BE897455A

BE897455A - Analogues du facteur liberant des hormones luteininsantes et stimulant les follicules ces analogues exercant une haute activite gomadotrope de meme que leur procede de preparation

Info

Publication number: BE897455A
Application number: BE0/211294A
Authority: BE
Inventors: M Flegel; J Pospisek; J Picha; D Pichova; M Krojidlo; J Kolinsky
Original assignee: Spofa Vereinigte Pharma Werke
Priority date: 1982-08-06
Filing date: 1983-08-03
Publication date: 1983-12-01
Also published as: IT8322397A1; JPS5959654A; DE3328235A1; YU45144B; CH658662A5; GB2125408A; ATA271583A; IT1165473B; YU163383A; FR2531952B1; CS230614B1; US4512923A; GB8320922D0; CA1206959A; SE8304158D0; IT8322397A0; FR2531952A1; HU192962B; GB2125408B; SE8304158L

Description


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   BREVET D'INVENTION. SPOFA spojené podniky pro 
 EMI1.1 
 f zdravotnickou vyrobu Analogues du facteur libérant des hormones lutéinisantes et stimulant les follicules, ces analogues exerçant une haute activité gonadotrope, de même que leur procédé de préparation. 
 EMI1.2 
 



  (Inventeurs : Martin FLEGEL, Jan POSP Josef POCHA, Drahomra CHOVÀ, Milan KROJIDLO et Jir KOLNSK) Convention Internationale-Priorité d'une demande de brevet déposée en Tchécoslovaquie le 6 août 1982 sous le No. PV 5868-82 aux noms des inventeurs. 

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  Analogues du facteur libérant des hormones lutéinisantes et stimulant les follicules, ces analogues exerçant une haute activité gonadotrope, de même que leur procédé de préparation. 



   La présente invention concerne des analogues du facteur libérant des hormones lutéinisantes et stimulant les follicules (LH + FSH) et répondant à la formule générale I : 
 EMI2.1 
 1 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (I) î x dans laquelle X représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur, de   préférence,   un radical p-toluènesulfonyle (tosyle). Les autres abréviations utilisées ont les significations habituelles,   c'est-à-dire   que Et représente un groupe éthyle et les symboles suivants représentent chacun un radical bivalent respectivement de : pGlu Acide pyroglutamique
His Histidine
Trp Tryptophane
Ser Sérine
Tyr Tyrosine
D-Tle Acide   l-amino-3, 3-diméthyl-D-   
 EMI2.2 
 butanoique 
Leu Leucine
Arg Arginine et
Pro proline. 



   Ces nouveaux nonapeptides biologiquement actifs exercent une haute activité gonadotrope et on envisage de les utiliser en médecine humaine et vétérinaire, en particulier, pour le contrôle du cycle oestral, pour le traitement des troubles oestraux, ainsi que comme contraceptifs non stéraniques. 

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   Comme on le sait, le facteur libérant les hormones lutéinisantes et stimulant les follicules (LRF) est produit par l'hypothalamus et il provoque la libération de LH + FSH dans le lobe hypophysaire antérieur. Les LH + FSH libérés contrôlent les teneurs en hormones stéroïdes chez les êtres humains et les animaux des deux sexes. De même, les récepteurs de LRF se trouvent immédiatement dans la zone des gonades. Des analogues de LRF à activité agoniste   (c'est-à-dire   dans le sens de la libération) sont utilisés en médecine humaine et vétérinaire, notamment pour le traitement de la stérilité fonctionnelle et des kystes ovariens. En outre, une action accrue et prolongée de certains analogues de LRF peuvent produire l'effet inverse,   c'est-à-dire   supprimer l'ovulation et la spermatogénèse. 



   Le décapeptide du LRF naturel de formule
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 subit une dégradation enzymatique rapide par suite du clivage de ses liaisons pGlu-His, Tyr-Gly et Pro-Gly. 



