiastase (d'Aspergillus oryzae), les gluconidases obtenues à partir de levure ou de suc hépatopancréatique, etc. 



  La etrophantholiabe (voir par exemple Enzymologia 1939. 



  Z, p. 362) constitue un ferment approprié. On utilise avantageusement 0,5 - 2 parties de strophanthobiase par partie de mélange de glucosides. La dégradation fermentative peut se faire dans une solution aqueuse, éventuellement avec l'addi- tion d'un solvant miscible à l'eau,par exemple d'une oétone, telle que   l'acétone;   d'un éther, tel que le dioxane, le oello- solve; d'un alcool inférieur, tel que le méthanol, l'éthanol, etc. A une température d'environ   37 .  la fermentation dure approximativement 5-20 jours. Il faut noter que certains 
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 ferments, tels que la $rophanthob1ase, provoquent la séparad¯elucose, tion non seulement des   radicaux* terminaux,   mais aussi celle du 
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 composant sucre attaché directement à l'aglueone.

   Les substances non fermentées,éventuellement obtenues, peuvent être soumises à une fermentation supplémentaire ; en général , cette opération n'en vaut cependant pas la peine. Les monosides formés par la dégradation fermentative peuvent être séparés des substances de départ inaltérées par extraction avec un solvant approprié, tel que le chloroforme, le chlorure de méthylène, etc. 



   On a trouvé que le canarigénine-digitoxoside [composant 
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 sucre: D )-digitoxosel prédomine dans le mélange de mono- sides obtenu. On peut lui attribuer la   formule   générale suivante! 

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Afin d'obtenir les différents monosides, en particu- lier le   canarigénine-digitoxoside   mentionné, on peut séparer, d'après des méthodes connues, ces monosides les uns des autres. 



  Ainsi, la séparation peut se faire, par exemple, par distilla-   tion   fractionnée, par chromatographie   (alumique,   gel de   silice,   etc.) ou par distribution à contre-courant. 



   Exemple 1 a)   Fermentation.   En   chauffant   légèrement, on dissout 84,5 g d'un mélange pulvérulent de glucosides [préparé à partir de feuilles de Digitalis canariensis L. sous forme de l'extrait de ohloroforme/éthanol   (4 il}]   dans 1200 ml d'un mélange méthanol/eau (1:1). En agitant, on ajoute peu à peu, alter- nativement,   600   ml de méthanol et 18 litres d'eau chaude à la solution claire et brun-miel. Cette solution légèrement trouble est libérée du méthanol à 50  ( à raison de   80   portions d'environ   250   ml), tout en étant concentrée ! un volume de 12 litres de solution trouble.

   En remuant, 

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 on ajoute ensuite par jet mince une solution de 100 g de   strophanthobiase   brute et de 1000   ml   d'eau. Après avoir ajouté 10-15 ml de toluène, on laisse reposer la solution de fermentation pendant 10 jours à 37 , en l'agitant de temps en temps. Un précipité spongieux   jaunâtre   se forme, que l'on isole par filtration à travers un filtre de"Hyflo-Super- cet. 



     On   sèche le gâteau de filtration par succion, le met, tout en   chauffant,   en suspension dans   150     ml   de méthanol, et le filtre avec succion. Le filtrat jaune est séché à sicci- té sous vide. On obtient 5,6 g de résidu sousforme   d'une  mousse jaunâtre, que l'on répartit dans un entonnoir séparateur entre 25 ml d'eau et 250 ml de chloroforme. Après avoir séparé le chloroforme, on extrait la phase aqueuse encore 3 fois avec 150 ml de chloroforme.

   On lave les extraits   chloroformé!avec   de   l'eau,   les sèche au moyen de sulfate de sodium et les con- centre par évaporation sous vide, de sorte qu'on obtient au total   4,8   g de mélange de monosides.En extrayant la solution aqueuse (25 ml) avec un mélange chloroforme/alcool (2:1), on peut récupérer 0.8 g de substance de départ (mélange de   diglucosides).   



   La solution de fermentation libre de précipité (voir ci-dessus) est concentrée sous pression réduite à 50  jusqu'à l'obtention   d'un   volume de 2 litres. Ensuite, on ajoute 12 litres   d'éthanol à   96%, chauffe à ébullition au bain de va- peur, puis filtre avec succion a travers un filtre de "Hyflo-Supercel". On concentre le filtrat olair jaunâtre   (14   litres) à 50    jusque   l'obtention d'une quantité de   1500     ml,   

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 traite avec 1500 ml d'eau et concentre à un volume de 1000 ml dans un évaporateur rotatif   (frte   production de mous *). Un produit visqueux de couleur orange-brun se précipite.

