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Nouveaux polypeptides et leur préparation.
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La présente invention concerne, à titre de produits industriels nouveaux, de nouveaux polypeptides et leurs dérivés répondant à la formule générale (3-thio-2-X-propionyl)-L-séryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-séryl-L- thréonyl-L-hémicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-séryl-L-alanyl-L-
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t>'ross'l-L-tryptophanyl-L-ar'ginyl-L-é6Faraginyl-L-leucyl-Tj- asparaginyl-L-asparaginyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-Lphénylalanyl-L-séryl-glycyl-L-Y-glycyl-L-phénylalanyl-glycyl-Lprolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide dans laquelle X représente un atome d'hydrogène, un groupe amino ou un groupe de formule R-CO-NH- ou R'-O-CO-NH dans lesquelles
R signifie un groupe alkyle, ou un groupe aryle ou aralkyle éventuellement substitués, et R' signifie un groupe alkyle, alcényle, ou un groupe aryle ou aralkyle éventuellement subs- titués,
et Y représente le reste norleucyle ou méthionyle, ainsi que leurs sels d'addition d'acides et leurs complexes de métaux lourds.
Lorsque X représente le groupe amino ou un groupe de formule R-CO-NH- ou R'-O-CO-NH, l'amino-acide correspondant, qui répond à la formule (3-thio-2-X-propionyl), est sous la forme L.
Dans le groupe de formule R-CO-NH-, R peut représenter par exemple le groupe méthyle, éthyle, propyle ou tertio-butyle, ou un reste phényle ou benzyle éventuellement substitués par un atome d'halogène ou par un groupe nitro ou alcoxy inférieur.
Dans le groupe de formule R'-O-CO-NH-, R' peut représenter par exemple le groupe propyle, tertio-butyle, allyle, benzyle, p-nitrobenzyle, p-chlorobenzyle, p-bromobenzyle, pméthoxybenzyle, le reste p-azobenzyle ou p-méthoxy-azobenzyle.
L'invention concerne également un procédé de préparation des composés et leur application en thérapeutique, à titre de principes actifs de médicaments.
Selon le procédé de l'invention, pour préparer les nouveaux polypeptides et leurs dérivés, on met en oeuvre des méthodes générales connues pour la synthèse de composés de ce
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type. Les acides aminés,,sont alors associés dans l'ordre où ils figurent dans la formule représentée ci-dessus, soit isolément, soit par petites séquences peptidiques préalablement formées.
Si on le désire, le produit final peut éventuellement contenir un groupe protecteur dans la molécule terminale de L-hémicystine; l'introduction de ce group,- protecteur peut se faire, avant la dernière étape, à n'importe quel stade de la préparation du pro- duit. Pour obtenir un composé qui n'est pas protégé dans la molécule terminale de L-hémicystine, on trarisforme le groupe amino protégé de la molécule de L-hémicystine en groupe amino libre. On effectue cette transformation par des méthodes connues en traitant le peptide protégé par des agents hydrolysants ou réducteurs.
Au dernier stade Je la condensation, il est conseillé d'utiliser des méthodes qui ne provoquent pas de racémisation ou qui ne provoquent qu'une racémisation peu importante, de préde couplage/ férence la méthode/à l azide ou à l'ester actif , en employant, pour l'activation, de préférence la N-hydroxy-succinimide.
Au cours de la synthèse des nouveaux polypeptides et de leurs dérivés, par exemple dans la séquence partielle A décrite ci-aprés, le groupe tertio-butyloxy s'est montré approprié pour bloquer le groupe -carboxylique; on peut cependant utiliser, dans le même but, d'autres groupes protecteurs, tels que le groupe méthoxy, éthoxy, tertio-amyloxy, amide ou benzyloxy.
Pour bloquer le groupe imidazole du reste de l'histi- dine dans la séquence partielle C décrite ci-après, le groupe triphényl-méthyle convient très bien ; on peut cependant utiliser aussi d'autres groupes protecteurs, tels que le groupe tertio- butyloxy-carbonyle, tertio-amyloxy-carbonyle, benzyloxy-carbonyle ou benzyle.
Dans la séquence partielle E décrite ci-après, le groupe nitro convient très bien pour bloquer le groupe guanidino du reste de l'arginine, mais on peut aussi utiliser, dans ce but, d'autres groupes protecteurs appropriés, tels que le groupe tosyle p-nitrobenzyloxy-carbonyle, ou 2-(isopropyloxy-carbonyl)- 3,4,5,6-tétrachloro-benzoyle. Dans la synthèse, il est également
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possible d'avoir recours à l'effet protecteur de la protonisation du groupe guanidino.
A la fin de la synthèse, on élimine habituellement les restes benzyle utilisés pour protéger les groupes SH dans la synthèse de la séquence partielle F, par traitement avec du sodium dans de l'ammoniac liquide. On a trouvé maintenant que l'on obtient des rendements particulièrement bons en produit
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final en effectuant l'élimination cbs groupprotecteu benzyle ainsi que la préparation de la liaison S-S , avant le dernier stade.
Les corps de départ servant à la préparation des nouveaux polypeptides et de leurs dérivés peuvent être préparés, dans la mesure où ils sont nouveaux, par les méthodes connues appliquées dans la chimie des peptides, les acides aminés étant associas les uns aux autres, soit un par un, soit par petites séquences peptidiques préalablement formées.
Dans la présente description, il est fait usage des abréviations suivantes: Z = benzyloxy-carbonyl BzL = benzyl BOC = tertio-butyloxy-carbonyl Trt = trityl = triphénylméthyl
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OTB = tertic,-b.1t,,jioxy ONP ester p-nltrophénylique OCP = 2, , -.
triuin oro-phénoxy OMe = méthoxy OEt = éthoxy N02 = nitro Ser = L-séryl Asn = L-asparagnyl Leu = L-leucyl Thr = L-thréonyl Val = L-valyl Ala = L-alanyl Tyr = L-tyrosyl
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Trp = L-trypcopüny 1
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Arg = L-arginyl Phe = L-phénylalanyl Glu = L-glutamyl His = L-histidyl Pro = L-prolyl Gly = glycyl Met = L-méthionyl Cys = L-cystéinyl Piv = pivaloyl Nle = L-ncrleucyl
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1CP = p-mercaptopropionyï OSu = oxysuccinimide EOC = éthoxy-carbonyl
Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Les températures y sont exprimées en degrés centigrades.
EXEMPLE 1 :
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L-hémi¯c;stinyl-L-séryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-séryl-L-thréonjfl-L-hémicystinyl-L-vals.l-L-lelcyl-L-séryl-L- alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl- L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phénylalanyl-Lhistidyl-L-arginyl-L-phénylalanyl-L-séryl-glycyl-L-
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méthionyl-glycyl-L-phénylalanyl '51ycyl-L-prolyl-L- glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide.
(H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-
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Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-rg-Phe-Sev-'Gly-Met-Gly-PheGly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2).
On dissout, sous atmosphère d'azote., 3,3 g d'hexaacétate octahydraté de BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-LeuSer-Ala-Tyr-Trp-.Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-MetGly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2(pour la préparation volr l'exemple 2 et 3) dans 100 ml d'acide t.rifluoro-aaétique, on laisse reposer pendant 15 minutes à 20 et on évapore à siccité. On dissout le produit ainsi obtenu dans 300 ml d'acide acétique
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0,2 N, on traite la solution par 20 ml d'Amberlite IRA--410 sous sa forme acétate, on lyophilise, on lave à l'éther diéthylique
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et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé.
On ob-
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tient ainsi i *cct#2tt dChJrrir.ahô du T-1-f'yç-Ççr.-6çn.-t?Ll-Ser- Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- ------- Asn-Asn-Phe- His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 fondant à 220 (avec décomposition); [a]20= -52 dans l'acide acétique 1N.
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6 N pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés:
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Ala 1,1, Arg2,0' AsP3,9' Cys/2,@ 6' G1u12,-¯-¯¯¯¯ Gly 3,0 , His 1,1 Leu 2,9' Met 1,0' Phe 31(), Pro 2,11 Ser -3, 8 Thr,@9, Tyr.,@- Val 0,9 (Trp 1,0 par spectrophotométrie).
EXEMPLE 2 : tert. -butyloxycarbonyl-L-hémicystinyl-L-séryl-L- asparaginyl-L-leucyl-L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl-
L-valyl-L-leucyl-L-séryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto-
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phanyl-L-arginyl-L-aspa>.aginyl-L-leucyl-L-asparaginylL-asaraginyl-L-phény7.alanyl-L-histidyl-L-arginyl-Lphénylalanyl-L-séryl-glycyl-L-méthionyl-glycyl-Lphénylalanyl-glycy7¯-L-prolyl-L-glutamyl-L-hréonyl-L- prolinamide.
(BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-TyrTrp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-
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Gly-Phe-Gly-Pro-slu-Thr-Pro-NH2).
On dissout, à une température de -20 , 1,C5 g de nonapeptide-hydrazide obtenu à l'exemple 23 (séquence partielle F) dans un mélange de 50 ml de diméthylformamide et 1,2 ml d'un mélange de dioxanne et d'acide chlorhydrique binormal. A la solution ainsi obtenue, on ajoute 0,116 ml de nitrite de tertiobutyle et on agite pendant 10 minutes à -20 . On ajoute ensuite
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1,4 ml de triéthylamine, 3,1 g d'hexa-trü'.luoro-acétate du tri.cosa-peptide obtenu â l'exemple 20 (séquence partielle ABCDE) et 5 ml d'eau et on agite pendant 16 heures à 0 . On évapore à siccité et on lave le résidu à l'éther diéthylique, au chloroforme et à l'acétone. On obtient ainsi le dotriacontapcptide protégé à l'état brut que l'on dissout dans 100 ml d'acide acétique 0,3 N.
On traite la solution par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate et on ajoute 50 ml d'hydroxyde d'ammonium
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0,6 N. On règle le pH à 6,5 et on verse la solution ainsi obtenue sur une colonne de carboxy-méthyl-cellulose (10 cm de diamètre et 100 cm de hauteur) équilibrée au moyen d'une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,15 N. L'élution est effectuée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium de concentration et de pH croissants (de 0,15 N à 0,4 N et de pH 6,5 à pH 7;0). On lyophilise à trois reprises les fractions réunies contenant le peptide à l'état pur, on lave le résidu à l'éthanol puis à l'éther diéthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé.
On obtient ainsi l'hexa-acétate octahydraté du BOC-Cys-
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S er-I\sn - Leu-S er-Thr-Cys - Val- Leu-S er- Al a-Tyr- Trp- Arg- Asn- Leu - ASIAsn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 qui fond à 220 (en se décomposant); [a]20= -56 dans l'acide acétique 1N.
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6 N pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés:
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Ala 1,1' Arg2,0' Asp -3,9' y'21,6' GlLli.;,21 Gly -3,0' His 1,1' Leu 2,9' hietl0, Phe30, Pro 2,1' Ser'9, Thr 1,.9' Tir 1,0' Val 019 (Trp 1,0 par spectrophotométric). EXEMPLE 3:
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tert.-butyloxycarbonyl-L-hém1.cystinYl-L-séryl-Lasparaginyl-L-leucyl-L-séryl-L-triréonyl-L-hémicystinylL-valyl-L-leucyl-L-séryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-ar,inyl-L-asparaginyl-L-leucy-L-asparaginyl- - asparaginyl-I.- phél'yla1any1- L- his tidy1-L- argif1yl-Lphénylalany1-L-séryl-gycYl-L-méthionyl-glycyl-L-phény1alanyl- glycyl-L- prolyl-. ..' gl'\.,; \'l1myl- L- thréonyl-Lprolinamide (BOC-Cy 5 -Asn-Leu-Ser-Thr-ßs-Val-Leu-Ser-Ala-'fßr- '±rp-Arg-As;
Leu-Asn-Asn-Phejiip-Arg-Phe-Ser-G15'-MetGly-Pie-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro'EFi2 ) .
On dissout 1 ,0 g du nonapeptple obtenu à l'exemple 25 {séquence partielle FI[) dans 10 ml' de 'ëÚméthylfo<mam1de, on ajoute 1,5 g de N-hYdroXysuccinmide et 0,52 g,4e dicyc1ohexyl- "codi-imide, on agite pendant 6 heures une température de 25 , on filtre ét on évapora le 1"iltraÉ à siccibé. On lave le
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résidu à l'acétate d'éthyle et à l'éther diéthylique et on sèche: on obtient ainsi le BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OSu fondant à 242 . On dissout 1,2 g du produit obtenu dans 10 ml de diméthylformamide, on ajoute 3,1 g d'hexa-trifluoro-acétate du tricosapeptide obtenu à l'exemple 20 (séquence partielle ABCDE), 0,4 ml de triéthylamina et 1,2 g de N-hydroxysuccinimide et on agite pendant 16 heures à une température de 25 .
On évapore à siccité, on lave le résidu successivement à l'éther diéthylique, au chloroforme et à l'acétone et on procède ensuite de la manière décrite à l'exemple 2. On obtient l'hexa-acétate octahydraté du composé mentionné dans le titre du présent exemple. Les caractéristiques physico-chimiques du composé sont identiques à celles indiquées à l'exemple 2.
EXEMPLE 4 :
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L-hémicystinyl-L-séryl-L-asparaginy1-L-l(ucyl-L-sérylL-thréonrl-L-hémicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-séryi-L- alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl- L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phénylalanyl-Lhistidyl-L-arginyl-L-phénylalanyl-L-séryl-glycyl-L-
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norleucyl-glycs,1-L-phénylalanyl-glycyl-L-propyl-Lglutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide (H-Cys Ser-Asn-Leu-cer-Th ßs-Val-Leu-Ser-Ala-TyrTrp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-Hi;
-Arg-Phe-Ser-Gly-NleGly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH 2)' On dissout, sous atmosphère d'azote, 3,3 g d'hexaacétate octahydraté du ü0C-Cßs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr s-Val-Leu- Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 (pour la préparation voir l'exemple 5 et 6) dans 100 ml d'acide trifluoro-acétique, on laisse reposer pendant 15 minutes à 20 et on évapore à siccité. On dissout le produit ainsi obtenu dans 300 ml d'acide acétique 0,2 N, on traite par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate, on lyophilise, on lave à l'éther diéthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé.
