<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention a pour objet la prépara- tion de nouveaux stéroïdes de la série du. #1,4-prégnadiè- ne.
Récemment,un certain nombre de stéroides des séries du prégnène et du prégnadiène, tels que l'hydrocor- tisone et la 1-déhydro-hydrocortisone sont devenus des agents thérapeutiques importants et sont devenus utiles comme intermédiaires pour la préparation d'autres stérol- des utiles en thérapeutiques. Les nouveaux #1,4-prégna- diènes envisagés suivant l'invention sont utiles comme agents anti-inflammatoires dans le traitement de l'arthri- te, de l'asthme, des brûlures, de la bursite, etc...,et aussi dans le traitement des affections cutanées et des maladies du collagène.
Ces composés sont utilisés en com- binaisons avec des charges, excipients, etc.., en tablet- tes, poudres, pilules, etc...,. Ils peuvent aussi être uti lisés par voie parentérale, en solution ou en suspension.
Suivant l'invention, on prépare lesnouveaux #1,4-prégnadiènes en soumettant un #4-prégnène à une fermentation ensymatique au moyen de champignons du genre Nocardia, ou du champignon Corynebacterium simplex
Le procédé de la présente invention peut être illustré par l'équation schématique suivante, dans laquel- le la formule générale I représente le #4-préngène, et; la formule générale II représente le #1,4-préganadiëne obtenu :
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
dans ces formules, X est un atome d'hydrogène ou d'halogè- ne, Y est. un groupe méthylène, hydroxyméthylène ou carbony- le, Z est un groupe méthylène, hydroxyméthylène ou alkylexy méthylène inférieur, R' est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle, et R est un atome d'hydrogène ou un grou pe alkyle inférieur. Dans certains composés préférentiels X représente le fluor, Y représente CHOH, Z représente CHOR", R' représente OH, R et R" sont des atomes d'hydro- gène ou des radicaux alkyle.
Dans la conduite du procédé de la présente in- ventiori, on cultive dans des conditions aérobies, dans un milieu nutritif approprié contenant un #4-stéroïde de la série du prégnène, un champignon du genre Nocardia (Ber- gey, Manual, 6ème édition), tel que le corallina, ATCC 999 et ATCC 4273, (Culture Lederle n 13);
l'asteroides, ATCC 3308, le keratolyticus, ATCC 12484, le transvalensis, ATCC 12485, l'erythropolis, ATCC 4277, le convoluta, ATCC 4275, le gardneri, ATCC 9604, le leishmanii, ATCC 6855, l'opaca ATCC 4276,'le blackwelii., ATCC 6846, le caviae, ATCC 6848, le cuniculi, ATCC 6864, le globerula, ATCC 9356, le poly- chromogenes, ATCC 3409, le sylvodifera, ATCC 7372, le far- cinica, ATCC 3318, le sylvodifera ATCC 4919, ou une autre espèce de Nocardia,
ou bien le champignon Corynebacterium
<Desc/Clms Page number 3>
simplex. Pendant la croissance de l'organisme dans des con- ditions favorables, deux atomes d'hydrogène s'éliminent du noyau stéroïde A,et on obtient ainsi une double liaisom en position 1,2. Le mécanisme exact de cette déshydrogéna- tion est obscur, mais celle-ci est le résultat des enzymes produites par l'organisme dans le processus de la croissan- ce. Un milieu nutritif approprié contient une source solu- ble solubla d'éléments carbonés, azotés, et minéraux.
Les sources de carbone comprennent les sucres, tels que le glu- cose, le sacchacrose, le maltose, le dextrose, le xylose et le galactose, et aussi les alcools tels que le glycérol ou le mannitol; l'amidon de mais; les acides organiques @ tels que l'acide citrique, l'acide malique et l'acide acé- tique; et divers produits naturels) contenant des hydrates de carbone, tels que la liqueur de macération de mais, la farine de soja, la farine de graine de coton, et de nom- breuses autres matières que l'on peut trouver et qui ont été utilisées antérieurement comme source de carbone dans les processus de fermentation. Généralement, on peut uti- liser différents corps ci=dessus, dans le milieu, avec de bons résultats.
Les sources appropriées d'azote comprennent certaines des matières citées ci-dessus, telles que la li- queur de macération de mais, la farine de soja, la farine de graine de coton, etc., et diverses autres substances, telles que l'extrait de boeuf, la caséine, la levure, les protéines digérées par enzymes, et les produits de dégra- dation, comprenant les peptones, les acides aminés et beaucoup d'autres matières protéiques disponibles qui sont susceptibles d'entretenir la croissance des champignons.
Les sources inorganiques d'azote, comprenant l'urée, les sels d'ammonium, les nitrates, etc., peuvent être utili- sées dans le miMeu comme source d'azote assimilable pour
<Desc/Clms Page number 4>
fournir un milieu de croissance favorable à l'organisme.
Les éléments minéraux nécessaires à la fermen- tation se trouvent généralement dans les matières brutes que l'on utilise souvent comme sources de carbone et d'azo- te, ou bien dans l'eau utilisée dans le procédé. Toute- fois, il est en général à conseiller d'ajouter des quanti- tés supplémentaires d'éléments minéraux à celles normale- ment présentes, pour obtenir une croissance maxima de Nocardis. Il est avantageux d'ajouter des cations et anions comprenant le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, les ions phosphate, sulfate, chlorure, le co- balt, le manganèse, et autres. L'usage d'oligo-éléments tels que le bore, le cuivre, le cobalt, le molybdène et le chrome est souvent désirable.
La croissance du champignon Nocardia ou du champignon Corynebacterium simplex se fait en milieu aéro- bie, et on peut réaliser l'aération, dans des flacons par exemple, par agitation sur une secoueuse alternative ou rotative, ou dans des bouteilles ou des cuves en envoyant sous pression de l'air stérile à travers le mélange de fermentation. Il est désirable d'insuffler de l'air sté- rile à travers le milieu à raison de 1/3 à 2 volumes d'air- par volume de milieu et par minute. L'agitation dans les bouteilles ou dans les cuves de fermentation est assurée par un agitateur mécanique. Le champignon Nocardia peut pousser à des températures de 5 à 45 C, mais il est pré- férable de conduire le procédé à des températures de 25 à 37 C.
Le Corynebacterium simplex peut pousser à des tem- pératures de 10 à 45 C, mais on l'utilise de préférence à une température de 25 à 38 C.
Pour préparer des inocula, on utilise 1,0 cm3 de suspension de cellules végétatives lavées de champigons du genre Nocardia ou de Corynebacterium simplex, pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypti-
<Desc/Clms Page number 5>
case, dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. Le bouillon de soja à la trypticase contient 3% de produit de diges- tion tryptique de protéines de soja, sous forme de poudre déshydratée (Baltimore Bacteriological Laboratories), 5% de glycérine et 8% d'extrait de boeuf (Armour), et ce mélange est stérilsé pendant 15 minutes à une températu- re de 120 C (pression de vapeur de 675 kg). Après stérilisation, le pH est compris entre 7,4 et 7,7.
Après avoir inoculé le flacon, on le fait incuber à 37 C, sur une secoueuse, pendant 4 à 8 heures environ. Onpeut uti- liser ces inocula pour inoculer de grandes quantités de milieu stérile en bouteilles, et ces cultures en bouteil- le, après fermentation, peuvent servir à.inoculer de gran- des quantités de milieu dans des cuves de fermentation.
Au lieu du bouillon de soja à la trypticase indiqué plus haut, on peut utiliser d'autres milieux, comme le montrent les exemples ci-après.
EMI5.1
Les 4-stéroides de la série du prégnène qui peuvent servir dans le procédé de la présente invention sont notamment le 3,20-dicéto-llbêta, 17 alpha, 21-tri-
EMI5.2
hydroxy- 4¯prégnène (hydrocortisone), le 3,20-dicéto- llbêta, 21-dihydroxy-'.prégnêne {corticostérone), le 3,20-dicéto-17 alpha,21-.dihydraxy..,(''prégnène (substance S de Reichstein), le 3,20-dicéto-ll alpha, 17 alpha, 21- trihydroxy- '-.prégnëne (11-épi-hydrocortisone), le 3,20- dicéto-11 bêta, 16 alpha, 17 alpha, 21-tétrahydroxy- Z-2.- prégnène, le 3 ,2O-dicéto-9alpha,fluor0-llbêtaji6alpha, 17alpha, 21-tétrahydroxy- 4¯prégnènè, le 3,11,20-tricéto- l6alpha, ;l7alpha, 21-trihydroxy- L::::..4..prégnène, le 3,11,20- tricéto-17alpha, 21-dihydroxy- 4¯prégnène, et leurs es- ters etc.
