Nouveaux dérivés de tylosine et leurs procédés de fabrication.
De nouveaux dérivés de tylosine ayant au moins un groupe
acylé à la position 3- et 4"- de la tylosine, et ses sels d'ad-,
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organismes incluant des isolants bactériens résistant aux médi-
caments et qui produisent des niveaux de sang élevés par administration orale sont produits par une réaction biochimique en
utilisant le micro-organisme du gène streptomyces qui sont
choisis pour leur capacité nouvelle d'acyler les positions 3-
et 4"- des antibiotiques macrolides 16- substitués; ils sont
récupérés à partir du milieu réactionnel par des procédés con-
ventionnels pour la récupération des antibiotiques macrolides.
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tués selon cette description signifient la position 3- du cycle
16- substitué et la position 4"- de mycarose de l'antiobiotique
macrolide respectivement.
L'acylation des antibiotiques est l'un des procédés pra- ;
tiques pour la production de nouvelles espèces d'antibiotiques
et de leurs dérivés. La synthèse chimique est communément employée pour une telle acylation, mais l'acylation est sujette
à se produire dans un modèle uniforme de la plupart des groupes
hydroxyles, ainsi des étapes de réaction supplémentaires sont exigées pour obtenir le produit désiré qui doit être acylé à des positions particulières. Des procédés biochimiques, d'autre part, facilitent une acylation sélective seulement sur des positions cibles dues à la spécificité des réactions enzymatiques et le rendement est ordinairement élevé. Les présents inventeurs ont réalisé une recherche minutieuse d'une telle conversion biochimique des antibiotiques macrolides, spécialement sur l'acylation des antibiotiques macrolides et ont trouvé de nombreux micro-organismes qui sont capables d'acyler spécifiquement les positions 3- et 4"- des antibiotiques macrolides 16-substitués.
Ceci constitue la première et nouvelle découverte de la réaction enzymatique dudittype créé à partir de micro-organismes, et elle est particulièrement appliquée à la production de nouveaux dérivés de tylosine à partir de la tylosine.
Il n'y a pas de description antérieure par rapport aux composés de tylosine présentés dans la présente invention, pour l'acylation biochimique de la tylosine.
La synthèse chimique de l'ester d'acétyle de la tylosine et de la tylosine acétylée est décrite dans le brevet japonais
(Kokoku) Showa 36-22 649, intutilié "Procédé pour la production de tyloseine" en référence à l'exemple 4 et 5, mais les produits sont évidemment différents des dérivés de tylosine de
la présente invention, la raison en étant présentée dans la description détaillée qui va suivre.
L'acylation des antibiotiques est l'un des procédés pratiques pour la production.de nouvelles espèces d'antibiotiques et leurs dérivés. La synthèse chimique est communément employée pour une telle acylation, mais l'acylation est sujette
à se produire dans un modèle uniforme sur les groupes hydroxyles du composé, ainsi des mesures et des étapes spéciales sont exigées, par exemple la protection propre de quelques groupes hydroxyles et d'autres résidus fonctionnels, pour obtenir le produit désiré qui est acylé à une position particulière. Un procédé biochimique, d'autre part, facilite une acylation sélective due à la spécificité de la réaction enzymatique et le rendement est ordinairement élevé. Les présents inventeurs ont réalisé une recherche sérieuse d'une telle transformation biochimique des antibiotiques macrolides et ont trouvé que de nombreux micro-organismes sont capables d'acyler spécifiquement et simultanément les positions 3- et 4"- des antibiotiques macrolides 16-substitués.
Une caractéristique particulière de ce procédé est qu'une variété de dérivés acylés peut être produite ' par la combinaison propre des deux systèmes d'acylation produits dans un organisme, les antibiotiques substrats et les donneurs de groupes acyle, apportant un résultat industriel substantiel.
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avec le procédé pour l'acylation microbiale des antibiotiques macrolides 16-substitués; par exemple, avec la spiramycine et le YL-704. Le procédé utilisant la spiramycine est présenté dans le brevet américain 2.943*024 "Préparation de spiramycine III", brevet américain 2.943.025 "Préparation de spiramycine II", le brevet français 1.262.571 "Transformation biochimique de la spiramycine I en spiramycine II et III" , et le brevet japonais (Kokoku) Showa 36-349 "Procédé pour la production de spiramycine II, spiramycine III et leurs mélangée?. Ces brevets.traitent pratiquement de la même invention traduite en différents langages, montrant les procédés en résumé :
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2420 produisant la spiramycine dans un milieu de culture auquel on ajoute la spiramycine I (:ayant un groupe 3-hydroxyle ) et les agents acylants, dans lequel on produit la spiramycine II ( ayant le groupe 3-acétyle et la spiramycine III (ayant le groupe 3-propionyle).
2. Les cellules cultivées sans spiramycine et les agents acylants sont mis en suspension dans un milieu réactionnel, auquel
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Après incubation, on produit la spiramycine II et III.
3. Dans la production fermentationnelle des spiramycines avec ledit organisme, l'addition des agents acylants améliore le taux de production de spiramycine II ou III.
Le procédé selon la présente invention se distingue clai. rement dans le principe pour les raisons suivantes :
1. Ils employant un organisme qui est un producteur direct de spiramycine, et le procédé est lié de manière proche à la fermentation antibiotique. Tandis que les quatre souches favora- blés employées dans la présente invention sont des non-producteurs des espèces antibiotiques. désirées, ceci indique que notre procédé est un procédé enzymatique dans son principe.
2. Les-.substrats d'antibiotiques employés dans leur procédé
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orgànisme, tandis- que notre procédé peut employer la plupart des antibiotiques macrolides 16-substitués, indiquant la nature non spécifique de la réaction en termes de spécificité de sub-
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3 * Leur procédé peut réaliser seulement la conversion de la
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et avec un organisme. Une plus vaste variété de produits
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Egalement offerte est la simplicité du procédé pour con-
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système de cellule*
Par rapport au YL-704 qui est une famille de leucomycines, on présente le brevet japonais (Kokoku) Showa 49-13 992
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procédé indique qu'un organisme choisi parmi le groupe consis-
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qui possède un_ groupe isovaléryle à la position �"- du
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Les procédés de la présente invention sont également différents de manière évidente de ceux de la production du
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mycine, par rapport aux organismes employés, la nature enzymatique du procédé, la spécificité de non-substrat, de la variété des produits vices et. que l'acylation aux positions 3- et 4" peut être réalisés simultanément avec un système de cellule, qui donne une utilité industrielle substantielle.
Il résulte de ce qui précède que c'est un objet de la présente invention de réaliser un nouveau composé ayant des activités de contrôle d'infection.
Un autre objet de la présente invention est de fournir un nouveau produit pharmaceutique, un médicament vétérinaire et une composition d'additif à la nourriture ainsi qu'un procédé pour leur emploi.
Encore un autre objet de la présente invention est de fournir un nouveau procédé pour l'acylation d'au moins un grou-
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1-ides 16-substitués.
