La présente invention concerne des compositions ayant une affinité pour le virus d'hépatite, de même que des procédés d'élimination/concentration du virus d'hépatite de mélanges contenant une matière biologique.
Le virus d'hépatite type B, également connu sous le nom de "sérum-hépatite", est répandu par une matière biologique telle que le sang, le plasma, le sérum, l'urine et les excréments. C'est ainsi que l'hépatite de type B peut être répandue par des fractions de plasma utilisées à des fins thérapeutiques. Elle peut également
être présente dans les eaux d'égouts et d'autres types de matières résiduaires comprenant une matière biologique en une quantité suffisante pour répandre la maladie.
Le virus d'hépatite de type B peut être détecté par des procédés immunologiques relatifs à la structure de l'antigène superficiel viral, HB Ag, cet antigène étant également connu sous le nom d'antigène d'Australie (antigène Au).
Les procédés de détection de l'antigène Au sur lesquels on s'est basé au cours des travaux effectués dans le cadre de la présente invention, sont les suivants :
Ausria II 125, radio-immunology assay test kit, Abbott Laboratories
North Chicago, E.U.A.
Hepanosticon, reversed hemagglutination assay test kit,
Organon, Oss, Pays-Bas. ion., ID, Berg et al., Vox Sang. volume 22 (1972) page 1.
Immunoelectro-osmoforesis, IEOP, Hansson and Johnsson,
Vox Sang. volume 21 (1971), page 531.
Lorsqu'on l'utilise pour tester des échantillons de sang, le test "Ausria" donne la sensibilité la plus élevée mais, lorsqu'on dose des fractions de matière biologique, la précision augmente dans l'évaluation de l'effet des différentes étapes effectuées lorsqu'on pratique des essais supplémentaires en utilisant un autre système de dosage.
Si, selon la routine pratiquée dans les hôpitaux, on se base uniquement sur des donneurs de sang reconnus ayant une réponse négative à l'hépatite dans le procédé de dosage le plus sensible, on peut réduire considérablement les risques de transmission de l'hépatite. En pratiquant..: de la sorte, on n'utilisa pas une importante
<EMI ID=1.1>
pouvant être adaptées à la technologie industrielle, de même qu'un procédé appropria pour le fractionnement industriel du plasma en vue de l'élimination sélective du virus d'hépatite constituent une meil-
<EMI ID=2.1>
sang, le plasma et les fractions de plasma.
Bien que la sensibilité de dosage soit nettement améliorée par la technique de dosage radio-immunologique, l'hépatite risque néanmoins d'être toujours présente dans le sang et les fractions de plasma à la suite d'un résultat de dosage négatif. En concentrant le virus d'hépatite conformément à la présente invention, on peut tester des échantillons fortement concentrés, améliorant ainsi considérablement la précision du système de dosage d'hépatite adopté.
<EMI ID=3.1>
Chemical Society", New York, E.U.A., S.E. Charm et B.L. Wong ont présenté un procédé en vue d'éliminer le virus d'hépatite du plasma sanguin en utilisant des anticorps de chèvre contre le virus d'hépatite. Cette étude a été publiée dans "Biotech. Bioeng.", volume 16
(1974), page 593. Une utilisation de ce procédé à l'échelle industrielle est strictement réduite par la réserve limitée d'anticorps. En outre, il faut tenir compte du risque de fuites de matière immunogène à partir du support d'anticorps dans la mesure où le procédé est adapté au fractionnement du plasma d'origine humaine et si les fractions de plasma obtenues doivent être utilisées dans les hôpitaux.
Les nouvelles compositions et le nouveau procédé de la présente invention ne présentent pas les inconvénients de la technique connue antérieurement. Les substances sont aisément disponibles pour une fabrication à l'échelle industrielle en adoptant des procédés de synthèse connus en soi ; ces substances ne contiennent aucune matière immunogène ; leur affinité pour le virus d'hépatite est élevée et spécifique, tandis que la réaction entre les substances et le virus d'hépatite est rapide et irréversible si bien qu'il n'y a aucun risque de fuite lors du traitement des nouvelles compositions après que le virus d'hépatite y ait été fixé.
Les compositions suivant la présente invention comprennent une matière formant gangue et perméable, à l'eau, par exemple, un gel insoluble dans l'eau sous forme d'un carbohydrate à poids moléculaire élevé ou d'une matière plastique comportant (en incorporant éventuellement un groupe d'écartement dans la gangue) un coordinat hydrophobe constitué d'une chaîne de plus de 7 atomes de carbone ou d'un système à noyau condensé.