On obtient ainsi
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l'octa-acétate dénahydraté du H-Cßs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cßs-ValLeu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-
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Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2, qui fond à 220 en se décomposant; [a]20=-54 dans l'acide acétique 1 N.
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6N pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés:
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Ala 1,1' Arg2.. 0, ASP3,9' Cys/2,@6, Glu, 2, G1Y3,Ol llis 1,1, Leu 2,9' Nle 1,0' Phe 310, Pro 2,11 Ser38, Thrl9' TYrl,O' Val 0,9 (Trp 1,0 par spectrophotométrie). EXEMPLE 5:
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tert.-butyloxycarbonyi-L-hémieystinyl-L-sé4-yl-Lasparaginyl-L-leucyl-L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinylL--valyl-L-leucyl-L-séryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-T,-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl- L-asparaginyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-Lphénylalanyl-L-séryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-Lphénylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-Lprolinamide (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-
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Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Sev-Gly-NleGly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr,-Pro-NH 2).
On dissout, à une température de -20 , 1,05 g du nonapeptide-hydrazide obtenu à l'exemple 23 (séquence partielle F) dans un mélange de 50 ml de diméthylformamide et 1,2 ml d'un mélange de dioxanne et d'acide chlorhydrique 2N. On ajoute 0,116 ml de nitrite de tertio-butyle, on agite pendant 10 minutes à -20 , on ajoute 1,4 ml de triéthylamine, 3,1 g d'hexa-trifluoro-
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acétate du tricosapepfjide obtenu à l'exemple 28 (séquence par- tielle AB1CDE) et 5 ml d'eau et on agite pendant 16 heures à une température de 0 . On évapore à siccité et on lave le résidu successivement à l'éther diéthylique, au chloroforme et à l'acétone.
On obtient ainsi le dotriacosapeptide protégé à l'état brut que l'on dissout dans 100 ml d'acide acétique 0,3 N. On traite la solution par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate et on ajoute 50 ml d'hydroxyde d'ammonium 0,6 N. On règle le pH à 6,5 et on verse la solution ainsi obtenue sur une colonne de carboxy-méthyl-cellulose(de 10 cm de diamètre et 100 cm de hauteur)équilibrée avec une solution tampon d'acétate
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d'ammonium 0,15 N. L'élution est effectuée avec.une solution tampon d'acétate d'ammonium de concentration et/pH croissants (etc 0,15 N à 0,4 N et de pH 6,5 à pH 7,0).
On lyophilise à trois reprises les fractions réunies contenant le peptide à l'état pur, on lave le résidu avec de l'éthanol et ensuite avec de l'éther diéthylique, et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé. On obtient ainsi l'hexa-acétate octahydraté du BOC-C
EMI10.1
Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cßs-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-LeuLÂsri 7 Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2' qui fond à 2200 en se décomposant; [a]20= -58 dans l'acide acétique 1 N.
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6 N pendant 15 heures) donne la composition suivante en acides aminés:
EMI10.2
Alal,l, Arg2,o' ASP3,9' Cys/21,6' Glu, 2' Gly .310, His 1,1' Leu2,9' rilel0 Phe 310, Pro 2,1' Ser38, Thrl,9' Tyrl,O, Val 0,9 (Trp 1,0 par spectrophotométrie).
EXEMPLE 6: tert.-butyloxycarbonyl-L-hémicystinyl-L-séryl-L-
EMI10.3
asparaginyl-L-leucyl-L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl- L-valyl-L-leucyl-L-séryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto- phanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl- L-asparaginyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-Lphénylalanyl-L-séryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-Lphénylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-Lprolinamide (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-
EMI10.4
Trp-Arj-AS::-.T.W'.:-AS::-A,c¯n-Phn-T7i S-ArÛ-Pho-Çen-l:l y-A11 eGly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH.).
On dissout 1,0 g du nonapeptide obtenu à l'exemple 25 (séquence partielle F4) dans 10 ml de diméthylformamide, on
EMI10.5
ajoute 1,5 g de td-hyàroxysuccinimide et 0,52 g de dic-CeL'9-ga4bodi- imide, on agite pendant 6 heures à une température de 25 , on filtre et on évapore le filtrat à siccité. On lave le résidu avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther diéthylique et on sèche: on
EMI10.6
obtient ainsi le 30C-Cßs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr ßs-Val-Leu-OSu fondant à 242 . On dissout 1,2 g du produit obtenu dans 10 ml de
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d1r:"éthYlrormatnid.t - on:ajoute 3,1 g d' hëxa-triflùoréï-acétàte 'du tricosapeptide obtenu à l'exemple 28 (séquence partielle AB1CDE), 0,4 ml de triéthylamine et 1,2 g de N-hydroxysuccinimide et on agite pendant 16 heures 31 25 .
On évapore à siccité, on lave le résidu successivement à l'éther diéthylique au chloroforme et à l'acétone. On obtient ainsi le dotriacontapeptide protégé à l'état brut que l'on dissout dans 100 ml d'acide acétique 0,3 N.
On traite cette solution par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate et on ajoute 50 ni! d'hydroxyde d'ammonium 0,6 N.
On règle le pH à 6,5 et on verse la solution ainsi obtenue sur une colonne de carboxy-méthyl -cellulose(de 10 cm de diamètre et 100 cm de hauteur) équilibrée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,15 N. L'élution est effectuée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium de concentration et de pH croissants (de 0,15 N à 0,4 N et de pH 6,5 à pH 7,0). On lyophilise les fractions réunies contenant le peptide à l'état par, on lave le résidu avec de l'éthanol et ensuite avec de l'éther diéthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé.
On obtient ainsi l'hexa-acétate octahydraté du BOC-Cs-Ser-Asn-Leu- Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His- Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 qui fond à 226 (avec décomposition); [a]20= -58 dans l'acide acétique 1 N.
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6 N, pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés:
EMI11.2
l,1' Arg 2,0' Asp 319, Cys21,6' GIUl,2' Gly 3,0$ l,1' Leu2,9' Nlei,,, Phe30, Pro 2,1' Ser3,8' Thrl9' l,0' Val 0,9 (Trp 1,0 par spectrophotométrie).
EXEMPLE 7 : pivaloyl-L-hémicystinyl-L-séryl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L- séryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L- asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L- phénylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phénylalanyl-L- séryl-glycyl-L-méthionyl-glycyl-L-phénylalanyl-glycyl-
L-prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide (Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-
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Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-
Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2).
On dissout 1,0 g du nonapeptide obtenu à l'exemple 29 (séquence partielle F5) dans 10 ml de diméthylformamide, on ajoute 1,5 g de N-hydroxysuccinimide et 0,52 g de dicyclohexylcarbodi-imide, on agite pendant 6 heures à 25 , on filtre et l'on évapore le filtrat à siccité. On lave le résidu avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther diéthylique et on sèche: on obtient le
EMI12.1
P iv-C ly.,3 -S er- Asn-Leu -Ser-TIr.-Cs'-Val -Leu- OSu fondant à 242 . On dissout le produit obtenu dans 10 ml de diméthylformamide, on ajoute 3,1 g d'hexa-trifluoro-acétate du tricosapeptide obtenu à l'exemple 20 (séquence partielle ABCDE), 0,4 ml de triéthylamine et 1,2 g de N-hydroxysuccinimide et on agite pendant 16 heures à 25 . On évapore à siccité, on lave le résidu successivement à l'éther diéthylique, au chloroforme et à l'acétone.
On cbtient ainsi le dotriacontapeptide protégé à l'état brut que l'on dissout dans 100 ml d'acide acétique 0,3 N. On traite cette solution par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate et en ajoute 50 ml d'hydroxyde d'ammonium 0,6 N. Or. règle le pH à 6,5 et on verse la solution ainsi obtenue sur une colonne de carboxy-méthyl-cellulose (de 10 cm de diamètre et 100 cm de hauteur) équilibrée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium 0.15 N. L'élution est effectuée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium de concentration et de pH croissants (de 0,15 N à 0,4 N et de pH 6,5 à pH 7,0). On lyophilise les fractions réunies contenant le peptide à l'état pur et on lave le résidu à l'éthanol et ensuite avec de l'éther diéthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé.
On obtient ainsi l'hexa-acétate octahydraté du Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-
EMI12.2
Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-'Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Net-Gly-PheGly-PI'0-Glu-Thr-pro-NH2 qui fond à 2160 en se décomposant; la) 20 = -56 dans l'acide acétique 1 N.
L'hydrolysa totale (acide chlorhydrique 'ON pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés:
EMI12.3
1,1' Arg2,0' ÀSP3,9' Cys?1,6' Glul,20 Y3,0' i,1' Leu2,9' >.iet , Phe 3,0' pr02,l' Sur 3,8 1 Thr,@9, Tyx'1,0' V^.1 0,9 (Trp 1,0
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par spectrophotométrie).
EXEMPLE 8 :
EMI13.1
pivaloyl-L-héinicystinyl-L-sétyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl-L-valyl-L-leucyl-Lséryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-
EMI13.2
asparaeinyl-L-leucyl-L-aspaz.agin>-1-L-asparaginyl-L- phénylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phénylalanyl-Lséryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phénylalanyl-glycyl- L-prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide
EMI13.3
(Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-TyrTrp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-NleGly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2).
On dissout 1,0 g du nonapeptide obtenu à l'exemple 29 (séquence partielle F5) dans 10 ml de diméthylformamide, on ajoute 1,5 g de N-hydroxysu :inimide et 0,52 g de dicyclohexyl- carbodi-imidc et on agite p:ndant 6 heures à 25 . Après cela on filtre, on évapore le filtrat à siccité, on lave le résidu avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther diéthylique et on sèche: on
EMI13.4
obtient ainsi le Iàv-C-La:ù-Ser-TÙ.s-Èal-Leu-0Su fondant à 242 .
On dissout le produit obtenu dans 10 ml de diméthylformamide, on ajoute 3,1 g d'hexa-triîluoro-acétate du tricosapeptide obtenu à l'exemple 28 (séquence partielle ABCDE), 0,4 ml de triéthylamine ainsi que 1,2 g de N-hydroxysuccinimidc et on agite pendant 16 heures à 25 . On évapore à siccité et on lave le résidu successivement à l'éther diéthylique, au chloroforme et à l'acétone. On obtient ainsi le dotriacontapeptide protégé à, l'état brut que l'on dissout dans 100 ml d'acide acéti-
EMI13.5
que 0,3 N. On traite la solution par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate et on ajoute 50 ml d'hydroxyde d'ammonium 0,6 N.
On règle le pH à 6,5 et on verse la solution ainsi obteue sur une colonne de carboxyméthyl-cellulose (de 10 cm de diamètre et 100 cm de hauteur) équilibrée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,15 N. On effectue l'élut:! on avec une solution tampon d'acétate d'ammonium de concentration et de pH croissants (de 0,15 N à 0,4 N et de pH 6,5 à pH7,0). On lyophilise à trois reprises les fractions réunies contenant le peptide à
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l'état pur et on lave le résidu à l'éthanol et ensuite avec de l'éther diéthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé.
On obtient ainsi l'hexa-acétate octahydraté du Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-AsnLeu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-
EMI14.1
Thr-Pro-NH2 qui fond â 216 en se décomposant; [a]0 - -56 dans de l'acide acétique 1 N.
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6N pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés:
EMI14.2
Ala 1,1' Arg2 0' Asp -3,9' Cys/2 1,6 , Glu, 21 Gly- 0, Hisl l, Leu 2,9' ?1e1,0' Phe30, Pro 2,1' Ser 3,8' Thr 119, Tyrl,O' Val 0,9 (1-rp 1,0 par spectrophotométrie).
EXEMPLE 9 : Ethoxycarbonyl-L-hémicystinyl-L-séryl-L-asparaginylL-leucyl-L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl-L-valyl-L-
EMI14.3
leucyl-L-séryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryntophanyl-Larginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-aspara- ginyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phényl- alanyl-L-séryl-glycyl-L-méthionyl-glycyl-L-phénylalanyl-
EMI14.4
glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-I,-pi,olinamide (EOC-Cµs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cls-Val-Leta-Ser-Ala-Tyr- Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-
Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2).
On dissout 1,0 g. du ncnapeptide obtenu à l'exemple 30 (séquence partielle F6) dans 10 ml de diméthylformamide, on
EMI14.5
ajoute 1,5 g de N-hydroxysucc.ni.m1.de et 0,52 g de dicyclohexyl- carbodi-imide, on agite pendant 6 heures à 25 , on filtre et on évapore le filtrat à siccité. On lave le résidu avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther diéthylique et on sèche. On obtient le
EMI14.6
EOC-Cßs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cts-Va1-Leu-OSu fondant à 242 . On dissout le produit obtenu dans 10 mi. de diméthylformamide, n ajoute 3,1 g d'hexa-trif1uoro-aoétroe du tricosapeptide obtenu à l'exemple 20 (séquence partielle #CDE), 0,4 ml de triéthylamine et 1,2 g de N-hydroxysuccini*,ritie et on agite pendant 16 heures à 25 .
On évapore à siccité et on lave le résidu successivement à 1'±cher diéthylique, au chloroforme et à l' acétone. On obtient
<Desc/Clms Page number 15>
ainsi le dotriacontapeptide protégé à l'état brut que l'on dissout dans 100 ml d'acide acétique 0,3 N. On traite la solution par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate et on ajoute 50 ml d'hydroxyde d'ammonium 0,6 N. On règle le pH à 6,5 et on verse la solution ainsi obtenue sur une colonne de carboxy-méthylcellulose (de 10 cm de diamètre et 100 cm de hauteur) équilibrée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,15 N. L'élution est effectuée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium de concentration et de pH croissants (de 0,15 N à 0,4 N et de pa 6,5 à pH 7,0).