1. La présente invention fournit un nouveau composé de la formule générale suivante :
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un groupe propionyle et R2 représente l'hydrogène, un groupe
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fois R, et R2 représentent l'hydrogène est à exclure ; et les sels d'addition d'acides acceptables pharmaceutiquement, non
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quement au moins l'un des groupes 3- et 4""-hydroxyle de la tylosine avec l'organisme du gène Streptomyces capable d'exer-
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sont récupérés à partir du milieu réactionnel par des procédés conventionnels pour la récupération des antibiotiques macroli- des.
La présente invention fournit également de nouveaux dérivés de tylosine qui :
(a) inhibent la croissance de divers micro-organismes incluant des isolants bactériens résistant aux médicaments et
(b) produisent des niveaux élevés de sang par administration orale et entérique.
2. D'autres réalisations de la présente invention fournissent un produit pharmaceutique, un médicament vétérinaire et une composition d'additifs à la nourriture pour l'administration aux êtres humains et aux animaux, comprenant un tel composé en une quantité suffisante pour contrôler des maladies infectieuses provoquées par des micro-organismes.
3. Encore d'autres caractéristiques de la présente invention fournissent un procédé pour contrôler chémothérapeutiquement des maladies infectieuses provoquées par des micro-organismes chez les êtres humains et les animaux par l'administration d'un' tel composé auxdits êtres humains et aux animaux en un dosage suffisant pour contrôler lesdites infections.
4. La présente invention fournit de plus un procédé pour la production de composés antibiotiques macrolides 16-substitués ;
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exemple, les dérivés de tylosine ayant ladite formule, qui com-� prend la culture des organismes du.gène streptomyces possédant
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ployé pour la culture des organismes du gène, en réalisant une ; telle réaction d'acylation dans une combinaison des sources en-' zymatiques, par exemple des cellules croissantes et non-crois- santes dudit organisme cultivé ou les préparations enzymatiques; préparées à partir de celui-ci, le substrat antibiotique des antibiotiques macrolides 16-substitués ayant au moins un grou-
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<EMI ID=24.1> <EMI ID=25.1>
D'autres avantages et caractéristiques de 1'invention apparaîtront plus clairement dans la description qui va suivre
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ples et dans lesquels :
Les figures 1 et 2 montrent le spectre d'absorption ul-
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tylosine, respectivement*
Les figures 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 montrent le spec-
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nyl-4"-isovaléryltylosine, 4"-n-butyryltylosine et le 4"-isovaléryltylosine, respectivement.
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le spectre d'absorption infrarouge dans cet ordre, respectivement.
Les figures 19, 20 et 21 sont le spectre de masse d'io- nisation chimique pour la 3-acétyltylosine, la 3-propionylty- ;
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ryltylosine.
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mince des dérivés de tylosine suivant la présente invention.
La présente invention concerne de nouveaux dérivés des antibiotiques macrolides et leur production. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux dérivés acylés de la tylosine et des procédés pour leur préparation par l'acylation biochimi:.: , que de la tylosine ou de ses dérivés. Plus en détail, elle con-� cerne de nouveaux dérivés de tylosine comme montré dans la for-
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ou un groupe propionyle et R2 représente l'hydrogène, un groupe n-butyryle ou un groupe isovaléryle, le cas dans le-
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ce qui est produit en acylant la tylosine ou ses dérivés
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tandis que l'autre représente un groupe acyle avec un nombre d'atomes de carbone de 2-5 dans au moins l'un des groupes hydroxyle aux positions 3- et 4"- par l'emploi de cellules croissantes et au repos, des préparations de cellules et des préparations enzymatiques des micro-organismes appartenant au gène streptomyces qui sont capables de produire l'enzyme pour la- dite acylation.
L'acylation des antibiotiques est l'un des procédés pratiques pour la production de nouvelles espèces d'antibio- tiques et leurs dérivés. Les procédés chimiques sont commune-
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tion est sujette à se produire dans un schéma uniforme, qui exige en conséquence dés étapes supplémentaires, par exemple une protection sélective des résidus fonctionnels, pour obtenir le produit désiré qui est acylé à des positions particulières. Des procédés biochimiques, d'autre part, provoquent une acylation sélective seulement à une position cible due à la spécificité des réactions enzymatiques et le rendement est ordinairement élevé. Les présents inventeurs ont réalisé une recherche minutieuse sur une telle réaction biochimique, spécialement sur l'acylation des antibiotiques macrolides, et on trouvé qu'un grand nombre de micro-organismes peuvent spécifiquement acyler
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macrolides 16-substitués. La découverte par les présents inventeurs de l'existence de ce type d'enzyme dérivé de micro-organismes et des réactions enzymatiques est nouveau et le premier de cette sorte. Ces réactions ont été étudiées de plus pour établir une conversion biochimique des antibiotiques macrolides industriellement et particulièrement appliquée à la production de nouveaux dérivés de tylosine à partir de la tylosine. Les dérivés de tylosine nouvellement développés incluent les 3-acétyltylosine, 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine, 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine, 3-propionyltylosine, 3-propionyl-4"-n-butyryl-
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sine et 4"-isovaléryltylosine.
Expérience 1.
On prépare un milieu de composition suivante : farine de
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rilise 100 ml. du milieu, placé dans un ballon de culture d'agitation de volume 500 ml., à 120[deg.]C. pendant 20 minutes, auquel on inocule le Streptomyces thermotolerans ATCC 11 416 et on
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jours de culture, après qu'environ la moitié du glucose soit
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tration finale du milieu dans la proportion de 2 g. par litre et on continue la réaction pendant 6 heures supplémentaires. On clarifie le mélange réactionnel obtenu par centrifugation, on ajuste le pH à 8,5 par une solution d'hydroxyde de sodium dilué, et on extrait avec un volume égal d'acétate déthyle. On concentre l'extrait à environ un tiers de son volume originel sous pression réduite et on place une partie sur une plaque de couche mince de silicagel (Merck Co.). Il est ensuite dévelop-pé par un mélange de solvant de n-hexane : acétone : méthanol ; benzène : acétate d'éthyle (30 : 10 : 8 : 25 : 20), on sèche complètement et ensuite on verse dansde l'acide sulfurique à .10 % et on chauffe. On détecte deux taches avec des valeurs de Rf d'environ 0,50 à 0,65 qui sont attribuées à la leucomycine <EMI ID=47.1>
en comparaison avec des échantillons authentiques.
Expérience 2.
On collecte les cellules cultivées dans l'expérience 1
(juste avant l'addition des antibiotiques) par centrifugation, on rince une fois avec une solution tampon de phosphate 0,05 M d'un pH de 6,5 et on remet en suspension dans la même solution tampon avec du glucose ajouté dans la concentration de 2 g. par litre. La concentration des cellules dans la solution tampon est environ de 10 g. de matière sèche par litre..Ensuite, on ajoute la leucomycine V et la L-leucine dans des concentrations de 0,5 g. par litre et de 1 g. par litre respectivement, et on conduit une incubation aérobie dans des conditions semblables
à celles pour la culture des cellules, Trois heures plus tard, la réaction est terminée, suivie par les processus comme dans l'exemple 1. Sur une plaque de chromatographie en couche mince, les deux tâches émergent possédant la valeur Rf d'environ 0,3 et 0,65 respectivement et qui sont identifiées comme le sub-
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<EMI ID=49.1>
- .Expérience 3.