Quand on utilise les substrats de stéroïdes ci- dessus dans la fermentation, les produits formés sont les
EMI5.3
stérolde's'libres. On ajoute généralement ces stéroïdes à
<Desc/Clms Page number 6>
la fermentation, en solution ou sous forme finement divi- sée. Une méthode préférentielle consiste à dissoudre le stéroïde dans l'éthanol ou d'autres solvants miscibles à l'eau, et à l'ajouter au milieu de fermentation, au stade désiré du processus. Bien que le stéroïde précipite par- fois de la solution quand on l'ajoute de cette façon, il se disperse dans tout le milieu sous forme de suspension fine et se trouve facilement à la disposition de l'organis- me en vue de l'oxydation. La quantité de stéroïde ajoutée à la fermentation peut varier considérablement, mais elle est généralement de l'ordre de 1/10 à 1 g par litre de milieu.
Pendant 'le processus de fermentation, il est parfois désirable d'ajouter des agents antimousses tels que les silicones, les huiles glycéridiques, etc. On ajou te ces composés de temps en temps, et dans les quantités voulues.
Dans le procédé de la présente invention, on fait généralement incuber pendant une durée de 16 à 40 heures environ, à une température d'environ 32 C, des portions de 10 cm3 de milieu inoculé en tubes de secoueu- ses de 100 cm3. Au bout de ce temps, on ajoute, dans cha- que tube, 2 mg de substrat stérile (stéroïde #4-prégnène) dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on poursuit la fermen- tation à environ 32 C. On laisse la fermentation se poursuivre pendant un laps de temps suffisamment long pour réaliser la conversion maxima du #4-prégnène en #1,4- prégnadiène. Ce laps de temps peut varier de 1 à 72 heu- res ou plus.
A la fin du processus de fermentation, on récupère dans le milieu de fermentation le #1,4-stéroïde de la série du prégnadiène que l'on désire obtenir, grâce à la méthode suivante qui décrit en particulier une fermen-
<Desc/Clms Page number 7>
tation sur 10 cm3. Ce'st là une méthode générale qui est applicable pour des fermentations à diverses échelles.
On extrait à quatre reprises le contenu d'un tube de fermentation, avec quatre volumes de chlorure de méthylène. On réunit les quatre extraits, puis on lave une fois la solution résultante avec une solution aqueuse à 2% de bicarbonate de sodium saturée de chlorure de so- dium, et ensuite on lave à deux reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium. Après lavage, on peut sé- cher la solution de chlorure de méthylène sur du sulfate de magnésium anhydre et la filtrer. On concentre le fil- trat au bain-marie à la pression atmosphérique, jusqu'à un faible volume, et on transfère le concentré dans un fla- con volumétrique de 10 cm3, puis on complète à ce volume avec du chlorure de méthylène.
On utilise cette solution pour déterminer la teneur en stéroide, comme indiqué ci- après.
Dans les fermentations à grande échelle, on peut récupérer le ou les produits bruts de la liqueur de fermentation, par une simple extraction par solvant, en utilisant un solvant approprié non miscible à l'eau tel que les hydrocarbures inférieurs chlorés, les alcools, les esters, les cétones, etc.. On peut procéder à une nouvel- le purification et séparer les produits stéroïdes des ex- traits, par des méthodes bien connues du technicien. La séparation et la purification du mélange de stéroïdes né- cessitent souvent l'usage de la chromatographie.
Le procédé employé pour identidier les stérol- des présents dans la liqueur de fermentation soumise à l'extraction et mentionnée plus haut, est la chromatogra- phie à bande de papier. La système solvant utilisé est un système eau-méthanol-benzène, que l'on prépare en agi- tant environ 50% d'eau et 50% de méthanol avec du benzène,
<Desc/Clms Page number 8>
dans une ampoule à décantation, puis n laissant les deux couches se séparer. On place une portion de la couche in- férieure dans un cristallisoir ouverte sur'le fond d'un grand cylindre en verre. La couche supérieure est la pha- se solvant, et elle sert à remplir la cavité en forme d'au- ge à l'intérieur-du cylindre.
On prépare une solution
EMI8.1
étalon de stéroïde en dissolvant 10 mgl;hacun des sté- roides suivants dans 10 cm3 de chlorure'de;méthylène:
EMI8.2
3,20-dicéto-llbta,l7alpha,21-trihydroxy f-prégnène; , 20-dicéto-llbta, 21-.dihydroxy..,'-prégnéne.
3, 20-dicéto-17alpha, 21-dihydroxt-j'-prégnëne; 3,20-dicéto-llalpha,l7alpha,21-trihßdroxy-'-prégnène; 3,20-dicéto-llbta,16a1pha,17alpha,21-tirahydroxy-jj'-. prégnène;
EMI8.3
16,2-diacéto-3,20-dicéto-11-bta,l6alpha,l7alpha,21-té- - trahydroxy-4¯prêgnène; 3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbêta,l$alpha,17alpha,21-tétra hydroxy--prégnène ; \ (/ lôalpha , 21-diacéto-3 , 20-dicéto-9alpha-f luoro-llbêta , lôal- pha,l7alpha,21-tétrahydraxy-f,'-prégnène; (D'autres stéroides peuvent servir dans la solution étalon lorsqu'ils sont appropriés).
On chromatographe simultanément au moins une solution courante de stéroïde chaque fois que l'on essaie une solution inconnue. On applique exactement 0,025 cm3 de la solution étalon de stéroïde pour essais, sur la bande de papier, à la ligne de d épart, à 10 cm de l'ex- trémité supérieure de la bande, que l'on plie par-dessus le bord de l'auge et que l'on plonge dans la phase solvant contenue à l'intérieur. On développe alors la bande pen- dant 2 à 4 heures à environ 37 C. De même, on applique
0,1 cm3 de la solution inconnue sur une autre bande, que l'on plie alors dans la même auge et que l'on développe
<Desc/Clms Page number 9>
simultanément avec la bande étalon au stéroïde. L'auge permet de développer de nombreuses bandes simultanément.
Après avoir développé convenablement les bandes de papier, on les enlève de l'appareil et on les sèche à l'air à en- viron 37 C. Après séchage, on pulvérise sur les bandes une solution alcalino de bleu tétrazolium qui fait apparat- tre la couleur aux points où les stéroïdes sont présents.
On aligne des bandes à couleur développés avec au moins une bande "étalon" et en compare. On peut identifier les dif- férents stéroides par leur position sur la bande.
Les 2\' -stéroïdes; désirés seront plus polai-
EMI9.1
res que les 4"'stéroïdes correspondants. Il est entendu, de plus, que les ('''-stéro3de's désirés, une fois qu'ils ont été isolés et caractérisés, peuvent eux-mêmes servir dans une solution étalon de stéroïdes afin d'améliorer le procédé.
Les exemples précis qui suivent illustrent en détail la déshydrogénation des #4-ptéroïdes de la sé- rie du prégnène, pour préparer les #-1,4-stéroïdes corres- pondants de la série du prégnadiène.
EJ#MPLE 1
EMI9.2
.Préparation du 3,20dicéto-.llbéta-l7alpha,l.-trihydroxy z\ le4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar en tube à essai, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile, et on obtient une suspension de cellules végétatives que l'on utilise pour inoculer 100 cm3 de bouillon de soja stérile à la trypticase (décrit plus haut), dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le flacon pendant 7 heures à 37 C. Un utilise alors cet inoculum pour ino- culer un bouillon stérile de soja à la trypticase dans des tubes de secoueuse de 100 cm3. On utilise 1 cm3
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
diinoculum'pour inoculer chaque portion de 10 cm3 d'un milieu contenant 2% de mélasse (Grandma), 1% d'extrait de boeuf (Difco, et 1% de glucose dans chaque tube de secoueuse de 100 cm3. On fait incuber les tubes à 32 C pendant 40 heures.
A ce moment, on ajoute dans chaque tu-
EMI10.2
be 2 mg de 3,20-dicéto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy-ü'- prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol. On continue alors l'incubation pendant encore 24 heures.
