CH683187A5 - Procédé pour la préparation d'un vaccin antityphoique vivant oral. - Google Patents

Description

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Description

Cette invention se rapporte à un procédé pour la préparation d'un vaccin antityphoïque vivant oral, plus particulièrement à une méthode de culture utilisant de nouveaux milieux de croissance et de protection, et des températures de culture contrôlées afin d'obtenir une récolte accrue de cellules bactériennes après culture et un taux élevé de survie des bactéries vivantes atténuées immuno-actives après lyophilisation.

La fièvre typhoïde, dont le germe est connu comme Salmonella typhi, est généralement infectée par les eaux ou aliments contaminés, ainsi que par les contacts personnels dans des zones peuplées.

Pour la prévention de la fièvre typhoïde, des vaccins non vivants et non oraux ou des vaccins vivants oraux ont normalement été utilisés.

Actuellement, l'utilisation de vaccins vivants oraux est en augmentation, à cause du fait que les vaccins non vivants ne présentent pas l'activité im-munogénique efficace désirée en dépit de leur sécurité élevée.

La méthode de préparation des vaccins vivants est différente de celle des vaccins morts. Les vaccins vivants sont préparés par le procédé connu suivant:

i) culture d'un mutant atténué de bactéries typhoïdes dans un milieu liquide ou solide, ii) centri-fugation et lyophilisation, et iii) formulation, alors que les vaccins non vivants sont préparés par la méthode suivante: i) culture de bactéries typhoïdes en milieu liquide ou solide, ii) stérilisation en utilisant de l'acétone, du phénol ou de la formaline, et iii) formulation.

Pour la production de vaccins vivants, le mutant atténué Salmonella typhi Ty21a qui a été isolé par des traitements de mutation à double étape à partir de Salmonella typhi Ty2 par R. Germanier et E. Furar est normalement utilisé. Un tel mutant est caractérisé par le manque d'activité enzymatique de l'uridine-diphosphogalactose-4-épimerase qui est un intermédiaire nécessaire dans la formation des lipo-polysaccharides dans les parois cellulaires des bactéries. Par conséquent, un tel mutant est pratiquement libre de virulence étant donné que seules des parois cellulaires incomplètes sont formées.

Toutefois, un tel mutant présente des effets d'immunisation remarquables en synthétisant les lipopo-lysaccharides en présence de galactose. De plus, l'apport en excès de galactose produit l'accumulation sous la forme de galactose-1-phosphate et UDP-galactose qui provoque la bactériolyse.

R. Germanier et ai. ont obtenu le brevet US 3 856 935 accordé le 24 décembre 1972 concernant la mutation, la culture et la formulation de la souche Ty21a.

Ce qui suit est un procédé pour la préparation du vaccin anti-typhoïque divulgué dans ce brevet.

Le mutant sélectionné Ty21a a été cultivé dans une infusion de cœur de cerveau (brainheart) sur une machine à agitation à 37°C pendant 6 heures. Par centrifugation à 6000 g, les bactéries ont été recueillies et suspendues dans un milieu acqueux de protection contenant 8% de saccharose, 1,5%

de gélatine et 5% de lait écrémé. Après lyophilisation de la suspension dans des flacons, les bactéries ont été préparées par l'ouverture de l'un des flacons et ont été inoculées sur un agar nutritif incliné puis incubés à 37°C. Les bactéries ont été suspendues dans une solution saline physiologique et la suspension a été utilisée comme inoculum pour 600 ml d'une solution nutritive. La solution nutritive a été préparée en dissolvant 28 g d'hydrolysat de caséine, 10 g d'extrait de levure et 2 g de glucose dans 1 litre d'eau distillée avec un pH ajusté à 7,2.

Puis la culture a été transférée dans une quantité de la même solution nutritive de 25 It qui a été maintenue à 37°C pendant 12 heures après inoculation en étant aérée à un taux de 5 It d'air par minute. Après culture, les cellules bactériennes ont été recueillies par centrifugation à 6000 g et suspendues dans le milieu de protection aqueux mentionné précédemment, puis lyophilisées dans des flacons.

Toutefois, les bactéries cultivées selon la méthode précitée présentent un faible taux de survie après lyophilisation à cause du fait que la souche Ty21 a est facilement détruite pendant cette lyophilisation étant donné la faible propriété de résistance contre le changement d'environnement.

L'objet de cette invention est de fournir une méthode de culture améliorée utilisant de nouveaux milieux de culture et de protection et des températures de culture contrôlées afin d'obtenir une récolte accrue de cellules bactériennes après culture et un taux élevé de survie des bactéries vivantes atténuées immuno-actives après lyophilisation.

