JPH03501085A

JPH03501085A - 化学的プロセス

Info

Publication number: JPH03501085A
Application number: JP1501523A
Authority: JP
Inventors: フェルドマン，ピーター　アントニー
Original assignee: セントラル、ブラッド、ラボラトリーズ、オーソリティー
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1991-03-14
Anticipated expiration: 2009-01-05
Also published as: EP0391974A1; GB8729822D0; NO178882B; DK153490D0; DE3881895D1; WO1989005650A2; JPH0664B2; NO902757D0; EP0391974B1; DE3881895T2; DK153490A; AU627446B2; NO902757L; AU3032989A; ATE90567T1; DK175514B1; WO1989005650A3; NO178882C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】化学的プロセス本発明はビタミンに依存性血液凝固因子を含有した分画中におけるかかる因子の精製又は豊富化のために改良された方法に関する。

ヒト又は動物起源の血液から得られる血漿はいくつかの有益な生理学的活性物質、特に様々な血液凝固因子を含有しており、それらの一部はかかる物質の１以上を欠く個体の治療用医薬として用いられる。血液凝固因子、即ちいわゆる血液凝固カスケードの構成因子は下記様式で関連した不活性及び活性タンパク質分解酵素及び修正タンパク質の群からなっている：Ｘｌ＋因子→Ｘｌｌ　ａ因子 ↓ ■因子−Ｘｌａ因子 ↓ ■因子＝ＩＸａ因子Ｘ因子−−−−ｓ−Ｘ　Ｂ因子−−−−Ｘ因子↓−■因子（プロトロンビン）■因子→Ｉｌａ因子（トロンビン）↓ フィブリノーゲンー−→フィブリン付随文字“ａ“は酵素が活性形であることを意味する。

血液凝固因子の一般的カテゴリー内に属するとみなされる更に重要な血漿タンパク質としてはプロティンＣ及びプロティンＳがある。プロティンＣはタンパク質分解酵素活性プロティンＣ（ＡＰＣ，ＰＣａ）の不活性チモーゲンである。上記凝固因子とは異なり、ＡＰＣはこのように不活性である■因子及び■因子のタンパク質分解を介して機能する抗凝固効果を有している。プロティンＣの活性化は双方とも凝固プロセスで機能するトロンビン及び内皮結合タンパク質のトロンボモジュリンを要するフィードバックプロセスによるらしい。その際にＡＰＣの活性は補因子として作用するらしいプロティンＳの存在によって高められる。

上記因子のいくつか、即ち■、■、■及びＸ因子更にプロティンＣ及びプロティンＳはビタミンに依存性であることが示された。活性及び不活柱形双方のこれら因子（活性化■因子を除く）は末端γ−カルボキシグルタミン酸残基を有するが、これはビタミンにで媒介される酵素プロセスによって導入される。加えて、プロティンＣ１プロテインＳ１Ｘ及びＸ因子は、但しプロトロンビン（■因子）を除くが、修正されたアスパラギン酸残基、即ちβ−ヒドロキシアスパラギン酸残基を有することが判明した。

このようにビタミンに依存性血液凝固因子とは、密接に類似した物理化学的性質を有する関連酸性タンパク質群を表す。これら物質の酸性性質はそれらを一部として単離することを既に可能としたが、但しそれらの構造的及び化学的類似性は陰イオン交換クロマトグラフィーのような常法で個々のタンパク質を分離することを困難にした。

プロトロンビン複合体の一部ではない■因子は別として、最も頻繁に投与される血液凝固因子は■因子である。

伝統的には、■因子はプロトロンビン複合体のすべての因子■、■、■及びＸの濃縮物として提供されるが、但し５■因子は時々■、■及びＸとは別に提供される。

このような■因子濃縮物の注入後、静脈血栓症及び散在性向管内凝固（Ｄ　Ｉ　Ｃ）に関していくつが報告されたケースがあった。これらの望ましくない応答は、■因子と共に注入された高レベルの不必要な凝固因子及び／又は濃縮物中の望ましくないトロンボゲン成分によって助長される高凝固状態のせいであろう。■ 因子の強度なかつ長期の投与で■因子のＬ〆ベベル正常よりも非常に高くしてしまい、■因子は等量で注入されて血漿中で長い半減時間を有する。インビトロ研究又は動物モデルに基づく一部の仮説でも、諸因子の組合せが■因子単独よりも高いトロンボゲン性であることを示唆している。当然ながら■因子の現投与量レベルは、■因子の過剰レベルを避ける必要性から一部制限されている。

更に■因子濃縮物による治療後、一部の血友病Ａ患者では非ウィルス性免疫抑制の徴候を示す。■因子濃縮物による治療後の血友病Ｂ患者における同様の免疫抑制からみても、双方のケースの応答が濃縮物中における望ましくない汚染物質のせいらしいことを示唆している。

凝固因子濃縮物が製造されるドナー血漿プールは非Ａ非Ｂ型肝炎の原因物質（おそらくウィルス）を含有しており、ウィルス（例えば、Ｂ型肝炎及びＨＩＶ）汚染リスクを有すると仮定しなければならない。製品を安全に改善するためには、濃縮物は殺ウイルス処理をうけねばならないが、これは汚染タンパク質の存在で複雑化されるであろう。例えば、この殺ウイルス処理は不必要なタンパク質による干渉が最少に抑制される高度に精製された濃縮物で考えることが容易であろう。

一般に、他の因子又は更には望ましくない生理学的効果を示すいかなる汚染物質のレベルも同時に高めることなくヒト患者の特定凝固因子に代わる又はそれを補充するように考えられた血液凝固因子を投与することが原則として好ましい。

このため上記問題の一部を緩和又は更に解決するためビタミンに依存性凝固因子を少なくとも部分的に分離する改良法に関して必要性がある。ビタミンに依存性血液凝固因子は金属キレートクロマトグラフィーで少なくとも部分的に互いに分離されうろことがここに発見されたのである。

本発明によれば、ビタミンに依存性血液凝固因子を少なくとも１種のかかる因子を含有した混合物から少なくとも部分的に分離する方法が提供され、その方法は上記混合物が不活性支持体に固定化された多価金属のキレートに吸着されしかる後上記因子の１種に関して富む１以上の分画を得るため溶出されることで特徴付けられる。

一般に、上記混合物は少なくとの２種のビタミンに依存性血液凝固因子を含有している。このため本発明では紹換えＤＮＡ技術を用いて微生物培養物から得られる十分に機能化された凝固因子の精製及び豊富化を伴うが、凝固因子源は通常血漿、特にヒト血漿である。

本発明に従い処理される因子の混合物は、最も普通には一部の血漿因子が既に除去された血漿う〕画濃縮物である。

血漿から混合因子を得る場合、望ましい成分を含有した典型的初期分画としては凍結沈澱上澄（上澄は■因子濃縮物の凍結沈澱後に残留する）、フラクションＩ上澄及び様々なアフィニティ試薬、例えばヘパリンセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で血漿の吸着後に得られる分画がある。