  En conséquence, des essais ont été entrepris en vue d'obtenir, par une substitution différente des radicaux d'acides aminés dans ces positions critiques, des analogues plus résistants qui exerceraient une action modifiée ou accrue et prolongée. C'est ainsi que le remplacement de Gly en position 6 par différents D-amino-acides non protéinogènes et leurs dérivés, en particulier, d'une certaine nature lipophile, a conduit à des substances exerçant une haute activité agoniste. Une substitution simultanée de Gly-NH2 en position 10 par des groupes alkyle appropriés a donné, en raison d'un accroissement complémentaire de l'activité de LRF, ce que l'on appelle des analogues   "superactifs".

   Lorsqu'on   les administre en faibles 

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 doses, ces derniers sont utiles, en particulier, pour le traitement des troubles ovariens, de même que pour provoquer l'ovulation dans le régime reproductif dirigé chez les vaches laitières. On peut utiliser un dosage élevé de ces agents, par exemple, pour l'interruption contrôlée du cycle oestral chez les animaux d'élevage, pour la contraception non stéranique, de même que pour le traitement de certaines tumeurs dépendant des glandes endocrines. 



   Une étude systématique continue des relations   structure/activité,   y compris de nouvelles altérations structurales, a abouti à l'élaboration d'analogues de LRF ayant une haute puissance biologique et pouvant être utilisés en thérapie. C'est ainsi que, suivant la présente invention, le radical glycine occupant la position 6 du LRF naturel a été remplacé par le radical bivalent d'un nouvel amino-acide de la configuration D que l'on n'a jamais décrit jusqu'à présent à ce propos. Il s'agissait du radical de l'acide   l-amino-3,     3-diméthyl-D-butanoïque   (tert-leucine). La structure de sa chaîne latérale aliphatique est considérablement lipophile et elle comporte efficacement un empêchement stérique.

   Ces deux caractéristiques exercent un effet favorable sur les propriétés biologiques des analogues de LRF, en particulier, sur le degré et la durée de leur action. On présume que l'analogue 6-D-Tle obtenu de LRF est beaucoup plus stable vis-à-vis des effets métaboliques et que, par conséquent, il exerce une action plus prolongée que les analogues contenant un radical   O-tert-butyl-D-   sérine ou une chaîne latérale aromatique, par exemple, de   3- (2-naphtyl)-D-alanine.   Le   10-Gly-NH   a été le mieux remplacé par NHEt. 



   Les précurseurs d'analogues de LRF partiellement protégés conservent une importante partie de 

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 l'activité des composés non protégés respectifs ; dès lors, la présence d'un groupe Arg libre en position 8   n'est   pas critique pour une haute activité agoniste. 



  Cette découverte est   d'une   importance supplémentaire, car elle offre la possibilité de produire l'effet biologique   désirée   en particulier, en médecine vétérinaire et ce, moyennant l'utilisation de ces précurseurs synthétiques qui sont plus aisément disponibles et moins coûteux. Des découvertes semblables ont été mentionnées antérieurement dans le cas opposé de certains analogues de LRF exerçant une activité inhibitrice. 



   Les analogues VI et VII de LRF (voir les exemples) ont été administrés par voie intraveineuse à des génisses ovariectomisées en doses de 10 et   200 rg.   



  Le radio-immuno-titrage a été pratiqué dans un système homologue d'anticorps doubles (Stupnicki   R., Mladej   A. : Endocrinology   68,   6 (1976)). La préparation bovine de NIH-LER-1716-2 a été utilisée comme étalon   d'ioda-   tion ; la sensibilité au radio-immuno-titrage a été supérieure à   100 ug.   La réaction croisée de l'hormone somatotrope-prolactine était de 1%. Les résultats des essais sont résumés dans le tableau   I ci-après.   