On lyophilise à trois reprises les fractions
EMI15.1
rcunicG contenant 1 e pc#tidc ù l'état pur, en lave le résidu avec de l'éthanol et ensuite avec de l'éther diéthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé. On obtient ainsi l'hexa-acétate octahydraté du EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-
EMI15.2
Cys-Val-L-eu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asil-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe- Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Prc-NH 2 qui fond à 240 en se décomposant; [a]20= -56 dans l'acide acétique 1 N.
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6N pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés:
EMI15.3
l,1' Arg2,0' ASP3,9' 'l,6' l;2' G1Y..0' Hi---1,1' Leu2,9, Met,@0, Phe30, Pro2,11 Ser,,8, Thrl9' '1.0' Val 0,9 (1r'h 1,0 par spectrophotométrie). EXEMPLE 10:
EMI15.4
Ethoxycarbonyl-L-hétnicystinyl-L-séryl-L-aspana4inylL-leucyl-L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl-L-valyl-Lleucyl-L- séryl-L-alll1yl..
T.I- tyrosyl-L- tryptophyl-arginyl- L- aSï ';ú"üg:tnyl- L..l eucyl- L- a::;paraginy 1- L- aclpraginyl-L-phénylala.r.y7.-L-histidyl-L-arginyl-L:-phznyl- ¯ ¯ alanyl-L-séryl-glycyl-L'-. r!orleucyl-glycyl-L7hénylalanylglycyl-.L- pro lyl-T.", glu tamyl -L-, I.-hr donyi-L- pr6 11 nim '4e (E(:C-Cys er-Asn-=eu-Sèj=Thr-Cjrs-Val-Lea-S;l'-:la-T1r- x, Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Aar;ie-ais-Arg-Phe-Ser=ûly-11 e- ü.y-Phe-Gly-prO-Glu-Tf.P!0-NH2)' ;.f"'... ¯;¯ i""1 , (';)1 dissout 1,0 g du nonapeptide obtenu à l !"eml).2'''9: .
(séquence partielle F6) dans 10 1."";"'-e'-diméthYlfOj,"manÍide, on Óu:9: .
1.5 g de N-l'1ydroxysucainimide et 0,59 g de dicyclohexylcarbpdj.--'
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EMI16.1
11df!",' on: agi te pendant 6 heures à 25 , on filtre et on évapore le filtrat à siccité. On lave le résidu avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther diéthylique et on sèche. On obtient le EOC-Cys-Ser-
EMI16.2
Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Lcu-OSu fondant à 242 . On dissout le produit obtenu dans 10 ml de diméthylformamide, on ajoute 3,1 g d'hexa-trifluoro-acétate du tricosapeptide obtenu à l'exemple 28 (séquence partielle AB1CDE), 0,4 ml de triéthylamine et 1,2 g de N-hydroxysuccinimide et on agite pendant 16 heures à 25 . On évapore à siccité et on lave le résidu successivement à l'éther di.éthylique, au chloroforme et à l'acétone.
On obtient ainsi le dotriacontapeptide protégé à l'état brut que l'on dissout dans 100 ml d'acide acétique 0,3 N. On traite la solution par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate et on ajoute 50 ml d'hydroxyde d'ammonium 0,6 N. On règle le pH à 6,5 et on verse la solution ainsi obtenue sur une colonne de carboxy-méthylcellulose (de 10 cm de diamètre et 100 cm de hauteur) équilibrée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,15 N. L'élution est effectuée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium de concentration et de pH croissants (de 0,15 N à 0,4 N et de pH 6,5 à pH 7,0). On lyophilise à trois reprises les fractions réunies contenant le peptide pur, on lave le résidu avec de l'éthanol et ensuite avec de l'éther diéthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé.
On obtient l'hexaacétate octahydraté du EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-
EMI16.3
Gly-Pne-Gly-Pro-Glu-l'nr-l'ro-NI4 qui fond à 240 (avec décomposition);[a]D = -56 dans l'acide acétique normal.
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6N pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés:
EMI16.4
Aia 1,1 Ar1;20 ASP3,9' Cys/21,6' GIUl,2' G1y30' , His 1,1 Leu 2,9' Nlel 0' Phe .3, 0' Pro , Ser 8' Thr 1,91 Tyrl 0' Val 0,9 (Trp 1,0 par spectrophotométrie). EXEMPLE 11:
EMI16.5
p-mercaptopropionyl-L-séryl-L-asp.raginyl-L-leucyl-Ls6ryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl-L-valyl-L-leucyl-Lséryl-L-alaiiyl-L-tyrosy1-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-
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EMI17.1
asparaginyl-L-leucyl-L-asparag1nyl-L-asparag1nyl-Lphénylalanyl-L-histîdyl-L-arglnyl-L-phdnylalanyl-Lséryl-glycyl-L-méthionyl-gl5cyl-L-phénylalanyl-glycyl- L-prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide (MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-TrpArg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-
EMI17.2
Phe-Gly-Pi-c-Glu-Thr-Pro-Nli 2).
On dissout, à une température de -20 , 1,05 g d'octapeptide-hydrazide obtenu à l'exemple 32 (séquence partielle F8) dans un mélange de 50 ml de diméthylformamide et 1,2 ml d'un mélange de dioxanne et d'acide chlorhydrique binormal, on ajoute 0,116 ml de nitrite de tertio-butyle et on agite pendant 10 minutes à -20 . On ajoute ensuite 1,4 ml de triéthylamine,3,1 g d'hexa-trifluoro-acétate du tricosapeptide obtenu à l'exemple 20 (séquence partielle ABCDE) et 5 ml d'eau et on agite pendant 16 heures à 0 . On évapore à siccité et on lave le résidu sucdessivement à l'éther diéthylique, au chloroforme et à l'acétone.
On obtient ainsi le peptide à l'état brut que l'on dissout dans 100 ml d'acide acétique 0,3 N. On traite la solution par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate et on ajoute 50 ml d'hydroxyde d'ammonium 0,6 N. On règle le pH à 6,5 et on verse la solution ainsi obtenue sur une colonne de carboxy-méthylcellulose(de 10 cm de diamètre et 100 cm de hauteur) équilibrée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,15 N. L'élution est effectuée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium de concentration et de pH croissants (de 0,15 N à 0,4 N et de pH 6,5 à pH 7,0). On lyophilise à trois reprises les fractions réunies contenant le peptide à l'état pur, on lave le résidu à l'éthanol et ensuite avec de l'éther diéthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé.
On obtient l'hexaacétate octahydraté du MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-
EMI17.3
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-GlyPhe-Gly-Pro-GluThr-Pro-NH2 qui fond à 2200 (avec décomposition): [a]20= -56 dans l'acide acétique normal..
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6N pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés :
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Alall' Ârg20, Asp 3,9' "Y$/21,01 G.ul2' Gly3'0' Hisl,l' Leu29' !uletl0, Phe30, Pr02,l' Ser38, Thrl,9' Tyrl,O' Val 0,9 (Trp 1,0 par spectrophotométrie). EXEMPLE 12 :
EMI18.2
8-mercaptopropionyl-L-séryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L- éryl--thréonyl-L-hémlcystlnyl-L-valyl-L-leucyl-Lséryï.-L-alnyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-Lasparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-Lphénylalanyl-t-histldyl-L-arglnyl-L-phénylalanyl-Lséryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phénylalanyl-glycylL-prol yl-L- gl!' tamyl-L- thréony1-L-prollnarnide (MCP-Scr-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-TrpArg-Asn-Leu-Azn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-
Phe-Gly-Pro-Gl -Thr-Pro-NH2).
On dissout, à une température de -20 , 1,05 g d'octapeptide-hydrazide obtenu à l'exemple 32 (séquence partielle F8) dans un mélange de 50 ml de diméthylformamide et 1,2 ml d'un mélange de dioxanne et d'acide chlorhydrique binormal, on ajoute 0,116 ml de nitrite de tertio-butyle et on agite pendant 10 minutes à -20 . On ajoute ensuite 1,4 ml de triéthylamine, 3,1 g d'hexa-trifluoro-acétate du tricosapeptide obtenu à l'exemple 28 (séquence partielle AB1CDE) et 5 ml d'eau et on agite pendant 16 heures à 0 . On évapore à siccité et on lave le résidu successivement à l'éther diéthylique, au chloroforme et à l'acétone.
On obtient ainsi le dotriacosapeptide à l'état brut que l'on dissout dans 100 ml d'acide acétique 0,3 N. On traite la solution par 20 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate et on ajoute 50 ml d'hydroxyde d'ammonium 0,6 N. On règle le pH à 6,5 et on verse la solution ainsi obtenue sur une colonne de carboxyméthyl-cellulose (de 10 cm de diamètre et 100 cm de hauteur) équilibrée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,15 N.
L'élution est effectuée avec une solution tampon d'acétate d'ammonium de concentration et de pH croissants (de 0,15 N à 0,4 N et de pH 6,5 à pH 7,0). On lyophilise à trois reprises les fractions réunies contenant le peptide à l'état pur, on lave le résidu à l'éthanol et ensuite avec de l'éther diéthylique et on
<Desc/Clms Page number 19>
EMI19.1
sèche sur hydroxyde de potassfi::;.:#ous 'vide pôûs'sé:;0n: obtiont=- 1 'hcxa-acétatédodécEdïuté du ->1.0P.Ser-Asn":Leu'-Ser-Thr-Cys-Val-' Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-GlyNle-Gly-Phe-Gly-pro-Olu-Thr-pro-NH2 qui fond à 220 (avec décom- 20 position [a]20= -57 dans l'acide acétique 1 N.
L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6 N pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés :
EMI19.2
Aiai,i> Arg2,o ASP3,9J CYS/21,o> Glul,2, GlY3JO' His l'il Leu2,9J Nlei,oi, Phe3@0, Pro2,1' Ser,@8, Thrl,9J Tyrl,OJ Val 0,9 (Trp 1,0 par spectrophotométrie).
La préparation des corps de départ utilisés aux exemples 1 à 12 est exposée ci-dessous: EXEMPLE 13: Séquence partielle A:
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L-phénylalanyl-glycyl-L-prolyl-Y-tertio-âutyloxy-Lglutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
On dissout à -5 , 134 g de Z-Thr-NH-NH2 dans 2 litres d'acide chlorhydrique 1 N et on ajoute 0. 55 1 de nitrite de sodium 1 N. Après 5 minutes, on ajoute du carbonate de potassium jusqu'à pH 9, on extrait l'azide ainsi formé par de l'acétate d'éthyle et on ajoute une solution de 80 g de chlorhydrate de H-Pro-NH2 dans 100 ml d'eau, 500 ml de diméthylformamide et 77 ml de triéthylamine. On évapore l'acétate d'éthyle sous pression réduite à 20 et on laisse reposer pendant la nuit à 25 .
On évapore le reste de la solution sous pression réduite, on dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle, on lave successivement à l'eau, à l'acide chlorhydrique dilué et avec une solution aqueuse de carbonate de potassium. On sèche ensuite sur sulfate de sodium, on évapore sous pression réduite, on dissout dans de l'acétate d'éthyle chaud et on refroidit. On obtient le Z-Thr-Pro-NH2 qui fond à 148 ; [a]20= -72 dans l'acide acétique à 95%. On dissout ensuite 90 g de Z-Thr-Pro-NH2 dans 2 litres de dioxanne et 260 ml d'acide chlorhydrique normal et on hydrogène sous pression normale à 20 en présence d'un catalyseur au palladium. On filtre, on évapore la solution sous pression réduite et oh lave le résidu
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à l'acétate d'éthyle.
Il se forme le chlorhydrate de H-Thr-Pro-
EMI20.1
PIFI2 qui fond à 216 ; [a]DO= 0 dans l'acide acétique à 95%.
On dissout le produit ainsi obtenu dans 500 ml de diméthylformamide, 50 ml d'eau et 32 ml de triéthylamine et on ajoute 118 g de Z-Glu(OTB)-OCP et 800 ml de tétrahydrofuranne. On laisse reposer pendant la nuit à 20 , on évapore sous pression réduite et on cristallise le résidu dans de l'éther éthylique. On obtient le Z-Glu (OTB)-Thr-Pro-NH qui fond à 65 (avec décomposition); 20 [a]D= -18 dans le diméthylformamide.
EMI20.2
On dissout 80 g de Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 dans 1,5 1 de dioxanne et 200 ml d'eau et on hydrogène sous pression normale à 20 en présence d'un catalyseur au palladium.
On filtre la solution, on évapore sous pression réduite et on ajoute de l'éther diéthylique au résidu : obtient ainsi le H-Glu(OTB)- Thr-Pro-NH2 qui fond à 65 (en se décomposant); [a]20= -28 dans le diméthylformamide. On dissout à 0 le produit obtenu dans 700 ml de diméthylformamide, on ajoute 200 ml d'acétonitrile, 68 g de Z-Phe-Gly-Pro-OH et 32 g de dicyclohexylcarbodi-imide.
On laisse reposer pendant la nuit à 20 , on filtre, on évapore sous pression réduite et on ajoute de l'acétate d'éthyle. On lave ensuite la solution à l'eau, à l'acide chlorhydrique dilué et avec une solution aqueuse de carbonate de potassium, on sèche sur sulfate de sodium, on évapore sous pression réduite et on cristallise le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et
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d'éther éthyliqu,1: on obtient le Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro- NH2 qui fond à 120 (avec décomposition); [a]20= -66 dans le
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diméthyJ.formam1de. On dissout le produit obtenu dans 1500 ml de dioxanne et 300 ml d'eau, en ajoute 30 g de charbon palladié à 10% et on hydrogène jusqu'à ce que l'absorption d'hydrogène cesse.
On filtre, on évapore le filtrat et on cristallise le résidu dans du diôxanne. On obtient le H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2
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qui fond à 153 ; a = -79 dans le diméthyli'ol'rI1mnide.
EXEMPLE 14: Séquence partielle B :
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N- tertio- bu tyloxycv.rbonyl-L-séryl-glycyl..L-méth1 ony1- glycine
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(BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) ester éthylique de la L-méthionyl-glycine (H-Met-Gly-OEt).
