BE647485A - - Google Patents

Description

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 EMI1.1 
 



  Procédé de production de -'û&yotMt 
 EMI1.2 
 La présente invention concerne un peft.l'b1onnemen\ au 
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 procédé de production de ± -carotène par fermentation* 
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 Il est connu d'obtenir du p-earotène par fermentation submergée de mioroorganismea du genre Choanephora ou Blakesloat 
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 Diverses publications ont décrit les conditions favorisant la 
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 production de -carotène.

   BARNËTT et colle 4'ociencop J"U, Ul (:&.9J6); ont Montra qi4o le p'o4o'.n de '.'U"CI était <Ma<34e<< par là te <Me lu Itliii 1""'" tous ilil llfllli ootto ee à la#"$$ été diffitut è tâ 49bot de Il...., ..... 

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 EMI2.1 
 d'espèces différentes Z*Co BBSâSL2Xffll   NYOOI*ïitt à±# 49 9â7)",' 
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 Les Milieux de ffoltuarts ont également été examinés et il   été montré que l'addition 4. grades entières ou hydrolysées, 4'JIùJ... végétales, d'agents tonsiomaotitai d' antioxydants tt d'épaissis- sants augmentait la rendement en $ë ouotêno ", 1t01 i ooll. 



  J. àtre fond. Oha. j, H* (1958)7- wiYa oZlO# et 40110 àppo glarobs 2, 94 et 98 (J.959) j. lII1ta 1WE et 003.:1., C;t Wa ob 4 Me. 74i '4'6 (192) J avai b 801"" qui l'addition de "ioaeM la oultaurt  tatique d'un Pbfoomyoe. augmentait fortement la formation du ;## ,.asrot8ne au détriment 4'Autre. pigments ouot4no...

   ANDER30N 
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 et colle ont nubtf le gaze effet en culture -agitée avec des l3leacaalas et Cboantphora (loo. cite)* On * maintenant trouvé, et c'eat et qui fait l'objet de la présente invention, qu'il est 1nt'r'.l4nt de remplacer, dans les milieux de culture,, toute ou une partie de la ,..s.ontm. par le trtm'tbfl-2,a,6 acétyl-1 eyclohexene (produit chimique moins évolué donc plus accessible que la -3anone) et qu'on obtient ainsi une forte augmentation du taux de production de p-catfotène. par 
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 rapport aux milieux témoins sans précurseur. 
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  Lorsqu'on emploie comme précurseur la tr3éby, 2,6 t0<tyl"l oyolohexene seul, eelui"9i peut tiré ajoute au Milieu di setue, en quaatit< allant de 0,1 z gAi dru t4 tu tA @@va de ia3 wr t iiuiituti fett, Ittiitti lou "014te le Ws.D1ê'fhfl..2, 2,6 &0""1-1 o,o10h.x. tm atioai ...0 la " : -ionone, la quantité du premier est alors de ,1 à 6 g/1 et du deuxième de 0,1 à 4 g/1* De préférence on emploie soit une quantité ' 
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 comprise entre 0,5 et 2 1/1 de trittbr,,2,â aoétyl-i eyclohex&ne seul, soit un mélange tel que le milieu contienne de 0,? a zip g/1 #'# de trim4thyl-2#2#6 ao't11-1 Ofo10htx.

   et de 0,2 à 1 g/1 de ,C6 et on t'1ü'fir'4ü l'adûltioa après 113 joug As i1'' quia qièe feint la qimtîld '4"'i" et le mus 404utt6la 48 $la' 

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 produite il convient de poursuivre la culture Pendant   6   à 10 jours après l'ensemencement pour obtenir la production   maximale   de 
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 ,-carotène. Le milieu de culture peut varier mais contient essen-   tiellement   une source de carbone et une source d'azote assimilables, des éléments minéraux et éventuellement des facteurs de croissance, 
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 des antioxydants, des agents tensio-aetifs, des épaississants et des précurseurs. 