On obtient les substances actives des compositions vant l'invention en couplant le coordinat correspondant une matière formant un gel et une gangue*
Du point de vue rendement, toutes les liaisons covalentes étudiées
<EMI ID=4.1>
ae sont avérées équivalentes et strictement subordonnées à la struc-
<EMI ID=5.1>
De même, le type de matière formant gangue et perméable à l'eau, par exemple., une matière plastique de polyamide telle que
<EMI ID=6.1>
De même, la nature hydrophobe du coordinat est nettemenl décisive pour l'affinité vis-à-vis du virus d'hépatite, comme le démontre le tableau ci-après résumant les études effectuées sur l'élimination du virus d'hépatite du plasma humain contaminé par l'hépatite*
Tableau
Fixation du virus d'hépatite à partir de plasma humain fortement positif à l'antigène Au.
Dans ce tableau, on utilise la même matière pour la gangue et l'on ne fait varier que le coordinat.
L'affinité du virus d'hépatite pour les compositions
a été déterminée par les dosages immunologiquea indiqués ci-dessus . Une fixation forte et complète du virus d'hépatite sur une composi-
<EMI ID=7.1>
d'hépatite ne peut être décelé dans l'échantillon de plasma après
<EMI ID=8.1>
<EMI ID=9.1>
que le signe "++" indique des quantités inchangées ou légèrement réduites de l'antigène Au dans l'échantillon de plasma après le traitement.
<EMI ID=10.1>
<EMI ID=11.1>
Dans la série ci-après, la gangue est constituée de
<EMI ID=12.1>
(exemple 10)
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemple
Elimination de l'antigène Au du plasma par absorption sur un élément
<EMI ID=13.1>
On effectue l'activation de la "Sepharose" en lavant
<EMI ID=14.1>
("Pharmacia Fine Chemicals", Uppsala, Suède) avec de l'eau. Ensuite, on élimine l'excès de liquide par essorage avant de transférer le gel dans une solution de 4 g de bromure de cyanogène dans 100 ml d'eau distillée. Après mise en équilibre pendant 15 minutes, tout en agi- tant et en refroidissant à la glace, on active la suspension de gel
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
Pour le couplage de l'éthylène-diamine, on lave le gel activé sur un filtre en verre avec une solution froide de carbonate- bicarbonate de sodium 0,5 M d'un pH de 9,8 avant de le transférer dans une solution de 10 g d'éthylène-diamine dans 100 ml d'eau dis-
<EMI ID=17.1>
concentré. Tout en agitant, on abandonne le mélange réactiormel pendant 20 heures à la température ambiante. On lave convenablement le gel formé.
On met 25 ml de la suspension aqueuse du gel d'écarte- ment formé en suspension dans 20 ml de dioxanne. Tout en agitant à
la température ambiante, on ajoute goutte à goutte une solution fraîche de 6 g d'anhydride octyl-succinique dans 60 ml de dioxanne.
<EMI ID=18.1>
d'une solution diluée d'hydroxyde de sodium. On lave convenablement
<EMI ID=19.1> de l'eau, du chlorure de sodium 1 M et un tampon constitué de TRIS 0,05 M, de citrate de sodium 0,02 M et de chlorure de sodium 0,10 M à un pH de 7,5. Ci-après, ce tampon est appelé "tampon d'essai".
On détermine le rendement de couplage en se. basant sur l'acide octylsuccinique par résonance magnétique protonique (HA 100) et on cons-
<EMI ID=20.1>
Le 1,4-diaminobutane et le 1,6-diaminohexane peuvent être substitués à l'éthylène-diamine avec des résultats équivalents.
<EMI ID=21.1>
Comme matière de départ, on utilise une masse de plasma positif à l'antigène Au titrant 1:64 suivant IEOP et 1:32 suivant ID. Les titres sont indiqués par.rapport à un antigène standard.
Parmi une série de six éprouvettes, dans chaque éprouvette, on ajoute 2 ml de plasma positif à l'antigène Au et 2 ml d'une suspension de 3 parties d'un adsorbant convenablement sédimenté et équilibré avec un tampon d'essai, ainsi que 1 partie du même tampon. On déplace les échantillons pendant 1, 2, 5, 10, 20 et 30 minutes respectivement, tandis que l'on sépare les gels par centrifugation. On dose les produits surnageants en ce qui concerne l'antigène Au et on constate qu'ils sont négatifs suivant ID, IEOP et Hepanosticon.
