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"Procédé de récupération de la 'nystatine et nystatine ainsi obtenue",
La présente invention est relative à un nouveau procé- dé de récupération de l'antibiotique nystatine à partir du bouil- lon de fermentation dans lequel il est produit.
La nystatine est un antibiotique antifongique décrit % dans le brevet U.S.A. n 2.797.183 accorda le 25 juin 1957 à Halen 1 et Consorts. Elle est préparée par culture du Streptomy es noursei ,dans un milieu nitritif.
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fil iî maintenant trouvé. qu'en employant le procédé de 1. 1 i,nv':'ni:.'i\'mt ')11 peut. obtenir la. nystatinc en un plue grand ron- clemant "t #iJon une p-urot6 plue élevée que ce n'était possible jus.é'1,i pt5stmt par les procédés connus en pratique.
Essentielle- m'ntt >.1: proche tic la. présente invention comprend la séparation <11 ÍÎ(\IQ0U'l.1ffi à partir du bouillon complet d'un milieu de fermenta- t '.ou soutenant de la nystatine, lu traitement du mycélium avec <6' 1"('.,,,1.1 (à moins qu'un myca-l iurn humide ne soit utilisé) un o.1}-?xIQl t.rrF¯r:,fux (de préférence du méthanol) un acide, tel que *3o .'A,na;i.r,7f oxalique, de l'acide malonique, de l'acide succinique
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ou de l'acide citrique, et do préférence un acide minéral, tel
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que l'aaido nulfuriquef et un amine, telle qu'une amine primaire, comao une ,:\11<.yl inférieur amine (par exemple la méthylamine) et une hydr#{y,,11yl inférieur aminé (par exemple l'éthanolamine), une s.mina secondaire, telle qu'une di.(alkyl inférieur ) amine (par kaûay,.i¯r:
do la diméthylamine et de la diéthylaininu) , une -:!i (iayc#, v;:y ulkyl. inférieur amin:1 et une (alkyl inférieure) (hy- i,-7. t1.3:y. inférieur ).rninE.; (par t'xctnpio de- la méthyléthanolami- <; G) , "t Ic' i":rf:6rtn/'t' une aminé .e,y"'.ii77't tulle qu'une 1:.r:L(al...
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Au mycélium humide, on ajoute un alkanol inférieur (de préférence du méthanol); un acide ..particulièrement un acide minéral, tel que do l'acide chlorhydrique et de préférence de l'acide sulfurique; et une amine , en particulier une amine ter- tiaire, telle qu'une tri(alkyl inférieur)aminé (par exemple do la triméthylamine et de la triéthylamine) et, de préférence , une tri(hydroxyalkyl inférieur)amine (par exemple de la triéthanola- mine).
La quantité de l'acide et de l'amine qu'on ajoute est ré- glée de telle sorte que la solution alkanolique aqueuse résultante a un pH sensiblement neutre (c'est-à-dire un pH de l'ordre d'en- viron 6 à environ 6,5 et, de préférence, d'environ 6 à environ 6,2), Bien que l'addition de l'alkanol , de l'acide et de l'amine puisse se faire dans un ordre quelconque, on a trouvé que , de façon surprenante, si l'acide et l'amine sont ajoutés ensemble sous la forme du sel par addition d'acide de l'amine, de sorte qu'il n'y a pas de variation importante du pH du solvanb alkanol aqueux ,comme cela pourrait se produire si l'acide et l'amine étaient ajoutes séparément , ce qui pourrait provoquer une dégra- dation de la nystatine, la nystatine est encore solubilisée.
En conséquence, suivant le procédé préféré de l'invention, une solu- tion du sel par addition d'acide minéral de l'amino tertiaire (par exemple du sulfate de triéthylamine et de préférence du sulfate de triéthanolamine) dans un alkanol inférieur aqueux est utilisée comme milieu d'extraction.
Bien que la quantité d'alkanol que l'on ajoute ne soit pas critique, il faut utiliser au moins environ 2,0 ml d'al- kanol par gt de gâteau de Mycélium humide pour .saurer une extrac- tion sensiblement totale de la nystatine à partir du mycélium dans l'alkanol aqueux De plus, pour éviter la nécessité d'une sépara- tion de grandes quantités de solvant après la phase d'extraction, on utilise, dans le procédé préféré de la présente invention, une quantité non supérieure à environ 2,5 ml d'alkanol par gr de my- célium.