Le milieu de culture préparé selon cette invention est prévu de telle sorte que les bactéries croissent efficacement et s'adaptent facilement aux modifications de l'environnement par le contrôle des températures de culture.

De plus, le milieu de protection préparé selon cette invention est prévu de telle sorte que les bactéries puissent supporter la congélation rapide élevée durant la lyophilisation et que les bactéries lyophilisées puissent être conservées pendant longtemps sans modification de leurs propriétés.

D'autre part, le vaccin anti-typhoïque oral obtenu selon la méthode de culture de l'invention utilisant de nouveaux milieux de croissance et de protection présente un taux de survie élevé des bactéries atténuées et une immuno-activité élevée contre la fièvre typhoïde.

La méthode de culture détaillée selon cette invention peut être expliquée de la manière suivante.

La souche typhoïdique pour la préparation du vaccin anti-typhoïque oral est la souche mutante atténuée Ty21a de Salmonella typhi qui a été déposée auprès de l'Américan Type Culture Collection («ATCC»), 12301 Parklawn Drive, Rockviiie, Maryland 20852 (USA), sous le numéro de dépôt ATCC-33459 le 9 décembre 1980, et qui a également été déposée auprès du Korea Institute of Science and Technology («KIST») sous le numéro de dépôt KCTC-2425. La souche typhoïdique déposée ci-dessus peut également être obtenue par la revivification du produit disponible commercialement «Vivotif Berna» (commercialisé par Swiss Serum &

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Vaccine Institute, Berne) comme une colonie unique dans le milieu de revivification composé par de l'agar «Brain-Heart Infusion».

Les bactéries germes isolées de la colonie unique de la souche typhoïdique ci-dessus ont été inoculées dans 100 ml de milieu «Brain-Heart Infusion» («BHI») et la souche inoculée a été cultivée pendant 18 heures à 30°C sur une machine à agitation. Par centrifugation de la culture à 6000 g pendant 10 minutes, les bactéries ont été recueillies et suspendues dans un milieu protecteur. Le milieu protecteur contenait 8% de lactose, 1% de carboxyméthylcellulose, 5% de lait écrémé, 0,2% de MgS047H20, et 1% de monosodium glutamate.

La suspension ci-dessus a été lyophilisée dans une ampoule. L'ampoule lyophilisée a été stockée à 4-8cC avant la production du vaccin vivant.

Les bactéries ont été préparées par l'ouverture de l'ampoule et ont été inoculées sur un milieu BHI. Pour la culture du germe, les bactéries inoculées ont été cultivées pendant 18 heures à 30°C sur une machine à agitation. Les bactéries germes ainsi obtenues ont été inoculées dans le milieu de croissance de production qui était composé de 37 g de BHI, 5 g de L-lysine, 30 g de sorbitol, 1,5 g de K2HPO4, 0,5 g de MgS047H2Û et 1 litre d'eau distillée, le pH étant ajusté à 7,0 pour la culture principale. Dans le cas d'une production de masse, la culture obtenue à partir du milieu de production peut être inoculée dans un fermenteur de 250 It. Durant la culture principale, la température de culture qui est l'une des caractéristiques essentielles de cette invention doit être modifiée afin de supporter complètement la rapide modification de température durant la lyophilisation. La température de culture lors de la culture principale était i) de 30°C pendant les 6 premières heures, ii) de 25°C pendant les 2 heures suivantes et iii) de 20°C pendant les dernières 14 heures.

De plus, l'aération du fermenteur était maintenue à 0,5 VVm (Volume\Volume\minute).

A la fin de la culture, les cellules bactériennes ont été recueillies dans une centrifugeuse réfrigérée à 6000 g et suspendue dans le milieu protecteur mentionné précédemment pendant 2 heures à 0-4°C.

Puis la suspension a été lyophilisée dans un séchoir frigorifique. Finalement, les bactéries lyophilisées ont été mélangées avec du lactose de manière à contenir 2,5 x 1010 bactéries vivantes par gramme, et le vaccin ainsi préparé a été introduit dans des capsules en une quantité de 0,2 g par capsule, puis ces capsules ont été pourvues d'un revêtement entérique en vue d'un usage oral.

La présente invention sera maintenant expliquée plus en détails dans les exemples suivants. Ces exemples ne sont toutefois donnés qu'à titre d'illustration et ne doivent pas être considérés comme une limitation de la portée de l'invention.