Exemple 2
Elimination de l'antigène Au du plasma par adsorption sur un élément
<EMI ID=22.1>
Pour la réticulation de la "Sepharose", on mélange 100
<EMI ID=23.1>
sodium. On agite vigoureusement le mélange à 60[deg.]C pendant une heure. On lave convenablement le gel avec de l'eau chaude et on le mélange avec une solution de 0,25 g de, borohydrure de sodium dissous dans
<EMI ID=24.1> à 120[deg.]C pendant 1 heure. Ensuite, on lave le gel avec une solution alcaline de borohydrure de sodium. On ajoute lentement de l'acide acétique concentré jusqu'à ce que le pH du mélange atteigne environ
4. Enfin, on lave le gel avec un important volume d'eau.
<EMI ID=25.1>
suivant le procédé de l'exemple 1.
<EMI ID=26.1>
filtre en verre et on le lave avec un mélange 2:1 de dioxanne et d'eau avant de l'essorer, puis on. le transfère dans une solution
<EMI ID=27.1>
de dioxanne et d'eau. On agite le mélange à la température ambiante pendant une heure avant de le transférer dans un filtre en verre, puis on le lave convenablement avec du dioxanne, un mélange 2:1 de dioxanne et d'eau, du chlorure de sodium 1 M, de l'eau et un tampon d'essai.
On détermine le rendement de couplage en fonction de l'acide gras utilisé par résonance magnétique protonique (HA 100) et
<EMI ID=28.1>
<EMI ID=29.1>
Comme matière de départ, on utilise un plasma positif
à l'antigène Au titrant 1:128 suivant ID et IEOP. On garnit une colonne (d = 1,6 h = 1,0 cm) avec le dérivé de gel équilibré dans le
<EMI ID=30.1>
pour le mettre en contact avec le gel (débit : 5 ml/heure). Au
<EMI ID=31.1>
ait plus dilution de matière protéique (contrôle effectué par balayage à l'ultraviolet). L'éluat recueilli est négatif suivant ID, IEOP et Hepanosticon. Par dialyse sous pression, on concentre dix fois l'éluat qui reste toujours négatif dans les essais d'hépatite.
Exemple 3
Elimination de 1'antigène Au du plasma par adsorption sur un élément conjugué de Sepharose/hydrazide caprylique.
<EMI ID=32.1>
On transforme du caprylate d'éthyle en hydrazide correspondant par hydrazinolyse. On mélange 10 ml de l'ester éthylique
<EMI ID=33.1>
22 ml d'éthanol jusqu'à ce que le mélange réactionnel devienne clair, après quoi on laisse reposer la solution à la température ambiante pendant 15 heures. Par filtration, on élimine lthydrazide qui cristallise et on le lave avec de l'eau glacée et du méthanol aqueux
(1:1) à la température ambiante.
On active la "Sepharose 4B" conformément à l'exemple 1.
On lave le gel avec une solution de l'agent de couplage et on le filtre sous vide. On effectue le couplage en transférant
le gel activé dans 100 ml d'une solution saturée d'hydrazide caprylique dissous dans un mélange 1:1 de diméthylformamide et de bicarbonate de sodium 0,2 M. Le pH reste inchangé au cours de la réaction de couplage qui a lieu tout en agitant à la température ambiante pendant
<EMI ID=34.1>
formamide, un mélange 1:1 de diméthylformamide et d'eau, du chlorure de sodium 1 M, de l'eau et un tampon d'essai.
On détermine le rendement de couplage basé sur l'hydra- zide par résonance magnétique protonique (HA 100) et on constate qu'il est de 2,3%.
y Essai d'antigène Au.
Comme matière de départ, on utilise un plasma. positif
<EMI ID=35.1>
suspension constituée de 3 parties d'adsorbant convenablement sédi-
<EMI ID=36.1>
même tampon, on ajoute 2 ml de plasma positif à l'antigène Au. On agite légèrement le mélange pendant 30 minutes et on sépare le gel <EMI ID=37.1>
par centrifugation. Le produit surnageant est négatif à l'antigène Au suivant ID, IEOP et Hepanosticon.
Exemple 4
Elimination de l'antigène Au d'une solution d'albumine par adsorption
<EMI ID=38.1>
Comme matière de départ, on utilise une solution d'albumine positive à l'antigène Au, titrant 1:64 suivant ID et IEOP et obtenue par fractionnement de plasma positif à l'antigène Au. On effectue l'adsorption en discontinu conformément à l'exemple 3. On soumet le produit surnageant à un essai d'antigène Au et on constate qu'il est négatif suivant ID, IEOP et Hepanosticon.