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Bien-que la quantité d'amine ne soit pas critique, la concentration préférée d'amine est d'environ 0,02 ml à environ 0,05 ml d'amine par ml d'alkanol, La quantité d'acide que l'on utilise est réglée de manière à donner les gammes finales désirées de pH mentionnées précédemment. La quantité d'eau n'est pas cri- tique non plus; cependant, il est préférable qu'une quantité non supérieure à environ 0,25 ml d'eau par ml d'alkanol soit présente durant la phase d'extraction.
L'alkanol , l'amine et l'acide sont alors ajoutés au mycélium pour dissoudre la nystatine. Après l'achèvement de la dissolution de la nystatine, à l'aide d'une agitation si nécessai- re, le mycélium épuisé est filtré ou séparé par centrifugation et rejeté. Pour assurer que toute la nystatine ait été séparée à partir du mycélium, celui-ci peut être lavé avec une quantité supplémentaire d'alkanol.
Pour récupérer la nystatine, le filtrat (et lesliqui- de de lavage combinés, s'il y en a) est concentré dans de l'eau et on ajoute une cétone miscible à l'eau, telle que de l'acétone.
Le mélange résultant est alors chauffé jusqu'à une température d'environ 45 C à environ 55 C (de préférence environ 50 à envi- ron 52 C), puis il est refroidi, après quoi de la nystatine sen- siblement pure cristallise à partir de la solution et est récupé- rée.
Les exemple suivants illustrent le procédé de l'in- vention (toutes les températures sont données en degré* Centigrade! EXEMPLE 1 (a) Séparation du mycélium
Au bouillon entier de nystatine résultant de la fer- mentation de Streptomyces noursci dans un milieu nutritif aqueux de farine do soja et de mélasses, on ajoute 4% en poids/volume de Hyflo. On filtre le mélange résultant et on récupère le mycé- lium.
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(b) Extraction de la nystatine à partir du mycélium
Le mycélium obtenu dans la phase (a) est transformé en boue dans environ 10 volumes de méthanol, puis réglé au pH de 3 avec de l'acide sulfurique, agité pendant 7 minutes, neutralisé avec de la triéthylamine et filtré. Le filtrat est concentré jus- qu'à environ un vingtième de son volume d'origine et la boue ré- sultante est cristallisée à 45 après dilution avec un volume égal d'acétone aqueuse à 40%. Le précipité est recueilli sur une centrifugeuse à bol , retransformé en boue dans de l'acétone aqueuse à 40%, recentrifugé, retransformé en boue dans de l'acéto. ne, recentrifugé à nouveau et séché, La nystatine obtenue a une puissance d'environ 4.000 unités par mg,
elle est plus thermos- table que la nystatine récupérée parles procédé antérieurs, et elle a une teneur de cendres inférieure à 1%.
EXEMPLE 2
On prépare une solution méthanolique en ajoutant 2% (volume/volume) de triéthylamine à du méthanol et en ajoutant en- suite de l'acide sulfurique aqueux à 40% pour réduire le pH à 6.
Le mycélium obtenu dans la phase (a) de l'exemple l'est ensuite ajouté à la solution de méthanol et de sulfate de triéthylamine de manière que la concentration finale de méthane! soit environ 90%. Le mélange est ensuite agité énergiquement pendant und demi- heure, le pH est réglé à 6,8 avec de la triéthylamine , et on filtre. Le gateau de filtre est lavé avec du méthanol aqueux à 90% (10% du volume d'extraction) et il est ensuite rejeté.
Le filtrat et le liquide de lavage sont mélangés et concentrés à environ un vingtième de leur volume d'origine. Ceci sépare essentiellement tout le méthanol. Au concentré, on ajoute 2 volumes d'acétone aqueuse à 60%. Le mélange est réglé au pH de 6,5 par addition à de la triéthylamine ou de l'acide sulfurique, suivant les nécessités, puis on le chauffe à 50-52 C pendant une heure, on refroidit jusqu'à la température ambiante sur une période
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d'une heure à une heure et demie, et on maintient casuite à la @ température ambiante pendant 5 à 6 heures.
Le produit cristallin est ensuite sépara par filtration retransformé en boue avec 5 ml d'acétone aqueuse à 40% par gr humide de produit, puis avec 10 ml d'acétone par qr humide de produit, et finalement on sèche sous vide de la manière habituelle.