On extrait à quatre reprises les 10 cm3 de liqueur de l'un des tubes ci-dessus, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites ci-dessus. Le chromatogramme sur bande de papier indique
EMI10.3
la présence du 3,20-d.icéto-llbéta,l7alpha,21-trihydroxy- l,4¯prégnadiène. EXEMPLE 2 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy-
EMI10.4
l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia sp.(ATCC 12483) sur agar-agar en tube adossais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile. On utilise 2 cm3 de la suspendison obtenue pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le mélange en agitant à 37 C pendant 8 heu- res, et on utilise la culture obtenue pour inoculer des tubes contenant du bouillon stérile de soja à la trypti- case. On utilise 1/2 cm3 de la culture de 8 heures pour inoculer 10 cm3 de milieu dans un tube de 100 cm3. On incube les tubes inoculés à 32 C en agitant pendant 16 heures. Dans chaque tube, on ajoute 2 mg de 21-acéto-
EMI10.5
3, 20-dicéto-l.béta,l7alpha,21-trihpdroxy-.'-prégnène
<Desc/Clms Page number 11>
dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol.
On fait incuber les tubes encore 1 1/2 à 5 heures et on récolte. La chromatographie sur bande de papier indique que le substrat s'est converti
EMI11.1
en 3,20ddicéto-llb,-ta,l7alpha,21-trihydroxy.,,1*-prégna- diène. On observe encore, sur les bandes de papier, à me- sure que le temps croît, l'apparition de 3,20-dicéto-llbê-
EMI11.2
ta,l7alpha,21-trihydroxy.-'-prégnëne, et que sa quantité augmente aux dépens du 21-acéto-3,20-di%to-11-bêta.17alphe, 21-trihydroxy-j'-prégnène, suivi par l'apparition en quantité croissance de 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-tri- hydroxy-l,4¯prégnadiène.
EXEMPLE 3 Préparation du 3,20-dicéto-llbêt9,17alpha,21-trihydroxy- ######################j################# 1,4-prégnadiène. '
On lave une culture de Nocardia sp. (ATCC 12483) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile. On prend deux portions de 100 cm3 de bouillon de soja à la trypticase dans des flacons Erlenmeyer de 500 cm3, et on. inocule chacune avec 1 cm3 de cette suspension. On fait .incuber les flacons sur une secoueuse alternative pendant 7 heures à 32 C. On utilise alors cet inoculum pour ino- culer un bouillon de soja stérile à la trypticase dans des tubes de secoueuse de 100 cm3. Il y en a 96 tubes, conte- nant chacun 10 cm3 de milieu., On fait incuber ces tubes pendant 23 1/2.heures à 32 C avec agitation.
Au bout de ce temps, on ajoute dans chaque tube 2 mg de 3,20-dicéto-
EMI11.3
llbêta,17alpha,21-trihydroxy-/\17-prégnène dissous dans' 0,2 cm3 de méthanol. On continue alors la fermentation encore pendant 5 heures à 32 C. On réunit le contenu des tubes, et on extrait à quatre reprises la liqueur obtenue. chaque fois avec 500 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les quatre extraits et on les concentre sous vide jus-
<Desc/Clms Page number 12>
qu'à obtention d'un résidu huileux. On dissout ce résidu dans 2 cm3 de la phase stationnaire du système; 3 parties d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole.(90-10000), 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau.
On mélange cette. solution avec 4 g de terre d'infusoires et on entasse le mélange obtenu au sommet d'une colonne chromatographique mesurant 2 x 39 en et comprenant 50 g de terre d'infusoi- res, on mélange avec 25 cm3 de la phase stationnaire dû système précédent. On développe la colonne obtenue à l'aide d'une phase mobile, et on recueille par fractions le liquide qui filtre. On concentre la fraction appro- priée jusqu'à siccité, sous pression réduite. On dissout le résidu dans l'acétone, et on cristallise le produit brut par addition d'éther de pétrole (60-70 C). Le rende- ment est de 27 mg d'un produit qui fond à 192-205 C. On recristallise cette matière dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, on obtient un produit qui fond à
25 231-233 C et qui mesure [Ó] D- +103 (dioxane).
Le spectre infra-rouge de ce produit est identique à celui
EMI12.1
d'un échantillon authentique de 3920-dicéto-Ilbêtael7alphas 21-trihydroxy-/ '"-prégnadiêne.
EXEMPLE 4 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- le4-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia gardneri (ATCC 9604) sur soja à la trypticase et agar-agsr, en tu- be à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives ainsi obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile contenant 1% de céréalose, 0,1% d'extrait de levure, 0,25% de chloru- re de sodium, 0,4% d'extrait de boeuf (Difco) et 0,4% de peptone, à pH 7 (milieu n 13) dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alterna-
<Desc/Clms Page number 13>
tive pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une au- tre quantité de 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber ce dernier flacon, avec agitation, pendant 24 heures à 32 C, et au
EMI13.1
bout de ce temps on ajoute 20 mg de 3,20-dicéto-llbêta, l7alpha,21-trihydroxy-,'-prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On continue l'incubation, et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à 4 reprises avec 40 cm3 de chlorure de méthylène chaque fois. On réunit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide.
On reprend le résidu dans 2 cm3 d'acétone et on analyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-llbêta,
EMI13.2
l'alpha , 21-trihydroxy-a,l' *.pré gnadiène . EXEMPLE 5 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,l6alpha,17alpha,21-té- ,
EMI13.3
trahydroxy-,L\ 1,4¯pré-nadiène.
On lave une culture de Nocardia gardneri (ATCC 9604) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspen- sion de cellules végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu n 13 stérile ajustées à pH 7, chaque portion étant dans un tube de secoueuse de 100 cm3.
On agite les tubes sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures, et au bout de ce temps,-on ajoute dans
EMI13.4
chaque tube 2 mg de 3,20-dicéto-llbgta,16alpha,17alpha, 21-tétrahydroxy.-'-prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'étha- nol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6, 24,
<Desc/Clms Page number 14>
72 heures d'incubation supplémentaire après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois par 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on concentre jusqu'à obtention d'un résidu sec, sous pression réduite. On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10 à 15 minutes, puis on les concentre sous vide jusqu'à siccité. On dis- sout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromatogra- phie des volumes appropriés de solutions résultantes. Les chromatogrammes montrent que le substrat a été converti
EMI14.1
en 3,20-dicéto-llbêta,16alPha,17alpha,21-tétrahYdroxy¯1'4 -prégnadiène.
EXEMPLE 6
EMI14.2
Préparation du 3,20-dicéto-llbéta,21-dihydroxy.µls'-pré- gnadiène.
On conduit cette fermentation d'une façon si- milaire à l'exemple 1, en utilisant le Nocardia corallina (ATCC 999) sauf que l'on continue la fermentation pendant 72 heures après l'addition du substrat de stéroïde qui
EMI14.3
est le 3,20-dicéto-llbëta,21-dihydroxy-4-prégnène. Le produit est le 3,20-dicéto-llbêta,21-dihydroxy-/"-pré- gnadiène, que l'on identifie par chromatographie sur pa- pier comme dans l'exemple 1. exemple 7
EMI14.4
Préparation du 3,20-aicéto-llbêta,l6alpha,17alpha,21-té- trahydroxy-L, 1,4-pré,-nadiène.
On lave une culture de Nocardia leishmanii (ATCC 6855) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la sus-
<Desc/Clms Page number 15>
pension de cellules végétatives obtenue pour inoculer des . à portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 jausté pH 7, chaque portion étant dans un tube de secoueuse de 100 cm3.
On agite les tubes sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures, et au bout de ce temps on ajoute dans chaque tube 2 mg de substrat constitué par du 3,200dicéto-
EMI15.1
llbêta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-'.-prégnène dis- sous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures supplémentaires d'in- cubation, après l'addition du substrat.
On extrait à quatre reprises chaque liqueur fermentée, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthy- lène. On réunit les'extraits de chaque liqueur et on con-. centre jusqu'à résidu sec sous pression réduite. On re- prend chaque résidu par 2 cm3 de pyridine et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique.,On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, et ensuite on con- centre jusqu'à résidu sec sous vidé. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatographie des vo- lumes appropriés des solutions résultantes. Les chroma- togrammes indiquent que le substrat s'est converti en
EMI15.2
3 , 20-âicéto-llbéta, l6alpha, l7alpha, 21-tëtrahydroxy.-l '-. prégnadiène.
