BE814419R

BE814419R - (1-alpha-aminoisobutyryl)-corticotropines peptidiques

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Publication number: BE814419R
Application number: BE143807A
Authority: BE
Priority date: 1974-04-30
Filing date: 1974-04-30
Publication date: 1974-08-16

Description


   <EMI ID=1.1> 

  
La présente invention concerne les octadécapeptides agissant comme!

  
 <EMI ID=2.1> 

  
radical d'aminoacide à l'extrémité à radical amino terminal au lieu du  radical de sérine de la corticotropine naturelle et elle se rapporte  aussi à leurs sels d'addition d'acides non toxiques et à leurs complexes . 

  
Plus particulièrement, elle se rapporte à l'a-aminoisobutyryl-L- 

  
 <EMI ID=3.1> 

  
L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-   <EMI ID=4.1>  nyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycylL-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine.sous forme d'amide,(symboly-

  
 <EMI ID=5.1> 

  
tyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-

  
 <EMI ID=6.1> 

  
à leurs sels d'addition d'acides non toxiques et à leurs complexes, de même qu'à leur préparation.

  
La Demanderesse a déjà découvert que la substitution à l'ex.

  
 <EMI ID=7.1> 

  
dans un peptide agissant comme la corticotropine améliore beaucoup les propriétés biologiques de ce peptide, augmente son efficacité et prolonge son action (voir brevet principal). Cette amélioration des propriétés est due à une moindre sensibilité du peptide à l'action de l'aminopeptidase intracellulaire. La poursuite des

  
 <EMI ID=8.1> 

  
l'hormone corticotrope naturelle et des peptides connus, y compris un octadécapeptide connu comprenant un radical a-aminoisobutyryle à l'extrémité à radical amino terminal en remplacement du radical dE

  
 <EMI ID=9.1> 

  
mone corticotrope (dite aussi ACTH) comprenant en position 4 un reste de norleucine au lieu du reste de méthionine offre un avantage qui découle du fait que les peptides contenant de la méthionine sont souvent oxydés en sulfoxydes correspondants qui s'inactivent. Dès lors,le remplacement de la méthionine par la norleucine évite cet inconvénient. On sait d'autre part que la synthèse ou 900 9 9 *ou ..  des peptides contenant de l'arginine est fort difficile à cause

  
 <EMI ID=10.1> 

  
que des réactions secondaires. Sous ce rapport, le remplacement de l'arginine par la lysine facilite la synthèse des peptides voulus. La Demanderesse a confirmé que des modifications aux posi-

  
 <EMI ID=11.1> 

  
mone corticotrope naturelle conduit à d'excellents peptides ayant de remarquables activités pharmacologiques.

  
Suivant la présente invention, les octadécapeptides peuvent être obtenus par condensation des aminoacides un à un ou bien par condensation de petits peptides un à un de la manière habituelle.

  
La réaction finale de condensation donnant les octadécapeptides est exécutée par exemple au moyen d'un décapeptide protégé de formule:

  
 <EMI ID=12.1> 

  
glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine,

  
 <EMI ID=13.1> 

  
présente un radical protégeant la fonction carboxyle, X représente un radical L-méthionyle ou L-norleucyle, qui est condensé avec

  
un octapeptide protégé de formule:

  
 <EMI ID=14.1> 

  
vant inerte à une température de -20 à +60[deg.]C en environ 2 heures à 7 jours et par élimination des radicaux protecteurs de l'octadécapeptide résultant de formule :

  
 <EMI ID=15.1>   <EMI ID=16.1> 

  
classique à une température d'environ -20 à +60[deg.]C en environ 30 mi-

  
 <EMI ID=17.1> 

  
de formule:

  
a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-X-L-glutamyl-Lhistidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysylL-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-Y

  
où Y représente la L-lysyl-L-lysine sous forme d'amide ou la L-arginyl-L-arginine sous forme d'amide et X a la signification ci-dessus, à l'exclusion toutefois de l'octadécapeptide dans

  
la formule duquel X représente Le radical L-méthionyle et Y représente la L-arginyl-L-arginine sous forme d'amide.

  
La condensation entre le décapeptide et l'octapeptide peut être effectuée suivant les procédés classiques. Au nombre

  
de ces procédés, il convient de citer celui à l'azide, celui  au dicyclohexylcarbodiimide,celui au carbonyldiimidazole, celui 

  
à l'anhydride mixte, celui à l'ester activé (par exemple à l'ester

  
 <EMI ID=18.1> 

  
p-nitrophénylthiol, à l'ester de pentachlorophényle), celui à  l'isoxazolium, celui au N-carboxyanhydride, celui au pyrophosphite de tétraéthyle et celui au chlorophosphite d'éthyle outre les procédés combinés et les procédés d'usage courant.Les peptides peuvent être préparés aussi suivant les procédés dits de synthèse des peptides en phase solide. Bien que les procédés ci-dessus se prêtent à la formation de toute liaison peptidique dans les octadécapeptides

  
de l'invention, les procédés les plus couramment appliqués sont

  
 <EMI ID=19.1> 

  
l'anhydride mixte et celui à l'ester activé.

  
Lors de la préparation des octadécapeptides recherchés, les radicaux fonctionnels libres éventuels ne participant pas à la réaction sont avantageusement protégés, spécialement au moyen de radicaux qui peuvent s'éliminer aisément par hydrogénolyse,  <EMI ID=20.1> 

  
 <EMI ID=21.1> 

  
protégé par estérification, par exemple au moyen d'un alcanol  inférieur (comme le méthanol, l'éthanol, le propanol ou le t-bu-  tanol) ou au moyen d'un aralcanol (comme l'alcool benzylique, 

  
 <EMI ID=22.1> 

  
radicaux protégeant la fonction carboxyle sont introduits suivant la technique habituelle.

  
Le radical amino est protégé de préférence par introduction d'un radical tel qu'un radical t-butoxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, o-nitrophénylsulfényle, 2-(p-diphényl)isopropyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, p-toluènesulfonyle, formyle ou trityle de la manière habituelle. Pour la protection du radical guanidyle de l'arginine, on choisit de préférence un radical nitro, p-toluènesulfonyle ou adamantyloxycarbonyle)mais la protection du radical guanidyle n'est pas toujours nécessaire. Le radical E-amino de la lysine est avantageusement protégé par des radicaux propres à protéger la fonction amino du genre décrit cidessus.

   Le radical Y-carboxyle de l'acide glutamique est de préférence protégé par des radicaux propres à protéger la fonction carboxyle du genre ci-dessus et le radical imidazole de l'histidine peut être protégé par un radical p-toluènesulfonyle,  benzyloxycarbonyle ou benzyle, etc.. De plus, le radical hydroxyle de la sérine ou de la tyrosine peut être protégé par un radical  acétyle, benzyle ou t-butyle, mais cette protection n'est pas  toujours nécessaire. 