On dissout 65 g de BOC-Met-OH dans 900 ml de chloroforme, on refroidit à -10 et on ajoute 30 ml de N-méthylmorpholine et 35,6 g de chloroformiate d'isobutyle. Apres 10 minutes, on ajoute lentement une solution de 30 g d'ester éthylique de la glycine dans 200 ml de chloroforme et on laisse réagir pendant une heure à 20 . On extrait avec de l'hydroxyde d'ammonium 0,5 N, ensuite avec de l'acide sulfurique 0,2 N, on lave à l'eau jusqu'à neutralité, en sèche sur sulfate de sodium et on concentre.
Après recristallisation dans de l'éther de pétrole, on obtient
EMI21.1
le Boc-1<et-Giy...ozt qui fond à 49 ; [a]D = -19 dans l'éthanol. On dissout le produit ainsi obtenu dans 750 ml d'un mélange d'acide chlorhydrique 4 N et d'éthanol, on abandonne pendant une heure à 25 , on évapore, on lave le résidu à l'éther diéthylique et on sèche jusqu'à poids constant. On obtient ainsi'le chlorhydrate
EMI21.2
de la 11-f:et-Gly-OEt sous forme d'une huile. b) Ester éthylique de la N-tertio-butyloxycarbonyl-L-séryl- glycine (BOC-Ser-Gly-OEt)
On dissout 12,5 g de N-tertio-butyloxycarbonyl-sérine dans 100 ml de chloroforme, on ajoute 6,1 g de N-méthylmorpholine puis, goutte à goutte, 8,2 g de chloroformiate d'isobutyle.
Apres 10 minutes, on ajoute une solution de 6,6 g d'ester éthylique de la glycine dans 50 ml de chloroforme et on agite pendant une heure à la température ambiante. On lave le mélange réactionnel avec de l'ammoniaque diluée, puis avec une solution d'acide chlorhydrique, on sèche sur sulfate de sodium et on évapore la phase
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organique. On obtient le ü0f:--5ez--Gly-OEt tous forme d'une huile: la] 20 -3 dans le dl.!éthYl!'?1;'mamide. c) Hydrazide de la N-tertIo-butyloxycarbonyl-L-séryl-glycine (BOC-Ser-Gly-NHNH 2) On dissout 19,4 '@-de BUC-Ser-Gly-OEt dans 270. mil d'éthanol, on ajoute 48,6ml d'hydrate d'hydrazine et on laisse reposer pendant 2 jours à la. température ambiante.
On évapore en-
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suite la solution et on cristallise le résidu dans un mélange de méthanol et d'éther diéthylique dans le rapport 1:3. On ob-
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tient le BOC-Ser-Gly-NHNli2 qui fond à 157 ; la] D 20 -5 dans le diméthylformamide. d) Ester éthylique de la N-tertio-butyloxycarbonyl-L-séryl- glycyl-L-méthionyl-glycine (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
A 200 ml de diméthylformamide, on ajoute 25 ml d'une solution d'acide chlorhydrique 4N dans de l'éther diéthylique et
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on y dissout 11 g de BOC-Ser-Gly-NHNH2 obtenu sous c) à une température de -10 .
A la même température, on ajoute ensuite goutte à goutte 5,4 ml de nitrite de tertio-butyle et à la solution ainsi obtenue on ajoute d'abord 18 ml de triéthylamine puis une solution de 12 g de H-Met-Gly-OEt obtenu sous a) dans 100 ml
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de diméthylforma::j.de et 6,2 ml de triéthylamine. On agite pen- dant 3 heures à la température ambiante et après 12 heures on filtre et on évapore. On dissout le résidu dans du chloroforme, on lave successivement avec une solution diluée d'ammoniaque et d'acide chlorhydrique, on sèche sur sulfate de sodium et on éva-
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pore.
On obtient le BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt; [a]D = -11E dans le diméthylformamide. cj Tertio-butyloxycarbonyl-L-séryl-glycyl-L-méthionyl-glycine (BOC-Ser-Gly-b2e -Gly-OH )
On dissout 24 g de BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt dans 250 ml de dioxanne, on ajoute 75 ml de lessive de soude caustique 1 N, on agite pendant une heure à 25 , on traite par 150 ml de Dowex-
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50 sous sa toi,me H+' urC=Pil tre, on évapore le filtrat et on cristallise le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther diéthylique. On obtient le BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH qui fond à 87 (avec décomposition); [a]20=-17 dans le dimétllyl-- formamide.
EXEMPLE, 15 : Séquence partielle C:
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ri , * N imidazolyl -di trityl-L-IListiJyl-L-a.-ginyl-l-p',.i6nyl- alanyl-hydrazide
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(Tr.t-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2).
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a) z-Arg(N02)-Phe-Or-te .-- -1-
On dissout 51,8 g de H-Phe-OMe dans 1 'litre d'éther et environ 50 ml d'eau glacée et, tout en agitant et en refroi- dissant, on ajoute suffisamment de carbonate de sodium jusqu'à séparation complète de l'eau. On filtre et on évapore le filtrat jusque a poids constant ce qui donne le H-Phe-OMe sous forme d'une huile incolore.
On dissout 67,6 g de Z-Arg(NO2)-OH dans 300 ml d'acéto- nitrile et 150 ml de diméthylformamide et on ajoute 41,2 g de H-Phe-OMe obtenu ci-dessus à cette solution. On refroidit ensuite à -20 et on ajoute une solution de 43,4 g de dicyclohexylcarbodi- imide dans 100 ml d'acétonitrile. On laisse reposer le tout pen- dant 4 heures au réfrigérateur,' tout en agitant de temps en temps.
On sépare par filtration le précipité qui s'est formé et on évapore le filtrat. On dissout le résidu d'évaporation dans 1 1 d'acétate d'éthyle et on lave à froid successivement avec une solution normale de lessive de soude, de l'eau, de l'acide sul- furique normal, de l'eau et pour finir avec une solution satura de chlorure de sodium. On sèche la phase d'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium et on l'évaporé complètement.
On obtient le
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Z-Arg(N02)-Phe-Oife qui fond à 131-133 âpres cristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole; [a]D-
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= -7 dans le méthanol et -4 dans le dimétilylformamide. b) H-A..(N 2)-Phe-Or4e . 0,5 H2O - 1,2 HBr'
On dissout 20 g de Z-Arg(NO2)-Phe-OMe dans 50 ml d'acétate d'éthyle et on ajoute, tout.en refroidissant légérement, 50 ml d'acide bromhydrique à 40% dansai'acétate d'éthyle. Or. laisse reposer le tout pendant 1 haure à 20 tout en agitant de temps en temps. Après avoir évaporé complètement, on dissout le résida dans 200 ml d'eau et on lave à deux reprises à l the On évapore complètement la phase aqueuse et on recristallise le résidu dans un mélangé de méthanol et d'éthor.
Le produit fond -
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?65-167 (avec décomposition); [il 20= +ruz dans le méthanol et'-+140 dans le dim6thylforma-..nide. ,4' cr ,Z-His(Z)-Arg(NÓ2)-Phe-or-tc . , w .- -;--.
On dissout ti6,1 J g dë H-Art(N02 ) -'he-Ohte.,¯ 0,5 i'0 1, 2
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HBr dans 100 ml d'eau, on chauffe et ensuite on refroidit. On ajoute du chloroforme et de la glace et on règle le pH à 9 avec de l'ammoniaque. On lave la phase chloroformique encore une fois à l'eau, on sèche sur carbonate de sodium et on filtre. Au filtrat ainsi obtenu on ajoute une solution de 44.5 g de Z-His (Z)-OH, 12,1 g de N-hydroxysuccinimide dans 200 ml d'acétonitrile et 100 ml de pyridine, on refroidit le tout à -20 et on ajoute une solution de 21,1 g de dicyclohexylcarbodi-imide dans 70 ml d'acétonitrile. On laisse reposer ensuite pendant 4 heures au réfrigérateur, tout en agitant de tjmps en temps.
On sépare par filtration le précipité qui s'est formé et on évapore le filtrat.
On reprend le résida dans de l'acétate d'éthyle et on lave successivement avec une solution de carbonate de potassium à 10% (pH environ 10), de l'eau, une solution saturée de chlorure de sodium, de l'eau, une solution saturée de chlorure de sodium, de l'acide sulfurique (pH 3), de l'eau et une solution de chlorure de sodium. Après séchage sur sulfate de sodium on évapore com- plètement la phase d'acétate d'éthyle ce qui donne une mousse beige claire. On dissout cette mousse dans un peu de Méthanol, on fait précipiter par addition d'éther et on répète l'opération.
On sépare les phases éthérées par décantation et on sèche le
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précipité; on obtient le Z-Ilis(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe sous forme d'une mousse amorphe; [a]20= -8 dans le méthanol et -8 dans le diméthylformamide.
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d) H-His-Jl.rg-Phe-Oi,ye . 4 HC1
On délaie 100 g de palladium à 10% sur charbon actif dans 200 ml d'acide chlorhydrique 1 N et on ajoute le mélange à
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une soluLLon de 25 g de Z-ilis(Z)-Arg(NO 2)-Phe-OMe dans 800 ml d'acide acétique glacial. On hydrogène le tout pendant 2 heures et on sépare ensuite le catalyseur par filtration. On hydrogène à nouveau le filtrat après y avoir ajouté 5 g de palladium à 10% sur charbon actif dans de l'eau.
Après 5 heures et demie, l'hydrogénation est terminée (environ 80% de la quantité théorique d'hydrogène sont absorbés). On sépare le catalyseur par filtra- tion et on évapore complètement le filtrat : obtient le H-His- Arg-Phe-OMe ' 4 HCl sous forme d'une mousse amorphe.
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e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe . HCl
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On dissout 21,5 g de H-Hls-Arg-Phe-OMe . 4 HCl dans 100 ml de pyridine et dans environ 100 ml de diméthylformamide.
A une température d'environ +5 , on ajoute de la triéthylamine jusqu'à pH 9 et on ajoute ensuite goutte à goutte, en l'espace de 5 minutes, une solution de 29 g de chlorure de trityle dans 300 ml de pyridine. L'addition terminée, on contrôle le pH de temps en temps et, le cas échéant, on règle de nouveau à environ pH 9 en ajoutant de la triéthylamine. Après environ 4 heures, on évapore le tout, on reprend le résidu par du chloroforme et de l'eau et, tout en ajoutant un peu d'acide chlorhydrique 1 N, on règle le pH à 4. On sépare la phase chloroformique, on la lave à deux reprises à l'eau, on sèche sur sulfate de sodium et on évapore complètement.
On ajoute de l'éther au résidu et on le sépare de l'éther par filtration: on obtient le Trt-His(Trt)- Arg-Phe-OMe ' HCl f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2
On dissout 17 g de Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe ' HCl dans 200 ml de méthanol, on ajoute 40 ml d'hydrate d'hydrazine à la solution ainsi obtenue et on abandonne ensuite pendant 2 jours à la température ambiante. On évapore, on dissout le résidu dans du chloroforme et on lave à l'eau à deux reprises. On sèche la phase chloroformique sur sulfate de sodium et on évapore. On lave ensuite le résidu à l'éther et on sépare par filtration: le résidu ainsi obtenu est le chlorhydrate du Trt-His(Trt)-Arg-Phe-
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liH-1,iH fondant à 153 ; [Ci] ;8= -9 dai)s le diméthylformamide.
EXEMPLE 16 : Séquence partielle ABC :
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Ni-tritYI-L-histiàYI-L-r81nYI-L-phÓnYlalanYl-L-sérYl- glycyl-L-méthionyl-glycyl-L-phénylalanyl-glycyl-Lprolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide
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( ti-fi is- ( Tr t ) -lirg-Phe-Ser-Gl y-i1e t-G1 y-Phe-Gly-Pro-Gl u-Thr-ProNH2). a) L-séryl-glycyl-L-méthionyl-glycyl-L-phénylalanyl-81ycyl-Lprolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide (H-Ser-Gly-j'1et-Gly-Phe-G ly-Pro-G lu-Thr- Pro-}jf! )
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On dissout 6,7 g de BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH obtenu à
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l'exemple 14 (séquérrçe-partielle B), 12 g de H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB)-Thr-Pro-NH2 obtenu à l'exemple 13 (séquence partielle A) et 2,1 g de N-hydroxysuccinimide dans 50 ml de diméthylformamide et 20 ml d'acétonitrile.
On refroidit à 0 , on ajoute 4,0 g de dicyclohcxylcarbodi-imide et on laisse reposer pendant 16 heures à 0 . On élimine le solvant par évaporation, on lave le résidu à l'eau, à l'éther diéthylique et à l'acétate d'éthyle et on le recristaliise dans du chloroforme. On obtient le BOC-Ser-Gly-
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Met-Gly-Phe-Gly-PrO-Glu(OTD)-Thr-Pro-NH2 qui fond à 121 (avec 20 décomposition); [a]20= -47 dans le diméthylformamide. On dissout le produit ainsi obtenu dans 250 ml d'une solution d'acide chlorhydrique 8 N dans le dioxanne.
On agite à 25 pendant 2 heures, on évapcre siccité et on traite le résidu dans de l'éther diéthylique. On obtient ainsi le chlorhydrate du H-Ser-
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Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH 2 [F = 130 (avec décomposition); (a] 20 -48 dans le diméthylformamide]. b) Nlm-trityl-L-his:,idyl-L-arginyl-L-phénylalany,l-L-séryl-glycylL-méthionyl-gl cyl-L-phénylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamylL-thréonyl-L-prolinamide (II-His-l'i'rt)-Arg-E he-Ser-Gly-1>let-(lly-Phe-Gly-Pro-Glu-Ti>r-Pro- NH2)..
On dissout 9,9 g de chlorhydrate de Trt-His(Trt)-ArgPhe-NHNH2 obtenu à l'exemple 15 (séquence partielle C) dans 100 ml de diméthylformamide, on refroidit à -20 , on ajoute 15 ml d'Un mélange de dioxanne et d'acide chlorhydrique 2 N et ensuite 1,16 ml de nitrite de tertio-butyle et on agite pendant 10 minutes à -20 . On ajoute ensuite 28 ml de triéthylamine et 10,0 g
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de Ii-Ser-<Zly-1,iet-Gly-Phe-Gly-Pro-GJ.u-'±hr-Pro-llH obtenu au para- graphe a) précédent, on agite à 0 pendant 4 heures, on filtre et on évapore à siccité. On dissout le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol dans le rapport 8:2, on lave avec de l'ammoniaque diluée et ensuite à l'eau jusqu'à neutralité, on sèche sur sulfate de sodium, on concentre à 100 ml et on fait précipiter par addition d'éther diéthylique.