Les cellules obtenues et rincées comme dans l'expérience 2, sont remises en suspension dans une petite quantité de ladite solution tampon de phosphate et homogénéisées par l'emploi d'une "presse française", à partir de laquelle on obtient un fluide super-limpide par centrifugation à 3.000 X G pendant 10 minutes . A une solution diluée de ce fluide, on ajoute la leucomycine U et le coenzyme A isovaléryle (pour la suite de la description, le co-enzyme A sera abrégé en tant que CoA) en concentration de 0,2 g. par litre de manière égale, et la réaction se produit comme dans l'expérience 2. La formation de la leucomycine A3 (4"-isovalérylleucomycine U) est confirmée par un chromatogramme sur couche mince.
Comme souligné préliminairement dans les expériences
-la réaction d'acylation des antibiotiques macrolides sui- <EMI ID=50.1>
comme substrat, par exemple la tylosine, et un donneur d'acyle.
La description suivante caractérise en détails l'exécution de la présente invention.
Des organismes possédant l'activité d'acylation sont
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les cultures déposées sont :
Streptomyces thermotolerans ATCC 11 416 ;
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Les variants et les mutants obtenus naturellement ou artificiellement à partir dudit organisme possédant ladite ac- tivité sont également employés dans la présente invention. Par exemple, des mutants possédant une activité d'acylation accrue peuvent être dérivés par des techniques employées convention- '
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Dans la présente Invention, on cultive ces organismes en employant le procédé général employé pour la culture de souches du gène Streptomyces : mais des conditions appropriées peuvent être réalisées de façon à obtenir une puissance d'acylation complète pour l'activité enzymatique. Le milieu de cul-
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malte, des alcools tels que l'éthanol e t la glycérine, des huiles" des graissés et des cires d'origine végétale ou animale, des acides organiques tels que l'acide acétique et l'acide citrique et leurs sels, mais d'autres composante assimilables
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Poids sont employés seuls ou en combinaison de deux ou davan-
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f lement et de préférence de 2-6 g. par décilitre, ceci dépendant du type de composé employé. Les sources d'azote préféremment employées sont des composés organiques riches en protéines, d'origine animale, végétale ou microbiale, tels que la caséine et la peptone, des produits farineux préparés à partir du soja, du blé, des graines de coton et des préparations à partir de levures et de bactéries, et divers composés minéraux conventionnellement employés comme sources d'azote tels que des sels dtammonium. D'autres composés riches en azote qui peuvent être as- similés par les organismes sont également utilisables. Ces sour- ces d'azote sont employées seules ou en combinaison de deux ou davantage dans le milieu en une concentration de 0,1 - 10 g.
par décilitre. Avec des substances organiques, la concentration préférée est de 1-6 g. par décilitre, et avec des composés mi- néraux, elle est inférieure. Le milieu contient également des sels minéraux tels que des phosphates, des sels de magnésium, des sels minéraux et des substances facilitant la croissance telles qu'un extrait de levure, un extrait de viande et de vitamines ou des substances riches en vitamines. Ils sont utilisés en concen-
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l'organisme et de la composition du milieu employée.
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bie au moyen d'aération et d'une agitation. On maintient le pH du milieu dans le domaine de 4,5 - 9,0, et de préférence de
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la température préférée étant de 20 - 35[deg.]C.,:avec des souches
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streptomyces thermotolerans. L'activité d'acylation des antibiotiques mcrolides 16-substitués par les organismes selon la présente invention est produite au début de la phase de croissance et est préservée bien que la croissance ait cessé. Une activité spécifique particulièrement élevée de l'acylation du groupe 3-hydroxyle est réalisée dans des cellules de phase de croissance du début à la fin et pour que l'acylation du groupe
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croissance au stade de post-croissance..
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l'acylation avec des cellules sous des conditions associées de
<EMI ID=63.1> la séparation du milieu,- ou avec diverses formes de préparation enzymatique, par exemple, des cellules séchées ou des cellules homogènes, la solution super-natante étant obtenue à partir de l'homogénéisation et des préparations enzymatiques. Une préparation enzymatique immobilisée telle que celle fixée dans un polymère acrylamide est également utilisable. Comme résultats des recherches sur la nature de ladite acylation, on a trouvé que deux systèmes enzymatiques sont indépendamment inclus dans une telle acylation: Ce sont la transférase 3-acyle de macrolide et la transférase 4"-acyle de macrolide, comme les présents inventeurs ont essayé de la nommer, et qui transfèrent des groupes acyles aux groupes 3- et 4"-hydroxyles, respectivement, des antibiotiques macrolides 16-substitués.
Ces systèmes enzymatiques catalysent ledit transfert dans un modèle non spécifique en des termes du type de groupe acyle, cependant, ils ont une préférence respective pour chaque groupe acyle tel que la transférase 3-acyle de macrolide, préféramment transfère le groupe acétyle, le groupe propionyle et le groupe n-butyryle dans cet ordre, tandis que la transférase 4"-acyle de macrolide transfère le groupe isovaléryle, le groupe n-butyryle et le groupe propionyle dans cet ordre.
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cylation de la présente invention inclut les acyles CoA qui servent comme donneurs directs du groupe acyle à incorporer, et les composés précurseurs pour l'acyle CoA à partir duquel on produit l'acyle CoA respectif dans la cellule par métabolisme de cellule. L'acyle CoA de préférence employé inclut l'acétyle
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et leurs composés précurseurs incluent des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide n-buty-
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de sodium et d'ammonium, etc., leurs esters, le méthanol et l'éthanol, etc., et leurs amides. Egalement inclus sont les amino acides tels que l'acide alpha-amino-butyrique, la norvaline, la L-leucine et les céto-acides tels que l'acide alphacétobutyrique et l'acide alpha-céto-valérique.
En général, les acyles CoA sont employés et ajoutés au milieu réactionnel lorsque la réaction est conduite avec un système enzymatique de capacité pauvre pour générer respective-, ment l'acyle CoA à partir de CoA et les précurseurs d'acyle.
En même temps, les composés précurseurs d'acyle sont employés lorsque le système pour la régénération de l'acyle CoA concerné
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de croissance des cellules et analogues. La quantité de donneur d'acyle ajoutée au milieu réactionnel est ordinairement équivalente à ou proche de la proportion molaire du substrat antibiotique dans le cas de l'acyle CoA, et dans des proportions molaires supérieures, par exemple, une proportion molaire de 3-10, dans le cas de composés précurseurs. Des cellules vivantes peuvent produire l'acétyle CoA à partir de source carbonée par
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source carbonée est présente dans la réaction avec les cellules vivantes, l'acétylation ordinairement a lieu par l'emploi de l'acétyle CoA formé de manière endogène. De manière semblable dans un tel système de réaction puisque le propionyle CoA et d'autres CoA son produits en petites quantités plus lointaines que l'acétyle CoA, seulement une petite quantité des produits acylés sont remarqués dans le milieu qui a réagi. Dans le cas où on emploie l'acyle CoAs dans la réaction, lorsque la réaction est complète, on peut récupérer le CoA à partir du milieu réactionnel par des procédés employés conventionnellement pour l'isolation du CoA peuvent être réutilisés pour la synthèse de l'acyle CoA.