  
Le solvant inerte utilisé pour la condensation est le  diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne, l'hexamé-  thylphosphortriamide ou un mélange de tels solvants, éventuel-  lement aqueux. 

  
 <EMI ID=23.1>   <EMI ID=24.1> 

  
respectivement.

  
Dans ces tableaux, les abréviations sont les suivantes:
Ibu = reste d'acide a-aminoisobutyrique,

  
Tyr = reste de L-tyrosine,

  
Ser = reste de L-sérine,

  
Met = reste de L-méthionine,

  
 <EMI ID=25.1> 

  
Glu = reste d'acide glutamique,

  
His = reste de L-histidine,

  
Phe = reste de L-p hénylalanine,

  
Arg = reste de L-arginine,

  
Trp = reste de L-tryptophane,

  
Gly = reste de glycine,

  
Lys = reste de L-lysine,

  
Pro = reste de L-proline,

  
Val = reste de L-valine,

  
Boc = t-butyloxycarbonyle,

  
 <EMI ID=26.1> 

  
HOSu = N-hydroxysuccinimide,

  
OBz = benzyloxy,

  
HOBt = 1-hydroxybenzotriazole. 

  

 <EMI ID=27.1> 
 

  

 <EMI ID=28.1> 
 

  

 <EMI ID=29.1> 
 

  
 <EMI ID=30.1>  ceutiquement acceptable, suivant les conditions de réaction choisies. De plus, les sels peuvent également être obtenus par réaction des peptides avec des acides inorganiques,comme les halogénures d'hydrogène aqueux (acide fluorhydrique, bromhydrique ou chlorhydrique) ou tels quels (fluorure d'hydrogène, bromure d'hyorogène ou chlorure d'hydrogène), l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique,ou avec des acides organiques,comme l'acide acétique, l'acide formique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide benzoïque, l'acide méthanesulfonique, l'acide propioni que, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide pyruvique, l'acide oxalique, l'acide malonique, l'acide benzènesulfonique ou l'acide toluènesulfonique, de la manière habituelle.

   L'acide peut être pris en quantité équimolaire ou en excès pour la formation du sel.

  
De plus, les octadécapeptides obtenus suivant l'invention peuvent être convertis en complexes correspondants par réaction avec un métal lourd propre à former un complexe, comme le zinc, le cuivre, le fer, le nickel ou le cobalt,ou un polyaminoacide propre à former un complexe,comme l'acide polyglutamique, l'acide polyaspartique, la copoly-glutamyltyrosine ou l'acide copolyaspartylglutamique, éventuellement en mélange. Le complexe peut être préparé par réaction de l'octadécapeptide conforme à l'invention avec un composé de métal lourd tel qu'un halogénure de métal lourd,comme le chlorure de zinc, le chlorure de cuivre, le chlorure de fer ou le chlorure de cobalt,ou un hydroxyde de métal lourd, comme l'hydroxyde de zinc,dans un rapport pondéral d'environ 1:0,1 en milieu faiblement acide et de préférence à un pH de 6,5 à 7,0, de la manière habituelle.

   Parmi les métaux lourds, le zinc est spécialement préféré. Un complexe avec un polyaminoacide peut

  
être préparé par réaction d'octadécapeptide conforme à l'invention  <EMI ID=31.1> 

  
 <EMI ID=32.1> 

  
 <EMI ID=33.1> 

  
 <EMI ID=34.1> 

  
100.000 et en particulier de 2.000 à 6.000. Il est préférable d'utiliser le polyaminoacide qui a été neutralisé au préalable à l'aide d'un alcali, tel que l'hydroxyde de sodium. D'autres

  
 <EMI ID=35.1> 

  
l'alcool benzylique, le phénol ou le thimérosal, des tampons, par exemple au citrate, au phosphate ou au carbonate,ou des agents rendant le milieu isotonique, par exemple le chlorure de sodium, peuvent être ajoutés lors de la préparation des complexes.

  
Le tableau ci-dessous permet de comparer les résultats des essais de l'aptitude à stimuler les glandes surrénales pour les octadécapeptides de l'invention, pour l'hormone corticotrope naturelle, pour l'hormone vendue sous le nom de Cortrosyn (Société

  
 <EMI ID=36.1> 

  
principal). 

  
 <EMI ID=37.1> 

  

 <EMI ID=38.1> 


  
Note: Les résultats sont exprimés par rapport à l'hormone cortico-

  
trope(ACTH)naturelle. Les activités sont déterminées comme décrit dans le brevet principal.

  
Comme le montre nettement le tableau, les octadécapeptides de l'invention ont une excellente aptitude à stimuler les glandes surrénales.

  
Les octadécapeptides de l'invention sont hautement utiles et avantageux à des fins thérapeutiques, par exemple pour le traitement du rhumatisme articulaire aigu ou chronique, et pour les affections allergiques ou adrénergiques chez l'homme et les animaux  domestiques, de même que pour l'essai de la fonction des glandes  surrénales chez l'homme et les animaux.

  
Les octadécapeptides, les sels d'addition d'acides

  
et leurs complexes peuvent être administrés par voie orale ou parentérale sous des formes classiques, par exemple par Injection, sous forme de liquides, de suspensions, d'émulsions ou d'aérosols, éventuellement en association avec des véhicules, stabilisants, émulsionnants, agents de conservation, tampons, agents d'isotonie et agents mouillants appropriés, dans des condi-tions apportant une quantité thérapeutiquement efficace de l'agent  actif. 

  
L'invention a donc également pour objet une composition  pharmaceutique ou vétérinaire qui comprend un composé conforme à  l'invention et un excipient pharmaceutique inerte. 

  
La dose efficace peut être déterminée aisément par le  médecin d'après les indications donnéesici. Par exemple, une valeur typique pour les doses des octadécapeptides de l'invention

  
est d'environ 0,2 à 0,8 unité/kg pour l'adulte normal. Les octadécapeptides sont avantageusement administrés par injection sous forme dosée et l'administration est répétée à mesure des besoins 

  
sur indication du médecin. 

  
L'invention est illustrée sans être limitée par les  exemples suivants. 