一般に、因子はプロトロンビン複合体濃縮物イ得るためジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース。

ＤＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）又はＤＥＡＥセファロースのような陰イオン交換樹脂への吸着によって更に濃縮されるであろう。

■因子製造用に最適の条件下でＤＥＡＥセルロースは■因子と結合しないが、高能力イオン交換剤（例えば、ＤＥＡＥセファデックス及びＤＥＡＥセファロース〕は容認された工業処理条件下で更に効率的に■因子と結合することに注目すべきである。このためＤＥＡＥセファロースからのプロトロンビン複合体濃縮物は ■因子を含有していない。挙動上のこの差異に基づき主に■因子を含有した濃縮物を得ることができるが、これは本発明による精製及び豊富化からでも効果的である。陰イオン交換樹脂濃縮物は本発明に従い有利に処理されるが、他の組合せの因子であっても望ましい因子の濃度を高めるため有利に処理される。特に、本発明に従い得られ２種のろの因子を含有【７た豊富化分画は更に豊富化させるため第二の処理に付してもよい・現在の精製系はいくつかの本質的欠点を有している。

ヘパリン−セファ０−スは工業規模で用いられた場合に分離及び凝固因子活性に乏しい。硫酸デキストランは非常に短いＮＡＰＴＴ　（後記参照）で■因子を生成して臨床的使用で血栓症状を発現することがあり、しかも硫酸デキストランは細胞毒性があって、このようなアフィニティマトリックスからの漏出で生成物をひどく汚染することがある。本処理法はこれらすべての面に関してかかる精製系以上の利点を有する。

何らかの効果は初期混合物を固定化された金属キレートでバッチ様式により処理ししかる後最も容品に溶出する因子を除去するため単に洗浄することで得られるが、最も好ましい操作方式はカラムクロマ）・グラフィーである。このため因子の混合物はカラムの最上部に適用され、分離された及び部分的に分離された因子を含有した分画を得るため溶出液が通される。一方、初期混合物はカラムに担持させる前固定化された金属キレートにバッチ様式で適用してもよい。

本発明のプロセスでの使用のためのキレート化多価金属は通常二価状態であり、Ｃｕ２＋が特に好ましい。

固定化されたキレート化剤は多価金属をキレート化しうる基を有した慣用的主鎖又は骨格支持体（例えば、セルロース、ポリスチレン、アクリルアミド、シリカ、フッ化炭索類、架橋デキストラン又は架橋アガロースに基づく支持体）である。このような基は周知であって、マーチル（Ｍａｒｔｅｌ　＋）及びカルビン（Ｃａｌｖｉｎ）、金属キレート化合物の化学、プレンティス・ホール社（Ｐｒｃｎｔｉｃｃ　Ｈａｌｌ。

Ｉｎｃ、）　、ニューヨーク、１９５２年のようなテキストブックでみられる。

イミノニ酢酸基−Ｎ　（ＣＨＣ００Ｈ）　２が特に好まましいキレート化基である。

キレート化基は通常キレート化基及び支持体間で有利には８〜１６の間の原子、例えば約１２原子を有する場合により置換された炭化水素又は炭水化物鎖のような直鎖“スペーサー“基で支持体の主鎖又は骨格から隔たっている。このようなスペーサー基は望ましい鎖長の二価試薬との反応で適切な基質中に導入される。

好ましい金属結合マトリックスは下記鎖：でセファロースに結合されたイミノニ酢酸基を有するファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ）市販ビーズ化６％アガロース製品のキレート化セファロースである。

キレート化支持体に対するタンパク質の結合性は下記の少なくとも４つの考慮事項＝　（１）イオン強度（高イオン強度は見掛上非特異的結合を最小に抑制する）；（２）担持されるサンプル及び平衡化金属キレートゲルの双方中における緩衝イオンの存在：　（３）マトリックスの担持能（これは弱く結合するタンパク質を犠牲にして更に強く結合するタンパク質で十分に飽和されうる有限量である。このため具体的タンパク質に関するマトリックス能はそれが担持及び吸着接触時間中に適用されるタンパク質混合物の組成及び濃度に依存している）；（４）結合性及び溶出の双方、に依存しているが、ｐＨが認識されたエフェクターである。

比較的高いイオン強度下においてプロトロンビン（■因子）及びトロンビンのキレートに対する結合性は低下するが、一方■、Ｘ因子及びプロティンＣの場合は増加することが発見された。一般に、トロンビン形成の可能性を回避する上で他の血液凝固因子の濃縮物中におけるプロトロンビンレベルを低下させることが望ましいため、この発見は特に有用である。このため例えば０３４〜１、ＯＭ、好ましくは０．４〜０．６Ｍ、最も好ましくは約０．５Ｍの塩化ナトリウム及び／又は等イオン強度の溶液を与える１窪以上の他の電解質を含存した比較的高イオン強度の水溶液に金属キレートを加えることが好ましい。

異なるビタミンに依存性凝固因子はキレート化ゲルとの結合性に関して異なるｐＨ適性を有しており、したがって添加される緩衝液のｐＨの選定は１種以上のビタミンに依存性凝固因子のキレート化ゲルに対してもう１つのかかる因子よりも優先的な結合を促進させるための手段を更に提供することになる。このため例えばＣυ２＋プライム化キレート化セファロースの場合、■、■、Ｘ因子の至適結合は各々ｐＨ６，０〜７．Ｑ、ｐＨ７，０以上及びｐ）！６．５〜７．５で起きる。したがって例えばプロトロンビン以上のＸ因子のかかるゲルに対する示差的な結合性を高めるためには、適用ｐａはｐＨ７，０以上であることが望ましい。

更に１種以上の他のビタミンに依存性凝固因子からプロトロンビンを除去することが望まれる場合、他の血液凝固因子、例えばＸ因子に適したプロトロンビンの低結合性は吸着接触時間及び担持量チャレンジの適切な選定によって促進される。このためプロトロンビン複合体濃縮物から出発する場合Ｃｕ２＋プライム化キレート化セフア０−スによる■因子からＸ因子の分離を最適化するためには、吸着接触時間は有利には２０分間以上、更に好ましくは約４０分間以上であり、約２５０〜４５０Ｆ、ＥＸ；Ａｇ単位／ｍｆゲルのＸ因子担持が達せられるような担持量チャレンジが望ましい。

カラムクロマトグラフィーが好ましい。因子の初期混合物はカラムの最上部に適用されることが好ましいが、固定化されたキレートにバッチ様式で初期混合物を担持させてもよい。洗浄後、高イオン強度の場合にはほとんど、残留因子はバッチ溶出か又はクロマトグラフィー溶出用カラムにゲルを移すかのいずれかで分離することができる。