   La solu- tion et le précipité sont extraits avec du chloroforme (10 x 1000 ml) dans un entonnoir séparateur de 3 litres. Les extraite de chloroforme passent alors succesivement à travers 2 entonnoirs séparateurs contenant chacun 200 ml d'eau, puis ils sont élaborés de la manière décrite ci-dessus, de sorte qu'on obtient 23,7 g de mélange de monosides. La quantité totale est de 28,5 g (ensemble avec le mélange de monosides isolé des précipités de fermenta-   tion).   



   De la solution de fermentation, extraite avec du ohloro- forme (comme décrit ci-dessus), on peut récupérer 32 g de substance de départ non fermentée,en l'extrayant avec un mélange j chloroforme/alcool   (4:1).   En général, une fermentation ultérieure n'en vaut pas la peine.       b) Décomposition   chromatographique   du mélange de monosides. 



   On fait passer 28 g du mélange de monosides obtenu. travers une colonne de 600 g d'alumine. La table ci-après donne des indications concernant la méthode de travail et les résultats obtenus. 

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<tb> 



  Numéro <SEP> de <SEP> Solvant <SEP> Substance <SEP> isolée
<tb> 
<tb> la <SEP> fraction <SEP> (500 <SEP> ml <SEP> pour <SEP> Quantité <SEP> Composition
<tb> 
 
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 chaque fraction) brute en mg (cfiromatograph1e en couche mince) 1 - 5 Benzne-Chl.1'. (4:1) 125 
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<tb> 6 <SEP> - <SEP> 7 <SEP> " <SEP> . <SEP> (3:2) <SEP> 160
<tb> 
 
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 8 - 9 Il "1 (3:2) 150 a 10 - 11 Il Il (3t7) 195 ' a,b,c 
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<tb> 12 <SEP> . <SEP> . <SEP> (3:7) <SEP> 655 <SEP> b,c
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 13 <SEP> - <SEP> 15 <SEP> Chloroforme <SEP> 1100 <SEP> b,o,(d)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 16 <SEP> - <SEP> 17 <SEP> . <SEP> 1030 <SEP> b,(o), <SEP> d
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 18 <SEP> - <SEP> 35 <SEP> " <SEP> 10445 <SEP> d
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 36 <SEP> - <SEP> 40 <SEP> Chlf.-Me- <SEP> (99,5:

  0,5) <SEP> 645 <SEP> d,e
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 41 <SEP> - <SEP> 47 <SEP> . <SEP> . <SEP> -(99:1) <SEP> 1665 <SEP> e,f,g
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 48 <SEP> - <SEP> 56 <SEP> " <SEP> -(49.1) <SEP> 2030 <SEP> e,r,g
<tb> 
 
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 57 - 67 "" - (l9 : l ) 4500 e.f.g 
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<tb> 68 <SEP> - <SEP> 72 <SEP> . <SEP> . <SEP> -( <SEP> 9:1) <SEP> 435 <SEP> e,f,g
<tb> 73 <SEP> - <SEP> 77 <SEP> " <SEP> -( <SEP> 7:3) <SEP> 130 <SEP> e,f,g
<tb> 
 Chlf.: chloroforme;

   Me: méthanol 
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 a : éther oanr1génlne-3-méthy11que fc : canarigénine c 3-épi-eanarigénine d canarigénine-digitoxoside e : mélange de monosidea, composé de canarigénine-oanaroside et   xysmalogénine-canaroside   f,g ; monosides non identifiés 

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En partant des tractions   18-35,   on obtient 7,75 g de canarigénine-digitoxoside pur et 1,3 g de   canarigénine-   digitoxoside contenant peu de monosides. 



   Propriétés du canarigénine-digitoxoside pur: recristalli- sation dans un mélange acétone/éther: aiguilles   très   fines (contenant de l'eau) fondant à   176-201 ;  dans un mélange métha- nol/éther {exempt de solvant):paillettes prismatiques fondant à   135-142 ;     [[alpha]]22D -     -11,4  #   2  (dans le chloroforme). Le composé acétylé, que l'on peut obtenir sous forme d'aiguilles très fines, fond à   212-225    (dans   l'acétone);    [[alpha]]22D -     +4,20     # 2    (dans le chloroforme). 