EXEMPLE A -

  
Préparation de la a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-sérylL-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-Ltryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-

  
 <EMI ID=39.1> 

  
sous forme d'amide (I): 

  
On ajoute 10 ml d'ammoniaque concentrée à une solution j

  
 <EMI ID=40.1> 

  
 <EMI ID=41.1> 

  
Après évaporation, on extrait le résidu cristallin à l'acétate  d'éthyle. On lave l'extrait avec de l'acide chlorhydrique 0,5N froide 

  
 <EMI ID=42.1> 

  
le sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on le concentre à  siccité sous vide. On cristallise le résidu dans l'acétate 

  
 <EMI ID=43.1>   <EMI ID=44.1> 

  
Analyse pour C19H29N305

  

 <EMI ID=45.1> 


  
 <EMI ID=46.1> 

  
 <EMI ID=47.1> 

  
méthanol sur du noir de palladium catalytique pendant 150 minutes. On sépare le catalyseur par filtration et on le lave au méthanol. On évapore le mélange de filtrat et de liqueur de lavage sous vide pour obtenir un résidu huileux qu'on fait se solidifier au moyen d'éther de pétrole. On recueille le solide par filtration

  
 <EMI ID=48.1> 

  

 <EMI ID=49.1> 


  
 <EMI ID=50.1> 

  
dans 20 ml de chloroforme à une solution de 2,45 g du composé II dans 30 ml d'acétate d'éthyle. On agite le mélange à la tempé-

  
 <EMI ID=51.1> 

  
et on poursuit l'agitation pendant 3 heures. On concentre le mélange de réaction sous vide pour obtenir un résidu qu'on met

  
en suspension dans l'acétate d'éthyle. On lave la suspension successivement avec de l'acide chlorhydrique 0,5N froid, de l'eau,une solution de bicarbonate de sodium IX et de l'eau. Par filtration, on recueille la fraction insoluble dans l'acétate d'éthyle, on

  
la lave et on la sèche sous vide. Par recristallisation dans  <EMI ID=52.1> 

  

 <EMI ID=53.1> 


  
 <EMI ID=54.1> 

  
thanol sur du noir de palladium catalytique pendant 150 minutes. On sépare le catalyseur par filtration et on concentre le filtrat sous vide pour obtenir un résidu cristallin. On recristallise le résidu dans l'acétate d'éthyle et le n-hexane pour obtenir en quan-

  
 <EMI ID=55.1> 

  

 <EMI ID=56.1> 


  
 <EMI ID=57.1> 

  
forme d'amide (V)

  
On ajoute 2,84 g d'ester de N-hydroxysuccinimide de Nabenzyloxycarbonyl-NE-t-butyloxycarbonyl-L-lysine à une solution de

  
 <EMI ID=58.1> 

  
mélange à la température ambiante pendant 68 heures. Après évaporation, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et on lave la

  
 <EMI ID=59.1> 

  
quoi on évapore la solution pour obtenir un résidu. On dissout ce résidu dans l'acétate d'éthyle et on conserve la solution en armoire frigorifique. On recueille le précipité gélatineux qu'on

  
 <EMI ID=60.1>   <EMI ID=61.1> 

  

 <EMI ID=62.1> 


  
 <EMI ID=63.1> 

  
méthanol sur du noir de palladium catalytique pendant 2 heures.

  
Après séparation du catalyseur, on concentre le filtrat sous vide. On dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et on le précipite de sa solution par addition d'éther de pétrole. On recueille le précipité qu'on lave et qu'on sèche sous vide pour

  
 <EMI ID=64.1> 

  

 <EMI ID=65.1> 


  
 <EMI ID=66.1> 

  
du composé VI dans un mélange de 30 ml de chloroforme et de 3 ml de méthanol constituant le solvant. On conserve le mélange pendant 3 heures à la température ambiante,puis on l'évapore sous vide. On reprend le résidu dans l'acétate d'éthyle et on lave

  
 <EMI ID=67.1> 

  
Yextrait sous vide pour obtenir un solide. On fait précipiter le solide à partir du méthanol et de l'éther et on recueille le précipité par filtration,puis on le lave et on le sèche pour obtenir en  <EMI ID=68.1> 

  

 <EMI ID=69.1> 


  
 <EMI ID=70.1> 

  
sine sous forme d'amide (VIII)

  
On hydrogénolyse 2,13 g du composé VII dans 30 ml de méthanol en 4 heures et 30 minutes sur du noir de palladium catalytique. Après séparation du catalyseur par filtration, on évapore le filtrat sous vide pour obtenir un résidu. On reprécipite le  résidu à partir du méthanol et de l'acétate d'éthyle pour obtenir  un précipité gélatineux qu'on collecte par filtration, qu'on lave 

  
 <EMI ID=71.1> 

  

 <EMI ID=72.1> 


  
 <EMI ID=73.1> 

  
bonvl-L-lysine sous forme d'amide (IX) 

  
On ajoute 309 mg de dicyclohexylcarbodiimide à une so- 

  
 <EMI ID=74.1> 

  
L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycine s'obtenant comme décrit dans Bull. Chem. Soc. Japan 32., 1.471 (1964) et de 173 ml de N-hydroxysuccinimide dans 10 ml d'acétate d'éthyle. On agite le mélange

  
 <EMI ID=75.1> 

  
res. A ce mélange, on ajoute une solution froide de 1.395 g du composé VIII dans 15 ml de diméthylformamide et on agite la solu-tion résultante pendant 64 heures à la température ambiante. Après élimination de la dicyclohetylurée qui s'est séparée, on évapore le filtrat à siccité sous vide pour obtenir un résidu solide.

  
Par addition de méthanol et d'eau, on forme un précipité qu'on recueille, qu'on lave à l'eau et qu'on sèche sous vide pour obte-

  
 <EMI ID=76.1> 

  

 <EMI ID=77.1> 


  
 <EMI ID=78.1> 

  
nyl-L-séryl-L-méthionine dans 13 ml d'acétate d'éthyle et, sous refroidissement dans de la glace, on ajoute à cette solution 16 ml

  
 <EMI ID=79.1> 

  
On conserve le mélange à la température ambiante pendant 1 heure, puis on l'évaporé sous vide pour obtenir un résidu. On dissout le résidu dans 37 ml de dichlorométhane et on agite la solution

  
 <EMI ID=80.1> 

  
sous refroidissement. On sèche la couche organique sur du sulfate de sodium et on l'évapore sous vide pour obtenir un résidu cristallin. On ajoute 25 ml d'éther au résidu et on recueille

  
le produit par filtration, puis on le sèche sous vide pour obtenir

  
 <EMI ID=81.1> 

  
On dissout 10,65 g d'hydrazide de t-butyloxycarbonyl-a-

  
 <EMI ID=82.1> 

  
la température ambiante et on refroidit la solution. On ajoute

  
à cette solution 14 ml de nitrite de sodium 2M et on agite le mélange pendant 5 minutes. On extrait le mélange de réaction avec 2 fractions de 70 ml d'éther, on sèche la phase organique sur  <EMI ID=83.1> 

  
On dissout l'azide dans 58 ml d'acétonitrile froid et on agite la solution au bain de glace. On ajoute à la solution 6,15 g de l'ester méthylique de L-séryl-L-méthionine obtenu comme ci-

  
 <EMI ID=84.1> 

  
évaporation sous vide, on obtient un résidu huileux qu'on dis-

  
 <EMI ID=85.1> 

  
vement avec de l'acide chlorhydrique IN froid,une solution de bicarbonate de sodium à 5% et une solution saturée de chlorure de sodium. On sèche la phase organique sur du sulfate de sodium

  
et on l'évapore sous vide pour obtenir en quantité de 13 g l'ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-Lséryl-L-méthionine, sous forue d'un résidu huileux.