EXEMPLE 8
EMI15.3
Bréparation du 3,20-dicéto-llbgta,17alpha,21-trihydroxy- lj4¯prégnadiène.
On lave ,une culture de Nocardia leishmanii (ATCC 6655) sur soja à la trypticase et agar-agar, en tuba à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obte- nue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une
<Desc/Clms Page number 16>
secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps,on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait. incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heu- res à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-
EMI16.1
trihydroxy-4¯prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation, et on en retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heu- res.
On extrait chaque portion à quatre reprises,- chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone et on analyse un échantillon approprié par la technique des bandes de papier décrite ci-dessus. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-
EMI16.2
llbta,l7alpha,21-trihydxoxyl'"-prégnadiène.
EXEMPLE 9 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,2l-dihydroxy-/ '-.pré- gnadiène.
On conduit une autre expérience d'une manière similaire à l'exemple 1, sauf que l'on remplace le 3,20-
EMI16.3
dicéto-llbta, l7alpha, 21-trihydroxy.. f'. prégnène par le 3,20-dicéto-llbta,21-dihydroxy-f'-prégnène, et que l'or- ganisme utilisé est le Nocardia sp. (ATCC 12483). Quand on essaie le produit obtenu, par des méthodes chromato- graphiques sur bandes de papier, il indique la présence
EMI16.4
du 3,20-dicéto-llbêta,21-dihydroxy-(1''-prégnadiène.
EXEMPLE 10 Préparation du 3,20..dicéto-l7alpha,21-dihydroy..l''..pré- gnadiène.
<Desc/Clms Page number 17>
On conduit la fermentation et l'identification du produit de la façon décrite à l'exemple 1, en utilisant le champignon Nocardia Corallina (ATCC 999) sauf que l'on utilise comme substrat le 3,20-dicéto-17alpha,21-dihydro-
EMI17.1
xy-4¯prégnèRe, et que le produit obtenu est le 3,20- di céto-l' alpha, 1-dihydroxyvl' '..prégnadiène .
EXEMPLE 11 Préparation du 3,20dicéto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy- A ' -prégnadiène .
On lave une culture de Nocardia caviae (ATCC 6Ô4Ô) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un fla- con Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures, à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de sub- strat, constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-tri-
EMI17.2
hydroxy-4¯prégnêne, dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation, et on retire des por- tions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7,23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises par 40 cm3 de chlorure de méthylène à chaque fois. On réunit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vi- de. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone et on analy- se un échantillon approprié par les techniques à bandes .de papier décrites plus haut. La chromatographie sur bande de papier indique la présence du 3,20-dicéto-llbêta,
EMI17.3
l7alpha, 21-trihydroxy-1' '-prégnadi,ène
<Desc/Clms Page number 18>
TEMPLE 12
EMI18.1
Préparation du 3,2U-dicéto-llbta,16a1pha,l7alpha,21-té- trahydroxy-1 f-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia caviae (ATCC 6848) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspension de cellu- les végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite les tubes sur une secoueuse rotative à 32 C pendant 40 heures, et au bout. de ce temps on ajoute, dans chaque tube, 2 mg de
EMI18.2
substrat constitué par du 3j20¯dicéto->llbêta,l6alpha, 17alpha,21-tétrahydroxy-/y-prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures supplémentaires d'incubation après l'ad- dition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur, et on concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu par 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mé- langes sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, puis on concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatographie des volumes appropriés des solutions résultantes. Les chromatogrammes montrent que le substrat s'est converti
EMI18.3
en 320-dicéto-llbtaJlbalpha,l7alpha,21-tétrahydroxy- /\"14-prégnadiène.
EXEMPLE 13 Préparation du 3,20-dicéto-l7alpha,21-dihydroxy-1,.- prégnadiène.
<Desc/Clms Page number 19>
On conduit une fermentation en utilisant le procédé et le mode dtidentification du produit décrits - à l'exemple 1, sauf que le champignon est le Nocardia sp..
(ATCC 12483), au lieu du Nocardia corallina, et que le
EMI19.1
substrat est le 3,20-d3céto-l'alpha,2ï-dihydroxy-,,,'-pré- gnène, au lieu du 3,20-dicéto-llbµta,17alpha,21-trihydro- xy-4¯prégnène.
EXEMPLE 14 Préparation du 3,20-dicéto-llalpha,l7alpha,21-trihydroxy'-
EMI19.2
/'\1,4--prégnadiène.
On conduit une expérience de fermentation en utilisant la méthode décrite à l'exemple 6, sauf que l'on
EMI19.3
utilise comme substrat le ,20-dicéto-llalpha=17a1pha, 21-trihydroxy-'-prégnène, au lieu du 20-dicétorllbêta l7alpha,21-trihydroxy.-'-prégnène. Le chromatogramme sur bande de papier indique la présence du 3,20-dicéto-llal- pha,17alpha,21-trihydroxy-A le4 -prégnadiène.
EXEMPLE 15 Préparation au 3,20-dicéto-llbêta,16alpha,17alpha,21-tê- trahydroxy- 34-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia convoluta (ATCC 4275) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube.à essais, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile, et on utilise 1 cm3 de la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, avant passage à l'autoclave (pH 6,75 après passage à l'autoclave), dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite le tube sur une secoueuse alternati- ve pendant 16 heures à 32 C. On utilise des portions de 1 cm3 de la culture obtenue pour inoculer cinq portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans des tubes de se- coueuse de 100 cm3.
On fait incuber ces tubes sur une
<Desc/Clms Page number 20>
secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps, on ajoute dans,chaque tube 2 mg de sub- strat constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,16alpha,17alpha,
EMI20.1
21-tétrahydroxy-'-prégnène dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes après des temps d'incubation supplémentaire de 1/2, 2, 7, 24 et 72 heures.
On extrait chacune des liqueurs fermentées, à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on les concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu par 2 cm3 de pyridine, et on ajou- te 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10 à 15 minutes puis on con- centre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et pn chromatographie des vo- lumes appropriés de solutions obtenues. Les chromatogram- mes montrent que le substrat s'est converti en 3,20-dicé-
EMI20.2
to-llbêta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy.ül'-prégnadiê.. ne.
EXEMPLE 16
EMI20.3
Préparation du 3 ,20-dicéto-llbêija,17alpha,21-trihydroxy- l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia convoluta (ATCC 4275) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un fla- con Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon¯sur une se- coueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incu- ber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à
<Desc/Clms Page number 21>
32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat
EMI21.1
constitué par du 3'20-dicéto-llbéta,l7alpha,21-trihydroxy- 4¯prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7,23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises avec 40 cm3 de chlorure de méthylène chaque fois. On réu- nit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vide.
On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié, par les techniques à bandes de pa- pier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de
EMI21.2
papier indiquent la présence du 3i20-dicéto-llbêta,17alpha, 21-trihydroxy.-l' '-prêgnadiène.
. EXEMPLE 17 Préparation du 3,20-dicéto-llalpha,17alpha,21-trihydroxy-
EMI21.3
Li.l,4¯prégnadiène.
On conduit une expérience similaire à l'exem- ple 14, sauf que l'on utilise le champignon Nocardia sp.
(ATCC 12483) dans la fermentation, au lieu du Nocardia co- rallina. Le produit obtenu, examiné par chromatographie sur bande de papier, est identique à celui de l'exemple ' 14.
EXEMPLE 18
EMI21.4
Préparation du 3,20¯dicéto-llbêta,l6alpha,17alphas21-tétra=- hydroxy-l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar en tube à essais, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile. On ajoute la suspension obtenue à 100 cm3 de bouillon de soja à la trypticase sans glycérol dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le mélange avec agitation à 32 C pendant 40 heures. On ajoute dans chaque flacon 20 mg de
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
3,20-dicéto-llbéta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy..Lf-prê- gnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol. On fait alors incuber les flacons avec agitation à 32 C pendant 8 1/2 heures.
Un réunit le contenu des flacons,'ce qui donne une liquoue à pH 7,3. Après récolte, on réunit les liqueurs et on ex- trait de la façon usuelle, et on obtient 352 mg de cris- taux bruts. La cristallisation dans un mélange acétone- éther de pétrole donne 145 mg, à point de fusion de 216- 218 C. La recristallisation dans un mélange acétone-éther de pétrole élève le point de fusion à 229-231 C. Le spec- tre infra-rouge est identique à celui d'un échantillon
EMI22.2
authentique de 3,20-dicëto-llbéta,l6alpha,l7alpha,21-té- trahydroxy-l,4¯prégnadiène.