On obtient de la nystatine cristalline en des rendements de 75 à 90% (par rapport à l'activité initialement présente dans le mycé- lium), titrant environ 4.500 unités par mg , cette nystatine étant stable à 100 C pendant environ 48 heures.
EXEMPLE 3
On prépare une solution méthanolique en ajoutant 4% (volume/volume) de ttriéthanolamine à du méthanol et en ajoutant ensuite de l'acide sulfurique aqueux à 40% pour réduire le pH à environ 6. Le mycélium obtenu dans la phase (a) de l'exemple 1 est ensuite ajouté à la solution de méthanol et de sulfate de tri- éthanolamine de manière que la concentration finale de méthanol soit d'environ 80% (volume/volume). Le mélange est ensuite agité énergiquement pendant une demi-heure et filtré. Le gateau de filtre est lavé avec du méthanol aqueux à 85% (20% du volume du méthanol utilisé pour l'extraction) et il est ensuite rejeté.
Le filtrat et le liquide de lavage sont mélangés et concentrés à un dixième de leur volume d'origine. Au concentré, on ajoute 3 volumes d'acétone aqueuse à 60% , on règle le pH à 6,5 (avec de l'acide sulfurique ou de la triéthanolamine suivant les nécessités), on chauffe le mélange à 50-52 pendant une heure, on refroidit à la température ambiante sur une période d'une heure à une heure et demie ; on agite à la température ambiante pen- dant 5 à 6 heures. Le produit cristallin est séparé par filtra- tion, retransformé en boue avec 6 ml d'acétone aqueuse à 40% par gr humide de produit, puis avec 10 ml d'acétone par gr humide de produit, et on sèche sous vide de la manière habituelle.
On obtient
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de la nystatine cristalline en des rendements de@ 90 à 100% (par rapport à l'activité présente à l'origine dans le mycélium), ti- trant environ 5.000 unités par mg, cette nystati e étant stable à 1000 pendant environ 48 heures.
EXEMPLE 4 #######
On prépare la solution méthanolique par addition de 2,5% (volume/volume) de triéthylamine à du méthanol et en ajou- tant ensuite de l'acide citrique solide pour réduire le pH à 6.
Le gateau de mycélium riche obtenu dans la phase (a) de l'exemple 1 est ajouté à la solution de méthanol et de citrate de triéthyl- amine, de sorte que la concentration finale de méthanol est d'en- viron 90%. Le mélange est agité énergiquement pendant.une demi- heure, on règle ensuite le pH à 6,8 avec de la méthylamine et on filtre. Le gâteau de filtre est lavé avec du méthanol aqueux à
90% (10% du volume d'extraction) et il est rejeté
Le filtrat et le liquide de lavage sont concentrés à un vingtième du volume initial pour séparer le méthanol.
Au con- centré, on ajoute 2 volumes d'acétone aqueuse à 60%, on règle le pH à 6,5 avec de la triéthylamine ou de l'acide citrique suivant les nécessités, on chauffe à 50-52 C pendant une heure, on refroi - dit jusqu'à la température ambiante sur une période d'une heure à une heure et demie, on maintient ensuite à la température am- biante pendant 5 à 6 heures,
Le produit cristallin est alors séparé par filtra- tion, retransformé en boue dans de l'acétone aqueuse à 40% à une concentration de 5 ml/gr humide de produit, puis on filtre, on transforme en boue le produit séparé,par de l'acétone à une con- centration de 10 ml/gr humide, on filtre et on dessèche le produit sous vide de la manière habituelle.
Les rendements de produit s'élèvent à 70-85% (par rap- port à l'activité présente à l'origine dans le mycélium). Les bio-titrations du produit se situent dans la gamme de 3800
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4500 microns/mg et le produit a une bonne stabilité à 100 C.
L'activité d'autres combinaisons d'acide organique et de sel d'amine sur la solubilisation de la nystatine dans du méthanol est similaire à celle décrite dans l'exemple 4.
REVENDICATIONS
1. Procédé de récupération de nystatine à partir du my- célium du bouillon complet , dans lequel la nystatine est produi- te, caractérisé en ce qu'on traite ce mycélium avec un alkanol inférieur aqueux, un acide et une amine, l'acide et l'amine étant en des proportions telles que la solution alcoolique aqueuse ré- sultante ait 'un pH sensiblement neutre, et on récupère la nys- tatine à partir de cette solution.