担持は、存在するかもしれないプロトロンビン及びトロンビンを除去するため同 −又は同様のイオン強度及びｐｎの水溶液で直ちに洗浄することが望ましい。有利には、酸性ｐＨ洗浄ステップがキレート化ゲルからインター−α−トリプシンインヒビターを除去するため更に行われる。このタンパク質は従来技術で製造されたＸ因子濃縮物の望ましくない主汚染物質として認識されており、一部の場合には全タンパク質の３０％もの多くを占めている。しかしながら、インター−α −トリプシンインヒビターはゲルからＸ因子の明白な損失なしにＤＨ約４．５〜５．５でＣｕ２＋プライム化キレート化セフアロ−・スから溶出させることができることが見出された。最終製品中の電解質レベルを減少させるためには、例えば１００〜２００ｍＭＮａＣ１に相当する低イオン強度で少洗浄操作ではタンパク質が固定された状態における追加洗浄ステップでウィルスを若干除去する。更に固定化因子はこの段階で界面活性剤のような殺ウイルス剤により処理され、しかる後殺ウイルス剤は溶出ステップ前に更に洗浄することで除去される。金属キレート物質は本発明による初期吸着前に殺ウイルス剤として用いられる界面活性剤及び／又は溶媒の存在下で目的のタンパク質因子と容品に結合し、し、かも殺ウイルス剤が洗浄で除去される場合又は更に殺ウイルス剤の界面活性剤洗浄が因子の溶出前に適用される場合にこれらの因子を残留させることに注目すべきである。これはかかるタンパク質を吸着させるために用いられた多くの従来のアフィニティ力ラムと対照をなし、その場合には界面活性剤がタンパク質を溶出させてしまう。

ｎ因子の除去後にカラムに残留する凝固因子又は更にｎ因子の実質的不存在下でカラムに適用されるこのような因子は、得られる豊富分画から塩を除去する必要性を緩和又は回避するために、望ましくは添加緩衝液よりも有意に低いイオン強度下においてｐＨの変化及び／又はイミダゾール及びアミノ酸から選択される置換剤の使用により溶出される。このような溶出に適した好ましいイオン強度は１００〜２００１の範囲内である。

望ましい血液凝固因子の溶出がｐＨ勾配に依存している場合、これは増加ｐＨ勾配でも又は減少ｐ）１勾配でろっでもよいが、いずれの場合でもインター−α− トリプシンインヒビターはＸ因子に富む分画の回収前にキレート化剤から除去されることが望ましい。このため溶出に増加ｐＨ勾配適用の場合、出発ｐＨはインター−α−トリプシンインヒビターを除去させるためｐＨ約４．５〜５．５の低さであってもよいが、但し通常望ましい血液凝固因子の溶出のためｐＨの実質的な段階的増加をこれに続けることは明らかであろう。特に、例えばＸ因子及びＸ因子に富む分画は例えば１００ｍＭＮａＣ１の比較的低イオン強度下、非アミノ酸又はイミダゾール含有緩衝系の存在下でｐＨ約７．０からｐＨ約８８０までｐＨを一スから溶出させることが望ましいことが発見された。

例えばプロトロンビン複合体濃縮物の同タイプのゲル血液凝固因子から溶出させるため減少ｐＨ勾配を適用Ｔる場合、ｎ因子を除去するためｐＨ７，０以上で例えば５００ｍ）ＩＮａＣｌの高イオン強度下ゲルの洗浄後、実質上インター−ａ −トリプシンを含有しないＸ因子及びＸ因子に富む分画の溶出がｐ　Ｈ約４．０までの酸性ｐＨ範囲内で溶出緩衝液のｐ、　Ｈの段階的減少により例えば１．００ｗＭＮａＣ１の比較的低イオン強度下で行われることが望ましい。この場合、下記順序でタンノくり貿溶出が観察される：Ｘ因子／Ｖ因子（ｐＨ約５〜５．６）、インター−α−トリプシンインヒビター／プロティンＣ（ｐＨ約４．６）、ＩＸ因子（ｐＨ約４．１）。

精製された又は豊富なｎ因子を製造することが望まれる場合、これはアミノ酸の非存在下低イオン強度で金属キレート力ラムから溶出させることも好ましい。

置換剤が用いられる場合、溶出液中におけるイミダゾール又はアミノ酸（特に、グリシン、メチオニン又はグルタミン酸）の濃度は５〜７０ｍＭの範囲内であることが好ましい。このような溶出における使用に適したアミノ酸としては例えばアラニン、フェニルアラニン、バリン、リジン、グリシ〉・、メチオニン及びグルタミン酸がある。

最後に３つ挙げられたアミノ酸がこの目的にとって特に好ましい。

置換剤含有溶出液は好ましくは４〜９の範囲内、更に好ましくは６〜８、例えば約７のｐＨに緩衝化される。

適切な緩衝系としてはトリスのようなアミノアルコール緩衝液及びクエン酸−リン酸緩衝液がある。トリスは低濃度の置換剤、即ちイミダゾール又はアミノ酸の存在下ですべての因子を溶出させうろことがわかっている。

一般に、いずれの溶出系が用いられても、結合親和性を反映した溶出順序はＵ　／　Ｕ　ｎ因子、Ｘ因子、ＩＸ　／　ＩＸ　ｎ因子／プロティンＣのようである。

一般に、溶出は溶出タンパク質比活性（純度及び／又は効力）が最大化されるような方法で行われることが好ましい。一般に目的とする主因子、例えばＸ因子の濃度は少なくとも３０１Ｕ／ｍｌであることが好ましい。

溶出後、溶液は凍結乾燥してもよい。ウィルス感染の不活性化のため凍結乾燥濃縮物は例えば８０℃で加熱される。本発明者らは、本発明による精製濃縮物が実質上かかる加熱に耐えて以前の濃縮物よりもかなり各因子の有意の活性化を回避しうろことを発見した。

本発明の方法を用いて、初めて：（ａ）ｎ因子及びインター−α−トリプシンインヒビターを実質上歯まないＸ因子；（ｂ）　ＩＪ、■及びＸ因子を実質上歯まないプロティンＣ；（ｃ）ＩＴ因子を実質上歯まずかつ少なくとも１３１Ｕ／ａｇタンパク質のＸ因子比活性を有するＸ因子；及びｃｒ−＋）ｎ因子を実質上歯まずかつ１単位／　ｍｇタンパク質１、Ｊ上の■因子比活性を有する■因子；を製造することが可能なことを立証した。

試験方法：従来のプロトロンビン複合体濃縮物の注入後における血栓症状の発現に関して報告された事例は、それらのトロンボゲン性作用に関する製品のインビトロ及びインビボ試験に基づいていた。インビボ試験は注入後に血栓症を評価するため様々な基準を用いて動物（ウサギ、ブタ及びイヌ）で行われた。インビトロ試験は基質血漿又はフィブリノーゲンの凝固時間を減少させうる濃縮物の能力に基づいている。これらの試験の有意性は示されなかったが、但し大きなウェイトが製品品質コントロールに関してそれらにかけられている。