Les antibiotiques substrats pour l'acylation sont ajoutés au milieu réactionnel dans des formés telles qu'une solution d'eau, un fluide aqueux légèrement acide et des solvants qui exercent un petit effet contraire sur la réaction, par exemple le méthanol et l'éthanol, ou dans les formes de mélanges de solvants aqueux des suspensions, une boua et des poudres fines. On emploie la concentration des composés antibiotiques dans le mélange réactionnel de 0,1 - 50 g. par litre, de préférence 0,5 - 30 g. par litre.
Les antibiotiques utilisables dans cette invention sont ceux ayant le cycle macrolide 16-substitué, par exemple les leucomycines, les maridomycines, les spiramycines, l'angolamycine, la tylosine, la carbomycine A et la carbomycine:: B, dans lesquels au moins un groupe aux positions 3- et 4"- est un groupe naturellement hydroxtle ou est rendu hydroxyle par des procédés chimiques ou biochimiques.
Les conditions chimiques et physiques dans là réaction <EMI ID=69.1>
de tous les organismes inclus, qui- seraient également des conditions favorables pour les ractions enzymatiques pertinentes pour de telles cellules particulières. La température de réac-
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est souhaitée pour le maintien de la valeur de pH souhaitée dans le cas de réactions avec des types de cellules non croissantes.
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les réactions enzymatiques générales telles que la solution tampon de phosphate, la solution tampon de citrate, etc., sont utilisables, cependant, l'emploi des solutions tampons d'acétate ou celles contenant des groupes acétyle dans leurs compositions devrait être limité seulement aux réactions d'acétylation. La période de réaction est d'ordinaire de 30 minutes à 10 heures.
Les descriptions suivantes illustrent davantage quelques procédés réalisés de manière favorable de l'acylation pour pro- duire des dérivés de tylosine de la présente invention et sont données à titre d'indication et, par conséquent, sans caractère exhaustif, en particulier :
(1) La 4"-n-butyryltylosine.
On fait croître les organismes susmentionnés dans un milieu contenant des concentrations restreintes de sources de carbone et d'azote,. et lorsque les sources de carbone sont presque entièrement consommées, on ajoute la tylosine au bouillon en une quantité excédant l'activité d'acylation de la position 3- des cellules avec le n-butyryle CoA ou ses précurseurs.
On réalise la réaction sous pratiquement les mêmes conditions que dans une culture de cellules. Une partie du substrat, ajoutée est acétylée pour former la 3-acétyltylosine, tandis que l'autre partie reste non acétylée. Dans le milieu, la buty- ! rylation concurrente du groupe 4"-hydroxyle a lieu, résultant
en la formation de 4"-n-butyryltylosine et une petite quantité
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Dans une réaction d'acylation conduite de la même manière' que pour l'exemple (1), l'emploi de isovaléryl CoA ou de ses précurseurs comme donneurs d'acyle provoque la formation de 4"isovaléryltylosine dans le fluide réactionnel.
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Pour la production de 3-acétyltylosine, l'organisme, par exemple le Streptomyces thermotolerans ATCC 11 416, est mis en croissance dans un milieu contenant une quantité riche de sources carbonées et de sources d'azote. Lorsqu'on a atteint la croissance maximum et que les sources carbonées restent toujours en quantité substantielle, on ajoute la tylosine au milieu dans une quantité limitée n'excédant pas l'activité d'acétylation des cellules. On maintient une vigoureuse agitation ainsi qu'une vigoureuse aération pendant que la réaction est accompagnée avec la croissance des cellules et on réalise l'acétylatio par l'emploi de l'acétyle CoA reproduit dans les cellules, donnant la 3-acétyltylosine.
(4) 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine.
i) Les organismes susmentionnés sont mis en croissance ;
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source carbonée et une quantité équilibrée de source d'azote jusqu'à ce que la concentration de la source carbonée décrôisse à un niveau faible, et à ce moment, on ajoute la tylosine ou la 3-acétyl-tylosine en une quantité n'excédant pas la capacité d'acylation des cellules, ensemble avec n-butyryl CoA ou ses composés précurseurs comme donneur de groupe n-butyryle. On réalise la réaction jusqu'à ce que le substrat antibiotique soit complètement acylé et le produit, la 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine, est ensuite isolée.
ii) En employant la 4"-n-butyryltylosine comme substrat, on réalise la réaction dans pratiquement la même manière que dans l'exemple 3) pour la production de 3-acétyltylosine provo-' quant l'acétylation dans le groupe 3-hydroxyle, c'est-à-dire
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(5) 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine.
Pour la production de la 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine, on emploie pratiquement les mêmes procédés que dans l'exemple
(4) i) et ii), dans lesquels l'isovaléryl CoA ou ses composés précurseurs sont employés comme donneurs d'acyle en i) et la 4"-isovaléryltylosine comme substrat en ii).
(6) 3-propionyltylosine.
Pour la production de 3-propionyltylosine, les organismes susmentionnés sont mis en croissance dans un milieu contenant une quantité restreinte de source carbonée et une quantité riche de source d'azote. Lorsque la source de carbone est presque complètement consommée, on ajoute le substrat de tylosine au bouillon de culture en une quantité n'excédant pas la capacité de propionylation des cellules avec les donneurs de propionylation, par exemple le propionyl CoA ou ses précurseurs. On réalise la réaction jusqu'à complète propionylation.
(7) 3-propionyl-4"-n-butyryltylosine.
On peut produire la 3-propionyl-4"-n-butyryltylosine
en deux étapes. Premièrement, on produit la 3-propionyltylosine à partir de la tylosine par le procédé selon l'exemple 6.
Lorsque la première réaction est presque complète, le donneur de n-butyryle, c'est-à-dire le n-butyryl CoA ou son précurseur, et une petite quantité de sources de carbone, si nécessaire, sont ajoutés au milieu et on réalise la réaction de manière aérobie. On obtient ainsi la 3-propionyl-4"-n-butyryltylesine.
Il n'est pas besoin de dire qu'elle peut être également produite en une seule étape en additionnant la 3-propionyltylosine comme substrat au mélange de cellules de culture avec les donneurs d'acyle.
(8) 3-propionyl-4"-isovaléryltylosine.
D'une manière analogue à l'exemple (7), l'emploi d'un donneur d'isovaléryle, par exemple l'isovaléryle CoA ou son composé précurseur, au lieu du donneur n-butyryle, conduit à
la formation de la 3-propionyl-4"-isovaléryltylosine.
