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"Production d'un vaccin contre la rage"
La présente invention concerne un procédé de production d'un vaccin contre la rage et les vaccins produits par ce procède.
Les vaccins utilisés pour l'immunisation des chiens contre la rage sont produits couramment en partant d'un virus adapté à et mis à croître dans des oeufs embryonnaires de volaille. Ce procédé est handicapé par la difficulté de la sépa- ration du virus désiré à partir des composants des oeufs, et les
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vaccins produits par ce procédé conservent habituellement une proportion élevée de protéines de volaille, qui provoquent sou- vent des effets secondaires indésirables. En outre, il est dif- ficile d'enlever les souillures, telles que d'autres virus ou des organismes du type pleuro-pneumonie, à partir des virus pro- pages en passant par des oeufs.
Bien que le procédé de propaga- tion en passant par des oeufs présente des avantages par rapport à des méthodes plus anciennes utilisant des tissus nerveux vi- vants d'animaux, il n'est pas économique et le produit qui en résulte présente de nombreuses caractéristiques désavantageuses,
On a maintenant trouvé qu'il est possible de pro- duire plus économiquement un vaccin contre la rage à base de virus vivants, qui est pratiquement exempt d'effets secondaires provoques par la présence excessive de protéines ou de tissus nerveux, et ce grâce à un procède qui comprend la propagation ou la croissance d'un virus de la rage adapté aux volailles ou aux oeufs de volailles, en présence de cellules embryonnaires de volaille, avec ensuite la récolte du virus.
Les avantages de la présente invention peuvent être atteints si au moins la der- nière phase de propagation est mise en oeuvre, tandis que len cellules embryonnaires de volaille sont maintenues dans un milieu d'entretien synthétique, exempt de protéines. Un avantage impor- tant de la présente invention est que le procédé proposé permet la récolte du virus par des processus courants simples, tels qu' une congélation et une décongélation, suivies par une séparation d'une suspension du virus à partir des débris cellulaires, ce qui évite ainsi les techniques fastidieuses nécessaires pour produire des vaccins à partir de cultures sur oeufs.
On a en outre trouvé, suivant la présente inven- tion, qu'il est possible de réduire sensiblement la quantité de virus contaminants et d'autres organismes dans les vaccins, en employant dans le procédé précité de l'invention, un virus de la
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rage qui a été soumis à un ou plusieurs passages de dilution dans une culture embryonnaire de volaille, dans un milieu d'en- tretien synthétique, exempt de protéines.
Dans la mise en oeuvre de l'invention, le virus de la rage vivant adapté est propagé dans des cultures de tissu de cellules embryonnaires de volaille. Une méthode de prépara- tion de ces cultures de tissu consiste à hacher et à disperser des embryons de volaille vieux de 7 à 10 jours, pour obtenir une dispersion de cellules embryonnaires de volaille. La disper- sion est alors placée dans des récipients de culture avec un milieu non cultive capable de supporter la croissance et une série des cellules, et on maintient sous des conditions de crois- sance.
Lorsqu'on obtient une bonne croissance à mono-couche des cellules embryonnaires, on peut introduire un inoculum du virus de la rage dans la culture de tijsu. Lorsqu'on opère de cette manière, le milieu de croissance est remplacé par le milieu d' entretien synthétique pour la dernière phase de propagation.
Ou bien, lorsqu'on obtient une bonne croissance à. mono-couche de cellules embryonnaires de volaille, le milieu de croissance peut être décante et le milieu d'entretien synthétique peut être ajoute, avant ou après l'introduction d'un inoculum d'un virus vivant de la rage.
Il est essentiel que le virus de la rage employé dans le procédé de l'invention ne soit pas une souche en circu- lation mais plutôt un virus adapté ou modifié. Une telle adapta- tion ou modification peut être réalisée, par exemple, par une multiplicité de passages successifs par inoculation intracéré- brale sur des volailles. Cependant, on préfère employer un virus de la rage qui a été ainsi modifié et qui a été en outre adapté ou modifia par une série de passages successifs dans des oeufs embryonnaires.