３つの主な試験は以下のとおりである：ＮＡＰＴＴ：任意の下限凝固時間１５０秒間でサンプル中における活性化凝固因子のレベルについて測定する。

ＮＡＰＴＴは結局いずれの具体的活性化凝固因子の濃度とも関連していなかったが、Ｆ、ＩＸａ及びＦ、Ｘａの存在について示している。

ＦＣＴ：試験物質存在下でフィブリノーゲン溶液が凝固するのに要する時間を測定する。これはトロンビン（血液凝固“カスケード“において最後から二番目のタンパク質）の直接的測定である。下限凝固時間は３時間であって、これはトロンビン５　Ｘ　１０　’ＩＵ／　ｍｌ又は２ｎｇ／ｍｌに相当する。

ＴＧｔ５０：既知量のトロンビンを生成するのに要する時間を測定する。それは本プロセスで早期に機能する凝固因子の活性化に関する測定である。

下記例は説明のみの目的で示されている。

タンパク質の定量のため例中で用いられるｂ（験機能性生物学的活性及び抗原活性の双方が目的のタンパク質を定量するため利用された。

■、■及びＸ因子の生物学的活性は確立された凝固アッセイで測定された。凝固活性（二〇）の単位数は■、■及びＸ因子濃縮物に関する一次国際標準コード８４／６８１に対して較正されたワーキング標準８７１５３２を用いて決定された。

■因子の生物学的活性は確立された凝固アッセイ又は合成基質を用いた発色原アッセイで測定された。双方の場合において、単位数はドナー３０例以上のヒト血漿プールに対して較正され１．　ＯＦ、■：Ｃυ／ｍｌの■因子活性を有するとして規定される自家■因子濃縮物ワーキング標準を用いて決定された。

■、Ｖ、ＩＸ及びＸ因子、プロティンＣ並びにインター−α−トリプシンインヒビターに関するすべての抗原活性（：Ａｇ）は標準として正常プール血漿を用い免疫電気泳動〔ローレルのロケット法（Ｌａｕｒｅｌ　Ｉ　’ｓ　Ｒｏｃｋｅｔｍｅｔｈｏｄ）　）で測定された。各場合において、標準は１．０単位／ｍｌの効力に選定されており、サンプル活性は血漿当量単位／ｍｌとして表された。

本明細書において、凝固活性又は“因子−：Ｃ“は国際単位／ｍｌ又は１０／ｍｌで示される。抗原活性又は“因子−：Ａｇ”は単位／ｍｌ　（Ｕ／ｍｌ）又は血漿当量単位／ｍｌ（ｐｅｕ／ｍｌ　）で示される。

凝固及び抗原活性はタンパク質化学の異なる面の０１定であるため、凝固活性の国際単位は血漿当量単位と同じではない。典型的には、部分的精製タンパクＩＲ６縮物中において■因子、Ｘ因子及びＸ因子に関するｌＵ：ｐｃυの比は各々０，８６．０．６及び０．６３である。

例１キレート化セファロースをそれに硫酸銅溶液を通すことで銅イオンによりプライム化した。次いでゲルをｐＨ７、０の５００ａ＋ＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。５００ｍＭＮａＣ１含有ＰＣＣをＸ因子１、００〜２００１Ｕ／ｍｌゲルの担持量でカラムに適用した。

タンパク質溶出液をモニターし、漏出タンパク質を回収した。これは５〜２５１Ｌｌ／ｍｌの効力で比活性５１０／ｍｇタンパク質を有するプロトロンビンを含有していた。この物質は少なくとも７０％のプロトロンビンであった。

例２０、■、Ｘ因子及びプロティンＣの銅−キレートゲルへの結合性に関するイオン強度の効果ＦＣＣを１００．２５０．５００又は１０００１０００Ｉｎ　ｌ含有ｐｕ’７．ｏのクエン酸−リン酸緩衝液に対して透析した。次いでこれを同一イオン強度緩衝液で洗浄されたＣｕ２＋プライム化キレート化セフアロースカラムに担持させた。４３０単位／ｍｌゲルで担持後、カラムを同一緩衝液で更に洗浄し、溶出未結合タンパク質を■、■、Ｘ因子及びプロティンＣに関して分析した。下記第１表はその結果について示している。

第１表 ■因子と比較したＸ因子の最大差結合性は５００１ＮａＣ１で観察された。

例３ ■、ＩＸ及びＸ因子の銅−キレートゲルへの結合性に関する吸着ｐＨの効果キレート化セファロースを最初銅イオンでプライム化し、しかる後下記レベルに調整されたｐＨの５００ｍＭＮ　ａ　ＣＩ含有クエン酸−リン酸緩衝系で洗浄した。

５００ｍＭＮａＣ１含有ｐｃｃを同−ｐＨまで滴定し、しかる後■因子約３００単位／ｍ＋ゲルでゲルに担持させた。

カラムを同一緩衝液で更に洗浄し、漏出／未結合タンパク質を回収し、■、■及びＸ因子に関して測定した。下記第２表はその結果について示している。

第２表 ■因子の至適結合はｐＨ６，０〜７．０で達せられた。

Ｘ因子の至適結合はｐＨ７，０以上で達せられた。

Ｘ因子の至適結合はｐ）！６．５〜７．５で達せられた。

したがって、吸着ｐＨはゲルへの好ましい凝固因子の結合性を最適化させるために用いることができる。

例４低プロトロンビン含有Ｘ因子及びＸ因子濃縮物の製造キレート化セファロースカラムを例１のように調製して担持させた。ＰＣＣの適用後、カラムをｐＨ７，０の５００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。次いでイオン強度を１００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液による洗浄で低下させた。

次いでＸ因子分画を１００ａＭ１００ａ及び５ｍＭグリシン含有クエン酸−リン酸緩衝液で溶出させた。これはＸ因子１５〜４０Ｉｌｌ／ｍｌ及びＸ因子１単位当たりプロトロンビン０．０１単位以下を含有していた。Ｘ因子比活性は１３１Ｕ／■タンパク質であり、したがって純度７％であった。この分画はほぼ当モルｆｆ１（Ｘ因子１単位当たりＸ因子１１ｔＪ）でＸ因子も含有していた。

例５低プロトロンビン及びＸ因子含有Ｘ因子の製造キレート化セファロースカラムを例１で記載されたようにプライム化して担持させた。サンプルの適用後、カラムをｐａ７．０の５００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。次いでＸ因子をｐＨ７，０の５００１ＩＩＭＮａＣ１及び５ＩｎＭグリシン含有クエン酸−リン酸緩衝液で溶出させた。この物質は比活性１．４１０／　ｍｇタンパク質でＸ因子１５〜３０１０／ｍｌを３何していた。この物質は高プロトロンビン活性及び低■因子活性を有することがら例４で得られた物質と異なっていた。ここでは０．２５１Ｕ／単位Ｘ因子でプロトロンビン及びＸ因子双方に関し得られた。したがフて、プロトロンビンはなお全タンパク質中約４０〜５０重量９６であった。

例６低プロトロンビン含有Ｘ因子及びＸ因子濃縮物の製造キレート化セファロースカラムを例１で記載されたようにプライム化して担持させた。次いでそれを最初５００ｍＭＬかる後１００ａＭ１００ａを含有したｐＩ（７，０のクエン酸−リン酸緩衝液で連続的に洗浄した。

