"Compositions antibiotiques et leur utilisation"
La présente invention est relative à une composition
pharmaceutique contenant, à titre d'ingrédient actif, l'antibiotique
C-15003, ainsi qu'à un procédé de traitement des êtres humains et
animaux à sang chaud présentant une ou plusieurs tumeurs actives,
au moyen de cet antibiotique C-15003.
Depuis de nombreuses années, on effectue des recherches
pour trouver des substances qui, lors de leur administration à des êtres humains ou des animaux à sang chaud présentant des tumeurs, prolongeront la durée d'existence de ceux-ci.
On a à présent constaté que le nouvel antibiotique C-
15003 pouvait atteindre cet objectif.
L'antibiotique C-15003 est un nouveau composé répondant à la structure chimique suivante:
<EMI ID=1.1>
Dans le contexte de la présente invention, l'expression "antibiotique C-15003" englobe d une manière générale les trois composés répondant à la formule générale (I) précédente, ou bien elle se rapporte à un mélange de deux ou trois de ces composés ou
<EMI ID=2.1>
à la formule générale (I), le composé dans lequel R représente le
groupe
<EMI ID=3.1>
est appelé "antibiotique C-15003 P-3", ou d'une
manière plus abrégée "C-15003 P-3"; le composé dans lequel R représente le radical -CO-CH2-CH2-CH3 est appelé "antibiotique C-
15003 P-3'", ou, d'une manière plus abrégée, "C-15003 P-3'"; le
composé dans lequel R représente le radical
<EMI ID=4.1>
est ap-
pelé "antibiotique C-15003 P-4" ou, d'une manière plus abrégée, "C-15003 P-4".
L'antibiotique C-15003 peut être obtenu, par exemple, en cultivant un micro-organisme appartenant au genre Nocardia et qui est capable de produire de l'antibiotique C-15003, dans un mi-lieu de culture contenant des sources de carbone assimilables et des sources azotées digestibles jusqu'à ce que l'antibiotique s'y soit pratiquement accumulé, et à récupérer l'antibiotique.
A titre d'exemple de souche de micro-organisme productrice d'antibiotique C-15003, on peut citer la souche d'Actinomycète n[deg.] C-15003, que l'on a isolée à partir de sol et d'autres échantillons lors de l'examen des micro-organismes producteurs d'antibiotiques.
Les caractéristiques microbiologiques de la souche
n[deg.] C-15003 sont étudiées par des méthodes analogues à celles pro-
<EMI ID=5.1>
tic Bacteriology 16, 313-340 (1966)]. Les résultats de ces observations à 28[deg.]C pendant une période de 21 jours sont les suivants:
1) Caractéristiques morphologiques:
Le mycélium végétatif s'étend bien et se développe sous la forme de ramifications, à la fois sur de l'agar et en milieu liquide. Un grand nombre des hyphes mesurent entre 0,8 et 1,2
<EMI ID=6.1>
fragments ressemblant à des bactéries sous forme de baguettes ou à de courtes longueurs d'hyphes ramifiées. La souche donne une bonne croissance sur divers milieux taxonomiques, le mycélium aé- rien étant superposé au mycélium végétatif, bien qu'elle forme fré-
<EMI ID=7.1>
ou en forme de spirale, lâche étant rencontrée en quelques occasions. Un examen au microscope de cultures agées révèle que seu- lement dans quelques cas les cellules du type conidies apparaissent sous forme de chaînes, tandis que les suspensions cellulaires obtenues à partir de la surface de ces cultures, ainsi qu'on a pu le
<EMI ID=8.1> <EMI ID=9.1>
Des examens au microscope électronique ont montré que ces corps présentent des surfaces lisses.
2) Constituants des cellules:
La souche est cultivée, tout en étant soumise à une agitation à secousses, dans un milieu ISP n[deg.] 1 à 28[deg.]C pendant 66 à 90 heures, période après laquelle les cellules sont recueillies et rincées. On examine en appliquant la méthode de B. Becker et Co. [Applied Microbiology 12, 421 (1964)] et la méthode de M. P. Lechevalier (Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 134
(1968)], les cellules entières dont question ci-dessus pour ce qui est de la composition de leur acide diaminopimélique et de leur sucre. On constate que le premier de ces constituants est sous la forme méso, tandis qu'on décèle des taches qui correspondent au galactose et à l'arabinose.