Comme signale précédemment, un vaccin pratiquement
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111'1 moto d T't....it1""'et'H: exempt de virus formant souillures et. d'autres organismes peut être produit suivant la présente inven- tion si le virus de la rage employé a été soumis à un ou plu- sieurs passages de dilution. Dans une telle technique, le virus récolté est dilué et ensuite propagé dans une culture embryon- naire de volaille, dans un milieu d'entretien synthétique exempt de protéines. Pour assurer un degré élevé de purification, il est désirable de répéter ces passages de dilution au moins 3 fois, de préférence au moins 10 fois.
Cette technique à passages de dilution peut être mise en oeuvre de manière très efficace pour atteindre un degré élevé de purification, par dilution d' abord du virus récolte au cours de 10 phases successives, avec ensuite l'inoculation d'une portion de chaque dilution de ce genre dans un tissu cellulaire embryonnaire de volaille, et uti- lisation du virus provenant de la croissance montrant l'inoeu- lum le plus dilué, pour d'autres passages en série ou pour la production du vaccin. Pour la facilité, cette dernière technique à passages est désignée ici par "passage à dilution limitative".
Un excellente croissance du virus de la rage est généralement observée lorsque la propagation dans la dernière phase de propagation ou dans les passages de dilution est réa- lisée à une température de 34 à 37 C., bien que l'on préfère employer une température d'environ 35 C. La période de temps nécessaire pour réaliser une multiplication satisfaisante du virus variera évidemment suivant les conditions sous lesquelles les cellules embryonnaires sont maintenues. Généralement, on peut obtenir une prolifération avantageuse en 4 à 14 jours, bien qu'il soit préférable de récolter le virus après 7 à 9 jours.
La multiplication du virus de La rage dans une culture de tissu de cellules embryonnaires de volaille n'est ha- bituellement pas mise en évidence par un effét cytopathologique observable quelconque sur les cellules. La croissance du virus
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peut être démontrée par l'inoculation intracérébrale sur de souris de dilutions en série du fluide provenant des tubes de culture, avec ensuite une incubation du virus.
Dans un mode opératoire préféré, les cultures de tissu embryonnaire de volaille sont préparées en hachant des embryons de volaille après enlèvement des yeux, et en dispersant ensuite les cellules par trypsinisation. Des parties de la sus pension résultante de cellules sont placées dans des récipients de culture avec un milieu nutritif convenable, par exemple une solution d'hydrolysat de lactalbumine dans une solution de sel basique de Earle fortifiée par un sérum animal, par exemple un sérum de veau non activé et contenant des antibiotiques convena- bles pour supprimer la contamination bactérienne.
Lorsqu'on a ainsi obtenu une bonne croissance mono-couche de cellules de tissu embryonnaire de volaille, le milieu nutritif est décanté et la couche de cellules de la culture est humidifiée par un inoeulum de la souche Flury adaptée sur oeufs du virus de la rage.
La souche de Flury dont il est question ici est une souche en circulation modifiée par 138 passager successifs par inoculation intracérébrale sur des volailles. Dans de telles opérations, il est désirable d'obtenir de bons rendements du virus propagé pour contrôler la concentration du virus et/ou la matière issue des oeufs dans l'inoculum. On a obtenu de bons résultats lorsqu'on utilise un inoculum consistant en une suspension d'environ 1% de la matière embryonnaire provenant d'une culture active de la souche de Flury du virus de la rage dans des oeufs embryonnaires.
Dans le mode opératoire préféré de l'invention, après l'humidification de la couche cellulaire embryonnaire avec la suspension du virus actif, les récipients de culture sont fer- més et maintenu.-, fixes pendant une période de temps propre à fa- voriser l'absorption du virus par les cellules. Ensuite, un mi- lieu d'entretien synthétique, tel que le milieu 199 de Morgan,
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Morton et Parker, ou le milieu basique de Eagle, est ajouté dans la récipient de culture inoculé, et les récipients nont maintenus une température d'environ 35 pendant une période d'environ 4 à 14 jours, de préférence pendant environ 7 à 9 jours, pour réaliser la multiplication du virus.
Les passages ultérieurs du virus propagé résultant peuvent être réalises par la technique d'adsorption décrite ici ou par introduction d'une petite quan- tité de virus récolté provenant d'un passage précédent, dans le tube de culture. L'expression "milieu d'entretien synthétique, exempt de protéines", tel qu'utilisé ici, se réfère à un milieu composé d'amino-acides essentiel$, de purines, de sucres, de vita- mines et de sels inorganiques capables de maintenir les cellules cultivées en condition pour une multiplication du virus, sans additifs, fuis qu'un sérum ou d'autres matières protéiques obte- nues d'animaux vivants, en une quantité telle que leur présence se manifeste lors de l'injection des vaccins.