  
On dissout l'ester de tétrapeptide obtenu ci-dessus

  
 <EMI ID=86.1> 

  
à la solution. On chauffe le mélange au reflux pendant 2 heures,

  
 <EMI ID=87.1> 

  
d'acétate d'éthyle au résidu huileux résultant qu'on conserve alors au frais pendant 90 minutes. Par addition de 100 ml d'éther et de 100 ml d'acétate d'éthyle, on provoque la formation d'un gel qu'on conserve au frais pendant 90 minutes de manière à obtenir

  
 <EMI ID=88.1> 

  

 <EMI ID=89.1> 


  
11. t-Butyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-

  
 <EMI ID=90.1> 

  
On dissout 1,67 g du composé X dans 17 ml de diméthylformamide à la température ambiante et on refroidit la solution  <EMI ID=91.1> 

  
 <EMI ID=92.1> 

  
de sodium 1M, puis on agite le mélange pendant 5 minutes sous re-  froidissement à la glace. On extrait le mélange de réaction avec 
60 ml d'acétate d'éthyle et on lave l'extrait organique avec une  solution de bicarbonate de sodium froide et de l'eau, après quoi on  le sèche sur du sulfate de sodium anhydre.

  
D'autre part, on dissout dans 38 ml d'acide acétique à 50% 1,933 g de benzyloxycarbonyl-1-Y-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-  phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine (préparée comme indiqué

  
 <EMI ID=93.1> 

  
pendant 3 heures à la température ambiante sur du noir de palladium catalytique. Après avoir séparé le catalyseur par filtration, on concentre le filtrat sous vide à une température du bain de 30 à 50[deg.]C On dissout le résidu huileux résultant dans 20 ml d'acide acétique et on lyophilise la solution pour obtenir en quantité de 2,62 g de

  
 <EMI ID=94.1> 

  
tryptophyl-glycine sous forme d'une poudre légère. On dissout le produit dans 40 ml de diméthylformamide et on ajoute 0,78 ml de triéthylamine à la solution. On refroidit la solution au moyen de glace et on la mélange avec une solution de l'azide du tétrapeptide obtenu ci-dessus dans de l'acétate d'éthyle. On agite le mélange pendant 22 heures et 30 minutes en le refroidissant dans la glace. On recueille par filtration le solide résultant qu'on dissout dans

  
 <EMI ID=95.1> 
 <EMI ID=96.1> 
  <EMI ID=97.1> 

  
N -t-butyloxycarbonyl-L-lysine sous forme d'amide (XII) 

  
On hydrogénolyse 200 mg du composé IX dans 20 ml de méthanol sur du noir de palladium catalytique pendant 5 heures, puis on sépare le catalyseur par filtration. On concentre le filtrat sous vide jusqu'à environ 3 ml. On ajoute 6 ml de benzène et 30 ml d'éther de pétrole à la solution résiduelle et on recueille le précipité ainsi formé, puis on le lave et on le sèche sous vide pour obtenir 181 mg de N[pound]-t-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-

  
 <EMI ID=98.1> 

  
oxycarbonyl-L-lysine sous forme d'amide qui se révèle homogène à la chromatographie en couche mince (gel de silice, n-butanol:  acide acétique:eau = 4:1:2 en volume). 

  
A une solution de 200 mg du composé XI dans 5 ml de 

  
 <EMI ID=99.1> 

  
! refroidissant le mélange dans de la glace. On ajoute le mélange  immédiatement goutte à goutte à un mélange glacé de 50 ml d'acéta- &#65533; 

  
 <EMI ID=100.1> 

  
lave et qu'on sèche sous vide pour obtenir 234 mg de chlorhydrate .1 de benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-  méthionyl-Y-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L- 

  
 <EMI ID=101.1> 

  
On dissout 234 mg du chlorhydrate de décapeptide pro- 

  
 <EMI ID=102.1> 

  
32 mg de N-hydroxysuccinimide et 0,021 ml de triéthylamine  dans 4 ml de diméthylformamide à 0[deg.]C. A cette solution, on  ajoute une solution froide de 107 mg de dicyclohexylcarbodiimide et on agite le mélange à la température ambiante pendant 20 heures. On recueille par filtration le précipité formé par addition de

  
15 ml d'acétate d'éthyle,puis on le lave et on le sèche sous vide pour obtenir un résidu. On lyophilise le résidu dans l'acide acétique pour obtenir sous la forme d'une poudre légère 351 mg du composé recherché.

  
13. a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-

  
 <EMI ID=103.1> 

  
On dissout 351 mg du composé XII, 0,2 ml d'éthanedithiol et 0,35 ml d'anisole dans 4 ml d'acide trifluoroacétique aqueux à 90% et on conserve la solution pendant 1 heure à la

  
 <EMI ID=104.1> 

  
réaction,puis on recueille par filtration le précipité résultant qu'on lave et qu'on sèche sous vide. Ensuite, on dissout le

  
 <EMI ID=105.1> 

  
solution sur une colonne de 0,9 cm x 30 cm de résine Amberlite CG-400 sous forme acétate. On élue la colonne avec de l'acide

  
 <EMI ID=106.1> 

  
colorée à l'essai de Folin-Lowry. On concentre les éluats à petit volume et on les lyophilise pour obtenir 267 mg d'une poudre. On introduit la poudre dans une colonne de 2,2 cm x 30 cm de carboxyméthylcellulose (Watman CM-52) et on élue la colonne au débit de 60 ml par heure avec un tampon à l'acétate d'ammonium
(pH 6,50) présentant un gradient linéaire de concentration de

  
 <EMI ID=107.1> 

  
n[deg.]235 à 290, 10 ml/tube, puis on concentre le mélange et on le lyophilise pour obtenir 153 mg d'une poudre. On dissout la poudre dans un mélange 12:3:4:6 de n-butanol, d'acide acétique, de pyridine et d'eau et on soumet la solution à une chromatographie de partage sur une colonne de Sephadex G-25. On élue cette colonne de 2,7 cm x 80 cm au débit de 70 ml par heure à l'aide du même solvant que ci-dessus. On combine les fractions des

  
 <EMI ID=108.1> 

  
lyophilise. On soumet la poudre ainsi obtenue à une chromatographie sur une colonne de carboxyméthylcellulose comme précédemment, puis on effectue une lyophilisation pour obtenir sous

  
 <EMI ID=109.1>  1,2, arginine 1,0, sérine 0,9, acide glutamique 1,1, proline 1,0, glycine 2,0, acide a-aminoisobutyrique 0,9, valine 1,0, méthionine 1,0, tyrosine 1,0, phénylalanine 1,0. Le rapport du trypto-

  
 <EMI ID=110.1> 

  
dans l'ultraviolet sur une solution dans l'hydroxyde de sodium N/10. Le produit donne une tache unique avec la ninhydrine

  
et les réactifs Ehrlich, Pauly et Sakaguchi à la chromatographie en couche mince (plaque de cellulose, n-butanol:acide acétiqueïpy-

  
 <EMI ID=111.1> 

  
4:1:2 en volume).