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   TABLEAU Teneurs en LH + FSH après l'administration de 200   ug   de LRF et ses analogues. 
 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Composé <SEP> Début <SEP> de <SEP> 1 <SEP> r <SEP> ac- <SEP> Durée <SEP> Concentration
<tb> tion <SEP> stimulant <SEP> (minutes) <SEP> moyenne
<tb> les <SEP> follicules <SEP> FSH
<tb> (minutes) <SEP> ( g/ml)
<tb> Blanc--31, <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 9
<tb> LRF <SEP> 40 <SEP> + <SEP> 11,5 <SEP> 100 <SEP> ¯ <SEP> 26,7 <SEP> 108,4 <SEP> ¯ <SEP> 16,1
<tb> VI <SEP> 26,7 <SEP> 7 <SEP> + <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 43 <SEP> + <SEP> 20,4 <SEP> 72, <SEP> 4 <SEP> + <SEP> 10, <SEP> 9
<tb> VII <SEP> 40, <SEP> 0 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> 230 <SEP> + <SEP> 32, <SEP> 1 <SEP> 110, <SEP> 9 <SEP> ¯ <SEP> 11, <SEP> 7
<tb> Composé <SEP> Début <SEP> de <SEP> l'ac- <SEP> Durée <SEP> Concentration
<tb> tion <SEP> lutéini- <SEP> (minutes) <SEP> moyenne
<tb> sante <SEP> @ <SEP> LH
<tb> (minutes) <SEP> (ug/ml) <SEP> 
<tb> Blanc--0, <SEP> 26 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 04
<tb> LRF <SEP> 53,

   <SEP> 3 <SEP> + <SEP> 13, <SEP> 9 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> + <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 43 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 6
<tb> VI <SEP> 46, <SEP> 6 <SEP> 15, <SEP> 4 <SEP> 86,7 <SEP> + <SEP> 10, <SEP> 7 <SEP> 3, <SEP> 88 <SEP> ¯ <SEP> 1, <SEP> 3
<tb> VII <SEP> 53, <SEP> 3 <SEP> + <SEP> 19, <SEP> 0 <SEP> 236,7 <SEP> + <SEP> 10 <SEP> 11,24 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 59 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI6.2 
 Le composé VII administré aux deux dosages ayant fait l'objet de l'essai, a exercé un effet agoniste nettement prononcé   ;   ce composé était plus actif que le composé VI, c'est-à-dire le dérivé tosyle correspondant et il était beaucoup plus actif que le LRF naturel qui a servi de composé de référence pour établir une comparaison.

   Le remplacement de Gly par D-Tle conformément à la présente invention a donné lieu à un remarquable accroissement du degré et de la durée de l'action de LRF   ;   cette caractéristique a été observée distinctement même à un 
 EMI6.3 
 dosage de 10 par animal. Il s'est avéré que le précurseur partiellement protégé VI exerçait une activité considérable   ;   cette découverte confirme l'ef- 

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 fet important exercé par la modification structurale mentionnée en position 6 sur la conformation (disposition stérique) de la molécule du peptide. L'effet favorable de ce remplacement a prédominé nettement l'effet néfaste de la tosylation de Arg en position 8. 



  Le dérivé 8-tosyle correspondant du LRF naturel était notamment presque inactif. 



   Les composés de nonapeptides de formule I peuvent être préparés par des procédés comprenant des réactions dans lesquelles on combine les radicaux respectifs d'acides aminés et de peptides inférieurs avec l'utilisation de méthodes de préparation de la chimie des peptides. Un procédé avantageux à cet effet comprend des réactions dans lesquelles on com- 
 EMI7.1 
 bine un dérivé hexapeptide de formule générale II : 
 EMI7.2 
 Y-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (II) 1 x 
 EMI7.3 
 où X a la même signification que celle indiquée pour la formule I et Y représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur pouvant être éliminé par voie   hydrogénolytique,   de   préférence,   un groupe benzyloxycarbonyle, avec un dérivé réactif du tripeptide de formule III :

     pGlu-His-Trp (III),    les groupes protecteurs étant, au besoin, éliminés. 



   Les réactions de combinaisons peuvent être effectuées en solution, ce qui constitue la technique de préparation classique de la chimie des peptides (E. Schroeder, K. Lübke, The Peptides, volumes I et II, Acad. Press, New York, 1965), ou en phase solide (J. M. Stewart, J. D. Young, Solid phase peptides synthesis, W. H. Freeman   Comp.,   San   Francisco,     1969).   La protection momentanée des groupes amino terminaux a été avantageusement effectuée en introduisant un radical benzyloxycarbonyle   ;   les groupes fonctionnels des 

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 chaînes latérales (à la seule exception de Arg) ne doivent pas être protégés. La protection du groupe guanidino de l'arginin a été effectuée par un groupe tosyle.