次いでＸ因子及びＸ因子双方を３０１０／ｍｌの効力で１．００ｍＭＮａＣ１含有トリス−グリシン緩衝液により溶出させた。プロトロンビンはＸ因子及びＸ因子１単位当たり０．０３１Ｕまで減少した。

例７低プロトロンビン及びＸ因子含有Ｘ因子及びプロティンＣ濃縮物の製造キレート化セファロースカラムを例４で記載されたように調製して洗浄した。５ｍＭグリシンでタンパク質溶出後、トリス−グリシン緩衝液を用いてＸ因子を溶出させた。トリスは１０〜３０Ｉｌ１Ｍの範囲、グリシンは４０〜７０吐の範囲内であってかつＮａＣｌは１００ｍ１１１であることが適切と判明した。これにより３０〜５０１Ｕ／ｍｌの効力でＸ因子を溶出させた。プロトロンビンは検出されず、Ｘ因子は■因子１単位当たり０，０１単位以下（０，０５重量％以下）でありだ。プロティンＣも２５〜４０血漿当量単位／ｍＩの濃度で溶出した。

例８プロトロンビン及びＸ因子からプロティンＣの分離プロティンＣの精製はヘパリン−セファロース又はデキストラン−サルフェート−セフ７０−スのような慣用的クロマトグラフィーの場合プロトロンビン及びＸ因子の共溶出によって複雑化される。しかしながら、これらの系では、■因子汚染はそのタンパク質の強い結合性のせいで最少である。したがって、前記金属キレート系もプロティンＣの精製に際しては−ステップとして用いてよい。

キレート化セファロースカラムの調製及び洗浄は例７で記載されたとおりであった。タンパク質結合性は濃度依存性であるため、担持量はＸ因子１．６０１１Ｊ／　ｍｌゲル又はプロトロンビン２４０１Ｕ／ｍｌゲル以内で可能なかぎり高くした。次いでカラムを洗浄し、例７で記載されたように溶出させたところ、プロティンＣは最終トリス−グリシン緩衝液溶出液中に溶出して、プロトロンビン及びＸ因子汚染物から分離された。

例９キレート化セファロースをカラムに充填し、銅イオンでプライム化し、しかる後ｐＨ７，０の５００１ＤＭＮ　ａ、　Ｃ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。

５００ｍＭＮａＣ１含有ＰＣＣをゲルとの接触時間が異なるカラム毎に変わるよう制御された流速で各カラムに担持させた。カラムに■因子４３０単位／ｍｌゲルで担持させ、５００ｍＭＮａＣ１緩衝液、１００ｍＭＮａＣ１緩衝液、しかる後ｐＨ７，０の１０ｄ）リス、７０ｍＭグリシン、１００ｍＭＮａＣ１緩衝液で洗浄した。漏出物及びトリス−グリシン溶出液を■因子、Ｘ因子、Ｘ因子及びプロティンＣに関して測定した。結果は下記第３表で示されている。

第３表したがってゲルへのタンパク質結合性は接触時間に依存している。これにより■ 、Ｘ因子及びプロティンＣに関しては４０分間以上の接触時間で最適化させることができる。接触時間が増加するほどゲルへの■因子結合性は低下している。

例１０Ｃｕ２＋プライム化キレート化セフアロースによる■因子、キレート化セファロースをいくつかのカラムに充填し、銅イオンでプライム化し、しかる後ｐＨ７，０の５００ｍＭＮ　ａ、　Ｃ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。

５００ｍＭＮａＣ１含有ｐｃｃを異なる量でカラムに担持させ、各カラムに関する接触時間をカラムからの流速を変えることで４０分間維持した。次いでカラムを例６で記載されたように緩衝液で洗浄した。結果は下記第４表で示されている。

第４表担持量が増加するほど優先的に■因子と置き換わる。

担持量チャレンジは他方と比較した場合の１つの特定タンパク質の結合性及び回収率を高めるために行うことができる。■因子からＸ因子の分離改善は２５８〜４３０Ｆ、ＩＸ：Ａｇ単位／ｍｌゲル（約１５０〜２５０Ｆ、Ｄ：ＣＩＵ／ｍｌゲルに相当）の担持量で達成された。

例１１Ｘ因子、Ｘ因子及びプロティンＣの結合性及び回収率に関する■因子濃度の効果キレート化セファロースを前記例で記載されたように銅イオンでプライム化し、洗浄した。５００ｍＭＮａＣ＋含有ｐｃｃをｐＩ（７，０の５００ｍＨＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で希釈した。カラムに異なる希釈率で担持させ、例６で記載されたように緩衝液で洗浄した。

全担持量チャレンジ（約２５０単位／　ｍｌゲル）及び接触時間は一定に保たれた。結果は下記第５表で示されている。

第５表担持される物質の濃度が高いことはキレートとの結合を生じさせる上で好ましい。

例１２等容量の５タイプのキレート化ゲルを５つのカラムに充填し、Ｃｕ２＋イオンでプライム化し、ｐＩ（７，０の５００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。５００１ＭＮａＣ１を含有するように調整されたＰＣＣを各カラムに等容量で担持させ、しかる後１００ｍＨＮ　ａ　Ｃ１含有の同一緩衝液で連続的に洗浄し、次いでｐＨ７，０の１１０ｌ１１トリス、７０ｍＭグリシン緩衝液で溶出させた。漏出、洗浄及び溶出分画中における■因子を肋１定しｌ二。

用いられたゲルタイプは以下のとおりであった＝１．１２原子（１０炭素）スペーサー分子でセファ０−スに結合されたイミノニ酢酸を有するキレート化セファロース〔ファルマシア〕　；２．１と同様であるが、但しファースト・フロー・セファｏ−ス（Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　５ｅｐｈａｒｏｓｃ）と更に架橋；３．１２原子（１０炭素）スペーサー分子で結合されたイミノニ酢酸を有するアガロース〔シグマ〕　；４、スチレン−ジビニルベンゼン架橋ポリマーに直接結合されたイミノニ酢酸〔キレックス１００　（Ｃｈｅｌｅｘｌ、００）、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））　；５．４と同様であるが、但し粗メツシユ非架橋マトリックスと結合〔キレツクスフ０．バイオラツド〕　；下記第６表はその結果を示している。

第６表Ｃυ２＋プライム化イミノニ酢酸基に対する■因子結合量はマトリックス及びキレート化基間におけるスペーサー分子の形成並びに非架橋キレート化セファロースの使用によって増加される。

キレート化セファロースを水洗し、しがる後硫酸銅溶液（５＋ｎｇ／ｍｌ）に懸濁し、２０〜３０分間混合した。

Ｃｕ２”２ライム化ゲルを混合物から遠心で回収し、ｐＨ７，０の５００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で徹底洗浄した。ゲルを上記のように回収し、５００ｄＮａＣＩ含有ＰＣＣの溶液に再懸濁し、２０〜３０分間混合した。ＰＣＣ対ゲル比は約１５０１Ｘ因子＝Ｃ単位／ｍ１ゲルであった。ゲルを遠心又は重力沈降で回収し、上澄を除去した。