   Lorsqu'on soumet le   canarigénine-digitoxoside   à la décomposition usuelle pour les glucosides   [chauffage   pendant 30 minutes dans un mélange   méthanol/acide   sulfurique 0,1N (1:1) au bain de vapeur], l'aglucone obtenu; sera la 3,5-   dianhydro-périplogénine.   La décomposition comporte donc une déshydratation de   l'aglucone   (canarigénine). 



   Lors de la décomposition du canarigénine-digitoxoside avec un mélange   méthanol/eau   (1:1) et de l'acide acétique glacial à 1% ( en laissant reposer 8-10 jours à 37 ), on obtient principalement de l'éther   canarigénine-3-méthylique   fondant à   212-222 ;     [[alpha]]20D -   +   27,6 +   20 (dans du chloroforme). 



   Lorsqu'on décompose le canarigénine-digitoxoside avec un mélange acétone/eau (1:1) et de l'acide acétique glacial à 1% (en laissant reposer 8-10 jours à 370), le produit principal sera de la canarigénine; à part oelle-ci, on obtiendra de   la   3-épi-canarigénine (position-a du groupe 

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 3-hydroxyle) fondant à 207-215 01 [aj2 . + 10  * 2 ( dans du chloroforme), ainsi que de la 3,5-dianhydro-périplogénine. 



  De la formation de la 3-épi-oanarigénine, on peut déduire que lors de la décomposition, il peut se produire une inversion au Cs de l'aglucone. 



   En recristallisant l'aglucone canarigénine dans un mélange chloroforme/méthanol/acétone, on obtient des plaques prisma- 
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 tiques fondant A 25-252 s [alda2 - +220 Z 20 (dans du métha- non). L'acétvl-canarigén1ne fond il 214-2170; [a]0 = -4  2  (dans du chloroforme). En déshydratant prudemment la oanarigé- nine, on obtient   l'anhydro-périplogénone.   
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  Le mélange de monosides désigné par la lettre'e"(voir la table ci-dessus), qui est présent dans les fractions 36-77, est   chromatographiquement   uniforme. Il est composé de   2-monogluoo-   sides isomères contenant le même 2-désose, à savoir le D(+)- 
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 oanarose [2-désoxy-D-rhamnoee], et comme aglucones la canari- génine, respectivement la xysmalogénine. Il s'agit donc d'un mélange de canarigénîne-canaroside et de xysmalogénine- canaroside. Le mélange de monosides "c"a la composition   C2@H42O7   et le point de fusion double 150-155 / 218-235  (dans le méthanol);   [[alpha]]24D =   31,80   #   20 (dans le méthanol).

   Point 
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 de fusion du dérivé acétylé de e; 265-2Oo [alD2 = -21  + 20 (dans du chloroforme). c) Préparation de la substance de   départi à   60 , on mélange à fond 1200 g de feuilles de Digitalis canariensis L., séohées à l'air et pulvérisées dans un broyeur à boulets et 2 litres d'eau chaude, puis traite le produit à 60  avec 2 litres d'éthanol. On fait passer le produit chaud à travers un filtre de 

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 "Hyflo-Supercel", et extrait le résidu encore 6 fois avec 
2 litres d'éthanol. A une température du bain de 50 , on concentre sous vide les extraits réunis jusqu'à l'obtention d'un volume total d'environ 1,2 litres, puis ajoute le même volume d'eau.

   On secoue cette solution éthanolique à environ 50% avec du Pb(OH)a [préparé immédiatement avant l'utilisation à partir de 1,2 kg de   diacétate   de plomb trihydraté, lavé jusqu'à réaction neutre] pendant 30 minutes sur la machine, fait passer avec succion à travers un filtre de "Hyflo-Supercel, met le résidu en suspension dans 500 ml d'éthanol à 50%, filtre de nouveau avec succion et rince avec peu d'éthanol à 50%. 



  Lorsqu'on ajoute une solution aqueuse basique d'acétate de plomb au filtrat, il n'en résulte qu'une faible turbidité. On porte le pH du   filtrat à 6,en   ajoutant de l'acide sulfurique 2N, puis on concentre jusqu'à l'obtention d'un volume de 1 litre, tout en maintenant le pH à environ 6. Cette solution est extraite dans un entonnoir séparateur   sucoesivement   avec de l'éther (4 x 2 litres), avec du chloroforme (4 x 1 litre), avec un mélange   ohloroforme/éthanol  (4:1)   [8 x 1   litre], aveo un mélange chloroforme/éthanol (2:1) [3 x 1 litre], et finale- ment avec un mélange chloroforme/éthanol (3:2) [3 x 1 litre]. 