Four la préparation des vaccins, le virus produit par le passage en série dans une culture de tissu embryonnaire de volaille, peut être récolté de toute manière convenable quel- conque. Suivant une méthode opératoire préférée, le milieu d' entretien contenant une portion du virus produit est décanté de la culture de tissu environ 7 jours après l'inoculation de cette culture par le virus. Après la décantation, un volume égal d'un agent de stabilisation convenable pour vaccin, tel qu'un hydro- lysat de caséine, un mélange de sucre et d'amino-acides, une solution tamponnée de sucre, etc., est introduit dans le récipient de culture et le contenu de celui-ci est alors congelé et décon- gelé pour rompre les cellules de tissu et en libérer le virus.
Le fluide de stabilisation est alors décante, assemblé à la pre- mière récolte du milieu d'entretien et centrifugé pour enlever les débris cellulaires et produite un vaccin. Ce dernier peut alors être titré pour examiner sa puissance et vérifié en ce qui
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concerne sa pureté, et ce de manière courante. Si on le désire, un tel vaccin peut être emmagasiné directement à basse tempéra- ture ou bien il peut être conservé dans des récipients scellés après un séchage par congélation.
Suivant un exemple de mise en oeuvre du procédé de l'invention, un virus adapté aux oeufs de la souche de Flury, qui est caractérise comme ayant été modifié à partir du virus en circulation isolé par 138 passages successifs par inoculation intracérébrale sur des volailles, avec ensuite 64 passages dans (les oeufs embryonnaires, est inoculé dans des cultures de tissu de cellules embryonnaires de volaille. Les cultures de tissu sont des cultures en mono-couche, mises à croître dans des ré- cipients de culture en verre. La matière de culture est préparée de la façon suivante.
Des embryons de volaille de 7 à 10 jours sont finement découpés sous des conditions aseptiques, après enlève- ment des yeux, et le tissu hache résultant est lavé avec une solution saline tamponnée au phosphate. Le tissu lavé est try- sinisé de la façon courante avec agitation par un dispositif d' agitation magnétique. Le tissu trypsinisé est centrifugé à 1000 tours par minute pendant 3 minutes et les cellules concentrées résultantes sont mises en suspension dans un milieu nutritif pour procurer environ 500.000 à 600.000 cellules par millilitre.
Le milieu nutritif est préparé à partir de la solution de sel basique de Earle, comprenant 6,8 grammes de chlorure de sodium, 0,4 gramme de chlorure de potassium, 0,2gramme de chlorure de calcium, 0,2eramme de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,125 ranime de phosphate acide mono@odique monohydraté, 1 gramme de glucose, 2,2 erammes de bicarbonate de sodium, et 0,02 gramme de rouge de: phénol, en dissolution dans de l'eau distillée, pour former 1000 millilitres de la solution achevée. Ce milieu nutri- tif a la composition suivante :
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<tb> Ingrédient* <SEP> 7.
<tb>
<tb>
Solution <SEP> de <SEP> sel <SEP> basique <SEP> de <SEP> Earle <SEP> (EBSS) <SEP> 85
<tb>
<tb> Solution <SEP> à <SEP> 5% <SEP> d'hydrolysat <SEP> de <SEP> lactalbumine
<tb> dans <SEP> EBSS <SEP> sans <SEP> bicarbonate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 10
<tb>
<tb> Sérum <SEP> de <SEP> veau <SEP> inactivé <SEP> 5
<tb>
Le milieu nutritif contient en outre 200 unités de pénicilline et 200 microgrammes de streptomycine par milli- litre.
Des portions d' un millilitre de la suspension de cellules embryonnaires ci-dessus sont placées dans des tubes stériles et maintenues à une température d'environ 35 C. pendant 24 à 48 heures, jusqu'à obtention d'une bonne croissance du tissu. On utilise paiement un processus similaire pour produire de plus grandes fournies par incubation de 60 à 70 millilitres de la suspension cellulaire dans des flacons de culture. Après la période initiale d'incubation pour les cellules embryonnaires, le milieu nutritif est drainé à partir des couches cellulaires, et ces dernières sont lavées par un milieu d'entretien synthé- tique, à savoir le milieu 199 de Morgan et Consorts (Proc. Soc.