On dissout de nouveau le précipité dans du diméthylformamide et on fait précipiter
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en ajoutant de l'éthëy diéthylique. On obtient àirisi,. 7:e. Trt-His (Trt)-Arg-Phe-Ser-01yMet-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH fondant 20 à 168 (avec décomposition); [a]20= -43 dans le diméthylform- amide. On dissout le produit obtenu dans 500 ml d'un mélang d'acide acétique et d'eau dans le rapport 8:2, on abandonne pen- dant 3 heures à 40 , on évapore, on lave le résidu à l'éther di- éthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé. On obtient le tri-acétate du H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-
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Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 fondant à 182 (avec décom..
20 position); [a]20= -56 dans l'acide acétique.
EXEMPLE 17 : Séouence partielle D:
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1-(L-aspni,aginyl-L-leucyl-L-asparaeinyl-L-asparaginylL-phénylalanyJ.)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (H-AsnLeu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z) a) 1-(N-tertio-butyloxycarbonyl-L-phénylalanyl)-2-benyloxy- carbonyl-hydrazide (BOC-Phe-NH-NH-Z)
On dissout 72 g de BOC-Phe-OH et 28 g de N-méthyl- morpholine dans 500 ml de chlorure de méthylène et on ajoute goutte à goutte, à -5 , 26 ml de chloroformiate de méthyle. Après 10 minutes, on ajoute encore 44 g de Z-NHNH2 dans 100 ml de chlorure de méthylène et on continue d'agiter à la température ambiante pendant 4 heures. Après extraction par lavage avec de l'acide phosphoreux dilué, on sèche et on évapore.
Après cristallisation dans de l'éther de pétrole, on obtient le BOC-Phe-NH-NHZ fondant à 117 ; [a]20=-5 dans le diméthylformamide. b) l-(N-tertio-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phénylalanyl)-2- benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
On dissout 41 g de BOC-Phe-NHNH-Z dans 400 ml d'acide trifluoro-acétique et on laisse reposer à 20 pendant une heure.
Après évaporation de l'acide trifluoro-acétique, on obtient le H-Phe-NHNH-Z sous forme de trifluoro-acétate cristallisé fondant à 191 ; [a]20= +26,4 dans le diméthylformamide. On dissout cette substance avec 35 g de BOC-Asn-ONP et 30 g de N-méthylmorpholine dans 200 ml. de diméthylformamide.
Après avoir abandonné pendant 16 heures à 20 , on évapore le solvant et on lave le résidu successivement à l'acétate d'éthyle et à l'acide phosphoreux dilué.
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On obtient ainsi le BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z fondant à 210 ; la] 20 -18 dans le diméthylformamide. c) 1- (N- ter tio-butyloxycarbonyl-L- asparagirtyl-L-asparaginyl-L- phénylalanyl)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
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On dissout 26 g de BOC-As(l.Phe-UH-NH-Z dans 200 ml 'd'acide trifluoro-acétique et on abandonne à 20 pendant une heure. Après évaporation du solvant, on dissout dans 100 ml de diméthylformamide et on ajoute 17 g de BOC-Asn-ONP et 15 g de N-méthylmorpholine.
On abandonne pendant 16 heures à 20 , en évapore le solvant et on lave le résidu successivement à l'acétate d'éthyle et à l'acide phosphoreux dilué. On obtient le BOC-Asn-
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- Asn-Piu..NE-NH-Z qui fond à 240 ; [aJ O= -28 dans le diméthylformamide. d) 1-(N-teriio-buiyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asp?iaginy"1-L-asparaginyl-L-phénylalanyl)-2-benzytoxycarbonyl-hyàraide (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z) On dissout 22 g de BOC-Asn-Asn-Phe-PIH-NH-Z dans 150 ml .d'acide trifluoro-acétique et on abandonne pendant une heure à 20 . Après évaporation du solvant, on ajoute au résidu 12 g de BOC-Leu-ONP et 10 g de N-méthylmorpholine dans 100 ml de diméthylformamide.
On laisse reposer pendant 16 heures à 20 , on évapore le diméthylformamide et on lave le résidu successivement à l'acétate d'éthyle et à l'acide phosphoreux dilué. On obtient
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ainsi le BOC-I,ez-Asn-Asr.-Pt-xc-rIH-Nii-Z fondant à 210 ; [a]2= -)4 dans le diméthylformamic;e. e) 1-(I-t;nrtl0r-butyloxyca:bony?-h-asparaginyl-L-leucyl-1,-asp?ragiryl-L-asparaginyl-L-phénylzlan-yl}-2-benzyloxy-cartyonyl-hydrazide (BOC-A!1.-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z) On dissout 57 g de BOC-t,eu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z dans 300 ml d'acide trlfluoro-acétique et on laisse reposer à 20 pendant une heure. Après évaporation du solvant, on cristallise le résidu dans l'éther. On dissout le tétrapeptide-trifluoroacétate dans 400 ml de diméthylformamide et on y ajoute 27 g de
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BOC-Asn-0'et1' et 25 g de r'-m6thylmol'p1'J('Ùine.
Après un abandon de
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16 heuresà une température de 200, on évapore le solvant et on lave le résidu successivement à l'acétate d'éthyle et à l'acide phosphoreux dilué. On obtient ainsi le BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe- NH-NH-Z fondant à 2500 (avec décomposition); [a]20= -34 dans le diméhylformamide.
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f) l-(L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phényl- alanyl)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
On dissout 43,5 g de BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z dans 200 ml d'acide trifluoro-acétique et on abandonne à 20 pen- dant une heure. Après évaporation: on recristallise le résidu dans l'éther.
On obtient le trifluoro-acétate du H-Asn-Leu-Asn- Asn-Phe-NH-NH-Z qui fond à 2420; [a]20= -22 dans le diméthyl- formamide.
EXEMPLE 18: Séquence partielle E :
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tertio-butyloxycarbons1-L-s:.ryl-L-alanyl-L-tyrosyl-Ltryptophanyl-L-arginyl-hydrazide (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NBH2) a) Ester méthylique de la N-tertio-butyloxycarbonyl-L-trypto- phanyl-(guanido)N-nitro-L-arginine
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(BOC-Trp-Arg(N02)-OMe) On dissout 35 g de H-Arg(N02)-01>1<? . HC1, 63 g de BOC- Trp-OCP et 14 g de N-méthylmorpholine dans 300 ml de diméthylformamide et on laisse reposer à 20 pendant 16 heures. Après évaporation du solvant, on reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle et on lave avec de l'acide sulfurique dilué.
On concentre un peu et on ajoute de l'éther ce qui fait cristalliser le BOC-
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Trp-Arg(N02)-Ofle fondant à 1300; [a] D 22L dans le diméthylformamide. b) Ester méthylique de la N-tertio-butyloxyûarbonyl-L-tyrosyl-Lta'yptophanyl-(grianido)11-nitz<,J-arginj,né (BOC-Tyr-Trp-Arg(N02)-Otde) On dissout 15 g de Bne-Trp-Arg(N02)-Otle dans 80 'ml d'une solution méthanolique d'acide chlorhydrique 5N et en abandonne à la température ambiante pendant une heure. Apres
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évaporation du solvant et traitement par de l'éther, le résidu
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est constitué par 13 g de H-Tl'p-Arg(Nu2 )-Of>1e sous forme de chlorhydrate: il fond à 120 ; [a]20= -9 dans le diméthylformamide.
On dissout le dipeptide ainsi obtenu avec 14 g de BOC-Tyr-OCP et 8 g de N-méthylmorpholine dans 200 ml de diméthylformamide.
Après avoir abandonné pendant 16 heures à 20 , on évapore le solvant et on reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle. Après lavage avec de l'acide phosphoreux dilué et concentration du
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solvant, on isole le BOC-Tyr-Trp-Arg(NO 2)-OMe au moyen d 'C'.h!:'p; il fond à 130 ; la] 20= - -11 dans le diméthylformamide.
c) Ester méthylique de la tertio-butyloxycarbonyl-L-alanyl-L- tyrosyl-L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginine
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(BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(N02)-OMe) On dissout 13,5 g de BOC-Tyr-Trp-Arg(NO 2)--OMc dans 130 ml d'une solution méthanolique d'acide chlorhydrique 5 N, on abandonne à 25 pendant une heure, on évapore à siceité, on lave le résidu à l'éther diéthylique, on sépare par filtration, on dissout dans 100 ml de diméthylformamide et on ajoute 8,0 g de BOC-Ala-OCP et 3,0 ml de triéthylamine. Après un abandon de té heures à une température de 25 , on ajoute 500 ml d'acétate d'éthyle, on lave avec de l'acide sulfurique dilué et une solution de bicarbonate de potassium et on évapore à siccité.
Après avoir lavé le résidu avec du chloroforme, on obtient le BOC-Ala-
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Tyr-Trp-Arg(N02)-OtZc qui fond à 120 (avec décomposition); fa!20 -12 dans le diméthylformamide. d) Ester méthylique de la tertio-butyloxycarbonyl-L-séryl-L-
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lanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-(guanido)1'1-nitro-L-arginine (BOC-Sr-Al-Tyr-Trp-Arg(N02)-OMe) On !.US3C1Ut 12,3 g de BOC-Ala-Tyr-Trp-Arr;.f02)-OMe dans 100 1 d'acte onjorhydrique méthanolique 5N, on shandonne à 25' pendant une nentr, on évapore à siccité, on lave résidu avec
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de :''éther dié;lylique, on dissout dans 100 ml de r.1méthyl- formatide et on ajoute 14 ml de triéthylamine et 8,5 g de BOC-
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Ser-N 3' Après un abandon de 16 heures à 0 , on ajc-\Í;;
\i 500 ml d'acétate d'éthyle, on lave successivement à l'acide sulfurique dilué et à l'hydroxyde d'ammonium, or' sèche sur sulfate de sodium
<Desc/Clms Page number 31>
et on élimine le solvant par évaporation. Après avoir lavé le résidu avec du chloroforme, on le dissout dans de l'acétate d'éthyle et on fait précipiter par addition d'éther diéthylique.
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On obtient ainsi le BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(N00)-OMe fondant ù 135 (avec décomposition); [a) 20 = ¯ -15 dans te diméthylformamide. e) Tertio-butyloxycarbonyl-L-séryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto- phanyl-L-arginyl-hydrazide
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$OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2)
On dissout 13,2 g de l'ester pentapeptidique obtenu sous d), dans 300 ml d'acide acétique, on ajoute 600 ml d'eau et 13,2 g de charbon palladié (à 10%) et on hydrogène jusqu'à ce que l'absorption d'hydrogène cesse. On filtre, on évapore, on dissout le résidu dans du diméthylformamide et on élimine les traces d'acide acétique en évaporant à nouveau. On dissout nsui- te le résidu dans 260 ml de méthanol, on ajoute 26 ml d'hydrate d'hydrazine et on abandonne à 40 pendant 16 heures.
Après addition de 260 ml d'éther diéthylique, on sépare le précipité cristallisé par filtration, on lave à l'éther diéthylique et on sèche sur acide sulfurique sous vide poussé. On obtient ainsi
EMI31.3
l'acétate du BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 qui fond à 182'^; 20 [a]20= -8 dans le diméthylformamide.
EXEMPLE 19: Séquence partielle DE:
EMI31.4
N-tert.-bL;tyloxycarbonyl-L-séryl-L-alan3rl-L-tyrosylLT,- -t1'yptoPhanYI-LarSinYlL-aSparaginyiL-leucYI-LSpara g1..wl- L- as par,"\iny 1- L- rh Ô ,:!-l al anyl- hydr az i!3.
(Büc'.-.Ser-Ala-yr-Ti p-Arg-Asn-ieu-Asn-Asn-Phe-NHNH2) a) 1-(N-tertio-butyloxyc;:.rbonyl--L-srryl-T-alan3l-L-tyrosßl-Ltryptophanyl-L-arginyL-L-asparaKinyl-L-leucyl-L-asparasinyï" L-asparainyl-L-phénylalayl)-2-benzy?oxycarbonyl-hydYazid: . .:.; On $éi:.3i.riâ¯t -320 l de diméthy1"f0rmail'lide à -20. , on ajoute 100 m7. ci '.acide chlorhydrique 2 dans du- dioxanne ¯,ét on .' dissout if3 g d'acétate de Bc-ser-A1a'-y-TrpArg-:-2.\Ó}?tE:!lu.' à l'exemple 18 (séquence partielle il) d3\ns.' le mélange a;Lr-si obtenu. On ajoute ensuite 12 'ml-de nJ.ite dé-'ùert1o-butY'J;-, on ¯.(.;.r " ..'.I-.--- -J
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abandonne à -20 pendant 10 minutes et on ajoute goutte à goutte 35 ml de triéthylamine.
Au mélange ainsi formé, on joint une solution de 8,8 g de trifluoro-acétate de H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe- NRNH-Z obtenu à l'exemple 17 (séquence partielle D) et de 17 ml de triéthylamine dans 150 ml de diméthylformamide. On abandonne pendant 16 heures à 0 , on évapore, on dissout le résidu dons un mélange d'acétate d'éthyle et de butanol et on lave avec une solution diluée d'acide acétique et une solution d'ammoniaque.
Après évaporation du solvant, on obtient le di-acétate du BOC-
EMI32.1
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z fondant à 175 ; [ajD = -19,jO dans le diméthylformamide. b) Ter tio-b-a Ü-1rloxycarbonyl-L-s(-à'ryl-L- alanyl -L- tyrosyl-L- tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-Lasnaragirivl-L-phény)-alanyi-hydrazide (BOC-Ser-Ala-q'yr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2)
On dissout 90 g de diacétate de BOC-Ser-Ala-Tyr-TrpArg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z dans 500 ml de diméthylformamide et on hydrogène sur 10 g de Pd/C (à 10%) jusqu'à ce que l'absorption d'hydrogène cesse. Après avoir séparé le catalyseur par filtration, on évapore le solvant et on cristallise le résidu dans un mélange d'éther et d'éthanol.