EXEMPLE B -

  
Préparation de l'a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-Lnorleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-

  
 <EMI ID=112.1> 

  
On dissout 2,50 g d'hydrazide de p-méthoxybenzyloxycar-

  
 <EMI ID=113.1> 

  
on ajoute à cette solution 4,2 ml de nitrite de sodium 2M glacé.

  
 <EMI ID=114.1> 

  
les on ajoute 20 ml d'acétate d'éthyle glacé et 12 ml de carbo-

  
 <EMI ID=115.1>   <EMI ID=116.1> 

  
l'extrait à nouveau à l'acétate d'éthyle glacé. On combine

  
les extraits organiques,on les sèche sur du sulfate de magnésium et on les ajoute à une solution de 3,35 g du formiate de l'ester méthylique de L-phénylalanyl-L-nitroarginyl-L-tryptophyl-glycine

  
 <EMI ID=117.1> 

  
On concentre le mélange par évaporation de l'acétate d'éthyle à une température du bain inférieure à 20[deg.]C. On conserve la solu-

  
 <EMI ID=118.1> 

  
du solvant sous vide, on triture le résidu sirupeux dans l'acétate d'éthyle et on recueille par filtration 5,46 g d'un précipité qui s'est séparé. Par reprécipitation à partir de méthanol aqueux puis des traitements répétés à l'aide de méthanol chaud, on obtient en quantité de 2,53 g (53%) le composé recherché à

  
 <EMI ID=119.1> 

  
calculé C, 55,51; H, 5,82; N, 17,66%

  
trouvé C, 55,65; H, 5,76; N, 17,62%

  
 <EMI ID=120.1> 

  
On refroidit au bain de glace une solution de 6,60 g du composé I dans 7 ml de diméthylformamide et 63 ml de méthanol.

  
 <EMI ID=121.1> 

  
agite le mélange pendant 40 minutes à la température ambiante. On refroidit le mélange au bain de glace et on le neutralise au

  
 <EMI ID=122.1> 

  
d'eau, on recueille par filtration le précipité qui s'est séparé et qu'on lave à l'eau. On met le produit résultant en suspension

  
 <EMI ID=123.1> 

  
et on chauffe la suspension à l'ébullition pendant quelques minutes pour induire la cristallisation, après quoi on met le tout à reposer à la température ambiante jusqu'au lendemain. On re-cueille par filtration le précipité cristallin qu'on lave au méthanol et à l'éther,puis qu'on sèche sous vide pour obtenir

  
 <EMI ID=124.1> 

  

 <EMI ID=125.1> 


  
 <EMI ID=126.1> 

  
glycine (III)

  
On ajoute 65 ml d'acide trifluoroacétique à un mélange de 6,50 g du composé II et de 6,5 ml de 2-mercaptoéthanol à 0[deg.]C

  
 <EMI ID=127.1> 

  
On recueille par filtration le précipité qu'on fait se séparer par addition d'éther,puis on le lave à l'éther et on le sèche sous vide. On dissout dans 75 ml d'eau le sel formé par l'acide trifluoroacétique et le pentapeptide recherché,puis on fait passer la solution sur une colonne de 2,7 cm x 30 cm de résine Amberlite CG-400 (sous forme acétate) en ajoutant des suppléments  d'eau. On combine les solutions aqueuses, on les concentre sous

  
 <EMI ID=128.1> 

  

 <EMI ID=129.1> 


  
 <EMI ID=130.1> 

  
composé III dans 5 ml de diméthylformamide et on conserve le mé-

  
 <EMI ID=131.1>   <EMI ID=132.1> 

  
 <EMI ID=133.1> 

  
sout le produit brut résultant dans 10 ml de méthanol et on ajoute un peu d'eau (environ 10 ml). On recueille par filtration le précipité résultant et on concentre le filtrat sous vide pour obtenir une masse gélatineuse. On ajoute environ 10 ml d'acide acé-

  
 <EMI ID=134.1> 

  
qu'on lave soigneusement à l'acide acétique 0,5M et qu'on sèche sous vide sur des pastilles d'hydroxyde de sodium et sur du

  
 <EMI ID=135.1> 

  
 <EMI ID=136.1> 

  

 <EMI ID=137.1> 


  
 <EMI ID=138.1> 

  
On hydrogénolyse 0,70 g du composé IV pendant 8 heures dans de l'acide acétique sur du palladium. Après séparation du catalyseur par filtration, on évapore le filtrat sous vide pour obtenir un résidu sirupeux qu'on lyophilise dans l'eau et qu'on sèche sur des pastilles d'hydroxyde de sodium et sur du pentoxyde de phosphore pour obtenir en quantité de 0,60 g le composé recher- 

  
 <EMI ID=139.1> 

  

 <EMI ID=140.1> 


  
 <EMI ID=141.1>   <EMI ID=142.1> 

  
qui s'est séparée et on évapore le filtrat sous vid.e pour obtenir un résidu cristallin qu'on recristallise dans l'éthanol afin

  
 <EMI ID=143.1> 

  

 <EMI ID=144.1> 


  
 <EMI ID=145.1> 

  
du composé III et de 0,42 ml de triéthylamine dans 8 ml de di-

  
 <EMI ID=146.1> 

  
On ajoute alors le mélange goutte à goutte à 80 ml d'acétate d'éthyle et on recueille par filtration le précipité résultant qu'on lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther, puis qu'on sèche sous vide pour en obtenir une quantité de 1,77 g. On chauffe à l'ébullition pendant quelques minutes une suspension du produit brut dans du méthanol,puis on laisse reposer la suspension jusqu'au lendemain. On sépare par filtration le précipité qu'on lave

  
au méthanol froid et à l'éther, puis qu'on sèche sous vide sur des pastilles d'hydroxyde de sodium et sur du pentoxyde de phosphore à 60[deg.]C de manière à obtenir 1,84 g (87%) du composé recherché.