Expérimental Biology and Medicine, 1950, 73, pages 1-8), avec un complément de 200 unités de pénicilline et de 200 microgram- mes de stptomycine par millilitre. Le milieu de lavage est drai- né des couches cellulaires du tissu cultivé, et on ajoute, avec une répartition de manière à assurer le contact avec la couche cellulaire, 0,2millilitre d'une suspension aqueuse de 1% de matière embryonnaire provenant d'oeufs embryonnaires, dans la- quelle la souche de Flury du virus de la rage a été propagée.
Ce virus a un titre de 106,3 doses léthales sur souris par 0,2 millilitre, comme on l'a déterminé par une inoculation intracé- rébrale sur des souris. Le tube de culture et son contenu sont maintenus à 35 C. pendant 1 heure, les tubes étant maintenus en position fixe, de telle sorte que l'inoculum recouvre la couche
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ou feuille cellulaire. A la fin de cette période d'adsorption, on ajoute 2 millilitres de Milieu 199 à la culture, et on place le tube et son contenu dans un tambour rotatif de manière a les soumettre à une agitation lente par rotation pendant 7 jours à une température de 35 C.
La septième jour après l'inoculation précédente du tissu de culture par le virus aux oeufs, le milieu de culture est congelé et décongelé pour libérer le virus intracellulaire, et le mélange résultant est centrifugé pour séparer les débris cellulaires. On emploie 0,2millilitre du liquide surnageant pro- venant du liquide centrifugé à titre d'inoculum dans des tubes frais du tissu cultivé comme précédemment. Après adsorption du virus de la manière précédente, l'incubation est réalisée pendant 7 jours à 35 C. comme précédemment.
Après six passages de ce gen- re, des passages ultérieurs sont réalisés en inoculant 0,2 milli- litre du fluide contenant le virus et surnageant provenant du passage immédiatement précédent, dans une culture fraîche, lavée de tissu contenant 2 millilitres du milieu d'entretien. Après 4 passages supplémentaires de ce genre, le liquide surnageant provenant de la culture, après congélation et décongélation, est titré par inoculation intracérébrale sur des souris et on a trou- vé qu'il présente un titre de 10-4,2 par 0,03 millilitre. Ce taux de passage représente un facteur de dilution de 10-10,7 à partir du virus de départ.
En commençant au 14ème passage, une série de pas- sages de purification, à dilution limitative, sont réalisés de la façon suivante. Le virus du 14ème passage est dilué dans 10 phases successives et inoculé en des quantités de 0,2 millilitre dans des cultures embryonnaires de volaille. Au bout de 7 jours, les cultures inoculées avec 10-1 et 10-2 dilutions sont récoltées par congélation et décongélation de la feuille cellulaire en vue de rompre les cellules. Dix jours après l'inoculation, les cultu-
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res inoculées avec 10-3 et 10-4 dilutions sont récoltées d'une manière semblable. Toutes les récoltes sont vérifiées sur des souris pour ce qui concerne le vaccin.
Les cultures montrant la croissance d'un virus infectant les souris, provenant de l'ino- culum le plus dilué, sont utilisées comme semences qui sont di- luées en série et passées dans des cultures de tissu embryonnai- re de volaille comme précédemment. Après huit passages de puri- fication à dilution limitative de ce genre, ce qui représente un facteurde dilution de 10 ' à partir de l'inoculum initial, le virus récolté de ce huitième passage a un titre de 10-4,5 par 0,03 millilitre, ou une augmentation de 1045,5 dans le vi- rus par rapport à la matière de départ. Dix passages à dilution limitative de ce genre sont réalisés pour assurer que le pro- duit final est exempt de virus qui le souillent et d'autres micro-organismes.
Des bouteilles préparées en parant d'un tissu embryonnaire de volaille trypsinisé sont utilisées pour de plus grandes quantités de virus. Des bouteilles qui sont inoculées par adsorption d'un mélange de 1 millilitre d'une suspension de virus provenant d'un passage précédent et de 9 millilitres de Milieu 199 sur la feuille cellulaire pendant 1 heure à 35 C.