   Son élimination peut être assurée par des méthodes classiques, mais on a constaté qu'il était recommandable d'adopter un nouveau procédé dans lequel on utilise une solution d'acide trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoracétique, en présence d'un agent protecteur approprié, par exemple, l'acide thioglycolique (voir les exemples). Ce procédé assure une élimination rapide du groupe tosyle sans détérioration simultanée du reste de la molécule sensible du peptide et, par conséquent, on obtient des rendements nettement supérieurs en produit désiré comparativement aux procédés connus. 



   Après avoir séparé le groupe protecteur, on peut immédiatement purifier le produit obtenu par chromatographie liquide   ;   on obtient ainsi le nonapeptide de la présente invention avec un haut degré de pureté. De préférence, comme phase fixe, on utilise 
 EMI8.1 
 la phase dite inverse, c'est-à-dire du gel de silice (d'une granularité de 10 à 30 modifié en surface par une couche d'hydrocarbures en C8 à C18 chimiquement. On a effectué l'elution avec un mélange de méthanol (20 à 60% en volume suivant le composé peptide en cause) et d'acide trifluoracétique aqueux à   0,     1-0,     5%,   de préférence, à 0,2% comme phase mobile. 



  La présence de l'acide trifluoracétique comme suppresseur d'ionisation dans la phase mobile a été nécessaire pour obtenir une séparation efficace. Cette technique a permis de purifier les substances par une seule opération sans un procédé supplémentaire de dessalage. 



   Jusqu'à présent, la chromatographie liquide   n'a   jamais été adoptée pour la purification de composés peptides semblables. La phase mobile précitée a été 

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 élaborée pour remplacer avantageusement les systèmes mobiles décrits antérieurement dans lesquels on utilisait des solutions tampons ayant des pH différents pour le contrôle de l'ionisation des substances traitées. Lorsqu'on utilise ces phases mobiles tamponnées, les produits séparés doivent être soumis à un dessalage supplémentaire, de sorte que la séparation est très laborieuse et exige beaucoup de temps. 



   Des détails particuliers complémentaires du procédé de préparation des composés nonapeptides biologiquement actifs suivant la présente invention ressortiront à la lecture des exemples ci-après qui illustrent, mais ne limitent nullement le cadre de l'invention et dans lesquels Z est un groupe benzyloxycarbonyle, Tos est un groupe tosyle,   c'est-à-dire   un groupe p-toluène-sulfonyle et DCH désigne la dicyclohexylamine. 



  Z-Pro-NH-Et (I) 
 EMI9.1 
 On dissout 50 g (0, 2 mole) de Z-Pro dans 170 ml de diméthylformamide, on verse 21 ml de pyridine et on refroidit la solution à On ajoute 29 ml (0, 22 mole) de chlorure de pivaloyl et l'on agite le mélange pendant 10 minutes à une température de-30 C. Après refroidissement du mélange réactionnel   à -40oC,   on ajoute une solution de 10 g   (0, 21   mole) d'éthylamine dans 50 ml de diméthylformamide. Après avoir laissé reposer pendant une nuit à OOC, on évapore le diméthylformamide et on dissout le résidu dans de l'acétate   d'éthyle,   puis on laisse cristalliser. 



  Le rendement est de 50 g (91%) du produit sous rubri- 
 EMI9.2 
 que d'un point de fusion de 125-130 C. 



  Z-Arg (Tos)-Pro-NH-Et On libère 4, millimoles) de Z-Pro-NH-Et du groupe protecteur par traitement avec une solution de bromure d'hydrogène dans de l'acide 

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 acétique. Après avoir laissé reposer pendant 20 minutes à la température ambiante, on précipite le bromhydrate avec de l'éther et on le dissout immédiatement dans 30 ml de diméthylformamide. 



   On décompose 10 g   (17,   millimoles) de Z-Arg (Tos)-DCHA avec du HC1 2N et on extrait le Z-Arg (Tos) libéré dans de l'acétate   d'éthyle.   Après évaporation du solvant, on obtient ce produit sous forme d'une mousse. On dissout la matière obtenue 
 EMI10.1 
 dans 60 ml de diméthylformamide, on refroidit la solution à-40 C et on la traite à cette température suc- cessivement avec   1, 4   ml (20 millimoles) de pyridine,   2, 2   ml de N-éthylpipéridine et 2, 1 ml de chlorure de pivaloyle   (18   millimoles).