  
 <EMI ID=147.1> 
 <EMI ID=148.1> 
  <EMI ID=149.1> 

  
 <EMI ID=150.1> 

  
On rajoute alors goutte à goutte à 250 ml d'acétate d'éthyle,puis on sépare par filtration le précipité résultant qu'on lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther,puis qu'on sèche sous vide pour en isoler une quantité de 5,52 g. On reprécipite le produit brut résultant à partir de l'acide acétique et du méthanol pour

  
 <EMI ID=151.1> 

  

 <EMI ID=152.1> 


  
 <EMI ID=153.1> 

  
On mélange convenablement 4,90 g du composé VIII avec 4,9 ml de 2-mercaptoéthanol et on refroidit le tout au bain de glace. On y ajoute 50 ml d'acide trif luoroacétique et on main-

  
 <EMI ID=154.1> 

  
de temps à autre. On recueille par filtration le précipité qui se sépare par addition d'éther, on le lave à l'éther et on le sè-

  
 <EMI ID=155.1> 

  

 <EMI ID=156.1> 


  
 <EMI ID=157.1>   <EMI ID=158.1> 

  
drazide de benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosine dans

  
15 ml d'acide chlorhydrique 1M. A cette solution, on ajoute goutte à goutte 3,0 ml de nitrite de sodium 2M glacé et on agite le mélange pendant 4 minutes. On extrait dans l'acétate d'éthyle glacé l'azide qui se sépare. On lave l'extrait organique avec du bicarbonate de sodium 1 M glacé puis on le sèche sur du sulfate

  
 <EMI ID=159.1> 

  
 <EMI ID=160.1> 

  
méthionine dans 5 ml de diméthylf&#65533;rmamide. On maintient le mélange à 40C pendant 65 heures,puis on le lave avec de l'acide

  
 <EMI ID=161.1> 

  
sèche sur du sulfate de magnésium. Par évaporation du solvant sous vide, on obtient un résidu mousseux qu'on rep récipite à plusieurs reprises à partir d'acétate d'éthyle pour obtenir 2,81g de l'ester de tétrapeptide sous la forme d'un solide amorphe. On dissout

  
ce solide dans 25 ml d'éthanol et on ajoute 2,4 ml d'hydrate d'hydrazine à la solution. Après 17 heures de repos à la température ambiante, on chasse la majeure partie du solvant par évaporation sous vide. On dissout le résidu dans un mélange de

  
10 ml d'eau et de 20 ml d'acétate d'éthyle,puis on lave la phase organique avec des suppléments d'eau. Par concentration sous vide de cette solution, on obtient l'hydrazide à l'état de précipité gélatineux qu'on purifie par reprécipitation à partir de l'éthanol et de l'acétate d'éthyle pour le collecter en quantité de 1,86 g

  
 <EMI ID=162.1> 

  

 <EMI ID=163.1> 


  
 <EMI ID=164.1> 

  
norleucine (XI) On ajoute 10 ml de dichlorométhane et 2 ml de carbonate

  
 <EMI ID=165.1> 

  
d'ester méthylique de L-norleucine dans 2 ml d'eau et on agite

  
le mélange. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et on l'évapore à une température du bain de 25[deg.]C. On dissout le résidu dans le dichlorométhane et on ajoute 1,20 g de benzyloxycarbonyl-L-sérine et 1,03 g de dicyclohexylcarbodiinide avec un peu de dichlorométhane. On maintient le mélange de réac-

  
 <EMI ID=166.1> 

  
la dicyclohexylurée qui s'est séparée. On évapore le filtrat sous vide pour obtenir un résidu. On dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et on lave la solution à l'acide chlorhydri-

  
 <EMI ID=167.1> 

  
sulfate de sodium et on l'évapore sous vide. Par reprécipitation à partir de l'acétate d'éthyle et de l'éther de pétrole, on obtient en quantité de 1,56 g (85%) le dipeptide pur recherché

  
 <EMI ID=168.1> 

  

 <EMI ID=169.1> 


  
 <EMI ID=170.1> 

  
On hydrogénolyse 1,10 g du composé XI dans un mélange

  
de 15 ml de méthanol et de 5 ml d'acide acétique pendant 90 minutes sur du palladium. Après avoir séparé le catalyseur, on évapore le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on traite au moyen

  
 <EMI ID=171.1> 

  
te d'ester méthylique de L-séryl-L-norleucine. On dissout 0,73 g de l'ester de dipeptide et 0,35 ml de triéthylamine dans 5 ml de diméthylformamide et on mélange cette solution avec une solution d'azide de benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosine (s'ob-

  
 <EMI ID=172.1>  drazide) dans l'acétate d'éthyle. On laisse la réaction progres-

  
 <EMI ID=173.1> 

  
 <EMI ID=174.1> 

  
puis on le sèche sur du sulfate de magnésium et on l'évapore sous vide pour obtenir un résidu sirupeux. On dissout l'ester de tétra-

  
 <EMI ID=175.1> 

  
te d'hydrazine à la solution. Après 2 jours de repos à la température ambiante, on chasse le solvant par évaporation sous vide. On dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et on lave la solution à l'eau, puis on la sèche soigneusement sur du sulfate de magnésium. On collecte par filtration le précipité gélatineux qui s'est séparé, on le lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther et on le sèche sous vide pour obtenir 0,93 g de produit. Par recristallisation dans l'éthanol, on obtient en quantité de 0,73 g (47%) l'hydrazide

  
 <EMI ID=176.1> 

  

 <EMI ID=177.1> 


  
 <EMI ID=178.1> 

  
On dissout 0,46 g du composé XII dans 1,9 ml d'acide

  
 <EMI ID=179.1> 

  
froidit la solution au bain de glace et on y ajoute goutte à goutte 0,42 ml de nitrite de sodium 2M glacé. On agite le mélange pendant 4 minutes et on l'extrait à l'acétate d'éthyle glacé. On lave l'extrait organique avec du bicarbonate de sodium 1M glacé, on le sèche sur du sulfate de magnésium et on l'évapore sous vide à une température du bain de 10[deg.]C. On mélange l'azide de tétrapeptide résultant avec une solution glacée de 0,62 g du composé IX et de 0,21 ml de triéthylamine dans du diméthylformamide. On con- <EMI ID=180.1> 

  
à goutte à dO ml d'acétate d'éthyle. On sépare par filtration le précipité résultant qu'on lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther et qu'on lyophilise dans l'acide acétique pour obtenir

  
 <EMI ID=181.1> 

  

 <EMI ID=182.1> 


  
 <EMI ID=183.1> 

  
sous forme d'amide (s'obtenant comme décrit dans Bull.Chem.Soc.Japa

  
 <EMI ID=184.1> 

  
tion, on évapore le filtrat sous vide. On dissout le résidu dans 5 ml d'eau et on ajoute 0,17 ml de triéthylamine. On refroidit la solution résultante dans de la glace et, après addition

  
 <EMI ID=185.1> 

  
pour obtenir le chlorhydrate recherché. On sèche le produit sous vide sur des pastilles d'hydroxyde de sodium et sur du pentoxyde de phosphore à 60[deg.]C pendant 2 heures pour l'obtenir en quantité

  
 <EMI ID=186.1> 

  
On ajoute 83 mg de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide à une  <EMI ID=187.1> 

  
jusqu'au lendemain à la température ambiante. On y ajoute une

  
 <EMI ID=188.1> 

  
dans 2 ml de diméthylformamide. On conserve le mélange de réac-

  
 <EMI ID=189.1> 

  
en volume d'acétate d'éthyle et d'éther. On recueille par filtration le précipité résultant qu'on lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther, puis qu'on sèche sous vide pour obtenir 242 mg de l'octadécapeptide protégé brut.