Exemple 5
Elimination de l'antigène Au d'un concentrât de facteur de coagulation
<EMI ID=39.1>
On prépare l'élément conjugué en gel conformément à l'exemple 1.
<EMI ID=40.1>
On utilise un plasma positif à l'antigène Au pour frac-
<EMI ID=41.1>
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
en verre comportant un lit de 5 ml du dérivé de gel équilibré dans
le tampon d'essai., on ajoute 10 ml de la solution d'essai de protéine et on lave le gel avec 3 x 5 ml du tampon d'essai. On dose les éluats <EMI ID=44.1>
tate qu'ils sont négatifs.
Exemple 6
Elimination de l'antigène Au du plasma par adsorption sur un élément
<EMI ID=45.1>
On active la "Sepharose" conformément à l'exemple 1.
Pour la réaction de couplage, à une solution de 22 g
<EMI ID=46.1>
"Sepharose" activée au bromure, de cyanogène, équilibrée avec de l'éthanol à 95% et essorée. On laisse reposer le mélange à la tempé-
<EMI ID=47.1>
blement le gel avec de l'éthanol chaud à 95$, de l'éthanol aqueux
<EMI ID=48.1>
On détermine le rendement de couplage par résonance magnétique
<EMI ID=49.1>
Essai d'antigène Au.
Comme matière de départe on utilise un plasma positif
<EMI ID=50.1>
verre comportant un lit de 10 ml du dérivé de gel équilibré dans le
<EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
<EMI ID=53.1>
Exemple 7
Elimination de l'antigène Au du plasma par adsorption sur un élément
<EMI ID=54.1>
Préparation du_dérivé de_gel.
On transforme le 2-dodécane en aminé correspondante par
<EMI ID=55.1>
procède à une hydrogénation catalytique en éliminant l'eau* La
<EMI ID=56.1>
Pour le couplage., à une solution de 10 g de 2-amino-
<EMI ID=57.1>
activé au bromure de cyanogène, lavé avec de l'éthamol à 95% et
essoré.
Tout en agitant, on abandonne le mélange à la tempéra- ture ambiante pendant 48 heures puis on lave convenablement le gel
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
On détermine le rendement de couplage par résonance magnétique protonique (HA 100) et on constate qu'il est de 1%. Essai d'antigène Au.
Comme matière de départ, on utilise un plasma positif à
<EMI ID=60.1>
sai conformément à l'exemple 3 et on constate que le produit surnageant est négatif lorsqu'on le soumet à un dosage suivant ID,' IEOP et Hepanosticon.
Exemple 8
Elimination de l'antigène Au du plasma par adsorption sur un élément
<EMI ID=61.1>
diamine, puis on effectue la mise en équilibre avec du dioxanne en filtrant sous vide. Tout en agitant, . on abandonne la suspension de gel pendant 15 heures à la température ambiante, on la lave avec du
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
Comme matière de départ, on utilise un plasma positif à l'antigène Au et titrant 1:128 suivant ID et IEOP. On effectue l'es-
sai conformément à l'exemple 3. On constate que le produit surnageant
est négatif à l'antigène Au suivant ID, IEOP et Hepanosticon.
Exemple 9
<EMI ID=68.1>
de plasma fortement positif à l'antigène Au, ce mélange étant forte-
ment positif à l'antigène Au suivant ID et Ausria. On fait passer ce mélange à travers une colonne de 4 cm garnie de 100 ml d'élément conjugué en gel équilibré avec un tampon d'essai. On recueille les
fractions et on les soumet: à un essai. On constate que l'éluat con- tenant le plasminogène est négatif lors d'un dosage effectué suivant ID at Ausria.
Exemple 10
Elimination de l'antigène Au du plasma par adsorption sur un élément
<EMI ID=69.1>
<EMI ID=70.1>
Pour le procédé d'activation, on mélange 20 ml de la suspension de
<EMI ID=71.1>
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1>
dioxanne et d'eau, de l'eau et le tampon d'essai.
<EMI ID=74.1>
<EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1> <EMI ID=77.1>
Comme matière de départ, on utilise un plasma positif
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1>
produit surnageant est négatif à l'antigène Au suivant ID, IEOP et
<EMI ID=80.1>
<EMI ID=81.1>
le gel avec un tampon de carbonate, de l'eau et enfin, avec du dioxanne. A une solution de 1,2 g d'acide octyl-succinique dans 40 ml
<EMI ID=82.1>
diimide dans 10 ml de dioxanne et 25 ml de Sepharose/cystéamine,, Après avoir agité pendant 2 heures à la température ambiante, on
<EMI ID=83.1>
on lave le gel avec du dioxanne. On répète le procédé réactionnel, puis on lave convenablement avec du dioxanne, un mélange de dioxanne et d'eau, de l'eau et un carbonate 0,1 M à un pH de 8,5. On bloque les groupes thiols restants en traitant le gel avec 60 mg d'iodoacétamide pendant 45 minutes. Enfin, on lave le gel avec un tampon d'essai.