EXEMPLE 1S Préparation du 3,20-dicéto-llbêtà,17alpha,21-trihydroxy- 1'f-prêgnadiène.
On lave une culture de! Nocardia globerula (ATCC 9356) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un fla- con Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une se- coueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incu- ber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat
EMI22.3
constitué par du 3,20-dicéto-llbê"ta,17alpha,21-trihydroxy- 4¯prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises,
<Desc/Clms Page number 23>
chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone et on ana- lyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-
EMI23.1
llbétal7alpha,21-trihyd-rox.y- '1''vp-rêgnadiène.
EXEJYjpLE 20 Préparation du 3,20-dicéto.llbta,l6alpha,lialpha,21-té-. trahydroxy-b 1,4 -prég-'
On lave une culture de Nocardia globerula (ATCC 9356) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspen- sion de cellules.végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite les tubes sur une secoueuse rotative pendant 40 heures . 23 C, et au bout de ce temps on ajoute, dans cha- que tube, 2 mg de substrat constitué par du 3,20-dicéto-
EMI23.2
llbcta9:6alphayl7alpha'21-tëtrahydroxywprégnêne, dis- sous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures d'incubation supplé- mentaire après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées, à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque.liqueur et on concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite. On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine et on ajou- te 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10 à 15 minutes,puis on con- centre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromatographie des vo-
<Desc/Clms Page number 24>
lumes appropriés de solutions obtenues. Les chromatogram- mes montrent que le substrat s'est converti en 3,20-dicé-
EMI24.1
to-llbta,l6alpha,l'?alpha,21-tétrahydroxp-.1'-prégna- diène.
EXEMPLE 21
EMI24.2
Préparation du 3,20-dicétorllbéta,16a1pha,l'alpha,21-té- trahydroxy-l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile et on utilise la sus- pension résultante pour inoculer 100 cm3 de milieu stéri- le n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On incube le mélange avec agitation pendante 7 1/2 heures à 37 C.
On utilise des portions de 1 cm3 de cette culture pour inoculer des portions de 10 cm3 du milieu stérile dans des tubes de 100 cm3. On fait incuber les tubes à 32 C pendant 40 heures, et au bout de ce temps on ajoute dans
EMI24.3
chaque tube 2 mg de l6alpha,21-diabétate-3,20-dicéto- llbêta,l7alpha-.dihydroxy-,f-prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol. On fait alors incuber les tubes pendant 24 heures. On extrait à quatre reprises le contenu d'un tu- be (10 cm3), avec chaque fois 40 cm3 de chlorure de méthy- lène. On réunit les extraits et on'concentre jusqu'à résidu sec sous pression. On reprend le résidu par 2 cm3 de pyridine et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ce mélange sur un cône à vapeur pendant 10-15 mi- nutes, puis on concentre jusqu'à résidu sec sous vide.
On dissout le résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromato- graphie un volume approprié de la solution obtenue. Le chromatogramme montre que le substrat s'est converti en
EMI24.4
3,20-dicéto-llbta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-,(ln' prégnadiène.
EXEMPLE 22 Préparation du 3, 20-dicéto-llbêta, lôalpha, 17alpha,21-tê-
<Desc/Clms Page number 25>
EMI25.1
trahydroxy-L it4-prégnadiène.
On conduit une expérience de fermentation com- me celle décrite à l'exemple 18, avec le Nocardia sp.
(ATCC 12483) au lieu du Nocardia corallina. Quand on es- saie le produit sur un chromatogramme sur bande de papier,
EMI25.2
on obtient du 3,20-dicéto-llbéta,l6alpha,l'(alpha,21-tétra- hYdroxy-l,4¯prégnadiène qui est identique au produit de l'exemple l.
EXEMPLE 23 Préparayion du 3,20-dicéto-llbêta,16alpha,17alpha,21-té-
EMI25.3
trahydroxY-Â 1,4 -prégnadi.ène.
On lave une culture de Nocardia polychromo- gènes (ATCC 3409) sur dextrose de pomme de terre et agar- agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution sali- ne stérile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la sus- pension de cellules végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3.' On agite les tubes sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures, et au bout de ce temps on ajoute dans chaque tube 2 mg de substrat constitué par du 3,20-dicé-
EMI25.4
to-llbéta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-'-prégnadiène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6,24 et 72 heures supplémentaires d'incubation après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermenté es à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure du méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mé- langes sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, puis
<Desc/Clms Page number 26>
on concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout; chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromatographie des volumes appropriés des solutions résultantes. Les chromatogrammes montrent que le substrat s'est converti
EMI26.1
en 3,20-dicéto-llbêta,l6alpha,17alpha,21-tétrahydroxy- l,4¯prégnadiène.
EXEMPLE 24 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- 124-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia polychromogè- nes (ATCC 3409) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise la suspension de cellules végétatibes obte-' nue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite ce flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture résultante pour inoculer une autre portion de 100 cm3 du milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heu- res à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de
EMI26.2
substrat, constitué par du 3,20-dicéto-llbùta,17alpha, 21-trihydroxy-/'-prégnène, dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On continue l'incubation et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à ban- de de papier décrites ci-dessus. Les chromatogrammes sur bandes de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-
EMI26.3
llbéta,17a1pha, 21-trihydroxy-,(l' '-prégnadiène.
<Desc/Clms Page number 27>
EXEMPLE 25 Préparation du 3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbêta,l6alpha,
EMI27.1
lidlpha,21-tétrahpdroxy-, '.-prégnadi:ne.
On lave uhe culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 7 cm3 d'une solution saline stérile et on utilise la suspension résultante pour inoculer 100 cm3 de milieu n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incu- ber ce mélange avec agitation à 37 C pendant 7 1/2 heures.
On utilise alors des portions de 1 cm3 de cette culture pour inoculer des portions de 10 cm3 du milieu stérile n 13 dans des tubes de fermentation de 100 cm3.On fait incuber les tubes inoculés pendant 40 heures Ó 32 C. Au bout de ce temps, on ajoute dans chaque tube 2 mg de
EMI27.2
3 , 20-dicéto-9alpha-f.uoro-llhéta, .balpha ,l7alpha., 21-té- trahydroxy-4¯prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol.
On fait incuber les tubes pendant 72 heures. Au bout de ce temps, on extrait à quatre reprises le contenu d'un tube, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène.
On réunit les extraits et on les concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 de pyridi- ne et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ce mélange sur un cône à vapeur pendant 10 à 15 minutes, puis on concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dis- sout le résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatogra-- phie un volume approprié de la solution obtenue. La chro- matographie donne des quantités importantes de 16,21-dia-
EMI27.3
céto-3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbêta,l6alpha,l7alpna-21- tétrahYdroxy-1,4¯prégnadiène. On voit ainsi que le 3,zo-dicétoa9alpha-.fluo-ra-llbéta.l6alpria,17a1hha, 21-étra hYdroxy-l,4¯prégnadiène s'est formé en quantités déca- lables pendant la fermentation.
<Desc/Clms Page number 28>
EXEMPLE 26
EMI28.1
Préparation du 1b,21-diacéto-3,20-dicéto9alpha-fluoro- llbêta-l6alpha,l7alpha,21-tstrahydroxy-.1'-.prégnadiène.
On utilise 7 cm3 de solution saline stérile pour laver une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar en tube à essais, et on utilise la suspension obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber le mélange pendant 8 heures à 37 C et on utilise des portions de 1 cm3 de cette culture pour inocu- ler des portions de 100 cm3 de milieu stérile dans 32 fla- cons de 500 cm3. On fait incuber ces flacons à 32 C pen- dant 40 heures, et au bout de ce temps on ajoute dans cha-
EMI28.2
que flacon 25 mg de 16,21-diacéto-3,20-dicéto-llbâta, lalpha,l7alpha,21-tétrahyaroxy-'-prégnène dissous dans 2,5 cm3 d'éthanol. On fait incuber les flacons pendant 53 heures. On réunit le contenu des flacons, et on ajou- te un volume égal d'acétone. On filtre la solution sur de la terre d'infusoires et on évapore l'acétone sous pression réduite. On sature de sel la phase aqueuse et on l'extrait à cinq reprises par des portions de 500 cm3 de n-butanol. On évapore l'extrait butanolique sous pres- sion réduite jusqu'à siccité.