ｐＨ７，０の５００ａ＋ＭＮａＣ１、しかる後１０１００ＩＩ　ａ　Ｃ１含有クエン酸−リン酸緩衝液による連続洗浄で弱結合タンパク質を除去し、イオン強度を低下させた。

次いでＸ因子をｐ）（７，０の１０ｍＭ）リス、５ｓＭグリシン、１００＋ＭＮａＣ１洗浄で除去することができた。次いで■因子をｐＨ７，０の１１０ｆｆ１トリス、７０１１Ｍグリシン、１００ｍＭＮａＣ１でゲルを洗浄することにより溶出させた。

例１４異なるアミノ酸溶出緩衝液を用いるＣｕ２＋プライム化キレート化セフアロースからの■因子回収キレート化セファロースのカラムを前記例で記載されたようにＣｕ２＋イオンでプライム化し、洗浄した。ＰＣＣ（５００ｍＭＮａＣ１含有）を各カラムに担持させ、しかる後ｐＨ７，０のクエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。

■因子を（ａ）非極性アミノ酸（例えば、アラニン、パリ、ン、フェニルアラニン、メチオニン）、（ｂ）極性非電荷アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、チロシン、グルタミン）、（Ｃ）極性負電荷アミノ酸（例えば、グルタミン酸）又は（ｄ）極性正電荷アミノ酸（例えば、リジン、アルギニン）から選択されるアミノ酸を７０ｄで含有したｐＨ７，０の１０Ｉｌｌ）Ｉトリスで溶出させることにより回収した。メチオニン、グリシン及びグルタミン酸が特に有利とわかったが、これらは８０％以上の■因子収率及び５１Ｕ／＋ｎｇ以上の■因子比活性を示す。

Ｃｕ２＋プライム化キレート化セフアロースのカラムをｐＨ７，０の５００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。ＰＣＣをカラムに適用し、しかる後向−緩衝液で洗浄し、次いで１００ｍＭＮａＣ１含有緩衝液で洗浄することによりイオン強度を低下させた。次いでＸ因子をｐＨ７，０の２〜５ｎＭメチオニン含有トリス緩衝液で溶出させた。Ｘ因子効力は１５Ｌｌ／ｍ１以上であり、比活性は約３０単位／　ｖｇであった。■因子はＸ因子分画中で■因子的０．５単位／単位Ｘ因子まで低下し、プロトロンビンは０．１単位／単位Ｘ因子以下で存在していた。

■因子は１０〜１５叶メチオニン含有トリス緩衝液による洗浄で溶出することがわかった。Ｘ因子効力は１５［１／ｕ＋１以上であって、それは約２０単位／　ｕｈＨの比活性を有していた。プロトロンビンは■因子分画中で検出されず、Ｘ因子はＸ因子０．１単位／単位■因子以下で存在していた。

例１６Ｃｕ”’ライム化キレート化セファ０−ス力ラムをメチオニン溶出（例１５）で記載されたように調製し、洗浄し、ｐｃｃで担持させ、洗浄した。

Ｘ因子を５〜１０ｍＭグルタミン酸含有１．０ｍＭトリス緩衝液で溶出させた。

Ｘ因子は１６〜２２単位／　ＩＩＩｇの比活性を有していた。

次いで比活性的１５Ｕ／＋ｎｇのＸ因子を溶出緩衝液中のグルタミン酸濃度を４０ａ＋Ｍまで高めることにより溶出させた。

キレート化セファロースのカラムをＣｕ’４オンでプライム化し、ｐＨ７，Ｏの５００ｍＭＮａＣ１含有緩衝液で洗浄した。５００ｍＭＮａＣ１含有ＰＣＣをカラムに担持させ、しかる後緩衝液で洗浄した。イオン強度をｐＨ７，０の低塩緩衝液を用いて１００１Ｉ１００１Ｉまで低下させた。一部のＸ因子は比活性１０．　５Ｕ／ｍｇでこの緩衝液により溶出した。

カラムをｐＨ７，０〜８．５のｐＨ勾配で段階的に溶出させた。Ｘ因子及びＸ因子は各々比活性２７ＵノＩ！１ｇ及び６１ｊ／■でｐＨ７，１〜７．９のとき溶出した。

例１８溶出させるためｐＨ及びグリシンを用いる■、Ｘ因子及びプロティンＣの製造キレート化セファロースのカラムをＣｕ２〜オンでプライム化し、ｐＨ７，，５のクエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。５００ａＭＮａＣ１含有ｐｃｃをｐＨ７，５に調整し、カラムに担持させ、緩衝液で洗浄した。次いでイオン強度をｐＨ７，５の１００ｍ１ｆＮａＣ１含有クエン酸゛−リン酸緩衝液による洗浄で低下させた。これにより比活性９０／ｍｇを有するＸ因子との混合物と１７て比活性１８Ｕ／ｌｌ１ｇのＸ因子を溶出させた。次いで混合プロティンＣ（１５Ｕ／ｍｌ　；　６．　５単位／ｌ１１ｇタンパク質）及びＸ因子（１２Ｕノｍｌ　；　５単位／ｒｎｇタンパク質）分画をｐＨ８，０の１０＋ｎＭ）リス、５ＩＩＩＭグリシン、１００ＩＤ１００ＩＤ緩衝液による洗浄で回収した。

キレ−１・化セファロースのカラムをＣｕ２〜オンでプライム化し、ｐＨ−ｚ、ｓの５００ｍＭＮ　ａ　Ｃ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。次いでＰＣＣをｐｉ（７，５及びＮＮａＣ１５００ａへの調整後適用し７た。次いで■因子を除去するため洗液として上記緩衝液を用いた。出発物質中の■因子３０％もこの洗液で除去された。次いでイオン強度を１００ｎＭ１００ｎ含有緩衝液による洗浄て低下させた。これにより約１５単位／Ｉｎｇタンパク質の比活性でＸ因子も除去した。クエン酸−リン酸鐸衝液を用いて、ｐＨ勾配をカラムの洗浄中ｐＨ７，５〜４．０に形成し、た。選択されたタンパク質に富む分画は回収しうろことがわかった。このため例えばｐＨ約５．５でＸ因子を更に除去し、一方ｐＨ５〜５．６で更に４０％の結合■因子をカラムから約５血漿当量単位／ｍｌで除去した。

このｐＨ範囲内でインター−α−トリプシンインヒビターもプロティンＣと同時に溶出し始めた。緩衝液ｐＨがｐＨ４，６に下がると、インター−α−トリプシンインヒビター及びプロティンＣの溶出が各々３．０及び４．６血漿当量単位／ｌｌ１ｇタンパク質の比活性で続いた。

はんの少量のＸ因子が減少ｐＨ勾配のこれらセグメントに際して溶出した。

ｐＨが例えばｐｌ（４，１まで更に低下したとき、Ｘ因子は効力４０単位／　ｍ１以上及び比活性３０単位／ｒａｇタンパク質以上で溶出した。この分画は検出可能な■因子又はＸ因子を含有していなかった。プロティンＣは約０．０１単位／単位■因子で存在し、■因子は０，０６単位／単位■因子で存在し、インター −α−トリプシンインヒビターは０．０３単位、／単位■囚子で存在した。