   Après agitation pendant 20 minutes à-30 C, on verse la solution précitée de Pro-NH-Et HBr et on règle le mélange réactionnel à un pH de   7, 5   avec de la   N-éthylpipéridine,   puis on l'abandonne dans un réfrigérateur pendant une nuit. Ensuite, on évapore les fractions volatiles, on extrait le résidu avec de l'acétate d'éthyle et on lave   11 extrait   successivement avec de l'acide chlorhydrique   1N   une solution   d'hydrogénocarbonate   de sodium à 5% et de   l'eau.   Ensuite, on sépare le solvant par distillation en procédant simultanément à un séchage azéotrope. 



  Le rendement est de 6, 02 g (63%) du produit sous rubrique sous forme d'une mousse. Analyse de la composition en acides aminés : Pro 0, 91, Arg 1, 09. 



    Z-Leu-Arg (Tos)-Pro-NH-Et (III)    
 EMI10.2 
 On libère 6 g (8, millimoles) de Z-Arg (Tos)- Pro-NH-Et du gro upe protecteur avec une solution de bromure d'hydrogène dans de l'acide acétique. On précipite le bromhydrate de la solution avec de   l'éther   et on le dissout immédiatement dans 25 ml de diméthylformamide. On effectue à nouveau la condensation ultérieure par le procédé ci-dessus aux anhydrides 

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 mixtes en utilisant 3,72 g   (8,   7 millimoles) de Z-LeuDCHA, 1, 2 ml (10 millimoles) de chlorure de pi-   valoyle,   0, 83 ml   (8,   7 millimoles) de pyridine et   1,   19 ml   (8,   7 millimoles) de N-éthylpipéridine   ;   on utilise le diméthylformamide comme solvant.

   On isole le produit de la même manière que pour le composé II de l'exemple précédent. Le rendement est de   4, 5 g   (73%) du produit sous rubrique sous forme d'une mousse. Analyse de la composition des acides aminés : Leu 0, 98, Arg   1,   09, Pro 0, 93. 



    Z-D-Tle-Leu-Arg     (Tos)-Pro-NH-Et   (IV)
On traite   2,   6 g   (5,   82 millimoles) de   Z-D-Tle-DCHAavecde l'acide   sulfurique 0,   1N   pour décomposer le sel et on extrait le Z-D-Tle libéré dans de l'acétate d'éthyle. Après évaporation du solvant, on obtient 2 g d'un produit huileux   ;   on dissout cette matière dans 20 ml de chlorure de méthylène. 



   On soumet 4 g   (5,   7 millimoles) du composé III à une décarbobenzoxylation avec du bromure d'hydrogène dans de l'acide acétique. On libère le produit du sel bromhydrate dans une colonne échangeuse d'anions dans le cycle    OH et   dans une solution méthanolique. Le rendement est de   2, 9   g de Leu-Arg   (Tos)-   Pro-NH-Et sous forme d'une mousse. A   l'électrophorèse,   ce produit est homogène à un pH de 2,5 et de   5,   7 (détection avec la ninhydrine).

   On dissout immédiatement l'amide du tripeptide libre obtenu dans 15 ml de chlorure de méthylène et, tout en refroidissant à   - 20 C,   on ajoute la solution de Z-D-Tle préalablement   préparée,   ainsi qu'une solution de 2 g (9, 7 millimoles) de dicyclohexylcarbodiimide dans 10 ml de chlorure de méthylène. On laisse reposer le mélange réactionnel dans un réfrigérateur pendant 4 jours. 



  Ensuite, par filtration, on sépare le précipité de dicyclohexylurée, on évapore le filtrat et on dissout 

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 le résidu dans de l'acétate d'éthyle. On isole le produit sous rubrique sous forme d'une substance neutre après avoir lavé plusieurs fois la solution d'acétate d'éthyle successivement avec de l'acide chlorhydrique IN, une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 5% et de l'eau. Le rendement est   3, 9   g (93%) du peptide sous forme d'une mousse. A la chromatographie sur une couche mince de gel de silice dans un système 9 : 1 de chloroforme et de méthanol, le produit est homogène. Analyse de la composition des 
 EMI12.1 
 acides aminés : D-Tle 0, 92, Leu 0, 98, Arg 1, 01, Pro 0, Z-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg On libère 3, g du composé IV du groupe protecteur par hydrogénolyse sur un catalyseur de Pd. 