On délaie le résidu avec environ 1 litre d'acétone bouillante pour séparer le rési- du organique d'avec les sels inorganiques, puis on filtre sur de la terre d'infusoires. On évapore l'acétone et on dissout le résidu dans la pyridine, puis on acétyle par l'anhydride acétique (à température ambiante pendant une nuit). On ajoute du méthanol et on évapore la solution sous pression réduite jusqu'à siccité (poids 1,17 g).. La chromatographie de partage (système solvant * 3 parties d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole à 90- 100 C, 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau) donne
<Desc/Clms Page number 29>
0,50 g de produit brut désiré qui est le 16,21-diacéto-
EMI29.1
3 , 2Wdicéto9a3.phafluoro-llbta, l6alpha, l."Iaâpha s 21--tétra- hydroxy-1,4¯prégnadiène.
Quand on cristallise le résidu dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, on ob- tient 341 mg, point de fusion 153-233 C avec ramollisse- ment préalable. La large gamme de point de fusion résulte probablement de la solvatation.
EXEMPLE 2?
EMI29.2
Préparation du 3 ,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- ,14-prégnadiènea
On lave une culture de Nocardia sylvodifera (ATCC 7372) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un fla- con Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heu- res à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de
EMI29.3
substrat constitué par du 3,2Q.-dicëi;o-l2bwta,l alpha , 21- trihydroxy-L-4prégnène, dissous dans 2 cm3 déthanol aqueux à 70%. On continue l'incubation et on en retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heu- res.
On extrait chaque portion à quatre reprises par 40 cm3 de chlorure de méthylène chaque fois. On réu- p-t les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cni3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à ban- de de papier décrite plus haut. Les chromatogrammes sur
<Desc/Clms Page number 30>
EMI30.1
bande de papier indiquent la présence de 3 ,20-dicéto-llbê- ta,l7alpha,21-trihydroxy-"l'-prégnadiène.
EXEMPLE 28 Préparation du 3$20-dicéto-galpha-fluoro-llbeta,16alpha, 17a1pha,21-tétrahydroxy.- ''-prégnadiène.
Dans une autre expérience de fermentation uti- lisant les conditions de l'exemple 1, avec le champignon Nocardia sp. (ATCC 12483) au lieu du champignon nocardia
EMI30.2
corallina, et avec le 3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbgta, l6alpha,17alpha,21-tétrahydroxy-'-prégnène au lieu du 3t20-dicéto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy-,'-prégnène le chromatogramme sur bande de papier indique la présence du 3,20-dicéto-galpha-fluoro-llbêta,lbalpha'l7alpha,21-tétra hydroXy-L11,4¯prégnadiène.
EXEMPLE 29 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- '
EMI30.3
1,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia astéroïdes, souche isolée A-3163 (ATCC 3308) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilisel 1 cm3 de la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans. un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce temps, on ajoute 2 mg de 3,20-di-
EMI30.4
céto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy..,j'-prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on continue la fermentation.
Quand on dose, par les méthodes à bande de papier décri- tes précédemment, des échantillons prélevés au bout de 2 à 24 heures sur la nouvelle fermentation, on constate la
EMI30.5
présence du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- l,4¯pradiène.
<Desc/Clms Page number 31>
EXEMPLE 30
EMI31.1
Préparation du 3,20dicéto-11'aétG.,l6alpha,¯7alpha,21-té- trahydroxy.- -prégnadiène.
On lave une culture de Nocarfia asteroides (ATCC 3308) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline sté- rile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspension de cellules végétatives résultante pour inoculer des por- tions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite les tubes sur une secoueuse alternative à 32 C pen- dant 40 heures, et au bout de ce temps, on ajoute dans chaque tube 2 mg de.substrat constitué par du 3,20-dicéto-
EMI31.2
ll.béta,16ü1pha,,'alpha,21-tétrGhydroxy--'-prégnène dis- sous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70% On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures supplémentaires d'in- cubation après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite. On reprend chaque résidu par 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, puis on con- centre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatographie des volumes appropriés des solutions résultantes. Les chro- matogrammes montrent que le substrat s'est converti en
EMI31.3
3,20-dicéto-llbèta,l6alpha,a7alpha,21-tétrahydroxy-1'"- prégnadiène.
EXEMPLE 31
EMI31.4
Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21¯trihydroxy- l,4...prégnadiène..
<Desc/Clms Page number 32>
On lave une culture de Nocardia astéroïdes, souche isolée n E-20(ATCC 3308) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspension résultante pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce
EMI32.1
temps, on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbéta,l7alpha-2ltri- hYdroxy-4¯prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on continue la fermentation. Quand on titre, par les mé- thodes à bande de papier décrites plus haut, des échantil- lons prélevés au bout de. 2-24 heures de nouvelle fermenta-
EMI32.2
tion,on constate la-présence de',20-dicéto-llbêta,17alpha, 21-trihydroxy 1'a'-prégnadiène.' EXEMPLE 32 Préparation du 3,2U-dicéto-llba,l'alpha,21-.trihydroxy- 41)4-prégnadiène.
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ,
On lave une culture de Nocardia farcinica (ATCC 3318) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de\cellules végétatives obte- nue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 50 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture résultante pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heu- res à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de
EMI32.3
substrat, constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,17alPha$21- trihydroxy-4¯prégnène, dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation, et on en retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, , 23 et 72 heures
<Desc/Clms Page number 33>
On extrait chaque portion à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à ban- de de papier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-
EMI33.1
llbèta,l7alpha,21-trihydroxy-1''-prégnadiêne.
EXEMPLE 33 Préparation du 3,20-dicéto-llbéta,l.7.lpha,2l-trihydroxy- /\ ' -prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia erthropolis, souche isolée A-ÔÔ45' (ATCC 4277) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspension résultante pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce
EMI33.2
temps, on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbéta,17alpha,21- trihYdroxy-4¯prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on continue la fermentation. Quand on titre,par les méthodes.à bande de papier décrites plus haut, des échan- tillons prélevés au bout de 2-24 heures de nouvelle fer-
EMI33.3
mentation, on constate la présence de 3,20-dicéto-llbgta, l7alpha, 21-.trihydroxy- jl' '-prégnadiène .
EXEMPLE 34 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia blackwelii (ATCC 6846) sur soja à la prypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obte--
<Desc/Clms Page number 34>
nue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de pilieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On incu- be ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat,
EMI34.1
constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy- /\ -prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 701o.
On continue l'incubation et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vide.
On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-llbêta,
EMI34.2
1?alpha, 21-trihydroxy-l''-prégnadiène .
EXEMPLE 35 'Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy-
EMI34.3
1,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia transvalensis, souche isolée E-42 (ATCC 12485) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspension résultante pour inocu- ler 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secou- euse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une se- coueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de
EMI34.4
ce temps, on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llb8ta,17-alpha, 21-trihydroxy-, -pregnene dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol
<Desc/Clms Page number 35>
et on continue la fermentation. Quand on titre, par les méthodes à bande de papier décrites plus haut, des échan- tillons prélevés après 2 à 24 heures de la nouvelle fermer'
EMI35.1
tation, on constate la présence de 3,20-dicéto-llb8ta) l7alpha, 21-trihydrdxy-al''-prégnadiène .
EXEMPLE 36 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,16alpha,17alpha,21-té- trahYdroxy¯l,4¯prégn8diène.
On lave une culture de Nocardia cuniculi (ATCC 6864) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile, et on utilise 1 cm3 de la suspension de cellules végétatives résultante pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7 avant passage à l'autoclave (pH 6,75 après passage à l'autoclave), dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite le tube sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C. On utilise des portions de 1 cm3 de la culture obtenue pour inoculer cinq portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans des tubes de secoueuse de 100 cm3.
On fait incuber ces tubes sur la secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute dans chaque tube 2 mg
EMI35.2
de substrat, constitué pat du 3,20-dicéto-llbâta,16alpha, 17alpha,21-tétrahydroxy-/\"-prégnène dans 0,2 cm3 d'étha- nol aqueux à 70%. On récolte les tubes après de nouveaux temps d'incubation dé 1/2, 2, 7, 24 et 72 heures.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on les concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mé- langes sur un cané à vapeur pendant 10-15 minutes puis on
<Desc/Clms Page number 36>
concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatographie des vo- lumes appropriés des solutions obtenues. Les chromato- grammes montrent que le substrat s'est converti en 3,20-
EMI36.1
dicéto-llbéta,lbalpha,l7alpha,21-tétrahydroxy 1''-prégna- diène.