■因子１単位におけるそれらの汚染について、これは出発物質（ｐ　ｃ　ｃ）よりもプロティンＣ，Ｖ因子及びインター−ａ　−ｔ・リブシンインヒビターに関し各々９５％、６３％及び９０％の減少を示す。

キレート化セファロースのカラムをＣｕ２〜オンでプライム化し、ｐＨ７，５の５００ｍＭＮａＣｌ含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。５００＋＋＋ＭＮａＣ１含有かつｐＨ７，５に調整されたＰＣＣをカラムに担持させ、しかる後上記緩衝液で洗浄した。更にｐＨ７，５の１．　ＯＯｌＩＭＮ　ａ　Ｃ１含有クエン酸−リン酸緩衝液による洗浄でイオン強度を低下させてＸ因子を除去したが、これは少なくとも６０７ｍ１の効力及び少なくとも１５単位／　ｍｇタンパク質の比活性で回収することができた。次いでｐＨを第三の緩衝液、典型的にはｐＨ４，５の１００ａＭ１００ａ含有クエン酸−リン酸による洗浄で低下さゼた。これにより残留結合インター−ａ−トリプシンインヒビターの少なくとも５５２６及び残留結合プロティンＣの２４％を除去したが、但し結合Ｘ因子に関しては５９６のみであった。次いでカラムをＸ因子溶出に適したｐｎ及び塩濃度を有する緩衝液、典型的にはｐＨ７，０の１．００ｍＭＮａ、ＣＩで再平衡化１．た。次いでＸ因子をアミノ酸溶出緩衝液、例えば前記例で記載されたような１００關ＮａＣ１含有トリス緩衝液中グリシンで溶出させた。これにより２Ｃ）０υ／ｍｌで５０単位／ｉｇタンパク質以上の比活性を有するＸ因子を得た。プロティンＣも２０血漿当量単位／■タンパク質の比活性で存在していた。

出発ＦＣＣ物質と比較して、■因子分画は有意に低量の汚染タンパク質しか含有していなかった。■因ｆ−、Ｘ因子、■因子及びインター−α−トリプシンインヒビターは■因子１単位当たり各々０．０００５．０．００５．０．００２及び０．０４単位のレベルで存在していた。

これはＦＣＣ出発物質中各々〕、０．１，０．０．２及び０．４の値に匹敵する。

キレート化セファロースのカラムをＣｕ２＋イオンで荷電し、しかる後ｐＨ７，０の５００ｉＭＮａＣ＋含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。凍結上澄又はＸ因子消失上澄で吸着されたＤ　Ｅ　Ａ、　Ｅ−セファロースの溶出により得られた■因子濃縮物を５００ＩＩＭＮａＣ１を含有するようにＸ［し、５０〜１５０■因子単位／ｍｌゲルでカラムに担持させた。上記緩衝液で洗浄後、イオン強度をｐＨ７，０の１００１００１Ｈ，ＣＩ含有クエン酸−リン酸緩衝液による洗浄で低下させた。■因子を１００ｍＭＮａＣ１含胃ｐＨ７，０の１０口旧・リス、６０ａＭグリシンでカラムを洗浄することにより１単位／　ｍｇ以上の比活性で回収した。

キレート化セファロースのカラムをＣｕ’４オンで荷電し、しかる後側１で記載されたように担持させた。次いでカラムをｐＨ７，０の５００ｍＭＮａＣ１ｆｉ有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。次いでカラムを少なくとも４倍層容量のドデシル硫酸ナトリウム１重量％含有同一緩衝液で洗浄して、ゲルに結合された脂質成分を可溶化させた。次いで界面活性剤を１００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸 −リン酸緩衝液でゲルから洗い出した。この段階は脱塩でイオン強度を低下させるためにも役立つ。次いでＸ因子を例７で記載されたようにトリス緩衝液中グリシンでゲルから溶出させた。同様の操作を用いるが、ドデシル硫酸ナトリウムは同重量のコール酸又はポリオキシエチレン（２０）モノオレエート〔ツイーン８０　（Ｔｗｃｅｎ８０）〕で置き換えてもよい。

上記特定例の溶出物を活性の損失なしに凍結乾燥し、しかる後８０℃で７２時間加熱して潜在的ウィルス感染力を低下させた。現ＰＣＣとは異なり、トロンビン生成Ｉよ加熱時に観１察されなかった。■、■及びＸ因子は異なる媒体中での加熱に対して異なる安定性を示した。溶出物をクエン酸及び水で希釈した場合、非加熱活性の６５〜９０％の加熱収率が得られた。トリスによる希釈では非常に大きな活性損失を招いたが、これはプロトロンビンよりもＸ因子に関して大きく、Ｘ因子よりもＸ因子に関して大きかった。この一般的効果は下記例２４及び２５で記載されるような利点を得る上で用いることができる。

例２４Ｘ因子の濃縮物中におけるＸ因子活性の低下前記例４及び例６はＸ因子が共存したＸ因子濃縮物の製造について記載している。Ｘ因子活性は凍結乾燥前にｐＨ７，０の５０１トリス緩衝液による関連Ｘ因子分画の希釈で優先的に低下させることができる。一方、溶出Ｘ因子効力の希釈を避けるため、溶出緩衝液中のトリスはＸ因子がその処方緩衝液中に溶出されるよう５０＋ｎＭまで増加させてもよい。凍結乾燥後、この物質は８０℃で７．２時間加熱することができる。Ｘ因子活性はＸ因子濃縮物として大きな特異性をもった生成物が用いられるようＸ因子よりも低下される。

例２５高純度Ｘ因子濃縮物の加熱処理加熱後できるだけ最大のＸ因子活性収率を達成するため、例７で記載されたＸ因子溶出物をクエン酸もしくはクエン酸−リン酸緩衝液又は水で望ましい最終効力まで希釈し、凍結乾燥し、しかる後８０℃で７２時間加熱処理した。溶出緩衝液はトリスを含をしていたが、但しこの効果は最終緩衝液中のトリス成分を有効に希釈しつるよう十分に高いＸ因子効力をもつ分画の選択によって最少に抑制した。一方、溶出緩衝液の処方を修正して、未希釈溶出液を直接凍結乾燥してもよい。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）゛１乙成　２　年　６　月　２２日１、　特許出願の表示ＰＣＴ／ＧＢ　８８１０１１５０２、発明の名称化学的プロセス３、特許出願人住　所　イギリス国ハートフォードシャー、エルスラリー、ダガー、レーン（番地ない名　称　セントラル、ブラッド、ラボラトリーズ、オーソリティー４、代理人（郵便番号１００）東京都千代田区丸の内三丁目２、特許請求の範囲は第７項、第１０項が補正されております。