Les composés acylés produits à partir des antibiotiques ; macrolides 16-substitués, selon l'invention, peuvent être iso- lés, purifiés et formulés par l'application des procédés géné- ralement employés dans la production de chaque antibiotique macrolide 16-substitué.
Pour l'isolation des dérivés de tylosine, si nécessaire, après une légère acidification, le mélange réactionnel est sé-
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procédés tels que la filtration et la centrifugation. On ajuste ensuite la solution claire pour former un pH neutre à sensible- { ment alcalin et on extrait avec des solvants immiscibles à l'eau, par exemple l'acétate d'éthyle, le toluène et le benzène, qui sont employés conventionnellement pour l'extraction des antibiotiques :.macrolides. Pour l'enlèvement ultérieur des impuretés dérivées du mélange réactionnel, on mélange l'extrait avec de l�eau acidifiée ou une solution tampon pour transférer les dérivés de tylosine dans une couche aqueuse, à laquelle on répète l'extraction précitée par les solvants.
Puisqu'une série de dérivés de tylosine sont présents dans l'extrait, ils sont séparés par divers procédés de différenciation pour les antibiotiques macrolides. Dans le cas où leur coefficient de partition en relation à l'eau ou au solvant organique sont largement différents des procédés, tels qu'une extraction à contre-courant et une e xtraction de séparation sont employées. D'autre part, si les coefficients sont voisins, des méthodes chromatographiques, employant un gel de silice, unrésine échangeuse d'ions, etc., sont appliqués selon le type d'espèces dérivées qui y sont contenues.
Lesdits dérivés sont obtenus sous forme solide par la concentration ordinaire de telles solutions antibiotiques jusqu'à ce qu'elles deviennent sèches ou par cristallisation. Pour la cristallisation des dérivés dans une forme rigoureusement pure, la préparation brute est dissoute dans des solvants organiques tels que l'acétone et le méthanol, et on ajoute ensuite la solution graduellement à un liquide tel que l'eau et le nhexane dans lequel le dérivé est difficilement soluble. On peut également réaliser la;cristallisation avec des solvants tels que l'éther d'éthyle et un mélange d'éther d'éthyle et d'éther d'isopropyle qui montrent une faible solubilité des dérivés. La 3-acétyltylosine est facilement cristallisée à partir du benzène et du toluène. On sèche les cristaux recueillis pour produire une poudre cristalline blanche.
Huit dérivés de tylosine développés par cette invention, c'est-à-dire la 3-acétyltylosine, 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine, 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine, 3-propionyltylosine, 3propionyl-4"-n-butyryltylosine, 3-propionyl-4"-isovaléryltylosine, 4"-n-butyryltylosine et le 4"-isovaléryltylosine sont prouvés pour être de nouveaux composés à partir des résultats des études sur la propriété physico-chimique, leurs structures chimiques, etc. L'analyse physico-chimique et les détermina-fions incluant l'analyse élémentaire, le point de fusion, le
pouvoir rotatoire spécifique, le spectre ultraviolet, le spec-
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<EMI ID=79.1> lyse de spectre de masse ionisé chimiquement. On montre ces
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1) Détection des acides organiques par.chromatographie en
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On prépare; les solutions dans une solution d'éthanol-KOH
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l'analyse.
2) Les cristaux obtenus à partir de solvants en (13) sont employés pour les tests en (1) - (12).
3) Les poids moléculaires sont obtenus en tant que QM à partir du spectre de masse d'ionisation chimique, utilisant
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Le spectre ultraviolet montre une légère différence entre les huit composés comme montré dans les exemples pour la 4"-n-butyryltylosine (figure 1) et la 3-acétyl-4"-n-isovaléryltylosine (figure 2). Les pics de maximum d'absorption résident entre 282-285 nm, qui est le même pour la tylosine, n'indiquant aucun changement de structure dans la fonction cétone et la structure de double liaison du cycle macrolide. Par la détec-
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gazeuse et à partir des résultats analytiques pour le poids moléculaire, on a montré que les composés possèdent une structure de base en commun : la tylosine supportant une ou deux espèces de groupes d'acylation, c'est-à-dire des résidus acétyle, propionyle, n-butyryle et isovaléryle. De plus, après l'analyse des
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tionnées ci-dessus sont confirmées. Les résultats de la spectrométrie de masse par ionisation chimique sont montrés pour la 3-acétyltylosine (figure 19) et la 3-propionyltylosine (figure
20) comme des exemples des dérivés 3-acylés et de la 3-acétyl4"-isovaléryltylosine (figure 21) comme un exemple de produit 3- et 4"-acylé. Des attributions ont été réalisées pour chaque fragment en comparaison du résultat avec la tylosine, qui révè-
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déshydratation et une déacylation à la fois de la tylosine et des dérivés. Il a été ainsi démontré que le groupe acétyle et le groupe propionyle sont liés au cycle macrolide et que le groupe isovaléryle est lié au cycle mycarose. Des résultats d'autres composés qui ne sont pas montrés ici donnent également les mêmes conclusions.
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pour les dérivés 3-acyles et avec la 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine pour les dérivés 3- et 4"- acylés sont montrés dans les figures 22 et 23. Par résultat de la d ésignation des signaux, en comparaison avec ceux de la tylosine, on a de plus déduit que la liaison de groupe acétyle est à la position 3- du cycle macrolide et que la liaison de groupe isovaléryle est à la po- <EMI ID=97.1>
me résultat en montrant la position de la liaison pour le groupe propionyle et le groupe n-butyryle et des structures chimiques identifiées.
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tylosine", en référence à l'exemple 4, la synthèse chimique de l'ester d'acétyle de tylosine par l'emploi de chlorure d'acétyle est décrite, et on doit remarquer que la teneur en poids du groupe acétyle est de 8,22 $6 (en poids) et la valeur du pk est d'environ 5,1 (détermination électrométrique de la solution dans
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Dans l'exemple de référence 5 du même brevet, la synthèse de la tylosine acétylée par l'emploi de l'anhydride acétique
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acétyle étant de 8,91 (en poids) et la valeur de pk environ de
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tylée selon les procédés précités et une comparaison avec les composés correspondants selon la présente invention a été!-faite pour leur valeur de Rf sur un chromatogramme en couche mince en employant le plateau Art 5715 (Merck Co.) et le solvant de développement acétate d'éthyle : éthanol : pyridine (85 : 15 :
2 en volume). '
La 3-acétyltylosine obtenue par cette invention donne une valeur de rf de 0,59, tandis que la tylosine acétylée dans ! l'exemple de référence 4 du brevet donne 0,71 et le produit de
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ce qui indique un mélange de 3 composés. D'autres déterminations:
confirment également des différences entre la 3-acétyltylosine ; de la présente invention et de ses produits chimiques. En d'au-'
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losine obtenue selon la présente invention.