3) Caractéristiques sur des milieux taxonomiques:
La souche montre une bonne croissance sur divers mi- lieux, le mycélium végétatif étant'incolore à jaune pale lors des phases initiales de culture et brun jaunatre clair à brun jaunâtre lors des phases ultérieures. La souche produit des pigments solubles, allant de la couleur jaune à brun jaunâtre, dans divers milieux taxonomiques. Le mycélium aérien est pulvérulent et donne généralement lieu à une croissance modérée, allant du blanc au jaune ou au brun jaunâtre clair. Les caractéristiques de la souche dans divers milieux taxonomiques sont données dans le Tableau 1.
Tableau 1 : caractéristiques de la souche n[deg.] C-15003 en cul-ture sur divers milieux taxonomiques
(A) Agar au sucrose et nitrate :
<EMI ID=10.1>
ambre (3 le) , formation de corps du type corémium
Mycélium aérien (MA): peu développé, blanc Pigment soluble (PS): aucun ou brun jaunatre pale
(B) Agar au glycérol et nitrate :
<EMI ID=11.1>
corémium
MA: modérée, blanc
PS: aucun
(C) Agar au glucose et à l'asparagine :
C: modérée, Souci Brite (3 pa)* à jaune Brite (2 pa)*.
MA: peu développé, blanc
PS: jaune Brite (2 pa)*
(D) Agar au glycérol et à l'asparagine :
<EMI ID=12.1>
corémium
MA: peu développé, blanc
PS: aucun
(E) Agar à l'amidon :
<EMI ID=13.1>
PS: aucun
(F) Agar nutritif
<EMI ID=14.1>
tion de corps du type corémium
MA: peu développé, blanc
PS: aucun (G) Agar au malate de.calcium :
<EMI ID=15.1>
corps du type corémium
MA: modérée, blanc à Ivoire Lt (2 ca)*
PS: aucun
(H) Agar à l'extrait de levure - extrait de malt
C: modérée, ambre (3 le)* à jaune Brite (3 la)*, formation de
corps du type corémium
<EMI ID=16.1>
PS: aucun
(I) Agar à la farine d'avoine :
<EMI ID=17.1>
tion de corps du type corémium
MA: peu développé, blanc à jaune clair
PS: aucun
(J) Agar à la peptone-extrait de levure - fer
C: modérée, jaune colonial (2 ga)
MA: aucun
PS: jaune colonial (2 ga)
(K) Agar à la tyrosine
<EMI ID=18.1>
tion de corps du type corémium
<EMI ID=19.1>
PS: Camel (3 ie)*
Codes de couleur suivant le Color H�rmony Manual, 4ième éd.
(Container Corporation of America, 1958).
4) Caractéristiques physiologiques
Les caractéristiques physiologiques de la souche sont indiquées au tableau 2. Gamme de températures pour la croissance:
<EMI ID=20.1>
bonne croissance aérienne sur de l'agar (ISP n[deg.] 2) est de 20 à 35[deg.]C.
Tableau 2 : caractéristiques physiologiques de la souche n[deg.]
C-15003
Gamme de températures pour la croissance : 12 à 38[deg.]C.
Gamme de températures pour la croissance aérienne : 20 à 35[deg.]C Liquéfaction de la gélatine : positive
Hydrolyse de l'amidon : positive
Réduction des nitrates : positive
Peptonisation du lait : positive
Coagulation du lait : négative
Décomposition de la caséine : positive
Production de pigments mélanotdes :
<EMI ID=21.1>
positive (agar à la tyrosine)
Décomposition de la tyrosine : positive
Décomposition de la xanthine : négative
Décomposition de l'hypoxanthine : négative
Tolérance au lysozyme : positive
Tolérance au chlorure de sodium : 2%
5) Utilisation de diverses sources de carbone L'utilisation de diverses sources de carbone est étudiée en utilisant un milieu décrit par Pridham & Gottlieb [journal of Bacteriology 56, 107 (1948)] et un milieu de base répondant à la même composition auquel on a ajouté 0,1% d'extrait de levure. Le spectre obtenu est indiqué au Tableau 3.