On obtient le diacétate du
EMI32.2
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 fondant à 265 ; la] 20= ¯ -57 dans le diméthylformamide.
EXEMPLE 20: Séquence partielle ABCDE: L-séryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-
EMI32.3
asparaginyl-L-leucyl-L-aspara8inyl-L-a::;paraginyl-Lphénylalanyl-L-histi.dyl-L-arginyl-L-phénylalanyl.-L- séryl-glycyl-L-méthionyl-glycyl-L-phénylalanyl-glycyl- L-prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-
EMI32.4
L '1cr-Gly-Het-Gl 01 "-Phe-G1y-Pro-Glu-'rhr-Pro-NH ) 2 .
On dissout 15,2 g de diacétate de ROC-Ser-111a-Pyr,f- r1,/ Asn-Leu-Jl.sn-Asn-Phc-NHHH2 obtenu à l'exemple 19 (séquence par- tielle DE) dans 200 ml de diméthylformamide., on ref'roidit à -20 , on ajoute 15 ml d'un mélange de dioxanne et d'acide chlorhydrique
<Desc/Clms Page number 33>
2N et ensuite 1,16 ml de nitrite de tertio-butyle et on agite à -20 pendant 10 minutes. On ajoute 14 ml de triéthylamine et une solution de 18,6 g de triacétate du tridécapeptide obtenu à l'exemple 16 (séquence partielle ABC), on agite le mélange ainsi obtenu à 0 pendant 16 heures, on filtre et on évapore à siccité.On lave le résidu à l'éther diéthylique et au chloroforme et on dissout dans un mélange de dioxanne et d'eau dans le rapport 8:2.
On traite ensuite la solution ainsi obtenue par 100 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate, on évapore et on recristallise le résidu dans un mélange d'isopropanol et d'eau. On obtient ainsi
EMI33.1
l'acétate de DOC-Ser-Ala-Tyr-nIrp-Arg-Asti-Leu-Asn-Asn-Phe7l!d--,-- (Trt)-A-g-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 fondant à 145 (avec décomposition); [a]20= -67 dans l'acide acétique.
On dissout sous azote le composé ainsi obtenu dans 500 ml d'acide trifluoroacétique. On abandonne à 25 pendant une heure, on concentre à 100 ml et on fait précipiter par addition de 1000 ml d'éther diéthylique. On filtre, on dissout le résidu dans du diméthylformamide et on fait précipiter par de l'éther diéthylique. Après séchage sur KOH, on obtient l'hexa-trifluoro-acétate
EMI33.2
du H-Scl,-Ala-Tyr-Trp-Arc.-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly- Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH.., fondant à 1300 (avec décom- position); [a]20= -42 dans l'acide acétique.
EXEMPLE 21 : Séquence partielle F 1:
EMI33.3
Ester méthylique de la L-thr60nyl-S-benzyl-L-cystéinyl- L-valyl-L-leucine (H-Thr-Cys-(Bzl)-Val-Leu-OMe)
EMI33.4
a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OUte
On dissout 21,0 g de Z-Cys(Bzl)-OCP et 12,3 g de chlorhydrate de H-Val-Leu-OMe dans 120 ml de diméthylformaide. On ajoute ensuite 5,9 ml de triéthylamine, on abandonne à 25 pendant 16 heures, on ajoute de l'acétatre d'éthyle, on lave à
EMI33.5
l'acide chlorhydrique âilué, on sèche :-' a' .-;ulfatc de sodium, on évapore à siccité et on cristallise le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther diéthylique. On obtient ainsi le
20
EMI33.6
Z-Cys(Bzl)-Val-1>eu-o14e, fondant à 160 ; [:x]0= -28 dans le
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diméthylformamide.
On dissout le composé ainsi obtenu dans 210 ml d'une solution à 40% d'acide bromhydrique dans de l'acide acétique glacial. On laisse reposer à 25 pendant une heure, on évapore à siccité et on recristallise le résidu dans un mélange d'isopropanol et d'éther diéthylique. On obtient le bromhydrate
EMI34.1
de H-Cys(Bzi)-Val-Leu-OMe qui fond à 168 ; [q) 20= +ljlo dars le diméthylformamide. b) H-'l'hr-CYS(Bzl)-Val-Leu-0Me
On dissout 20 g de Z-Thr-NHNH2 dans 350 ml de diméthylformamide, on refroidit à -20 , on ajoute 100 ml d'une solution 2M d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et ensuite 10 ml de nitrite de tertio-butyle. On laisse reposer pendant 10 minutes à -20 , on ajoute 45 ml de triéthylamine et 25,5 g de H-Cys(Bzl)Val-Lou-OMe obtenu sous a) et on agite le mélange ainsi obtenu à 0 pendant 16 heures.
On évapore à siccité, on dissout le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'eau, on lave la phase organique à l'acide chlorhydrique dilué, on sèche sur sulfate de sodium, on évapore et on recristallise le résidu dans de l'acétate d'éthyle. On cbtient ainsi le Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-
EMI34.2
Onc qui fond à 208 ; (a] 20= -27 dans le éiméthylflormainide.
On dissout 20 g du tétrapeptide préparé de la manière exposée ci-dessus dans 200 ml d'un mélange à parts égales d'acide trifluoro-acétique et d'acétate d'éthyle et, pendant une heure, on introduit un courant d'acide bromhydrique gazeux à une température de 0 . On évapore ensuite et on recristallise le résidu dans un mélange de méthanol et d'éther diéthylique. On obtient le H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe ' 1,3 HBr qui fond à 202 ; [a]20= -10 dans le diméthylformamide.
EXEMPLE 22 : Séquence partielle F2: Tertio-butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cystéinyl-L-sérylL-asparaginyl-L-leucyl-L-séryl-hydrazide
EMI34.3
(BOC-ys(Bzl)-Scr-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe
On dissout 43 g de chlorhydrate de H-Leu-Ser-OMe et 53 g de BOC-Asn-ONP dans 400 ml de diméthylformamide, on ajoute
<Desc/Clms Page number 35>
22 ml de triéthylamine et on abandonne à 25 pendant 16 'heures.
On évapore à siccité et on recristallise le résidu dans du méthanol. On obtient 51,6 g de BOC-Asn-Leu-Ser-OMe fondant à 190 [a]20= -24 dans le diméthylformamide. On dissout ce composé dans 500 ml d'une solution méthanolique d'acide chlorhydrique 4N. On laisse reposer à 25 pendant une heure, on évapore à siccité, on dissout le résidu dans du méthanol et on fait précipiter par de l'éther diéthylique.
Il se forme le chlorhydrate de
EMI35.1
H-A::>:1-Leu-Ser-or-1e qui fond à 180 ; [a]DO= -23 dans le diméthyl- formamide. b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe
EMI35.2
On dissout 39,5 g de BOC-Ser-NHPIH2 dans 500 ml de di- méthylformamide, on refroidit à -20 , on ajoute 200 ml d'une solution 2N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et ensuite 20 ml de nitrite de tertio-butyle. Après 10 minutes à -20 , on ajoute 40 ml de triéthylainine et 38,0 g de chlorhydrate de H-AsnLeu-Ser-OMe obtenu sous a). On agite ensuite à 0 pendant 16 heures, on évapore à siccité et on recristallise le résidu dans un mélange de chloroforme et d'éther diéthylique. On obtient le
EMI35.3
BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe qui fond à'135'; la] 20= ¯ 0-20 dans le diméthylformamide.
On dissout ce composé dans 420 ml d'une solution méthanolique d'acide chlorhydrique 4N, on abandonne à 25 pendant une heure, on évapore à siccité et on recristallise dans un mélange de méthanol et d'acétate d'éthyle. On obtient le chlorhydrate de H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe qui fond à 155 (avec décomposition); [a]20= -15 dans le diméthylformamide.
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EMI36.1
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH 2 On dissout 18,5 g de chlorhydrate de H-Ser-Asn-Leu-Ser-
EMI36.2
01le obtenu sous b) et, 18, 0 g de BOC-Cys(Bz1)-ONF dans 100 ml de diméthylformamide. On ajoute ensuite 10 ml d'eau, 3,5 ml d'acide acétique et 5,6 ml de triéthylamine, on abandonne à 25 pendant 16 heures, on évapore à siccité et on recristallise dans du
EMI36.3
méthanol.
On obtient 25,1 g de BOC-Cys(Bzl)-Ser-P.'m-Le:..l-Ser-Ofv1e fondant à 1820: (ej0 ¯ -17 dans le diméthylformar:5.àe. Tout en chauffant légèrement, on dissout ce composé dans 200 ml de diméthylformarnide. On ajoute 200 ml de méthanol et 20 ml d'hydrate d'hydrazine, on abandonne à 30 pendant 16 heures, on fait précipiter par de l'éther diéthylique, on lave le précipité avec un mélange à parts égales d'éther diéthylique et de méthanol et on
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sache le BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 obtenu qui fond à 224 ; [a]20= -13 dans le dimétiiylformamide.
EXEMPLE 23: Séquence partielle F :
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Tertio-butyloxycarbonyl-L-hémicystinyl-L-séryl-L-aspara- ginyl-L-leucyl-L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl-Lvalyl-L-leucyl-hydrazide
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(BOC-Cy-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Va-Leu-NHNH2) Un dissout 18,4 g de BOC-C3rs (Bzl )-Ser-Asn-Le-Sez - NHNH2 obtenu à l'exemple 22 (séquence partielle F2) dans 150 ml de diméthylformamide, on refroidit à -20 ., on ajoute 40 ml d'une solution 2N d'acide chlorhydrique dans du diexanne et 15 ml de nitrite de tertio-butyle. Après un repos de 10 minutes à -20 , on ajoute encore 28 ml de triéthylamine et 24,8 g de H-Thr-Cys
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(Bzi)-Val.-Leu.-OMe - 1,3 libr obtenu à l'exemple 21 (séquence par- tielle F1) et on agite à 25 pendant 16 heures.
On filtre ensuite, on évapore la solution et on lave le résidu à fond avec du
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méthanol chaud. On obtient le BOC-Cys(Bzl)-Ser-A.sn-Leu-Ser-ThrCys(Bzl)-Val-Leu-Of.1e fondant à 242-244 ; t'CLI 20= -25 dans le diméthylformamide. On dissout ce composé dans 100 ml de diméthyl- formamide à une température de 60 . On ajoute 10 ml d'hydrate d'hydrazine et on abandonne à 60 pendant 2 heures; l'hydrazide du nonapeptide ainsi formé se sépare à l'état cristallisé. On lave à l'éther diéthylique, à l'eau et au méthanol et on sèche sur anhydride phosphorique sous vide poussé. On obtient l'hydra- zide du nonapeptide fondant à 260 (avec décomposition); [a]20= -33 dans un mélange de diméthylformamide et d'eau dans le rap- port 3:1.
On dissout le produit ainsi obtenu dans 5000 ml d'am- moniac desséché et on ajoute du sodium métallique jusqu'à ce que la solution prenne une coloration bleu foncé, tout en agitant et en maintenant l'ammoniac à l'ébullition. On ajoute du chlorure d'ammonium afin de décolorer et on fait passer ensuite un courant au d'air à travers la solution jusqu'à réaction négative/nitroprus- siate. On évapore à siccité et on lave à fond le résidu à l'eau.
EMI37.2
Après séchage, ou obtient le BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-5er-Thr-Cßv-ral- Leu-NHNH2 qui fond à 298 (avec décomposition); [a]20= -20 dans
EMI37.3
un mélange de diméthylforniamide et d'eau dans le rapport 3:1.
EXEMPLE 24: Séquence partielle F3:
EMI37.4
L-thréonyl-S-benzyl-L-cystéinyl'-L-valyl'-L-leucine (H--2hr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH) On dissout 3 a g de bromhydra-ce de H-Thr -Cys (Bzl )-L"a 1-- Leu-OMe obtenu à l'exemple 21 (séquence partielle FI) dans 1800 ml de méthanol, on ajoute 900 ml de lessive de soude cauctique 2N, on laisse reposer à 25 pendant unc heure, on ajoute 240 ml d'acide acétique glacial et on abandonne à 0 pendant 2 heures.
On filtre ensuite la masse cristalline qui a précipité, on lave, d'abord à l'acide acé.tique 1N, puis à l'ean, et on sèche à 50 sous vide poussé. On obtient le H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH qui fond à 219 ; [a]20= -53 dans l'ammoniac 1N.
EXEMPLE 25: .
Séquence partielle F4:
EMI37.5
Tertio-butyloxycarbonyl-L-hérnicystinyl-L-séryl-L-
<Desc/Clms Page number 38>
asparaginyl-L-leucyl-L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinylL-valyl-L-leucine
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(BOC-Csn-Leu-Ser-Thr-C<s-Val-Leu-0H)
On dissout 18,4 g de BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser- NHNH2 obtenu à l'exemple 22 (séquence partielle F2) dans 150 ml
EMI38.2
de diméthylformamidé, on-refroidit à -20 , on ajoute 40 mil d'une solution 2N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et 15 ml de nitrite de tertio-butyle. Après 10 minutes à -20 , on ajoute encore 28 ml de triéthylamine et 16,2 g de H-Thr-Cys(Bzl)-ValLeu-OH obtenu à l'exemple 24 (séquence partielle F3) et on agite à 25 pendant 16 heures. On filtre ensuite, on évapore la solution et on lave à fond le résidu avec de l'acide acétique 1N.
On obtient ainsi le BOC-Cys(Rzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val- Leu-OH qui fond à 217 ; [a]20= -27 dans le diméthylformamide.