Le spectre antimicrobial des nouveaux dérivés de tyloaine de la présente invention est montré dans le tableau 2 en exposant les concentrations inhibitrices de croissance minimale
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sont supérieures à 400 mg/kg avec tous les composés. Dans des expériences thérapeutiques avec des souris manuellement infec-
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inférieures à 50 mg/kg (p.o.) avec tous les dérivés de tylosine
L'un des avantages particuliers des dérivés de tylosine sur des antibiotiques de macrolides connus est leur activité antimicrobiale distincte contre une bactérie résistant aux médicaments. Les résultats de quelques-uns de ces tests sont inclus dans le tableau 2.
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Les souches marquées x dans le tableau 2 sont des souches résistantes au médicament, isolées à partir de patients, c'est-à-dire le Staphilococcus aureus MS-9610 qui est résistant à la pénicilline, la tétracycline, l'érythromycine, à la leucomycine, à la spiramycine, à la josamycine et à la tylosine, le
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ne, la tétracycline, l'érythromycine, la leucomycine et la ty-
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à l'érythromycine, à l'oléandomycine, à la leucomycine et à la
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acyle, c'est-à-dire la 4"-n-butyryltylosine, la 4"-isovaléryl-
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microbiale particulièrement forte contre un vaste domaine de souches résistantes aux médicaments.
Une autre phase des avantages de ces dérivés de tylosine ett leurs niveaux élevés dans le sang des animaux. Lorsque chacun de cee composés est administré oralement aux souris en une dose de 100 mg. par kg., leur concentration dans le sang est mesurée pour être égale à 5-20 mcg/ml., une valeur sensiblement élevée comparée à celle de la tylosine (inférieure à 1 mcg/ml). En particulier, ces dérivés ayant un résidu n-butyryle ou isovaléryle ont prouvé leur excellente absorption par la voie d'ad. ministration orale. La concentration dans le sang, une heure après l'administration atteint'15-20 mcg/ml. Ces avantages démontrent d'avance l'utilité thérapeutique des composés de la présente invention.
Les nouveaux dérivés de tylosine selon la présente invention sont des composés basiques et forment leurs sels d'addition d'acides non-toxiques avec divers acides organiques tels que l'acide tartrique, l'acide acétique, l'acide propio-
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néraux tels que l'acide hydrochlorique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique. Ces sels sont formés, isolés, purifiés, et formulés par les procédés généralement employés dans la for-:
mation de sels pour les antibiotiques macrolides .16-substitués. Par exemple, le dérivé de tylosine souhaité et l'acide souhaité peuvent être dissous séparément dans un solvant approprié qui a une faible solubilité de sel, c'est-à-dire l'éther d'éthyle et l'acétone ou leurs mélanges et sont ensuite mélangés. La solution est ensuite concentrée, si nécessaire, et refroidie, pour donner les cristaux du sel d'addition d'acide qui.sont recueillis et séchés pour donner une poudre cristalline blanche. Les sels résultants montrent une solubilité supérieure dans ]!eau par rapport aux dérivés de tylosine acylée correspondants qui sont de préférence employés dans une application thérapeutique.
Comme exemples de telles formes de sels d'addition d'a-
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isovaléryltylosine a un point de fusion de 119-122[deg.]C.
A causé de leur activité antimicrobiale particulière, les composés de la présente invention sont utiles comme agents de contrôle d'infections chez les humains et en médecine vétérinaire, et peuvent être employés, par exemple, par le contrôle entéral, parentéral ou topique de maladies infectieuses d'une manière analogue-aux médicaments antibiotiques de macrolide connus.
De plus, à partir de l'utilité particulière de la tylosine comme agents permettant la croissance d'un animal, ces composés de la présente invention peuvent également être employés pour un emploi d'additifs de nourriture dans l'alimentation animale.
Les composés de la présente invention peuvent être employés en mélanges avec des excipients conventionnels et des supports, par exemple des substances supports minérales ou organiques acceptables pharmaceutiquement appropriées pour l'application entérale, parentérale ou topique qui ne réagissent pas d'une manière nuisible à la santé avec les composés actifs.
Des supports acceptables pharmaceutiquement appropriés incluent mais ne se limitent pas à l'eau, à des solutions de sels, des alcools, des huiles végétales, des polyéthylèneglycols, la gélatine, le lactose, l'amilose, le stéarate de magnésium, le talc, l'acide silicique, les paraffines, l'huile de <EMI ID=122.1>
vent être stérilisées et si l'on veut, mélangées avec des agents auxiliaires, par exemple des lubrifiants, des préservateurs, un stabilisateur, des agents mouillants; des émulsifiants, des tampons, des substances de coloration ou odorantes qui ne réagissent pas, de manière nuisible avec les composés actifs.
Les-composés de la présente invention peuvent également .être employés sous forme d'additifs de nourriture tels que des premières nourritures dans des procédés de formulation convention nels. .On préfère l'administration orale, entérale et intra- musculaire, par exemple sous la forme de comprimés, de dragées, de capsules, de sirops et d'élixirs, sous la forme de solutions d'injections ou sous la forma de mélanges d'additifs de nourriture pour des animaux incluant les êtres humains, les animaux familiers, les animaux de laboratoire et la voalaille. Un dosage journalier efficace des composés, comme administré oralement aux êtres humains, comprend de préférence 1 à 20 mg/kg. de poids du corps. La dose peut être administrée seule ou en doses divisées le long de la journée.
Sans élaboration supplémentaire, on pense qu'un spécialiste dans l'art, peut, en employant la description précédente, utiliser la présente invention dans-son é tendue le plus complète. Les modes de réalisation spécifiques préférés suivants sont en conséquence donnés simplement à titre illustratif et ne sauraient en aucun cas limiter la-portée de la présente invention.
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<EMI ID=124.1> myces thermotolerans ATCC 11 416 par une spire de platine. La
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rotatoire. Quinze litres du milieu additionné d'un agent anti-
<EMI ID=126.1> 120[deg.]C. pendant 15 minutes dans un fermenteur vibrant de 30 1. sont inoculés de manière aseptique avec 100 ml. de la culture
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agitation et une aération vigoureuse pendant environ un jour jusqu'à ce que la concentration de glucose dans le bouillon diminue jusqu'à être inférieure à 0,3 g. par décilitre, et à cet instant-là 60 g. de tylosine et 15 g. de DL-norvaline, comme donneur de,%groupe n-butyryle sont mis en suspension ensemble dans un litre d'eau et sont ajoutés au mélange. On continue la réaction pendant environ 6 heures supplémentaires pour compléter la réaction de conversion.
On ajuste le mélange réactionnel ainsi obtenu à un pH de 3,5 avec de l'acide sulfurique dilué et on sépare à partir du mycelia par centrifugation pour donner environ 16 litres incluant le rinçage du liquide super-limpide. On ajuste ce liquide à un pH de 6,0 avec une solution d'hydroxyde de sodium diluée et on extrait à 30[deg.]C. avec 10 litres de benzène. On sépare la couche de benzène contenant la 4"-n-butyryltylosine et
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citrate ayant un pH de 3,5. La couche aqueuse récupérée, après <EMI ID=129.1> de sodium diluée est ajoutée à un litre d'acétate d'éthyle pour extraction, et on concentre l'extrait de solvant et on sèche
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sous vide pour donner environ 5 g. d'une substance de couleur!