<EMI ID=84.1>
Comme matière de départ, on utilise un plasma positif à
<EMI ID=85.1>
en discontinu conformément à l'exemple 3. On soumet le produit surnageant à un essai concernant l'antigène Au et on constate qu'il est négatif suivant ID, IEOP et Hepanosticon.
Exemple 12
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
On obtient l'élément conjugué de Sepharose/hexaméthylène- diamine conformément à l'exemple 1.
On transfère 25 ml du gel d'écartement obtenu sur un filtre en verre et on le lave avec un mélange 3:2 de dioxanne et
d'eau avant de l'essorer, puis on le transfère dans une solution fraîche de 1,1 g d'acide naphtyl-1-acétique dans 30 ml d'un mélange 3:2 de dioxanne et d'eau. A la suspension de gel, tout en agitant,
on ajoute 2,65 g d'un carbodiimide hydrosoluble, à savoir le p-toluène-
<EMI ID=88.1>
imide, puis on règle le pH à 4,8 avec de l'acide chlorhydrique dilué. Après une heure à la température ambiante, on ajoute une deuxième
<EMI ID=89.1>
donne le mélange pendant une heure supplémentaire avant de le trans- férer sur un filtre en verre, puis on le lave convenablement avec du dioxanne, un mélange 3:2 de dioxanne et d'eau, du chlorure de sodium 1 M, de l'eau et un tampon d'essai.
On détermine le rendement de couplage en fonction de
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
Essai d'antigène Au.
Comme matière de départ, on utilise un plasma positif à l'antigène Au et titrant 1:32 suivant ID et 1:64 suivant IEOP. On effectue l'adsorption en discontinu conformément à l'exemple 3. On soumet le produit surnageant à un essai concernant l'antigène Au et on constate qu'il est négatif suivant ID, IEOP et Hepanosticon.
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
On obtient l'élément conjugué de Sepharose/hexaméthylène- diamine conformément à l'exemple 1.
<EMI ID=95.1>
verre et on le lave avec du dioxanne, de la triéthylamine à 10% dans
du dioxanne et à nouveau avec du. dioxanne, avant de l'essorer et de
le transférer dans une solution fraîche de 0,5 g d'hydrogénosuccinate de cholestérol dans 25 ml de dioxanne. On fait démarrer la réaction
<EMI ID=96.1>
de dioxanne. On effectue le couplage tout en agitant à la température ambiante. Après deux heures, on ajoute une portion supplémentaire
de carbodiimide et, deux heures plus tard, on lave convenablement le gel couplé avec du dioxanne, un mélange de dioxanne et d'eau, de l'eau et enfin, avec un tampon d'essai.
<EMI ID=97.1>
Comme matière de départ, on utilise un plasma positif
à l'antigène Au titrant 1:64 suivant ID et 1:128 suivant IEOP. On effectue l'adsorption en discontinu suivant l'exemple 3. On soumet le produit surnageant à un essai concernant l'antigène Au et on cons- tate qu'il est négatif suivant ID, IEOP et Hepanosticon.
Exemple 14
Elimination de l'antigène Au du plasma par adsorption sur un élément
<EMI ID=98.1>
On obtient l'élément conjugué de Sepharose/hexaméthylènediamine conformément à l'exemple 1..
On effectue le couplage de l'acide cholique sur le gel d'écartement obtenu conformément à l'exemple 13, avec cette exception
<EMI ID=99.1>
détermine le rendement de couplage en fonction de l'acide cholique utilisé par résonance magnétique protonique (HA 100) et on constate
<EMI ID=100.1>
<EMI ID=101.1>
Comme matière de départ, on utilise un plasma positif à l'antigène Au titrant 1:32 suivant ID. On effectue l'adsorption en discontinu conformément à l'exemple 3. On soumet le produit surnageant à un essai concernant l'antigène Au et on constate qu'il est négatif suivant ID, IEOP et Hepanosticon.
REVENDICATIONS
<EMI ID=102.1>
d'hépatite, caractérisées en ce qu'elles comprennent une matière
<EMI ID=103.1>
ment et à laquelle est couplé un coordinat hydrophobe.