  
On dissout 412 mg du peptide protégé brut dans 20 ml

  
de fluorure d'hydrogène liquide en ajoutant 100 mg de méthionine

  
 <EMI ID=190.1> 

  
dans 15 ml d'eau glacée et,après lavage de la solution avec de l'acétate d'éthyle, on fait passer la solution sur une colonne

  
de 1,7 cm x 20 cm de résine Amberlite CG-400 sous forme acétate. On lave la colonne avec de l'eau et on collecte les éluats aqueux qu'on évapore sous vide à une température du bain de 50 à 60[deg.]C. Par lyophilisation du résidu, on obtient 507 mg de l'octadécapeptide brut débarrassé des radicaux de blocage.

  
On dissout 507 mg du peptide brut ci-dessus dans 10 ml d'eau et on chromatographie la solution sur une colonne de 1,7 cm x 40 cm de carboxyméthylcellulose (11,2&#65533; g sur base sèche du produit vendu sous le nom de Serva,0,63 méq/g) en utilisant un tampon à l'acétate d'ammonium (2.000 ml, pH 6,0) dont le gradient de concentration linéaire s'étend de 0 à 0,6. mole/l.On collecte des fractions de 10 ml, on observe par spectrophoto:nétrie à 280 nm l'apparition du pic principal et on rassemble les fractions contenant le composé recherché, après quoi on les évapore à une température du bain de 50 à 60[deg.]C. On lyophilise le résidu et on le sèche sous vide sur des pastilles d'hydroxyde de sodium et sur  <EMI ID=191.1> 

  
On soumet les 221 mg d'octadécapeptide partiellement purifié à une chromatographie de partage sur une colonne de

  
2,3 cm x 46 cm de Sephadex G-25 (qualité moyenne, poids sec 50 g) en prenant comme solvant un mélange 12:3:4:6 en volume de 1-butanol, d'acide acétique, de pyridine et d'eau. On collecte des fractions de 6 ml dans lesquelles on observe la teneur en peptide suivant la technique de Folin-Ciocalteu. On rassemble séparément le contenu des tubes 12 à 15 et 16 à 40, on évapore

  
 <EMI ID=192.1> 

  
et on lyophilise les résidus pour obtenir 43 mg de la fraction F-l et 91 mg de la fraction F-2 respectivement. On chromatographie à nouveau la fraction F-l sur la même colonne de Sephadex exactement comme ci-dessus et on rassemble le contenu des tubes
16 à 3C pour obtenir 13 mg de la fraction F-1-2. On mélange les fractions F-2 et F-l-2 et on chromatographie le tout à nouveau exactement comme ci-dessus. On rassemble le contenu des tubes

  
16 à 40, on évapore le mélange sous vide et on le lyophilise pour obtenir 89 mg de peptide.

  
On soumet finalement les 89 mg de peptides résultant à une chromatographie sur une colonne de 1,7 cm x 35 cm de carboxyméthylcellulose (CM-52 de la Société Merck) en utilisant

  
un tampon à l'acétate d'ammonium (1.200 ml, pH 6,0) dont le gradient de concentration linéaire s'étend de 0,1 à 0,6 mole/1. On collecte des fractions de 8 ml et on rassemble celles (tubes 139 à 160) correspondant au pic principale puis on les évapore, on lyophilise le résidu et on sèche le produit sous vide sur des pastilles d'hydroxyde de sodium et sur du pentoxyde de phosphore pour obtenir en quantité de 62 g l'octadécapeptide pur désiré,

  
 <EMI ID=193.1> 

  
produit donne une tache unique à la chromatographie en couche mince (cellulose F, Merck) en présence du système solvant  <EMI ID=194.1> 

  
L-lysyl)-Ne-t-butyloxycarbonyl-L-lysine sous forme d'amide. Par évaporation du solvant sous pression réduite, on obtient un résidu qu'on sèche sur des pastilles d'hydroxyde de sodium et sur

  
 <EMI ID=195.1> 

  
tapeptide exempt de radical en Na dans 2 ml de diméth y l.formamide

  
 <EMI ID=196.1> 

  
et 54 mg de 1-hydroxybenzotriazole. On refroidit le mélange au bain de glace et on y ajoute 82,5 mg de dicyclohexylcarbodiimide

  
 <EMI ID=197.1> 

  
pendant 3 jours,,puis on le verse dans 100 ml d'un mélange 1:1 d'acétate d'éthyle et d'éther. On collecte par filtration le précipité résultant qu'on lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther^puis qu'on sèche sous vide pour obtenir 259 mg de l'octadécapeptide protégé brut.

  
On dissout 413 mg du peptide protégé brut dans environ 20 ml de fluorure d'hydrogène liquide en ajoutant 100 mg

  
 <EMI ID=198.1> 

  
75 minutes à 0[deg.]C, puis on l'évapore sous vide à 0[deg.]C. On dissout le résidu dans 15 ml d'eau glacée et,après lavage de la solution à l'acétate d'éthyle, on la fait passer sur une colonne de 1,7 cm x 20 cm de résine Amberlite CG-400 (sous forme acétate) en utili-sant de l'eau pour l'élution. On combine les solutions aqueuses qu'on évapore sous vide à une température du bain de 50 à 60[deg.]C. Par lyophilisation du résidu, on obtient 512 mg de l'octadécapeptide brut débarrassé des radicaux de blocage.

  
On dissout les 512 mg de peptide brut ci-dessus dans

  
10 ml d'eau et on chromatographie la solution sur une colonne

  
de 1,7 cm x environ 40 cm de carboxyméthylcellulose (11,25 g

  
sur base sèche de Serva, 0,63 mé q/g) en utilisant un tampon à l'acétate d'ammonium (2.000 ml, pH 6,0) dont le gradient de concentration linéaire s'étend de 0 à 0,6 mole/1. On collecte des fractions de 10 ml qu'on observe par absorption à 280 nm et on rassemble celles correspondant au pic principal, puis on les évapore sous vide à une température du bain de 50 à 60[deg.]C. On lyophilise le résidu et on le sèche sous vide sur des pastilles d'hydroxyde de sodium et sur du pentoxyde de phosphore pour l'isoler en quantité de 242 mg.