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substance sur une colonne de 60 cm. de longueur et de 2,1 cm. de diamètre, remplie avec du Wakogel C�200 (nom commercial de Wako Reagent Chemical Co.) et on élue avec un mélange benzène/ méthanol (97 : 3). On collecte les éluats qui contiennent seu-
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de. Cette substance est ensuite dissoute dans un mélange d'é- ther d'éthyle et d'éther d'isopropyle chauffé (4:1), et on laisse la solution d'éther d'éthyle s'évaporer graduellement pour permettre la formation de cristaux. On obtient environ
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D'autre part, après extraction avec le benzène, la cou-
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15 litres d'acétate d'éthyle à 30*Ce On mélange cet extrait avec 15 litres de solution-tampon de citrate ayant un pH de 3,5 à 5[deg.]C. et on ajuste la couche aqueuse récupérée à un pH de 8,0 avec une solution d'hydroxyde de sodium diluée et on extrait avec 10 litres de benzène à 30[deg.]C. On concentre l'extrait à un volume de 150 ml. sous pression réduite, et on laisse rester à
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par filtration et on sèche ensuite, on obtient 25 g. de cris- taux blancs...
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Exemple 2.
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Une culture et une réaction semblables à celle de l'axe 1 sont réalisées en substituant la L-leucine comme donneur de groupe isovaléryle par la DL-norvaline. A partir de 60 g. de
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taux blancs de 3-acétyltylosine.
(P.F. : 4"-isovaléryltylosine : 155*C.;
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Exemple 3.
Production de 3-acétyltylosine à partir de tylosine.
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On réalise une culture semblable à celle de l'exemple 1 avec la même souche dans laquelle un milieu de culture de com-
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auquel la concentration de glucose a diminué jusqu'à être en- viron de 2 g/dl., on ajoute 30 g. de tartrate de tylosine dans
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vec 5 litres d'acétate d'éthyle à 30*Ce On ajoute l'extrait d'acétate d'éthyle combiné (environ 9 litres) à 10 litres d'une)
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solution d'hydroxyde de sodium diluée, on extrait cette couche
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on concentre l'extrait sous pression réduite à un volume de
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jours, résultant en la formation de cristaux qui sont recueillis et séchés. On obtient environ 16 g* de cristaux blancs de 3-acétyltylosine.
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Exemple 4.
<EMI ID=156.1> wine.
On réalise une culture semblable avec la même couche, le même milieu et des conditions de culture identiques comme dans l'exemple 1. Lorsque le glucose est consommé jusqu'à être à une
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et 15 g. de BL-norvaline sous forme de poudre à environ 15 1. de bouillon dans un récipient fermenteur. Après 8 heures de
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3,5 à l'aide d'acide sulfurique dilué.
Après centrifugation de la masse de cellules, on ajuste
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droxyde de sodium diluée- et on extrait deux fois avec 4 litres d'acétate d'éthyle à 30[deg.]C. On concentre l'extrait d'environ 7,5 litres de la couche d'acétate d'éthyle à un litre sous vide,
à laquelle on mélange 500 ml. de solution-tampon de citrate d'un pH de 3,5 à 5[deg.]C. pour l'extraction des dérivés de tylosine formés dans une couche aqueuse'.
On répète cette extraction et on ajuste la couche aqueu-
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de sodium diluée:et on extrait deux fois avec 300 ml. d'acétate d'éthyle à 30*0" On concentre cet extrait à sec pour obtenir une poudre de couleur brun-jaunâtre. On passe cette poudre sur
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mètre et de 60 cm. de'longueur et on réalise l'élution avec un mélange de benzène = méthanol (97 3) de façon à collecter les fractions contenant la 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine. Après l'évaporation du solvant, on dissout le résidu dans une petite quantité d'éther d'éthyle, en chauffant, et ensuite en refroidissant, on obtient et on collecte des cristaux et on sèche pour récupérer 530 mg. de cristaux de 3-acétyl-4n-n-butyryltylosine.
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tyltylosine..
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même souche, dans laquelle on substitue la tylosine comme sub-
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blancs de 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine.
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Exemple 6.
Production de 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine à partir de 4"-n-
butyryltylosine.
On réalise la réaction de conversion avec la même souche' d'une manière analogue à l'exemple 3 (3-acétylation), dans la-
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environ 250 mg. de cristaux blancs de 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine.
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Exemple 7.
Production de 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine à partir de tyloBine.
On réalise la réaction de conversion d'une manière analogue à l'exemple 4 avec la même scuche, dans laquelle on emploie la L-leucine en substitution de la DL-norvaline de l'ex. 4 comme donneur de groupe isovaléryle. On obtient environ 400
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tirade 3 g. de tylosine.
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<EMI ID=172.1>
<EMI ID=173.1>
tyltylosine.
On réalise la réaction de conversion d'une manière analogue à l'exemple 7, avec la même souche, dans laquelle on emploie 1,5 g. de 3-acétyltylosine comme substrat au lieu de tylosine. On obtient environ 500 mg. de cristaux blancs de 3-
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Exemple 9.
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On réalise la culture et la réaction d'une manière analogue à l'exemple 3 avec la même souche en employant 500 mg. de 4"-isovâléryltylosine comme substrat, et on récupère le produit d'une manière analogue à l'exemple 4. On obtient 280 mg. de
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<EMI ID=178.1>
Exemple 10.
Production de 3-propionyltylosine à partir de tylosine.
On conduit une culture semblable à celle de l'exemple 1 avec la même souche, le même milieu de grain et-les mêmes conditions pour la culture. Quinze litres d'un milieu principal consistant en 3 g. par dl. de peptone, 1 g. par dl. de glucose,
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est stérilisé à 120[deg.]C. pendant 15 minutes.dans un fermenteur incliné (volume total 30 litres) et. est refroidi. On inocule
100 ml. de culture de semence au milieu principal et on réalise la culture pendant 18 heures jusqu'à ce que le glucose ajouté soit pratiquement consommé et le pH atteigne 7,5, et ensuite
on ajoute 3 g. de tylosine et 30 g. d'acide t>( -amino butyrique au bouillon pour une réaction supplémentaire pendant encore
6 heures sous les mêmes conditions que la culture. On enlève
le mélange réactionnel du fermenteur incliné, et on isole le produit et on récupère selon les procédés employés dans l'ex. 4, pour obtenir environ 850 mg. de cristaux blancs de 3-propionyltylosine.
(P.F. 3-propionyltylosine : 1Ô9[deg.]C.)
Exemple 11.
Production de 3-propionyl-4"-n-butyryltylosine à partir de
tylosine.
On réalise une culture semblable avec la même souche,
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pour la culture comme dans l'exemple 10. On réalise la culture jusqu'à ce que le glucose ajouté soit complètement consommé. et
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propionyle au bouillon (15 litres) de façon à réaliser la propionylation d'un groupe hydroxyle à la position 3- dans les marnes conditions que pour la culture.