Ensuite, on ajoute 90 millilitres de Milieu 199 et les bouteil- les sont incubées à l'état fixe. Dix jours après l'inoculation, le fluide surnageant infectieux est enlevé et une quantité éga- le d'un agent de stabilisation convenable est ajoutée à la feuil- le cellulaire qui est alors rompue par congélation et décongela- @ tion. Les débris cellulaires et l'agent de stabilisation sont combinés au fluide surnageant et centrifugés pour enlever les débris cellulaires en vue de préparer le vaccin final.
D'autres milieux d'entretien synthétique, tels que le milieu synthétique de Parker et Healy N 858 ou le milieu de Eagle, peuvent être employas dans le processus précédent, au
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lieu du milieu 199, et ce suivant les désirs.
Les virus récoltes des 4ème, Sème, 6ème et 7ème passages de la culture de tissu sont assembles et employés comme vaccin pour une injection intramusculaire sur des chiens. On a trouve que ce vaccin assemblé a un titre de 104,3 doses léthales à 50 sur souris (MLD50) par millilitre. Une dose d'un millilitre de ce vaccin est injectée â cinq chiens et six chiens similaires sont prévus comme témoins non inoculés. Environ 8 semaines après l'inoculation, tous les chions sont excites par injection d'une suspension d'un virus de la rage virulent. Tous les chiens- inocu- les survivaient en bon état, tandis que tous les chiens témoins non inoculas mouraient.
Four démontrer la puissance améliorée des vaccins prépares suivant l'invention, spécialement après la purification rar la technique à dilution limitative, des cobayes sont inoculés par voie intramusculaire avec les vaccins de la façon suivante : 1. Suspension du virus provenant d'une culture de tissu embryon- @ maire de volaille (TC) avant purification à dilution limitative., 2, Suspension de virus provenant d'une culture de tissu embryon- @ naire de volaille aprs 10 passages à dilution limitative.
Une portion de chaque vaccin est diluée en série pour donner des dilutions de 10-1, 10-2,10-3 et 10-4, par rap- port au vaccin non dilué. Des groupes de cobayes sont inoculés @ avec chacun des vaccins décrits ci-dessus. Chaque cobaye reçoit une injection de' 0,25 millilitre de l'un des vaccins ou de leurs @ dilutions par voie intramusculaire. D'autres groupes de cobayes semblables sont maintenus sans inoculation pour servir de témoins.
Vingt et un jours âpres inoculation, tous les cobayes étaient excités par une injection d'un virus en circulation virulent, en employant une injection intramusculaire d'une quantité de ce virus i permettant de provequer au moins 80% de mortalité pour les cobayes non vaccines. Les cobayes étaient ensuite maintenus en surveillance '
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pour observer les lignes de paralysie. Parmi le nombre des cobayes protégés avec chaque dilution de vaccin utilisée, le point final de protection à sa!. pour chaque vaccin est calculé par des métho- des courantes. Les résultats sont résumes au Tableau suivant .
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Doses <SEP> (MLD50) <SEP> sur <SEP> souris
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Numéro <SEP> du <SEP> vaccin <SEP> Source <SEP> requises <SEP> pour <SEP> protéger <SEP> 50%
<tb>
<tb>
<tb> des <SEP> cobayes
<tb>
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<tb>
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<tb> 1 <SEP> TC <SEP> embryonnaire <SEP> 184
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> non <SEP> purifia
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> TC <SEP> embryonnaire <SEP> 35
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> purifia
<tb>
Quatre vingtsept pour cent des témoins non vaccinés étaient pa- ralysés par le virus virulent.
Les résultats précédents démontrent le caractère antigène amélioré du virus de la rage cultivé sur des tissus em- bryonnaires de volaille. Ce caractère antigène amélioré est ob- tenu sans augmentation de la virulence du virus pour les chiens ou les cobayes.
REVENDICATIONS
1. Procède de production d'un vaccin contre la rage à base d'un virus de la rage vivant, comprenant la propa- gation ou la croissance d'un virus de la rage adapté aux volail- les ou aux oeufs de volaille, en présence de cellules ambryon- naires de volaille, et ensuite la récolte du virus, caractérise en ce qu'au moins la dernière phase de propagation est l'enlisée, tandis que les cellules embryonnaires de volaille sont mainte- nues dans un milieu d'entretien synthétique, exempt de protéines.