EXEMPLE 37
EMI36.2
Préparation du 320-.dïcéto-llbéta,l'7alpha,21-trihydroxy. le4-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia kerstolyticus, souche isolée E-43 (ATCC 12484) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspens'on obtenue pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce
EMI36.3
temps, on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbéta, 17alpha, 21.-trihyàroxy-j'-prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'étha- nol, et on continue la fermentation. Quand on dose, par les méthodes à bande de papier décrites précédemment, des échantillons prélevés au bout de 2-24 heures de nouvelle fermentation, on constate la présence du 3,20-dicéto-
EMI36.4
lliéta,17 alpha , 21-trihydroxy-19 *-prégnad,ène .
EXEMPLE 38 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy-
EMI36.5
,4¯prégnadiène..
On lave une culture de Nocardia cuniculi (ATCC 6864) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obterue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une
<Desc/Clms Page number 37>
secoueuse alternative pendant 16 heures 4 32 C, ez sur bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de sub-
EMI37.1
strat constitué par du 3,20-dione-llbgta,17alpha.21-trihy- droxy-4¯prégnène, dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation, et on retire des portion de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les extraits et on les évaporb jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone et on analyse un échantillon approprié par la technique à bande de papier décrite plus haut. Les,chromatogrammes sur ban- de de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-llbêta,
EMI37.2
l7alpha,21-trihydroxy-1*-prégnadiène.
EXEMPLE 39 Préparation du 320-dïcéto-llbêta,l7 alpha,21-trihydroxy- A. ' -prégnadiène.
On lave une culture de Nocardie corallina, souche isolée n 13 (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspension résultante pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce temp on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- #4-prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol et on continue la fermentation. Quand on dose, par les méthodes à bande de papier décrites plus haut, des échantillons prélevés au bout de 2-24 heures de nouvelle fermentation, on consta-
<Desc/Clms Page number 38>
EMI38.1
te la présence du 3j20-âicéto-llbêta¯17alpha,21-trihydroxy- ' -prégnadiène.
EXEMPLE 40
EMI38.2
Préparation du 3'20-dicéto-llbéta,l'Ïalpha,21¯trihydroxy- Lil,4.prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia opaca (ATCC 4276) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à es- sais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cra3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueu-. se alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour ino- culer une autre portion de 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat, con- stitué par du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- #4-prégnène dissous dans 2 cm3 dtéthanol aqueux à 70%.
On continue l'intubation, et on en retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises par 40 cm3 de chlorure de méthylène chaque fois. On réunit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprie par les techniques à bande de pa- pier décrites ci-dessus. Les chromatogrammes sur bande
EMI38.3
de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-llbgta, l7alpha, 21-tr ihydroxy..l' '¯prégnadiène .
EXEMPLE 41 Préparation du 3,20-dicéto-Ilbêta,17alpha,21-trihydroxy- l,4¯prégadiène..
On lave une culture de Nocardia corallina,
<Desc/Clms Page number 39>
souche isolée 228 (ATCC 4273) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de suspension obtenue pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alterna- tive à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce temps, on
EMI39.1
ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbgta,17alpha-21-trihydroxy- #4-prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on conti- nue la fermentation. Quand on dose, par les méthodes à bande de papier décrites plus haut, des échantillons préle- vés au bout de 2-24 heures de fermentation supplémentaire on constate la présence du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-'
EMI39.2
trihydroxy-A,le4-prégnadiène.
EXEMPLE 42 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,l6alpha,17alpha,21-tétra- hydroxy-l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia sylvodifera (ATCC 4919) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspen- sion de cellules végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On
EMI39.3
agite les tubes sur une secoueuseàlternative à 32 C pen- dant 40 heures, et au bout de ce temps, on ajoute dans cha- que tube 2 mg de substrat constitué par du 3,20-dicéto-
EMI39.4
llbgta,lb alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-*-prégnène dis- sous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures supplémentaires d'in- cubation après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3/de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on
<Desc/Clms Page number 40>
les concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mé- langes sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, puis on concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout cha- que résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromatographie des volumes appropriés des solutions obtenues. Les chromato- grammes montrent que le substrat s'est converti en 3,20-
EMI40.1
dicéto-llbéta-lbalpha'.7alphü,21-tétrahydroxy-fl'.-pré- . gnadiène.
EXEMPLE 43
EMI40.2
Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,lôalpha,17alpha,21-té- trahYdrQxy¯l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen d'une solution saline stérile. On utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer un flacon
Erlenmeyer de 500 cm3 contenant 100 cm3 de milieu stéri- le n 13. On place ce flacon sur une secoueuse alternati- ve à 37 C pendant 7 1/2 heures. On utilise 1 cm3 de la culture obtenue pour inoculer chacun des cinq tubes de secoueuse de 100 cm3 contenant 10 cm3 de milieu stérile n 13., On fait incuber les tubes sur une secoueuse alter- native à 32 C pendant 40 heures, et au bout ce ce temps,
EMI40.3
on ajoute dans chaque tube mg de I6,21-diacéto-3j20-dicê¯ to,llbéta,lô.alpha,l7r.pha,2l.-têtrahydroxy- -.prégtènps dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol.
On récolte les tubes après 2,7 1/2, 24, 48 et 72 heures de plu s. Les titrages, sur bande de paoier, des liqueure de fermentation extrai- tes indiquent qu'une quantité appréciable de la matière
EMI40.4
première s'est transformée en 3,20-dicéto-llbµta,l6alpha, 1.'ala-2ltêtrahydroxyw'!'-prégnadi.ène.
<Desc/Clms Page number 41>
EXEMPLE 44
EMI41.1
Préparation du 3,20-dicéto-llbgta,16alpha,17alpha,21-té- trahYdroxy1,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Corynebacterium simplex sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 d'eau stérile, et on utilise la suspen- sion de cellules obtenue pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase dans-un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber ce mélange avec agitation à 37 C pendant.8 heures. On prend 25 flacons Erlenmeyer de 500 cm3, contenant chacun 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase, sans glycérol, et on les inocule chacune avec 1 cm3 de l'inoculum vieux de 8 heures. On fait incuber ces flacons à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce temps, on ajoute dans chaque flacon 40 mg de
EMI41.2
3,20-dicéto-llbêta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-'- prégnène dissous dans 4 cm3 d'éthanol, et on continue la fermentation pendant 8 heures à 32 C.
On réunit le con- tenu des vingt-cinq flacons, et on obtient une liqueur à pH 8,1.
On réunit les liqueurs après récolte, on ex- trait une fois avec 3 litres de chlorure de méthylène et trois fois avec deux litres chaque fois de chlorure de méthylène. On lave une fois l'extrait réuni avec une so- lution saline saturée, et on évapore jusqu'à siccité sous pression réduite. On obtient 509 mg de résidu huileux, on le dissout dans 1,5 cm3 de la phase stationnaire du système, 3 parties d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole (90-100 C), 3 parties de méthanol, 2 parties d'eau, et on mélange avec 3 g de terre d'infusoires.' On entasse alors cette terre d'infusoires imprégnée en haut d'une colonne de verre de 1,5 x 35 cm contenant 25 g de terre d'infusoires imprégnée de 12,5 cm3 de la phase sta- tionnaire du système ci-dessus.
On élue le composé dési-
<Desc/Clms Page number 42>
ré avec la phase mobile du système ci-dessus, et on obtient 207 g de solide brut. On cristallise celui-ci:dans un mé- lange d'acétone et d'éther de pétrole(60-7000) pour obte- . nir 56 mg de produit à point de fusion de 195-200 C (bloc Kofler). La recristallisation dans le même couple de sol- vants élève le point de fusion à 202-205 C (bloc); point de fusion (par méthode capillaire) 229-231 C. Spectre ultra-violet :
EMI42.1
A max. 241 m /"# ( r 14 500). Spectre :infra-rouge: Max 34l2, 1718e 1667, 1622, 1612 (palier), 1098, 1072 cm"1.
Analyse : Calculée pour G2lH2,0 (375,.t.j ë CB¯ 67.00%:
21-28 H= 7,50% Effective :c- 66,80%;
H-7,62%.