   On fait passer tous le extraits (l'un après l'autre) à travers 2 entonnoirs séparateurs contenant chacun 150 ml d'eau (seuls les extraits d'éther étant en outra lavés avec de la solution diluée de carbonate de sodium], les sèche au moyen de sulfate de sodium, les filtre et les concentre sous vide. 

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   A partir de 1 kg de feuilles pulvérulentes, on obtient en moyenne les quantités suivantes: 
Extrait d'éther : 3 g 
Extrait de chlororme 3 g 
Extrait du mélange chloroforme/alcool   (4:1)   : 37.5 g 
Extrait du mélange chloroforme/alcool   (2tl)   3,75 g 
Extrait du mélange chloroforme/alcool   (3:2)   4,5 g 
Le mélange de glucosides, extrait avec le mélange ohloro- forme/éthanol (4: 1), est utilisé comme substance de départ pour la dégradation fermentative décrite ci-dessus. 

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   Les monosides préparés suivant le procédé de l'invention ont une forte action oardioactive. Celle-ci est favorisée par le fait qu'ils sont absorbés facilement et   n' ont   qu'un faible degré d'accumulation. Ils peuvent être transformés en prépara- tions médicamenteuses contenant la substance active en mélange avec un véhicule pharmaceutique qui peut être organique ou inorganique, solide ou liquide, adapté à l'administration per on ou parentérale. Comme véhicule pharmaceutique, on peut utiliser des substances qui ne réagissent pas avec les composés nouveaux, par exemple l'eau, la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, les gommes, les polyalcoylène-   glyools,   la vaseline, et les autres véhicules d'usage dans les préparations médicamenteuses.

   Ces préparations peuvent se pré- senter sous forme de comprimés, dragées, suppositoires, capsules ou de solutions, suspensions ou émulsions. Le cas échéant, les préparations peuvent être stérilisées et/ou peuvent contenir des substances auxiliaires, par exemple des agents conserva- teurs, stabilisants, de mouillage ou d'émulsification. Elles peuvent également contenir des sels régularisant la pression osmotique ou des composés-tampon, et être combinées avec d'autres substances thérapeutiquement utiles. Ces préparations sont obtenues par les procédés usuels, illustrés ci-après. 



   Exemple 2 a)Afin de préparer une solution d'injection, on dissout   150   mg du canarigénine-digitoxoside (décrit à l'exemple 1) dans 200 ml d'éthanol pur, puis ajoute de l'eau redistillée jusqu'à l'obtention d'une quantité totale de 1000 ml. 

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  La solution alcoolique-aqueuse obtenue peut être versée dans des ampoules de 2 ml ou de 5 ml, et être stérilisée de manière usuelle. b) On peut préparer,   d'après   des méthodes connues, des 
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 comprimés contenant chacun 2-3 mg de canarigénine-digitoxoside (décrit à l'exemple 1).

Claims

Revendication 1. Procédé pour la préparation de monoglucosides cardicactifs, caractérisé par le fait qu'on dégrade, par fermentation, les diglucosides extraite de Digitalis cana- ' riensis L. sous forme d'un mélange afin d'obtenir les mono- aides correspondants, et qu'on décompose, le cas échéant, le mélange de monosides obtenu.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise comme substance de départ les gluoosides se trouvant dans l'extrait du mélange de chloroforme/alcool (4:1).

3. Procédé suivant les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la dégradation fermentative des diglucosides se fait au moyen de strophanthobiase.

4. Procédé suivant les revendications 1-3. caractérisé par le fait que le canarigénine-digitoxoside est isolé du mélange des monosides obtenu.

5. Procédé pour la préparation de monoglucosides cardio- actifs comme décrit ci-dessus, en particulier dans l'exemple 1. <Desc/Clms Page number 16>

6. Les produite obtenue suivant le procédé des revendi- cations 1-5' EMI16.1 7' Les oanar1g6nlne-aonogluoos1d.s, dont le composant sucre est un 2-désose.

8. Le canarigénine-D(+)-digitoxoside.

9. Compositions ayant une action oardioaotive, oaraoté- risées en ce qu'elles comprennent un. componé suivant les revendications 6-8, ainsi qu'un véhicule ou support pharmaceutique.

10. Compositions suivant la revendication 9, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme d'unité. de dosage contenant 0,1 mg à 3 mg de substance active par unité de dosage.

11. Compositions suivant la revendication 10, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de comprimés, capsules, cachets, suppositoires, ovules, ampoules, etc.