Oïl dissout le produit ainsi obtenu dans 5000 ml d'ammoniac desséché et, tout en agitant et en maintenant l'ammoniac à l'ébullition, or: ajoute du sodium métallique jusqu'à ce que la solution prenne une coloration bleu foncé. On ajoute du chlorure d'ammonium afin de décolorer, on évapore à siccité et on lave à fond le résidu avec de l'acide acétique 1N et de l'acétone. Après séchage, on obtient le BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-
EMI38.3
Cys-Val-Leu-OH fondant à 248 (en se décomposant); [ali 20¯ ¯ -41 dans mélange de diméthvlformamide et d'eau dans le rapport 7 :3.
On dissout le nonapeptide ainsi obtenu dans 5000 mi d'ammoniac 0,01 N et on ajoute, tout en agitant, de l'eau oxygénée jusqu'à réaction négative au nitroprussiate. On ajoute ensuite 200 ml d'acide acétique glacial, on filtre et on lyophilise-. On
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obtient ainsi le BOC-Cys,-Ser-Asn-Leu-Ser-Thi,-Cs-V-il-Leu-011 qui fond à 238' (en se décomposant); [a]PO= -13 dans un mélargo de diméthylformamide et d'eau dans le t'apport 7:3.
EXEMPLE 26 : Séquence partielle Bl:
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Beliz-loxycarbonyl-L-s6ryl-glycyl-L-norleucyl-glycine (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbol1,y1-1-norleucyl-glyci!1c
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(Z-Nle-Gly-OH)
On dissout 31,6 g de H-Gly-OH dans 420 ml de soude 1N, on ajoute 840 ml de tétrahydrofuranne, puis 130 g de Z-Nle-ONP, on agite jusqu'à ce que la solution soit claire et on laisse reposer à 25 pendant la nuit. On concentre ensuite à 500 ml sous pression réduite et on règle le pH de la solution aqueuse ainsi obtenue à 9 avec de la soude 1N. On soumet à deux extractions à l'éther, on acidifie par de l'acide chlorhydrique 4N et on extrait par de l'acétate d'éthyle.
On lave la solution d'acétate d'éthyle à l'sau et avec une solution à 30% de chlorure de sodium, on sèche sur sulfate de sodium et on évapore sous pression réduite. On triture le résidu dans de l'éther et on laisse cristalliser à -20 pendant 2 heures. On obtient le Z-Nle-Gly-OH
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fondant à 138 : [ a j D = -4 dans le dimét:ylformam3.de . b) Benzyl oxycaébonyt-glycyl-L-ncrleucyl-glycine (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
On dissout 100 g de Z-Nle-Gly-OH dans 1000 ml d'un mélange de HBr 4N et d'acide acétique glacial, on abandonne à 25 pendant 50 minutes, on triture dans de l'éther, on sépare les cristaux par filtration et on les lave bien à l'éther. On obtient le bromhydrate de H-Nle-Gly-OH; [a]20= +24,7 dans l'acide acétique à 95%.
On dissout 84 g du bromhydratee ainsi obtenudans 240 ml d'eau, on ajouta 152 ml de soude 4N, 800 ml de tétrahydrofuranne et 91. g de Z-Gly-ONP. On agite à 25 pendant une heure et on laisse reposer à 25 pendant 2 juurs. On concentre à 500 ml sous pression réduite, on règle le pH à 9 avec de la soude 1N et on extrait par de l'éther. On acidifie la phase-aqueuse¯ avec de
EMI39.2
l'acide chlorhydrique 1N.--ensuite on extrait,¯# deux reprises pour de l'acétate d'éthyle. On lave à l'eau et avec une solution de chlorure de sodium à 30%. On sèche sur sulfate de sodium, on
EMI39.3
évapore so,,-is pre6si6n réduite et9n triture le résidu dans de l'éther.
On obtient ainsi'le Z-Ùi,À-*311e-Gly-0H;fondant à 1.55 ; 2'" [ai 20 --5',60 da-vis iè..dig%rnv;féµ,r,ide....
[û!=5.6 daytSledimét.hylf6rar!ide. c) Benzyloxycarbonyl-'L-aryl-gly6yl-L-norleucyl-glycine (Z-3er-Glr-hiis-Gly-OLi-L ¯ -- -' ." On dissout 89,5'g de Z-G,y-Nle-GIY-OH. dans 900 ml-d. art
<Desc/Clms Page number 40>
mélange de HBr 4N et d'acide acétique glacial, on abandonne à 25 pendant 50 minutes, on évapore sous pression réduite, on triture dans de l'éther, on filtre, on lave bien à l'éther, on sèche sous pression réduite, on dissout dans 280 ml d'eau et dans environ 650 ml de diméthylformamide, on ajoute 66,5 ml de triéthylamine et on ajoute la solution de l'azide préparée comme-' suit :
On refroidit 940 ml d'acide chlorhydrique 1N à -5 , on ajoute 96 g de Z-Ser-NH-NH2 et, à une température de -5 , on ajoute goutte à goutte 360 ml de nitrite de sodium 1N.
On agite pendant encore 6 minutes à -5 , on verse environ 600 ml d'acétate d'éthyle refroidis à 0 . on règle le pH à 8,5 tout en ajoutant du carbonate de sodium solide, on sépare la phase d'acétate d'éthyle, on extrait, on sèche la solution sur sulfate de sodium et on filtre.
Sous pression réduite, on évapore la solution réactionnelle obtenue après addition de la solution de l'azide, on ajoute 600 ml d'eau au résidu, on.acidifie, on extrait avec de l'acétate d'éthyle et on lave à l'eau et avec une solution de chlorure desodium à 30%, on refroidit à 0 et on sépare les cristaux par filtration. On obtient le Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH fondant à 210 (avec décomposition); [a]20=-8 dans le diméthylformamide.
EXEMPLE 27: Séquence partielle AB1C:
EMI40.1
NimtritYl-L-histidYl-L-arginY1-L-PhénYlaanY1-L-sérYl- glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phénylalanyl-glycyl-L- prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-
Thr-Pro-NH2) a) L-séryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phénylalanyl-glycyl.-L- prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide
EMI40.2
(H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2)
On dissout à 0 12 g de H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro- NH2 obtenu à l'exemple 13 dans 100 ml de diméthylformainide et 20 ml d'acétonitrile, on ajoute 2,1 g de N-hydroxysuccinimide, 8,0 g de Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH obtenu à l'exemple 26, 4,0 g de
<Desc/Clms Page number 41>
dicyclohexylcarbodi-imide,
on abandonne à 0 pendant la nuit, on filtre, on évapore sous pression réduite et on cristallise dans du chloroforme. On obtient le Z-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-
EMI41.1
pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 qui fond à 125:1380; (aiO= -440 dans le diméthylformamide.
On dissout dans 400 ml de dioxanne et dans 400 ml d'un mélange d'acide chlorhydrique et de dioxanne et on hydrogène en présence d'un catalyseur au palladium et en présence d'un acide sous pression normale jusqu'à ce que l'absorption d'hydrogène cesse. On filtre, on évapore sous pression réduite, on dissout dans du méthanol et on ajoute de l'éther.
On obtient le tétrachlorhydrate de H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH fondant à 1300 (avec décomposition); [a]20= -52 dans le diméthyl- formamide.
EMI41.2
b) N '"-trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phénylalanyl-L-séryl-glycyl- L-norleucyl-glycyl-L-phénylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-
EMI41.3
L-thréonyl-Liprolinamide (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-ProNH2) On dissout 9,9 g de Na-Trt-Nim-Trt-His-Arg-Phe-tdHNH2 dans 100 ml de diméthylformamide, on refroidit à -20 , on ajoute 30 ml d'un mélange de dioxanne et d'acide chlorhydrique 2N et ensuite 1,16 ml de nitrite de tertio-butyle, on agite à -20 pendant 10 minutes, on ajoute 28 ml de triéthylamine et 9,7 g de H-
EMI41.4
Ser-Gly-Ille-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH 2 4 HCI obtenu sous a),
on agite à 0 pendant 4 heures, on filtre et on évapore à siccité. On dissout le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol dans le rapport 8 :2, on lave à l'ammoniaque diluée et ensuite à l'eau jusqu'à neutralité. On sèche sur sulfate de sodium, on concentre à 100 ml et on fait précipiter par addition d'éther diéthylique. On dissout le précipité de nouveau dans le diméthylformamide et on fait précipiter par addition d'éther diéthylique. On obtient le Trt-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly- Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH 2 fondant à 168 (en se décomposant);
EMI41.5
[a]20= -430 dans le di;néthylforrarnide.
On dissout ce composé dans 500 ml d'un mélange d'acide acétique et'd'eau dans le rapport
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8:2, on laisse reposer à 40 pendant 3 heures, on évapore, on lave le résidu rvec de l'éther diéthylique et on sèche sur KOH sous vide poussé. On obtient le tri-acétate de H-His(Trt)-Arg-
EMI42.1
Phe-Ser-Gly-Ivle-G1y-i'iZe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 qui fond à 1800 (avec décomposition); [a]20= -61 dans l'acide acétique.
EXEMPLE 28 : Séouence partielle AB1CDE:
EMI42.2
L-séryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-typtophanyl-L-arg.lnyl-L- asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-Lphénylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phénylalanyl-Lséryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phénylalanyl-glycylL-prolyl-L-glutamyl-L-thréonyl-L-prolinamide
EMI42.3
(H-Ser..Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Ai,g-PheSer-Gly-Nle-Cly-Fhe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH?)
On dissout 15,2 g de diacétate de BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp- Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH 2 obtenu à l'exemple 19 (séquence partielle DE) dans 200 ml de diméthylformamide, on refroidit à -20 , on ajoute 15 ml d'un mélange de dioxanne et d'acide chlorhydrique 2N et ensuite 1,16 ml de nitrite de tertio-butyle et on agite à -20 pendant 10 minutes.
On ajoute 14 ml de triéthylamine et une solution de 18,6 g de tri-acétate du tridécapeptide obtenu à l'exemple 27 (séquence partielle AB1C), on agite le mélange ainsi formé à 0 pendant 16 heures, on filtre et on évapore à siccité. On lave le résidu à l'éther diéthylique et au chloroforme et on dissout dans un mélange de dioxanne et d'eau dans le rapport 8:2. On traite la solution ainsi obtenue par 100 ml d'Amberlite IRA-410 sous sa forme acétate, on évapore et on recristallise le résidu dans un mélange d'isopropanol et d'eau. On obtient l'acétate de BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
EMI42.4
Phe-His(Trt)-Arg-Pne-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-G1u-Thr-Pro-NH2 fondant à 145 (avec décomposition); [a]20= -71 dans l'acide acétique. On dissout sous azote ce composé dans 500 ml d'acide trifluoro-acétique.
On abandonne à 25 pendant une heure, on concentre à 100 ml et on fait précipiter par addition de 1000 ml d'éther diéthylique. On filtre, on dissout le résidu dans le diméthylformamide et on fait précipiter par de l'éther diéthylique.
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EMI43.1
Apréfi sôohage sur KO!i,'oh obtient l'hexa-trifluoro-acetatè 'de ¯-,;1,.i . "'" ..''-1' .< "'¯:J' ".',: 1 - II .s er- Po i::.' 'l'yr- Trp- Arg-A sn- Leu - Asn - Asn- Phe- Hi s-A rg- Phe:"Ser- G l yNle-Gly..Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-pro-NH2 fondant, à 1300 (avec décom- 20 position); [a]20= -45 dans l'acide acétique.
EXEMPLE 29: Séquence partielle F5:
EMI43.2
:'ivaloyl-L-hémicystinyl-L-séryl-L-asparaginyl-L-leucylL-séryl-L-thréonyl-L-hémicyst;inyl-L-valyl-L-leucine (Plv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH)
On dissout le BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-LeuOH obtenu à l'exemple 25 (séquence partielle F4) dans 300 ml d'acide trifluoro-acétique, on abandonne à 25 pendant 30 minutes, on évapore, on lave le résidu avec de l'acétate d'éthyle et on dissout dans 300 ml de diméthulformamide. A cette solution on ajoute 30 g d'ester p-nitrophénylique de l'acide pivalique (préparé de la manière exposée ci-dessous) ainsi que 14 ml de triéthylamine, on laisse reposer à 25 pendant 16 heures, on évapore et on lave le résidu avec du chloroforme.
On dissout dans 300 ml de diméthylformamide, on ajoute 50 ml d'eau et 50 g de Dowex-50, on agite pendant 15 minutes, on filtre, on lave la résine au diméthylformamide et on évapore le filtrat à siccité.
On lave le résidu d'abord avec du chloroforme, puis avec de l'acétate d'éthyle et on sèche. On obtient ainsi le Piv-Cys-Ser- Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH fondant à 243 ; la] 20 = -17 dans un mélange de ùiméthylformamide et d'eau dans le rapport 3:1.
Ester p-nitrophényltque de l'acide pivalique
On dissout 95 g d'acide pivalique et 131 g de p-nitrophényle dans 1000 ml d'acétate d'éthyle, on ajoute 197 g de dicyclohexylcarbodi-imide, on agite à 25 pendant 2 heures, on filtre, on évapore le filtrat et on cristallise le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole.
On obtient l'ester p-nitrophénylique de l'acide pivalique qui fond à 104 EXEMPLE- 30: Séauence partielle F6 : Ethoxycarbonyl-L-hémicystinyl-L-séryl-L-asparaginyl-L- leucyl-L-séryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl-L-valyl-L-
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leucine (EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH)
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On dissout le BOC-Cf ér-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- OH obtenu à l'exemple 25 (séquence partielle F4) dans 300 ml d'acide trifluoro-acétique, on abandonne à 25 pendant 30 minutes, on évapore, on lave le résidu avec de l'acétate d'éthyle et on dissout dans 300 ml de diméthylformamide.
A cette solution on ajoute 30 g de carbonate d'éthyle et de p-nitrophényle (préparé de la manière exposée ci-dessous) ainsi que 14 ml de triéthylamine, on abandonne à 25 pendant 16 heures, on évapore et on lave le résidu avec du chloroforme. On dissout dans 300 ml de diméthylformamide, on ajoute 50 ml d'eau et 50 g de Dowex-50, on agite pendant 15 minutes, on filtre, on lave la résine avec du diméthylformamide et on évapore le filtrat à siccité. On lave le résidu d'abord avec du chloroforme et ensuite avec de l'acétate d'éthyle et on sèche. On obtient le EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr- Cys-Val-Leu-OH qui fond à 263 ; [a]20= -21 dans un mélange de diméthylformamide et d'eau dans le rapport 3:1.