   Comme source de carbone   assimilable,   on peut utiliser 
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 des hydrates de carbone tels que le glucose# les dextrlnes, l'amidon ou des huiles animales ou végétales comme   l'huile   de lard ou l'huile de .soja ou de graine de coton. Les sources convenables d'azote assimilable sont   extrêmement   variées:elles peuvent être des substances chimiques ou des substances complexes   contenant   principalement   l'aaote   sous   ferme   protidique telles que   caséine,   
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 1aotaJ.1:

   'WÜnG, gluten et leurs hydrolysats, farine de soja, d'araehiw de, extraits de levure, distiller** solubles, eom-steep  Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ouxeutrtl.isant comme les phosphates alcalins ou a1oa11no.#rr.wc. 



   Parmi les facteurs de   croissance   les plus   fréquemment   employés est la   vitamine   B1 ou thiamine. Parmi les antioxydants on 
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 peut citer la H,N'-d:1phénrl paraphénylene diamine la triméthyl  2,2,4 éthoxy-6 dihvdro-1,2 quinoléine, l'acide ascorbique ou l'ao1de j sorbique. Les agents   tensio-aotifs   sont de préférence du genre non ionique tels que des dérivés du sorbitol avec des acides gras,  ou des produits à base de condensais d'oxyde d'éthylène. Parmi les épaississants les plus habituellement employés sont   l'amidon,   la   carboxyméthyloellulose,   la gélose. 
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  On a trouvé que dans ces milieux le trlméthyl-2,2,6 acétyl-1 ayalohexne est compatible avec les substances auxiliaires décrites dans le brevet belge n* 633.200 sous le titre "Procédé de production de p-carotbnew# et qui peuvent etret 

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 16 des empoêéê Ayant wne fonction  aidé, jttâ-d3,rt:

   - soit des amides de formai* téi<Ml  ' a,-, 
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 . dans laquelle B représente un atome d'hydrogène, un radical alooyla ayant au plus 6 atomes de carbone, un radical aryle ou ar;t3coyle et R, et %.t semblables ou différents, représentent chacun un atome   d'hydrogène   ou un radical alcoyle ayant au plus 4   atomes   de   carbone,   
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 soit des imides 4#aoides dioarboxyliques de   formule générale    
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 EMI4.6 
   soit des laota#e. de tor.8Y1. 1in4.a 
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 dans lesquelles B3 est uu radical bydrocarui aliphatique divalent. ayant au plus 8 atones de carbone et X un atome d'hydrogène ou d'halogène ou un radical alooyle ou hydrooyaleoyle ayant au.' .;

  '  ' maximum tu atomes de carbone, 20 des dialcoylaultoxydes dont les radicaux alcoyles   contiennent   chacun au   maximum     4     atomes   de carbone. 



   Le milieu de culture ainsi préparé est   ensuite     ensemencé   
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 par une culture des formée + et - de Blakeslea trisport (NRRI) 2456 et ,3'). 



   Les exemples suivas donnée à titre non   limitatif,   montrent comment   l'invention   peut être mine en pratique.      

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  On prrfpart lt t)dli<M de oulturt coaaat wu,1 SOO a3 drs oontomt 60 de ds3,ra,u 9=t portéi à l6bu'la.t,a  durant 1 ztnuteou iprbe x'ciirab 
 EMI5.2 
 on ajoute! 
 EMI5.3 
 âmd= *et =6 de <0jt wlri!!!!riiwrlrwr*1 i, nulle de iaiiwral ii1l11!ii1lmri!!* 35 xveâzi 80 #tt*f* ii * ** * i*   t        5 bzz =trait de l<vtu*t .,.,., ## ## 1 Phosphate monopotaosîque .t<ttt.ttt*<tt 0 g Sulfate de nanganàse monohydraté ou#*#@ 01 g Chlorhydrate de thiamine ..1.. , .......