１、　請求の範囲を別紙の通りに補正する。

２、　明細書第１頁第１５行目にｒｌＸ因子」とあるをｒＸ］因子」に補正する。

を「８〜１６の原子」に補正する。

４、　第１０頁第８行目に「約２５０−４５０Ｊとあるをｒ２５０〜４５０」に補正する。

請求の範囲１、ビタミンに依存性血液凝固因子を少なくとも１種のかかる因子を含有した混合物から少なくとも部分的に分離するための方法であって、上記混合物が不活性支持体に固定化された多価金属のキレートに吸着され、しかる後上記因子の１種に関して富む１以上の分画を得るために溶出されることを特徴とする方法。

２、　混合物が少なくとも２種のビタミ＞Ｋ依存性血液凝固因子を含有している、請求項１に記載の方法。

３、　混合物がプロトロンビン複合体濃縮物である、請求項２に記載の方法。

４、　混合物が組換えＤＮＡ技術で産生されるビタミンに依存性血液凝固因子含有微生物培養物から得られる、請求項１に記載の方法。

５、　不活性支持体がその上にキレート化されたＣυ２＋イオンを固定化している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

６、Ｃｕ２宥オニ／がスペーサーを介１．でアガロース支持体に結合されたイミノニ酢酸基でキレート化されている、請求項５に記載の方法。

７、　スペーサーが８〜１６の原子を有している、請求項６に記載の方法。

８、　混合物が、０．４〜１．　０１ｖｉ　ＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有したｐＨ７，０以上の緩衝液の存在下でキレートに吸着される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

９、　緩衝液が０．５Ｍ　ＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有している、請求項８に記載の方法。

１０、プロトロンビン複合体濃縮物が、２５０〜４５０Ｆ、■：Ａｇ単位／　ｍｌゲルの■因子担持量とするため２０分間以上にわたり請求項６に記載されたアガロース支持体に吸着される、請求項８又は９に記載の方法。

１］、　混合物の吸着後に、望ましいビタミンに依存性血液凝固因子に富むいずれかの分画の溶出前に結合■因子を除去するため支持体の洗浄が行なわれる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。

１２、混合物の吸着後に、少なくとも最終洗浄ステップが１．００〜２００ｉ１ＭＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有した緩衝液で行われる洗浄段階が続けられる、請求項］、−１１のいずれか一項に記載の方法。

１３、支持体に吸着された１種以上の望ましいビタミンに依存性血液凝固因子の溶出がｐＨ勾配によって行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

１４、　支持体に吸着された１種以上の望ましいビタミンに依存性血液凝固因子の溶出がグリシン、メチオニン及びグルタミン酸から選択されるアミノ酸を含有した緩衝液によって行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

１５、特に支持体から結合インター−α−トリプシンインヒビターを除去するため酸性ｐＨ緩衝液を用いる溶出ステップを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。

１６、溶出ステップ後に、インヒビター及び■因子を実質上含有しないＸ因子に富む分画の回収が続けられる、請求項１５に記載の方法。

１７、Ｘ因子に富む分画及び／又は■因子に富む分画及び／又はプロティンＣに富む分画が■因子を実質上含有しないで得られる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

１８、　カラムクロマトグラフィーが行われる１、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。

１９、■因子及びインター−α−トリプシンインヒビターを実質上含有しないＸ因子。

２０、■、■及びＸ因子を実質上含有しないプロティンＣ０２１、■因子を実質上含有せずかつ少なくとも１３ＩＵ／ｍｇタンパク質のＸ因子比活性を有するＸ因子。

２２、■因子を実質上含有せずかつ１単位／ｌ１１ｇタンパク質以上の■因子比活性を有する■因子。

国際調査報告ＰＣＴ／ＧＢ　８Ｂ１０１１５０＋＊＋呻ｅ＋＋ａ＋＋ａｌ　Ａｅｅｌｌｃａｌｌｍ　Ｎｏ、２国際調査報告ＧＢ　８８０１１５０

Claims

【特許請求の範囲】

１．ビタミンＫ依存性血液凝固因子を少なくとも１種のかかる因子を含有した混合物から少なくとも部分的に分離するための方法であって、上記混合物が不活性支持体に固定化された多価金属のキレートに吸着され、しかる後上記因子の１種に関して富む１以上の分画を得るために溶出されることを特徴とする方法。
２．混合物が少なくとも２種のビタミンＫ依存性血液凝固因子を含有している、請求項１に記載の方法。
３．混合物がプロトロンビン複合体濃縮物である、請求項２に記載の方法。
４．混合物が組換えＤＮＡ技術で産生されるビタミンＫ依存性血液凝固因子含有微生物培養物から得られる、請求項１に記載の方法。
５．不活性支持体がその上にキレート化されたＣｕ２＋イオンを固定化している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
６．Ｃｕ２＋イオンがスペーサーを介してアガロース支持体に結合されたイミノ二酢酸基でキレート化されている、請求項５に記載の方法。
７．スペーサーが８〜１６の間の原子を有している、請求項６に記載の方法。
８．混合物が、０．４〜１．０ＭＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有したｐＨ７．０以上の緩衝液の存在下でキレートに吸着される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．緩衝液が０．５ＭＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有している、請求項８に言己載の方法。
１０．プロト。ンピン複合体濃縮物が、約２５０〜４５０Ｆ．ＩＸ：Ａｇ単位／ｍｌゲルのＩＸ因子担持量とするため２０分間以上にわたり請求項６に記載されたアガロース支持体に吸着される、請求項８又は９に記載の方法。
１１．混合物の吸着後に、望ましいビタミンＫ依存性血液凝固因子に富むいずれかの分画の溶出前に結合ＩＩ因子を除去するため支持体の洗浄が行なわれる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．混合物の吸着後に、少なくとも最終洗浄ステップが１００〜２００釦ｍＭＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有した緩衝液で行われる洗浄段階が続けられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．支持体に吸着された１種以上の望ましいビタミンＫ依存性血液凝固因子の溶出がｐＨ勾配によって行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．支持体に吸着された１種以上の望ましいビタミンＫ依存性血液凝固因子の溶出がグリシン、メチオニン及びグルタミン酸から選択されるアミノ酸を含有した緩衝液によって行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．特に支持体から結合インター−α−トリプシンインヒビターを除去するため酸性ｐＨ緩衝液を用いる溶出ステップを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．溶出ステップ後に、インヒビター及びＩＩ因子を実質上含有しないＩＸ因子に富む分画の回収が続けられる、請求項１５に記載の方法。
１７．Ｘ因子に富む分画及び／又はＷ因子に富む分画及び／又はプロテインＣに富む分画がＩＩ因子を実質上含有しないで得られる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．カラムクロマトグラフィーが行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．口因子及びインター−α−トリプシンインヒビターを実質上含有しないＩＸ因子。
２０．ＩＩ、ＩＸ及びＸ因子を実質上含有しないプロテインＣ。
２１．ＩＩ因子を実質上含有せずかつ少なくとも１３ＩＵ／ｍｇタンパク質のＸ因子比活性を有するＸ因子。
２２．ＩＩ因子を実質上含有せずかつ１単位／ｍｇタンバク質以上のＶＩＩ因子比活性を有するＶＩＩ因子。