  
On soumet les 242 mg d'octadécap eptide partiellement purifié à une chromatographie de partage sur une colonne de

  
2,7 cm x 30 cm de Sephadex G-25 (qualité moyenne, poids sec 50 g) en utilisant comme solvant un mélange 12:3:4:6 en volume de 1-butanol, d'acide acétique, de pyridine et d'eau. On collecte des fractions de 6 ml dont on observe la teneur en peptide suivant la technique de Folin-Clocalteu. On rassemble séparément les contenus des tubes 12 à 18 et 19 à 60 correspondant à deux pics,on évapore les mélanges sous vide à une temperéture du bain de 45 à
50[deg.]C et on les lyophilise pour obtenir 64 mg d'une fraction

  
F-l et 170 mg d'une fraction F-2 respectivement. On chromatographi la fraction F-2 à nouveau exactement comme ci-dessus sur la même colonne de Sephadex. On rassemble le contenu des tubes 19 à 60, on les évapore et on les lyophilise pour obtenir 120 mg de produit.

  
On soumet les 120 mg de peptide résultant à une purifi- <EMI ID=199.1> 

  
d'ammonium (1.2CO ml, pH 6,0) dont le gradient de concentration linéaire s'étend de 0,1 à 0,6 mole/1. On collecte des fractions de 8 ml et on rassemble celles correspondant a un pic principal
(tubes 131 à 165), puis on les évapore et on les lyophilise pour

  
 <EMI ID=200.1> 

  
 <EMI ID=201.1>  tographie en couche mince sur cellulose F, Société Merck, on détermine que le produit est homogène (réaction à la ninhydrine

  
 <EMI ID=202.1> 

  
NH2 dans 1 ml d'une solution aqueuse de 20 mg de chlorure de zinc. D'autre part, on dissout 18 mg de chlorure de sodium et 2 mg d'al-

  
 <EMI ID=203.1> 

  
On mélange les deux solutions pour obtenir une suspension du complexe de l'octadécapeptide avec le zinc.

EXEMPLE E -

  
On ajoute,à 0,2 ml d'une solution aqueuse d'acétate

  
 <EMI ID=204.1> 

  
aqueuse de chlorure de zinc 100 mM et 22 ml d'une solution aqueuse

  
 <EMI ID=205.1> 

  
d'alcool benzylique et de 0,8 ml d'hydrogénophosphate disodique
100 mM, on agite le mélange pour former une suspension. On ajuste à environ 7,0 le pH de la suspension en y ajoutant de l'hydroxyde

  
 <EMI ID=206.1> 

EXEMPLE F -

  
 <EMI ID=207.1> 

  
(1-18)-NH2 dans 0,2 ml d'eau distillée et on ajoute à la solution

Claims

0,3 ml d'une solution aqueuse contenant 2 mg d'acide poly-L-aspartique (poids moléculaire environ 3.000) qu'on a neutralisé au <EMI ID=208.1>

sion. On ajoute ensuite à la suspension 9 mg de chlorure de sodium et 0,5 ml de dihydrogénophosphate sodique-dihydrogénophospha-

<EMI ID=209.1>

plexe.

REVENDICATIONS.

1 - Composé choisi parmi l'a-aminoisobutyryl-L-tyrosylL-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-

<EMI ID=210.1>

ryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valylglycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine sous forme d'amide,

<EMI ID=211.1>

histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-Lprolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysine sous forme d'amide, leurs sels d'addition d'acides non toxiques et leurs complexes.

2 - L'a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-méthionyl-Lglutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysylL-lysine sous forme d'amide.

3 - L'a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-norleucyl-Lglutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine sous forme d'amide.

<EMI ID=212.1>

L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl - L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl - L-lysyl-L-lysyl-L-lysine sous forme d'amide. <EMI ID=213.1>

prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-Y

où X représente un radical L-méthionyle ou L-norleucyle et Y re-

<EMI ID=214.1>

ginyl-L-arginine sous forme d'amide, à l'exclusion toutefois

de l'octadécapeptide dans la formule duquel X représente le radical L-méthionyle et Y représente la L-arginyl-L-arginine sous forme d'amide,et de leurs complexes ou sels d'addition d'acides non toxiques, caractérisé en ce qu'on condense un décapeptide protégé

de formule:

<EMI ID=215.1>

présente un radical protégeant la fonction carboxyle et X a la signification ci-dessus, avec un octapeptide protégé de formule:

<EMI ID=216.1>

sous forme d'amide ou la L-arginyl-L-arginine sous forme d'amide, et on élimine les radicaux protecteurs de l'octadécapeptide protégé résultant de formule:

<EMI ID=217.1>

où tous les symboles ont les significations ci-dessus,puis on convertit éventuellement l'octadécapeptide résultant débarrassa des radicaux protecteurs en l'un de ses complexes ou sels d'addition d'acides non toxiques d'une manière classique.

6 - Procédé de préparation de l'a-aminoisobutyryl-L-ty-rosyl-L-séryl-L-méthionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycylL-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysine sous forme d'amide et de ses complexes ou sels d'addition d'acides non toxiques, caractérisé en ce qu'on condense un décapeptide protégé de formule:

<EMI ID=218.1>

phyl-glycine

<EMI ID=219.1>

représente un radical protégeant la fonction carboxyle,avec un octapeptide protégé de formule:

<EMI ID=220.1>

la fonction amino, on élimine les radicaux protecteurs de l'octadécapeptide protégé résultant de formule:

<EMI ID=221.1>

où tous les symboles ont la signification ci-dessus, et on convertit éventuellement l'octadécapeptide résultant débarrassé des radicaux protecteurs en un de ses complexes ou sels d'addition d'acides non toxiques de façon classique.

7 - Procédé de préparation de l'c-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-/alyl-glycyl-Llysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine sous forme d'amide ou d'un

de ses complexes ou sels d'addition d'acides non toxiques, caractérisé en ce qu'on condense un décapeptide protégé de formule:

R<1>-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-norleucyl-YR<2>-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl -glycine.

<EMI ID=222.1>

représente un radical protégeant la fonction carboxyle, avec un octapeptide protégé de formule:

<EMI ID=223.1>

la fonction amino, on élimine les radicaux protecteurs de l'octadécapeptide protégé résultant do formule:

R -a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-norleucyl-Y-R L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-

<EMI ID=224.1>

R5-L-lysyl-L-arginyl-L-arginine sous forme d'amide

où tous les symboles ont la signification ci-dessus,et on convertit éventuellement l'octadécapeptide résultant débarrassé des radicaux protecteurs en un de ses complexes ou sels d'addition d'acides non toxiques de façon classique.

8 - Procédé de préparation de l'a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-séryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phénylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L--lysine sous forme d'amide ou d'un de ses complexes ou sels d'addition d'acides non toxiques, caractérisé en ce qu'on condense un décapeptide protégé de formule:

<EMI ID=225.1>

représente un radical protégeant la fonction carboxyle, avec un octapeptide pr.otégé de formule:

<EMI ID=226.1> la fonction amino, on élimine les radicaux protecteurs de l'octadécapeptide protégé résultant de formule:

<EMI ID=227.1>

où tous les symboles ont la signification ci-dessus,et on convertit éventuellement l'octadécapeptide résultant débarrassé des radicaux protecteurs en un de ses complexes ou sels d'addition d'acides non toxiques de manière classique.