   ! 0,01 g 
 EMI5.4 
 On complète le volume à 1000 cm' par de l'eau diatue liée Le mélange est ajusté à pïi 6,3 avec quelques gouttes 4' soude 10 90 réparti en noies 4'Jbo3.enm.,.r de 300 =3 à raison de 50 cm3 par fiole, puis stérilisé pendant 20 minutes à 10*9$ àjrbe stérilisation et refroidissement on ajouts stérilement dans chaque fiole 4, car d'une solution stérile de triaéthyl-2,2,4 éthoxy-6 dihydro-1,2 quinoléine à l;

  t dans du pétrole, Chaque fiole est ensuite ensemenoée avec 0'14' 'd'une 
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 culture agitée contenant les deux former + et - de la souche de 
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 Diazoolet trispora (NML 24'6 et NUL 2457) et 1&" de 49 he\U'1', 
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 Les fioles sont ensuite placées sur une table à agitation rotative 
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 tournant 4220 t/m dans une dtuve à 26000 Après 2 jours dinaubrtion 
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 les fioles sont partagées en deux lots équivalents et chaque fiole reçoit stérilement les additions suivantes! 
 EMI5.10 
 ler lot 8 pétrole 0#1  a3 2ème lots 00 DI de trlmétbyl-2,2,6 aoétyl-1 ".3.0... 



  ZOUUIÏ,7 ta solution dans 0#0 4$LJ de  A3r. 



  Les cultures sont encore poursuivies dans les usez condition$ de température et d'agitation pendant 8 jours de plus. 

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  Au bout de ee ttapty la production dt l¯esr0ttnt tst ftaxi&alt 4âûi #.tôttfcif les fioles. -;if:vv;;-->ViV' \;i'" vT.-v'-.:, ,:< 1.0 dosage du P-oarotâne est effectué ooxme i uit   lt ayoé* liw est séparé par ttltrationp lavé, pu' 'Ji,' pU., irfob4 un  $%Ut à 3bec sous vtdeb Le 041:S.......i <a<uit<t extrait pM ':'#"'; de 'h?Hne. On sépare le '.6<ût des autre# pré <<at< par un. cbroiaatoiraphif de 104tu4it,ou alumine. Loo 9 4" tient dilution ecnt<aMt K '.Ol1'Oi..., rdvm4o $t 4o.4,.'Q". u¯ent PI' r.ppo,t .. un 4ob8ntUlôA' pu loi .-.uo;.... ':). "::; Les résultats suivants ont été ottmuse '. \ .C ' ler lot sans préouraeuri 82' 8a/l de -carotànt 2ème lot avto 50ÎACS 11265 Il " #' -? EXEMPLE 2.

    .-#N;v4-v On prépare un milieu de culture B corne il * été dit ' pour la milieu A à l'exemple 1 =ne en ajoutant  tellement dIa8". ohaque fiole, apptt .i',:l.l1.at10n et rltI01cU...8mC1.i, om plus de , l't:1o:l'²4a.nt en solution dans le pêtrolqi 200 Mg do pyrrolidone-8  Les fioles sont ensuite tneaenoe* et mises à inouber dans les conditions décrites à l'exemple 1. Apres 2 jours d'incubation, le$ fioles sont partagées en deux lots équivalents et chaque fiole * -reçoit stérilement les additions savantes ::"'2;;1 1er lot pétrole 0#5 car :"':"ct1 Semé lots 50 ma de t,:1m4tbyl-a,a,4 aoétyl-1 o,oloh8ab.1:,:; l'mxoy en solution dans 0,5 =3 de pétrole. 



  Apres ces additions les cultures sont poursuivies $ jours de plus dans les mêmes conditions do température et apastbam, tion. vj fin dosant le -oarotène corne il est dit Ifexmple 1 ##  a a obtenu les P'04\i1':t.0A' suivantes! lep lot sans précurseur i 1160 8112. de -ftwotàfit i ':- #; K- abat lot avec OUCIS 1 1810       ' j;';:"?|| '.##-#,';-#';' :-%-,<i>i17 

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 EXEMPLE 3. - 
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 ,F:XE.1f1LE On prépare un milieu de culture C comme il a été dit 
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 pour le milieu Aâ l'exemple 1 en ajoutant en plus de l"âm1dcm des huiles et des autres constituants,, 4 g/1 de sicc3z3,i.de. Après répartition en fioles d'Erlenmeyer et stérilisation, -on complète de même le milieu par une addition stérile dans chaque fiole d'an-   tioxydant   en solution dans du pétrole.