  On obtient le tétrapeptide libre avec un rendement de 3 g   (4, 4   millimoles). On effectue la condensation partielle avec   Z-Ser-Tyr-N3 dans   un mélange anhydre de diméthylformamide et de chlorure de méthylène à une température de-30 C en utilisant 1,9 g de Z-Ser-Tyr- 
 EMI12.2 
 N2H3'1, 5 ml d'une solution de chlorure d'hydrogène 3 8N dans du dioxanne et   0,   9 ml de nitrite de n-butyle. 



  On effectue la neutralisation à un pH de 8 avec de la N-éthylpipéridine. Ensuite, on laisse reposer le mélange réactionnel dans un réfrigérateur à   OOC   pendant 3 jours. On évapore les fractions volatiles et on dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle. On lave plusieurs fois la solution successivement avec de l'acide chlorhydrique IN, une solution   d'hydrogène-   carbonate de sodium à 5% et de l'eau, puis on la sèche et on   l'évapore.   Le rendement est de 4, 14 g (76%) de   l'hexapeptide   non cristallin.

   A la chromatographie liquide (colonne de   0,   4 x 25 cm, phase fixe : gel de silice modifié, phase mobile : 70% en volume de méthanol et 30% en volume d'un tampon de phosphate,   pH :   

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 4, 4), le produit est homogène. Ce produit contient 82% de l'hexapeptide sous rubrique   ;   analyse de la composition des acides aminés : Ser   1, 14,   Tyr   1, 05,   D-Tle   0, 98,   Leu   1, 03,   Arg 1, 04, Pro 1, 00. 
 EMI13.1 
 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg (Tos)-Pro-NH-Et (VI) 
On libère l'hexapeptid précédent V   (3,   8 g) du groupe protecteur par hydrogénolyse sur un catalyseur de Pd dans une solution méthanolique.

   On obtient 3, 2 g de la substance contenant 88% de l'hexapeptide libre (détermination par chromatographie liquide, dimensions de la colonne et phase fixe comme indiqué ci-dessus, phase mobile : 50% en volume de méthanol et 50% en volume d'un tampon d'acide trifluor-   acétiquejtriéthylamine,   pH :   3, 9,   détection dans l'ul- 
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 traviolet à 220 nm). 



  On effectue la condensation des azides dans un mélange anhydre de diméthylformamide et de diméthylsulfoxyde (1 : 1) en utilisant 1, g de pGlu-HisTrp-NH- 2 g de l'hexapeptide précédent et 0, 5 ml j de nitrite de n-butyle ; on effectue la réaction à 
6- 200C et la formation des azides pendant 30 minutes à la même température. Ensuite, on règle le mélange réactionnel à un pH de 8-9 et on l'abandonne dans un réfrigérateur pendant 4 jours en vérifiant le pH par intermittence. Après évaporation des solvants, on dissout le résidu dans un petit volume d'éther et on dilue la solution huileuse ainsi obtenue avec 30 ml de méthanol. On précipite le produit par addition d'acétate   d'éthyle,   on le recueille sur un filtre et on le lave avec un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther. Le rendement est de 3, 65 g (87%) du nonapeptide brut.

   Comme l'indique la chromatographie liquide (dimensions de la colonne et phase fixe comme indiqué ci-dessus, phase mobile : 60% en volume de méthanol et 40% en volume d'un tampon de phosphate 

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 d'un pH de   7,   détection dans l'ultraviolet à 210 nm), le produit obtenu contient 70% du nonapeptide sous rubrique et, en outre, une certaine quantité des composés de départ comme l'indiquent les pics chromatographiques correspondants (identification par charge mixte avec des étalons), ainsi que l'analyse de la 
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 composition en acides aminés de ce nonapeptide brut Glu 1, 43, His 1, 41, Trp 1, 10, Ser 1, 09, Tyr 1, 20, D-Tle 0, 89, Leu 1, 00, Arg 0, 88, Pro 0, 90. 