Lorsque la.propionylationest complète, 4 heures après
<EMI ID=184.1>
30 g. de DL-norvaline comme précurseur de groupe donneur de nbutyryle et on réalise ensuite la réaction sous les mêmes conditions décrites précédemment, pendant 6 heures supplémentaires,
<EMI ID=185.1>
tyrylé. On isole le produit à partir du milieu réactionnel et on récupère selon les procédés employés dans l'exemple 4 pour
<EMI ID=186.1>
butyryltylosine.
(P.F. 3-propionyl-4"-n-nutyryltylosine : 1Ô5[deg.]C.)
Exemple 12.
Production de 3-propionyl-4"-n-butyryltylosine à partir de 3-
<EMI ID=187.1>
On réalise des procédés semblables-à ceux de l'exemple
11 avec la même souche en substituant 500 mg. de 3-propionyl-
<EMI ID=188.1>
tyrique avec oaissicn de la propionylation d'un groupe hydroxyle à la position 3- et ensuite, un groupe hydroxyle à la position 4"- est n-butyrylé pour obtenir 180 mg. de cristaux blancs de
<EMI ID=189.1>
<EMI ID=190.1>
Exemple 13.
Production de 3-propionyl-4"-n-butyryltylosine à partir de 4"-
<EMI ID=191.1>
On ajoute 500 mg. de 4"-n-butyryltylosine comme substrat. On propionyle un groupe hydroxyle à la position 3- selon les procédés employés dans l'exemple 10, et on isçle le produit
et on récupère selon les procédés employés dans l'exemple 4 pour <EMI ID=192.1>
4"-n-butyryltylosine.
(p.f. 3-propionyl-4"-n-butyryltylosine : 1$5[deg.]C.)
Exemple 14.
Production de 3-propionyl-4"-isovaléryltylosine à partir de
<EMI ID=193.1>
On utilise des procédés semblables à ceux employés dans l'exemple 11 avec la:même souche en substituant la L-leucine comme précurseur de groupe isovaléryle à la DL-norvaline comme précurseur n-butyryle et un groupe hydroxyle à la position 4"-
<EMI ID=194.1>
<EMI ID=195.1>
(P.F. 3-propionyl-4n-isovaléryltylôsine : 181[deg.]C.)
Exemple 15.
Production de 3-propionyl-4"-isovaléryltylosine à partir de
<EMI ID=196.1>
3-propionyltylosine.
On réalise une culture analogue à celle de l'exemple 10 avec la même souche, le même milieu et les marnes conditions pour la culture.
On réalise la culture jusqu'à ce que la concentration de glucose dans le milieu diminue jusqu'à être inférieure à 0,5 g. par dl., et ensuite on ajoute 1 g. de 3-propionyltylosine et
20 g. de L-leucine au bouillon (environ 15 litres) pour réaliser la réaction pendant 6 heures dans les mêmes conditions que lors de la culture. On isole le produit et on récupère selon
<EMI ID=197.1>
cristaux blancs de 3-propionyl-4"-isovaléryltylosine.
<EMI ID=198.1>
Exemple 16.
Production de 3-propionyl-4"-isovaléryltylosirie à partir de
<EMI ID=199.1>
<EMI ID=200.1>
strat et un groupe hydroxyle à la position 3- est propionylé selon les procédés employés dans l'exemple 10. On isole le produit et on récupère selon les procédés employés dans l'ex. 4 pour obtenir environ 85 mg, de cristaux blancs de 3-propionyl- <EMI ID=201.1>
On analyse respectivement les dérivés de tylosine obtenus comme dans les exemples 1 - 16 et on identifie les structu-
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tique, analyse élémentaire, chromatographie en phase gazeuse organique libéré par l'hydrolyse alcaline, etc., et si nécessaire, on compare les composés et on identifie respectivement par détermination du.point de fusion mélangé et par chromatographie sur couche mince comme dans la figure 24, dans
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des dérivés de tylosine dans l'ordre des dérivés qui apparais-
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On réalise la culture et la réaction de manière analogue, à celle de l'expérience 1. On place 100 ml. de chaque milieu dans chacun des 16 flacons de volume de 500 ml. respectivement stérilisés et on réalise la culture pendant 2 jours dé la même manière que la culture de la semence dans les exemples jusqu'à ce que le glucose ajouté soit complètement consommé. On.ajoute
100 mcg/ml. de tylosine ou de ses dérivés aux substrats à cha- cun des flacons et ensuite on ajoute dans chacun 0,1 g/dl. des substances montrées dans le tableau 3 comme précurseur de groupe
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mes conditions que pour la culture. On ajuste les mélanges réac;
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avec du benzène pour analyser par chromatographie sur couche mince dans les expériences. On identifie les produits'en les ; comparant aux dérivés authentiques de tylosine, en employant des techniques de développement parallèles et de développement de taches doubles: On montre l'interrelation entre le substrat,' les précurseurs de groupe acyle et les produits dans le ta-
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duits.
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On emploie les micro-organismes Streptomyces thermotolerans ATCC 11 416, Streptomyces fungicidicus subsp. espinomyceticus ATCC 21 574, Streptomyces hydroscopicua ATCC 21 5$2 et Streptomyces mycarofaciens ATCC 21 454 respectivement et on réalise la culture et la réaction comme suit : On emploie le même milieu analogue à celui de l'exemple 17. On cultive le.Strepto-
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filtre 300 ml. du bouillon (3 flacons) pour collecter les cellules vivantes, qui sont mises en suspension dans une solutiontampon de tris HC1 (pH 7,2, M/10) et on broie les cellules par une presse "française". Chaque 3 ml. de la solution-tampon contenant les cellules broyées sont placés dans des fermenteurs de
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par ml. de tylosine ou de ses dérivés comme substrats et ensuite on ajoute diverses sortes de acyle CoA mentionnés dans le
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légèrement pendant une réaction d'une heure. On termine la réac. tion en ajoutant une solution-tampon de glycine-NaOH. On extrait les produits avec du benzène et on identifie de la même manière que dans l'expérience. On obtient des résultats semblables avec les micro-organismes décrits précédemment..
On montre l'interrelation entre les substrats, l'acyle
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i <EMI ID=218.1>
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Exemple 19'
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On dissout 1 g. de 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine dans
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à 40 ml. et on maintiant à 5[deg.]C. pendant un jour.
On collecte les cristaux de 'la solution par filtration et on sèche pour donner 0,9 g. de cristaux blancs de tartrate de 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine.
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Exemple 20.
Production d'hydrochlorure de 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine.
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chlorique concentré dans 30 ml. d'un mélange d'éther d'éthyle et d'acétone. On mélange les deux solutions et on refroidit dans de la glace et on maintient à 5[deg.]C. pendant un jour. On recueille les cristaux à partir de la solution mélangée par
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d'hydrochlorure de 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine.
(P.F. : 129[deg.]C. - 133[deg.]C.)
Exemple 21.
On prépare deux sortes de comprimés (A et-B) appropriés pour l'administration orale et contenant les ingrédients suivants par des techniques de formation de comprimés conventionnelles.
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