   Les fioles sont ensuite ensemencées et mises à incuber dans les conditions décrites à l'exemple 1.   Apres   2 jours d'incubation, les fioles sont   partageas   en deux lots équivalents et chaque finie reçoit stérilement les additions suivantes; 
1er lot : pétrole 0,5 cm3 
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 2ème lot: 50 mg ae tr.mëtbl-2,,6 acétyl-1 cvclohejMnp ' /'*THACB 7 en solution dans 0, 5 cet de pétrole. \1 Après ces additions les cultures sont pc>ursuiv.es ' " 8 jours de plus dans les mêmes conditions de température et d'ai-   tation.   
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  En dosant 10'B-carotène comme il est dit à l'exemple.! on * obtenu les productions '1V"1 b ler lot sens précurae t 1240 mg/1 de ± ôâS'Otène 2ème lot avec TMACH ; 1690 * " . 



  Et1j,JLE 4r- 
On prépare le milieu C complété par l'addition d'anti- oxydant dans du pétrole comme il est dit à l'exemple 3. Les fioles contenant ce milieu sont ensemencées et mises à   incuber,     dana '   les conditions décrites à l'exempta 1. Après 2 jours d'incubation les fioles sont partagées en sept .lots équivalents et chaque fiole reçoit stérilement les additions suivantes: 
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 1er lot : 50 mg ae NUCE en solutlon dans bzz c= da pétrole. 
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  2ème lot : 50 mg de C1i et 10 mg ae p-ionone en' P1:.ù.- 't,on dans ut5 cmt de pétrole. \ 

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 3eme lot ; 50 mg de 2>UCII et 20 4 de p-iononc on solution daiis Op 5 =3 d pétrole... 



  4èmé lot 50 mg de TXLCH et 30 ug de .p"ionone en ablution dans o,5 ou3 de pétrole. 



  5è=o lot : 50 mg. de TMACH et 40 mgi de p-ionone ei. 



  D',Lt,Cit dans 0t5 cm 3 de pétrole.. ' 6eme .at 50 zg de ÎMACH p. 50 mg id-O ,-.oo3ne en ,solution daràd 05 car de pétrole. 



  .. 7ëa lot s 50 mag ae p-ionone en solution dans C, 5 cm3 de   pétrole*     Apres   .ces additions les cultures sont poursuivies 
8 jours de plus dans les mêmes conditions de température et   dagi-   aton. 



   En dosant   le -carotène   comme il est dit à   l'exemple   1 on a obtenu les productions   suivantes:   
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<tb> Précurseur <SEP> en <SEP> g/1 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI8.3 
 Ka de lot - '##"###" -""r ' ' # #"' "* .8-carotène en bf  .ot '!mCH #-ionon  ms1 MMWéaHMMMHiMiWwaiWMWHM m# #11111 1. 11 ## 11 rr n 1. mrm .,-.... 1 r y # - r 1 rrnil' #:

  i-...#l-.|r-, , 
 EMI8.4 
 4 z 1 4, b 3185 
 EMI8.5 
 
<tb> 0,8 <SEP> 2205
<tb> 
<tb> 6 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2265
<tb> 
<tb> 0 <SEP> 2065
<tb> 
 
 EMI8.6 
 P171 x-ra a1 11, 
Dans un fermenteur de 30 litres en acier   inoxydable,   on charge 
 EMI8.7 
 Distillersfoolubles + ..., 1.275 g 
 EMI8.8 
 
<tb> Eau <SEP> . <SEP> litres
<tb> 
 

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 Le mélange est agité et   chauffe   à 95  pendant 10   admîtes.   
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 Après refroidissement, on ajuste à pH 6:, avec 58 com de soudez. 