EMI44.2
Carbonate d' ê;yle et de -nlt.2.2-l'!énYle
On dissout 200 g de p-nitrophénol et 113 ml de pyridine dans 1200 ml d'acétate d'éthyle, on refroidit à 0 et, tout en agitant, on ajoute 156 ml de chloroformiate d'éthyle. On agite à 0 pendant encore 30 minutes, on lave l'eau, on sèche sur sulfate de sodium et on évapore à siccité. On dissout le résidu dans de l'éther àiéthylique et on fait cristalliser par addition d'éther de pétrole. On obtient le carbonate d'éthyle et de pnitrophényle fondant à 65 .
EXEMPLE 31:
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Séouence partielle F : .
S-benzyl-p-mercaptopropicnyl-L-éryl-L-aparagiryl-Lleucyl-L-séryl-hydrazide (BZI-MCP-Ser-Asn-LeuSer-NH-NH2) a.) H-Asn-Leu-Ser-OMe
On dissout 43 g de cholrhydrate de H-Leu-Ser-OMe et 53 g de BOC-Asn-ONP dans 400 ml de diméthylformamide, on ajoute 22 ml de triéthylamine, on laisse reposer à 25 pendant 16 heures,
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on évapre à siccité et on recristallise le résidu dans du méthanol. On obtient le BOC-Asn-Leu-Ser-OMe fondant ',- 190 ; [a]20= -24 dans le diméthylformamide. On dissout 51,6 g de ce composé dans 500 ml d'une solution 4N d'acide chlorhydrique dans du méthanol. On abandonne à 25 pendant une heure, on évapore à siccité, on dissout le résidu dans du méthanol et on fait précipiter par de l'éther diéthylique.
On obtient le chlorhydrate de H-Asn-Leu-Ser-OMe qui fond à 180 ; [a]20= -23 dans le diméthyl- formaide. b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe
On dissout 39,5 g de BOC-Ser-NHNH2 dans 500 ml de diméthylformamide, on refroidit à -20 , on ajoute 200 ml d'une solution 2N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et ensuite 20 ml de nitrite de tertio-butyle. Après 10 minutes à -20 , on ajoute 40 ml de triéthylamine et 38,0 g de chlorhydrate de H-Asn- Leu-Ser-OMe obtenu sous a), on agite ensuite à 0 pendant 16. heures, on évapore à siccité et on recristallise le résidu dans un mélange de chloroforme et d'éther diéthylique. On obtient le BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe fondant à 135 ; la) 20 = -22 dans le diméthylformamide.
On dissout ce composé dans 420 ml ù'une solution 4N d'acide chlorhydrique dans du méthanol. On abandonne 5-' 25 pendant une heure, on évapore à siccité et on recristallise dans un mélange de méthanol et d'acétate d'éthyle. Il se forme le chlorhydrate de H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe fondant à 155 (avec décomposition); [a]20= -15 dans le diméthylformamide, c) Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
On dissout 18,5g de chlorhydrate de H-Ser-Asn-Leu-Ser- OMe obtenu sous b) et 13,5 g de Bzl-MCP-ONP (ss-benzylthiopropionate de p-nitrophényle) dans 100 ml de diméthylfermaimde, on ajoute 10 ml d'eau, 3,5 ml d'acide acétique et 5,6 ml de triéthylamine. On laisse reposer à 25 pendant 16 heures, on évapore à siccité et on recristallise dans l'éthanol.
On obtient le Bzl-MCP- Ser-Asn-Leu-Ser-OMe fondant à 193 ; [a]20= -17 dans le diméthyl- formamide. On dissout 21,3 g de ce composé dans 200 ml de diméthylformamide, tout en chauffant légèrement. On ajoute 200 ml de méthanol et 20 ml d'hydrate d'hydrazine, on abandonne à 30 pendant 16 heures, en fait précipiter par de l'éther diéthylique,
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on lave le précipité avec un mélange à parts égales d'éther diéthylique et de méthanol et on sèche le Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-
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Ser-NHNH2 ainsi obtenu: il fond à 251'; la] 20 = -16 dans le diméthylformamide.
EXEMPLE 32: Séquence partielle F8 :
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l3-mercaptopropionyl-L-séryl-L-asparaginyl-L-leucY.L-L- séryl-L-thréonyl-L-hémicystinyl-L-valyl-L-leucyl- hydrazide
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(MP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cs-Val-Leu-NHNH2) On dissout 16,2 g de BzI-HCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 obtenu à l'exemple 31 (séquence partielle F7) dans 150 ml de
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diméthylfoi'mamide, on refroidit à -20 , on ajoute !0 ml (l'une solution 2N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et 15 mi de nitrite de tertio-butyle. Après 10 minutes à -20 . on ajoute
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28 ml de triét.1-iylanine et 24,8 g de H-'rhr-Cys(Bzl)-Val-I.:1-0Me .
1,3 HBr obtenu à l'exemple 21 (séquence partielle FI) et on agite à 25 pendant 16 heures. On filtre ensuite, on évapore la solution et on lave le résidu à fond avec du méthanol chaud. On
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obtient ainsi le Bzl-r<1CP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(I3z1 )":.':i.'.-LeuOMe fondant à 244 ; [ajDO= -22 dans le diméthylformamide. On dissout 24,1 g de ce composé dans 100 ml de diméthlformaide à une température de 60 , on ajoute 10 ml d'hydrate d'hydrazine et on abandonne à 60 pendant 2 heures: On lave à l'éther diéthylique, à l'eau et au méthanol et on sèche sur anhydride phosphôri- que sous vide poussé. On obtient l'hydrazide du nonapeptlde fon-
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dant à 265 ; [alé ;0 = -35 dans un mélanse de dimét.hylforme.m.!.df: et d'eau dans-le rapport 3:1.
On dissout le produit ainsi obtenu dans 5000 ml d'ammoniac desséché et on ajoute du sodium métallique jusqu'à coloration bleu foncé, tout en agitant et en. maintenant l'ammoniac à l' ébullition. On ajoute du chlcruer d'ammonium afin. de décolorer et ensuite on fait passer un courant d'air à travers la ablution
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jusqu'à réaction négative au nitroprussiate. On évapora à.:$.!1 té et on lave à fond le résidu à l'eau et à 1 ' acétone <Apes séèhCJ.W1 on obtient le MCP i --Asn-T¯u-3cr-Th s-Val-Leu-?IHPH2 fondant
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à 278 ; [a]20= -19 dans un mélange de diméthylformamide et d'eau dans le rapport 3:1.
L'invention concerne également un médicament comprenant, à titre de principe actif, un nouveau polypeptide répondant à la formule (3-thio-2-X-propionyl)-L-séryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-séryl-L-
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thréonyl-L-hémicystinyl-L-vlyl-L-leucyl-L-5éryl-L-alanyl-Ltyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-Lasparaginyl-L-asparaginyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-Lphénylalanyl-L-séryl-glycyl-L-Y-glycyl-L-phénylalanyl-glycyl-L- prolyl-L-glutamyl-L-thr-éonyl-L-prolinamide dans laquelle X représente un atome d'hydrogène, un groupe amino ou un groupe de formule R-CO-NH- ou R'-C-CO-NH dans lesquelles
R signifie un groupe alkyle, ou un groupe aryle ou aralkyle éventuellement substitués, et R' signifie un groupe alkyle alcényle, ou un groupe aryle ou aralkyle éventuellement subs- titués,
et Y représente le reste norleucyle ou méthionyle ou un sel d'addition d'acides ou un'complexe de métal lourd que forment ces composés.
Les nouveaux polypeptides peuvent également être représentés par la formule générale qui figure dans le tableau I, page 47.
Les nouveaux composés se cignalent par d'intéressantes
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propriétés priarmacodynamiques. C'est ainsi qu'ils abaissent le taux- du calcium s'1gu.i.n, en part3culvec les taux anormalement él.ovés, et, en ta11:.':quiantagOnistes p 1& parathormone ils produisent un blan positif du calcium,-"' 's-l'os.
L'activité'biologique des uvaux polypeptides peut. être mise en évidence par l'hypocalcémie qu'ils provoquent chez
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le rat. On uttlise des rats mâles p#it entre 100 et 130 g main- tenus au jeûne pendant 16 heures et ratés avec une solution physiologique de chlorure de sodium.
On prélève chez l'animal en-
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viron 1 ml de sang ' partir du pleas-seineux rétro-erlj3,taire.. , On injecte ensuite daiis la. queue,, intraveineuse ?. 1n1/kȯ ....¯-:,...: -..;=:...: ."r l:
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TABLEAU I
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CH2-CH-CO- 1 Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Ser Ala Tyr Trp Arg Asn Leu Asn Asn Phe His Arg #########¯¯¯¯¯¯-¯¯¯¯¯¯ Phe Ser Gly Y Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro NH2 X = H, NH2, R--CO-NH (R a2kyle, aryle ou aralkyle éventuellement substiicué) R'-O-CO-NH (R' - alkyle, alcényle, aryle ou aralkyle éventuellement substitué) Y = le reste norleucyle ou méthionyle.
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d'une solution du composé à essayer dans de l'acide acétique.
0,2 N et une heure plus tard on prélève à nouveau du sang. Après coagulation on centrifuge les échantillons de sang, on sépare le sérum surnageant, on le dilue avec une solution à 0,25% d'acide éthylènediamine-tétra-acétique et on détermine le taux de calcium au moyen d'un spectrophotomètre d'absorption. La différence entre les valeurs trouvées avant et après administration de la substance, donne la mesure de l'hypocalcémie. Les activités sont calculées selon la méthode décrite par M. A. Kumar et coll. dans J. Endocrin. 33, 469 (1965).
Les résultats obtenus sont comparés à ceux.obtenus avec un échantillon étalon de thyrocalcitonine provenant du "Medical Research Council" (MRC); l'activité est exprimée en unitésMRC par mg de peptide (10 milli-unités provoquent chez le rat une baisse de 10%, soit 1 mg%, du taux de calcium dans le sérum). Dans cet essai, les nouveaux composés possèdent une activité d'environ 100 à 450 unités MRC par mg de peptide.
Les nouveaux composés peuvent être utilisés, par conséquent, pour le traitement de tous les états dans lesquels on désire obtenir une baisse de la calcémie, comme par exemple les hypercalcémies de diverses origines, l'insuffisance de thyrocalcitonine endogène résultant d'une inactivité du tissu thyroïdien
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et l'hyperparathyroldie.
Les composés de l'invention sont indiqués également pour le traitement de toutes les ostéopathies provoquées par un catabolisme osseux trop élevé ou des ostéopathies dans lesquelles on désire provoquer une fixation accrue du calcium dans l'os, comme par exemple les ostéoporoses de diverses origines (telles que l'ostéoporose post-climatérique, l'ostéoporose post-traumatique, l'ostéoporose provoquée par une corticothérapie ou due à l'inactivité), les fractures, les ostéomalacies et le rachitisme.
On pourra également utiliser les composés en combinaison avec du calcium ou des phosphates.
La dose quotidienne administrée par voie intramusculaire sera comprise entre 1 et 500 unités MRC. On administrera de préférence une dose quotidienne de 5 unités par la voie intra-
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musculaire.
Les polypeptides de l'invention qui répondent à la formule générale représentée ci-dessus dans laquelle X représente un groupe R-CO-NH ou R'-O-CO-NH et Y a la signification déjà donnée, ont l'avantage d'être stables vis-à-vis de l'action protéolytique des aminopeptidases.
Les polypeptides de l'invention et leurs dérivés qui répondent à la formule générale représentée ci-dessus dans laquelle X représente l'hydrogène, un groupe amino ou un groupe R-CO-NH ou R'-O-CO-NH et Y représente le reste norleucyle, ont l'avantage particulier de résister à l'oxydation.
On pourra utiliser les nouveaux polypeptides soit tels quels, soit sous forme de leurs sels ou de leurs complexes de métaux lourds. Comme sels, on peut envisager ceux qui dérivent d'acides,organiques, comme l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide pyruvique, l'acide malonique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide benzoïque, l'acide cinnamique, l'acide salicylique, l'acide 2-phénoxybenzoïque, l'acide 2-acétoxy-benzoïque, l'acide mandélique, l'acide méthane-sulfonique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide hydroxy-éthane-sulfonique, l'acide benzéne-sulfonique, l'acide toluène-sulfonique, l'acide naphtalène-sulfonique, l'acide sulfanilique ainsi que des acides polymères, comme l'acide tannique, l'acide alginique, l'acide polygalacturonique,
les polyphosphates de phlorétine et la carboxy-méthyl-cellulose, et les sels dérivant d'acides minéraux, comme les acides halohydriques, par exemple l'acide chlorhydrique ou l'acide bromhydrique, l'acide nitrique, l'acide thiocyanique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique. Comme complexe de métal lourd on peut utiliser par exemple celui du zinc
Les nouveaux polypeptides peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple sous forme de préparations pharmaceutiques. Celles-ci renferment la susbtance active, en mélange avec un excipient minéral ou organique, approprié pour l'administration ar la voie parentérale.
Comme excipients, on utilisera des
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produits Q,,(.'ne réaçissent pas aveé les nouveaux'composés, comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, l'alcool benzylique, la
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gomme arabique,-.cle:3.poly-alkylènes-glycols, la Vaseline, le cholestérol ou d'autres excipients pharmaceutiques connus.
Les préparations pharmaceutiques liquides peuvent être par exemple des solutions, des suspensions ou des émulsions. On peut les stériliser et/ou leur ajouter des adjuvants, tels que des agents de conservation, des stabilisants, des-mouillants ou des émulsionnants. Elles peuvent également contenir d'autres substances douées d'une action thérapeutique intéressante. Les nouveaux composés peuvent également être administrés sous forma de préparations à effet retardé.
Les nouveaux composés et leurs sels peuvent aussi être utilisés comme produits intermédiaires pour la préparation de produits pharmaceutiques.