"Procédé de purification d'héparine".
La présente invention concerne un procédé de purification d'héparine, ce procédé étant caractérisé en ce que l'héparine obtenue est très pure et possède une haute activité spécifique.
Depuis plusieurs dizaines d'années, l'héparine
a été utilisée dans le traitement médical. Elle est un des anticoagulants bien connus et elle est largement utilisée, notamment pour la prévention de la thrombose. L'héparine est un polysaccharide sulfaté que l'on peut préparer à partir de poumons ou de
mucus d'intestins d'animaux par des procédés relativement compliqués. Les préparations d'héparine utilisées actuellement en clinique contiennent une matière présentant une large variété de dimensions
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L'activité spécifique est habituellement d'environ 130 unités/mg. Dès lors, les préparations actuellement disponibles dans le commerce sont très hétérogènes. La fréquence des effets secondaires lors de la thérapie à l'héparine est assez faible mais, lorsque ces effets secondaires se manifestent, ils posent très souvent de graves problèmes. Certains de ces effets secondaires sont probablement provoqués par les impuretés contenues dans la préparation d'héparine.
En conséquence, il y a de bonnes raisons pour
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effectuées sur l'antithrombine, qui est un co-facteur de l'héparine, on a examiné les possibilités de fixer la protéine sur une gangue. De façon étonnante, on a constaté que l'antithrombine fixée à une gangue pouvait fixer spécifiquement la fraction moléculaire de l'héparine utilisée en thérapie et agissant comme support de l'effet de l'héparine, laquelle est cliniquement intéressante et constitue un prophylactique de la thrombose. En choisissant judicieusement
<EMI ID=3.1> héparine extraordinairement pure. Les activités spécifiques atteintes sont de 200-270 unités/mg contre environ 130 unités/mg de la matière de départ. La répartition des poids moléculaires dans l'héparine purifiée spécifiquement est de loin plus limitée que dans la matière primaire. Outre l'antithrombine qui est un cofacteur de l'héparine, on peut également utiliser avantageusement d'autres protéines fixant l'héparine, par exemple, l'inhibiteur d'inter-a-trypsine d'un poids moléculaire d'environ 150.000, que l'on obtient au cours de l'isolation du facteur de coagulation IX
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obtient de l'héparine d'une qualité optimum avec des activités spécifiques allant jusqu'à 270 unités/mg.
Dès lors, on peut préparer de l'héparine ayant un très haut degré de pureté et d'activité spécifique par le procédé de l'invention qui est un procédé simple et applicable à une utilisation industrielle pour la préparation d'héparine ayant une activité spécifique supérieure à celle obtenue avec des préparations existantes. La détermination de l'activité spécifique de l'héparine a été effectuée comme décrit par Denson et Bonnar (1975, "Brit, J. Haematol.", 30, page 139).
Les exemples suivants illustrent l'invention, EXEMPLE 1
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Procédé en colonne.
On prépare le gel adsorbant de la maniée suivant -3:
Activation
On dissout 3 g de BrCN dans 30 ml d'eau distillée. A la solution de BrCN, on ajoute 50 ml d'agarose décanté ("Sepharose 4B", marque commerciale déposée de "Pharmacia Fine Chemicals", Uppsala, Suède). Tout en agitant, on refroidit le mélange au bain
<EMI ID=6.1> maintient ce pH constant pendant 10 minutes. Ensuite, on lave le
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Liaison
Au gel obtenu ci-dessus, on ajoute 200 mg d'antithrombine purifiée comme décrit par Miller-Andersson et al (1974,
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à la température ambiante pendant une nuit, puis on la lave soigneusement avec des tampons à haute concentration ionique avec des pH alternativement élevés et faibles.
Purification d'héparine
On charge le gel adsorbant contenant de l'antithrombine fixée à une gangue dans une colonne et on l'équilibre
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tion ainsi obtenue dans la colonne. Ensuite, on lave le gel avec le tampon précité, puis on désorbe l'héparine adsorbée avec un
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rine éluée par filtration sur gel dans de l'eau distillée et dans
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Des études de répartition des poids moléculaires démontrent que cette héparine présente une répartition de poids moléculaires beaucoup plus limitée que l'héparine primaire.
On effectue l'analyse des hydrates de carbone
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EXEMPLE 2
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Procédé discontinu.
On prépare la gangue d'antithrombine comme décrit à l'exemple 1.
Purification d'héparine
On dissout 500 mg d'héparine (Vitrum, activité spécifique : 130 unités/mg) dans 300 ml d'un tampon Tris 0�05M�
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300 ml d'antithrombine décantée et fixée à une gangue, puis on sèche par essorage. On ajoute l'adsorbant à la solution d'héparine que l'on agite ensuite à la température ambiante pendant une heure.
On sèche le gel par essorage sur un filtre en verre et on le lava avec 10 x 200 ml d'un tampon Tris 0,05M, NaCl 0,15M, pH : 7,4.
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éluée moyennant un séchage par évaporation de glace. On élimine
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l'eau distillée, puis on sèche l'héparine par évaporation de glace.
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EXEMPLE 3
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Préparation du gel adsorbant
Au cours de la purification du facteur de coagu-
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constituant la protéine de fixation d'héparine. Son poids moléculaire est d'environ 150.000. On dissout 250 mg de cette protéine
<EMI ID=24.1> déposée), décantée et activée avec du BrCN conformément au procédé décrit à l'exemple 1. On agite modérément la suspension de gel/ protéine à la température ambiante pendant une nuit. Ensuite, on lave le gel comme décrit à l'exemple 1.
Purification d'héparine
On charge, dans une colonne, le gel adsorbant contenant la protéine fixée à une gangue. On dissout 300 mg
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On lave le gel avec le tampon précité, puis on désorbe l'héparine
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le sel de l'héparine par filtration sur gel de "Sephadex G 25<1><1> dans de l'eau distillée, puis on sèche l'héparine par évaporation de glace. L'activité spécifique de l'héparine purifiée est de 230 unités/%-.
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'héparine ayant une haute activité spécifique, caractérisé en ce que, comme adsorbants, on utilise des protéines de plasma fixant l'héparine et fixées à une gangue.