  10 N et on complète le milieu avec les matières   premières     suivantes:   
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 Aaidon 709 g à g 
 EMI9.3 
 
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> ............................... <SEP> 450 <SEP> car
<tb> 
 
 EMI9.4 
 Huile de coton ........................,..... 4S0, Extrait de levure ........................... 15 8 Phosphate monopotaRs1que .................... 1,' i Sulfate de manganèse utoaoby dl"k'.1 ............ 1,, g Txitnéthyl-2,2,4 étnoxy-6 t3'!'ir'd'0..22 quinoléine en solution à 30% dans 3 l'éthanol ................................... 3 osr Solution aqueuse de chlorhydrate da ,,,, thiamine à 0,3 g/1 ......<................... 250 <ôr 
Le volume est ajusté à 15 litres avec de l'eau; la pH du mélange est à 6,45. Le milieu est stérilisé pendant 50   minu-   tes à 1220 avec injection de vapeur.

   Après refroidissement le pH est ae 5.95 et le volume ae 14,5litres. On ajoute alors   stérilement   
 EMI9.5 
 une solution de 45 g de succ1ninl1de dans 350 cra3 d'eau puis 150 cl de pétrole filtré stérilement. Le fenuentfcur est ensuite ensemence avec 1.500 em3 d'une culture   inoculum   en fermenteur      des deux formes + et - de la souche de   Blakeslea     Trispora   (NRRL 2456 et 2457) âgée de 49 heures, la culture esteffectue à 26  en agitant avec une turbine   tournant à   400   tours/minute   et en aérant avec un débit de 1,2 m3 d'airstérile par. heure. 



   Après 40 heures de culture, on ajoute stérilement 150 cm de pétrole et on meten marche un dispositif   permettant   d'ajouter dans la culture, en continu entre le 2ème et le 6ème 
 EMI9.6 
 jour de la fermentation, z0 ami d'une solution aqueuse .Ur1l4 i contenant 450 g de glucose hydraté. Les mêmes conditions d'aération, d'agitation et de température sont maintenues durant les 5 Jours pencant lesquels la culture est poursuivie* 
 EMI9.7 
 Dans aaux autres fermenteurs de 30 litres, on prépare 

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 de la même façon le milieu décrit ci-dessus en le complétant avec 
 EMI10.1 
 les mêmes additions.

   Le rllieu est ensemencé av,'3C la même culture incokum et la culture est. effectuée pendant toute la durée de 
 EMI10.2 
 la fermentation (7 jours) dans les conditions d'aér1ion, d'agita- -1   tion   et de température décrites   ci-dessus.   



   Après 40 heures de culture, on procède sur les deux appareils à la misa en marche des dispositifs d'addition continue de glucose hydrate dans les conditions de concentration et de durée décrites ci-dessus. Au mené moment, on ajoute stérilement! dana.le 1er fermenteur: 
 EMI10.3 
 19 de tcétrxyl,-2 f,6 acétyl-1 cyclohexane L-TMAC.7 en so.. lution stérile dans 150 car de pétrole (soit 1 g/1); dans le 2eme 1"ermonteura 22e5 g te trintïr1-2;2,6 acétyl-1 cyclohexène en sol..cion stérile dans 150 cm3 de pétrole (soit   1,5   g/1.)
Le dosage du   -carotène   produit dans ces trois   fermen-     tations   est effectué comme   indiqué   à l'exemple 1.

   Les résultats suivants ont été obtenus 
 EMI10.4 
 Opération sans préauw sa...................'74 mag/1 de p- 
 EMI10.5 
 
<tb> carotène
<tb> 
 
 EMI10.6 
 opération avec audition da TMACH ( 1 g/1) ... 1280 mg/1 de -carotène opération avec . addition de TMACH (1,5 g/1) 14.5rmg/ada 
 EMI10.7 
 
<tb> -carotène
<tb> 
 
 EMI10.8 
 BEVENDICATIQDi.

   --.¯-¯¯¯.¯¯M¯.¯¯----- 
Nouveau procéda de préparationde   -carotène   par fer-   mentation     aérobie     a'une   culture des formes +   et -   de   Blakeslea   
 EMI10.9 
 tl'1.apora sur un milieu convenable et dans les conditions habituelles pour ce genre de culture, le milieu contenant comme précurseur du trimethyl-2,2,6 acétyl-1 cyolohexène seul ou en association avec 

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims (1)

1. de, la -ionone.- **ATTENTION** fin du champ CLMS peut contenir debut de DESC **.