Exemple 1

La souche mutant atténuée Salmonella Typhi Ty21a de ATCC-33 459, KCTC-2425 ou Vivotif Berna a été inoculée dans 100 ml de milieu BHI et cultivée pendant 18h à 30°C sur une machine à agitation, puis les bactéries recueillies par centrifugation ont été lyophilisées dans une ampoule. Les bactéries lyophilisées ont été inoculées comme germe dans un milieu de croissance principal composé de 37 g de BHI, 5 g de L-lysine, 30 g de sorbitol, 1,5 g de K2HPO4, 0,5 g de MgS04.7H2Û et 1 litre d'eau distillée, avec un pH ajusté à 7,0.

Pour effectuer la culture principale, 5 litres du milieu de production principal ont été transférés dans un fermenteur de 10 litres. L'aération du fermenteur a été effectuée à un taux de 0,5 VVm avec agitation à 300 tpm. La température durant la culture principale était de i) 30°C pour les 6 premières heures, ii) 25°C pour les deux heures suivantes et iii) 20°C pour les 14 dernières heures. La durée de culture totale requise était de 22 heures.

Les propriétés de la solution cultivée obtenue finalement ont démontré que la turbidité de cette solution était de 0,516 x 20 sur OD 660 et que le nombre de bactéries vivantes était de 4,6 x 1010 par ml.

Exemple 2

La culture a été effectuée de la même manière que dans l'exemple 1, excepté en ce que la température de la culture principale était de i) 30°C pour les 6-8 premières heures, ii) 25°C pour les 2-4 heures suivantes et iii) 20-25°C pour les 12-14 dernières heures.

Les propriétés de la solution cultivée obtenue finalement ont démontré une turbidité de 0,452 x 20 - 0,516 x 20 sur OD 660 et un nombre de bactéries vivantes de 3,2 x 1010 par ml.

Exemple 3

La solution cultivée obtenue dans l'exemple 1 a été centrifugée à 6000 g et suspendue dans 2,5 It d'un milieu protecteur composé de 8% de lactose, 1% de carboxyméthylcellulose, 5% de lait écrémé, 0,2% de MgS04.7H20, 1% de monosodium glutamate. La suspension dans le milieu de protection a été laissée au repos à 0-4°C pendant 2 heures afin d'augmenter la résistance aux basses températures.

Dans le sécheur frigorifique, la suspension à résistance accrue a été congelée à -70°C pendant 2 heures, et séchée pendant 12 heures sous vide.

Le nombre de bactéries vivantes, après lyophilisation, était de 6,80 x 1010 par gramme.

Exemple 4

La lyophilisation a été effectuée de la même manière que dans l'exemple 3, en utilisant 1% de gélatine au lieu de 1% de carboxyméthylcellulose. Le nombre de bactéries vivantes obtenues après lyophilisation était de 4,1 x 1010 par gramme.

Claims (7)

Revendications

1. Procédé pour la préparation d'un vaccin antity-phoïque vivant oral comprenant les étapes suivantes:

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i) culture de bactéries obtenues d'une souche typhoïdique Ty21a dans un milieu infusion de cœur de cerveau dit BHI,

ii) suspension des bactéries cultivées dans un milieu protecteur et lyophilisation des bactéries suspendues dans une ampoule,

iii) revivification des bactéries lyophilisées et inoculation de celles-ci dans un milieu de production,

iv) culture des bactéries dans un fermenteur, et v) lyophilisation des bactéries et formulation de celles-ci en vue d'un usage oral.

2. Procédé selon la revendication 1, dans laquelle le milieu de protection est composé de 8% de lactose, 1% de carboxyméthylcellulose, 5% de lait écrémé, 0,2% MgSÛ47H20 et de 1% de monosodium glutamate.

3. Procédé selon la revendication 1, dans laquelle le milieu de croissance est composé de 37 g de BHI, 5 g de L-lysine, 30 g de sorbitol, 1,5 g de K2HPO4, 0,5 g MgSÛ4 et 1 litre d'eau distillée, avec un pH ajusté à 7,0.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle la température de culture dans le fermenteur est de i) 30°C pour les 6 premières heures, ii) 25°C pour les 2 heures suivantes, et iii) 20°C pour les 14 dernières heures.

5. Procédé selon la revendication 2, dans laquelle le 1% de carboxyméthylcellulose du milieu protecteur est remplacé par 1 % de gélatine.

6. Procédé selon la revendication 1, dans laquelle les bactéries sont lyophilisées, après que la suspension ait été laissée au repos à 0-4°C pendant 2 heures, par congélation à -70°C pendant 2 heures et séchage pendant 12 heures sous vide.

7. Vaccin antityphoïque vivant obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6.

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