Les propriétés physiques et chimiques du com-
EMI42.2
posé sont celles du 320-dicéto-<llbêta,l6alpha;17alpha 21-tétrahydroxy-,1 "-prégnadiène .
EXEMPLE 45 Préparation du 3920-dicétollbéta,lbalphaal7alpha,2lté trahydroxy-als4-pré,-nadiène.
On réunit les liqueurs provenant dfune fermen- tation comme celle décrite à l'exemple 1, ci-dessus, après récolte, et on extrait par 7 portions de 2 litres de chlo- rure de méthylène, et on évapore les extraits réunis jus- qu'à siccité sous pression réduite. On obtient 1,585 g d'un semi-solide brut que l'on chromatographie. On réunit les fractions contenant le composé désiré, et on les évapo- re jusqu'à siccité pour donner 601 mg de résidu cristal- lin. La cristallisation dans l'acétone et l'éther de pé- trole donne 278 mg de produit à point de fusion de 229- 231 C. La recristallisation dans le même couple de sol- vants élève le point de fusion à 231 - 2320 C.[d ] D24
<Desc/Clms Page number 43>
+ 77 C (méthanol).
Spectre ultra-violet
EMI43.1
À 1 éthanol 241-242 mp ( (- 14. 800). Spectre infra-rouge: Max . 3436, l715, 1664, 162le 1603e 1129, 1063 cm-la Analyse: Calculée pour C21H2$06(376,1.) ; C=67,00%; Bzz,5%; Effective C=66,82%; H=7,27.
Le produit est identique à un échantillon de
EMI43.2
3 , 20-dicéto-llbéta, l6alpha,1'7alpha, 21-tétrahydrocy-Ol '- prégnadiène obtenu comme dans 'l'exemple 1.
EXEMPLE 46
EMI43.3
16,21-diacéto-20-dicéto--llbéta,l,6alpha,l7alpha,21-tétra..
########################################## hYdroxy-1,4¯prégnadiène.
On laisse reposer une nuit, à la température ambiante, un mélange de 100 mg de 3,20-dicéto-llbêta,
EMI43.4
l6alpha,l'7alpha-21-tétrahydroxy-,l''-prgnadiène dans 10 cm3 de pyridine contenant 2 cm3 d'anhydride ecétique, après quoi on évapore la solution jusqu'à siccité sous pression réduite. On cristallise le résidu solide dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole (90-100 C), et on obtient 105 mg (86%) de l6,21-diacéto-3,20-dicé-
EMI43.5
to-llbêta,16alpha,17alpha,21-tétrahydroxy-/\ 1,4-pr6gnadiù- ne, à point de fusion de 147-1500C. La recristallisation dans le même couple de solvants élève le point de fusion à 161-163 C. Spectre infra-rouge :
EMI43.6
Y KBr : 3456, 175S 1668, 1632, 1612 (palier) 1234, 1060 cm-1.
Spectre ultra-violet : \ max : 242 m/u éthanol ( 14 200) éthanol EXEMPLE 42
EMI43.7
Préparation du 16,21-diacëto-,20-..dxcéto-.9alpha-.fluaro.. llbèta,l6alpha,l7alpha,21-tû'trahydroxy- ''-prégnadiène.
On lave une culture sur agar-agar en tube à
<Desc/Clms Page number 44>
essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, on obtient une suspension de spores de Ccrynebacterium sim- plex, que l'on ajoute à 100 cm3 de bouillon stérile de so- ja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber le mélange à 32 C pendant 8 heures. On utilise 1 cm3 de cette culture pour inoculer chacun des dix flacons contenant chacun 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase. On fait incuber les dix flacons avec agitation à 32 C pendant 16 heures. On ajoute dans
EMI44.1
chaque flacon 20 mg de l6,21-diacétob3,20-dicéto-9alpha- fl.uoro-llbéta al6alpha l'alph.a, 21.--tétrah ydroxy-d-prégnêr ne, dissous dans 2 cm3 d'éthanol, et on réunit le contenu des flacons. On extrait la solution global lusieurs reprises par un grand volume de chlorure de méthylène, on lave avec une solution saline saturée, et on évapore sous pression réduite.
On dissout le résidu dans le mé- thanol, on traite par le charbon activé, on filtre sur de la terre d'infusoires, et on évapore à nouveau pour don- ner 277 mg d'huile, qu'on acétyle pendant une nuit. La chromatographie, sur bande de papier indique des quantités approximativement égales de substrat et d'un produit plus
EMI44.2
polaira16,21-diaaéto-3,20-dicéto9a3.phafluorollbta l6alpha,17alpha,21-tétrahydroxy-l,4¯prègnadiène), ainsi que de très petites quantités de deux produit moins polai- res. Par chromatographie de partage de 0,25 g du résidu (colonne de terre d'infusoires) système : 2 parties d'acé- tate d'éthyle, 3 parties d'éther de pétrole (90-100 C), 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau), on sépare les produits moins polaires et le substrat.
Le produit dési- ré, à polarité maxima, reste sur la colonne et on l'élue avec '500 cm3 de méthanol. On prend le résidu (90 mg) obtenu par évaporation du méthanol, t on le répartit à nouveau sur de la terre d'infusoires (système : 3 parties
<Desc/Clms Page number 45>
d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole (90-100 C), 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau), et on éva- pore sous pression réduite la fraction contenant le pro- duit désiré (déterminé par spectre d'absorption d'ultra- violet), pour donner 1$ mg de solide.
La cristallisation dans un mélange acétone-éther de pétrole donne 13 mg d'aiguilles incolores de 16,21-diacéto-3,20-dicéto-9alpha-
EMI45.1
fluoro-llbêta,lôalpha-l7alpha,21-tétrahydroxy-U,1'-pré- gnadmène; point de fusion (bloc K/Fler) :;environ 150-240 C, avec perte apparente de solvant à 150 C. La recristalli- sation dans l'acétone et l'éther de pétrole ne change pas le point de fusion. Spectre ultra-violet :
EMI45.2
Max. mu ( 15 200); spectre dans l'acide ale.abs.' 239 miu ( (¯ 20?); spectre dans l'acide sulfurique : /\ ma** 26l, 30$i 387 mil.
On prépare le H2SO4 2,4-bis-dinitrophénylhydrazone du,composé ci-dessus, et on
EMI45.3
détermine son spectre d'absorption''d'ultra-violet : A max. 258) 300 (inflexion), 312 (inflexion), et 400 m/u.
EXEMPLE 48
EMI45.4
3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbêta,l6alpha,17alpha,21-té- trahydroxy-1,4¯prégnadiène.
On dissout 100 mg de 16,21-diacéto-3,20-dicéto 9alpha-fluoro-llbéta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-1'. prégnadiène dans 10 cm3 de méthanol et on refroidit à 0 C.
Après balayage à l'azote, on ajoute, à la solution de stéroide, une solution de 35 mg de potasse dans 2 cm3 de méthanol .
On laisse reposer 1 heure à la température ambiante) puis on neutralise la solution, et l'on éva l'acide acétique glacial sous atmosphère d'azote jusqu-:
<Desc/Clms Page number 46>
obtention d'un solide blanc. On ajoute de l'eau, et après refroidissement on filtre le produit et on le lave à l'eau
EMI46.1
pour obtenir 52 mg de 3,20-diceto-,9alpha-fl.iioro-llbêta, l6alpha,l7alph,2ltétra.ydrox5r-,,1''prégnadi.ëne, point de fusion 246-249 C. Trois cristallisations dans le mé- lange acétone-éther de pétrole donnent 29 mg de tétrol, point de fusion 260-262,5 Analyse :
EMI46.2
Calculé pour CZIH2706F : c= 63,94; H= 6,90%; F- 4,82%; Effective C= 6., 19; H= 717%; F= 4,90
REVENDICATIONS 1.
Nouveaux stéroides de la série du #1,4-prégna- diène ayant la formule générale suivante :
EMI46.3
dans laquelle X est un atome d'hydfogène ou d'halogène, Y est un groupe méthylène, hydrcxyméthylène ou carbonyle,
EMI46.4
Z est un groupe méthylène, hydroxyméthylène ou alkyloxy- méthylène inférieur, R' est un atome d'hydrogène ou un
EMI46.5
groupe hydroxyle et R est un atome ü s n frûr: ;c ou un
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.