  Pour l'évaluation de l'activité biologique, on purifie la substance par chromatographie de préparation dans les conditions suivantes : dimensions de la colonne :   2,   5 x 30 cm, phase fixe : gel de silice modifié (granularité :   10 um),   phase mobile : 60% en volume de méthanol et 40% en volume d'acide trifluoracétique aqueux à   0,     2%,   détection à 210 nm. Un échantillon de 300 mg du nonapeptide brut (injecté dans 3 ml de la phase mobile) donne 148 mg d'un produit d'une 
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 pureté de 96%.

   Analyse de la composition des acides aminés : Glu 1, 01, His 1, 01, Trp 0, Ser 0, Tyr 1, 01, D-Tle 0, 95, Leu 1, 00, Arg 0, 99, Pro 1, 01. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (VII) 
On dissout un échantillon de 30 mg du composé VI purifié comme indiqué ci-dessus dans 0, 6 ml d'acide trifluoracétique. On ajoute 0,5 ml d'acide thioglycolique et on refroidit le mélange à 0 C, on le traite avec   0,   4 ml d'acide   trifluorométhane-sulfonique   et on le laisse reposer pendant 30 minutes dans un réfrigérateur. Ensuite, on précipite le produit avec de l'éther et on le recueille sur un filtre. On dissout la poudre modérément hygroscopique ainsi obtenue dans de l'acide acétique 1M et on lyophilise la solution. On obtient un rendement de 25 mg du produit brut.

   On purifie cette matière par chromatographie liquide dans une colonne de   2,   5   x 30   cm en utilisant du gel de 

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 silice modifié comme phase fixe et, comme phase mobile, un mélange de 55% en volume de méthanol aqueux à 45% et de 45% en volume d'acide trifluoracétique aqueux à   0,   2%. On dissout un échantillon de 25 mg de la matière purifiée dans   0,   5 ml de la phase mobile et 
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 on l'injecte ; l'enregistrement est relevé à 280 nm. 



  On combine les fractions contenant le produit sous rubrique à l'état pur et on évapore le méthanol sous pression réduite à 30 C. On obtient le produit puri- fié avec un rendement de   10,   5 mg et avec une pureté de 98% par lyophilisation   d'une   solution dans de 
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 l'acide acétique 1M. Analyse de la composition des acides aminés : Glu 1, 03, His 0, 94, Trp 0, 80, Ser 0, 95, Tyr 0, 96, D-Tle 0, 90, Leu 0, 99, Arg 1, 06, Pro 1, 01.

Claims

REVENDICATIONS 1. Analogues du facteur libérant des hormones lutéinisantes et stimulant les follicules, ces analogues exerçant une haute activité gonadotrope, tandis qu'ils répondent à la formule générale EMI16.1 1 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (I) t x dans laquelle X représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur, de préférence, un groupe p-toluènesulfonyl.
2. Procédé de préparation des composés suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend des réactions consistant à combiner les radicaux d'acides aminés ou de peptides inférieurs respectifs en adoptant des méthodes de préparation de la chimie des peptides.
3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend des réactions consistant EMI16.2 à combiner un dérivé d'hexapeptids de formule générale II : EMI16.3 Y-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et t X EMI16.4 dans laquelle X a la même signification que celle définie dans la formule I et Y représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur éliminable par voie hydrogénolytique, de préférence, un groupe benzyloxycarbonyle, avec un dérivé réactif du tripeptide de formule III : pGlu-His-Trp (III) et, au besoin, éliminer les groupes protecteurs.
4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste à éliminer le groupe protecteur p-toluène-sulfonyle en position 8 avec une solution d'acide trifluorométhane-sulfonique dans de <Desc/Clms Page number 17> l'acide trifluoracétique en présence d'un agent protecteur, de préférence, l'acide thioglycolique, puis isoler et purifier le produit.
5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste à purifier les produits réactionnels par chromatographie liquide à phase inverse avec une solution d'acide trifluoracétique dans du méthanol aqueux comme phase mobile.