Tableau 3 : utilisation de sources de carbone par la souche
n[deg.] C-15003
<EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
milieu de base avec 0,1% d'extrait de levure
Note: +++: croissance abondante
++: bonne croissance
+: croissance
+:faible croissance
-:pas de croissance 6) Autres caractéristiques:
Les cellules furent recueillies par le procédé décrit précédemment en 2) et de l'ADN fut préparé par un procédé analogue à celui de J. Marmur et Col. (Journal of Molecular Biology 3, 208, 1961). La teneur en G-C (Guanine-Cytosine) de l'ADN était de l'ordre de 71 moles 96.
La coloration du gramme du mycélium végétatif de cette souche était positive.
Les caractéristiques précédentes de la souche n[deg.] C-15003 furent ensuite comparées aux publications de S.A. Waksman "The Actinomycetes vol. 2" (Williams and Wilkins Co., 1961), et de R. E. Buchanan et N.E. Gibbons, "Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology, 8ème édition, 1974", ainsi qu'à d'autres publications.
Bien qu'on pense que cette souche appartient au groupe III du genre Nocardia, la possibilité de trouver une espèce quelconque présentant les caractéristiques décrites jusqu'ici parmi les souches connues mène à la conclusion que cette souche représente une nouvelle espèce de micro-organisme.
La souche n[deg.] C-15003 de la présente invention a été déposée à l'Institut de la Recherche sur les Fermentations, Agency of Industrial Science and Technology (FERM) sous le numéro de col- lection 3992, à l'Institut de la Fermentation, Osaka (IFO) sous
le numéro de collection IFO 13726 et à l'American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, U.S.A., sous le n[deg.] de collection 31281.
Bien que la souche n[deg.] C-15003 soit une nouvelle espèce du genre Nocardia, ainsi qu'on vient de le mentionner, elle est susceptible, comme le sont d'une manière générale les micro-organismes, de subir des modifications et des mutations, soit spontanément soit sous l'influence d'un mutagène.
A titre d'exemple, les nombreuses variantes de la souche qui peuvent être obtenues par irradiation avec des rayons X, des rayons gamma, de la lumière ultraviolette, etc, par un isolement monocellulaire, par une culture sur des milieux contenant diverses substances chimiques, ou par tout autre traitement mutagène, ainsi que les mutants provenant spontanément de la souche, ne doivent pas être considérés comme représentant une autre espèce distincte quelconque et, par conséquent, on peut invariablement 'utiliser pour les besoins de la présente invention l'un quelconque de ces mutants et variantes capables de produire du C-15003 P-3, P-3' et/ou P-4.
Par exemple, le fait de soumettre la souche n* C-15003 à divers traitements mutagènes permet d'obtenir des mutants pratiquement dépourvus de la propriété de produire des pigments solubles, des mutants avec des mycéliums de support qui sont incolore, vert jaunâtre, brun rougeatre ou rouge orange, des mutants dont les hyphes sont prêts à se fragmenter sous la forme d'éléments bacillaires ou de fragments d'hyphes courts ramifiés, ainsi que des mutants avec un mycélium aérien blanc abondant ou pratiquement sans mycélium aérien.
Le milieu utilisé pour cultiver une souche productrice d'antibiotique C-15003 de ce type peut être un milieu liquide
ou solide quelconque, pour autant qu'il contienne des agents nutritifs que la souche peut utiliser, bien qu'il soit préférable d'utiliser un milieu liquide pour des essais de production intense. Le milieu peut comprendre des sources de carbone et d'azote que la sou- ' che n[deg.] C-15003 peut assimiler et digérer, des matières inorganiques,
des agents nutritifs à l'état de traces, etc. Comme exemple de sources de carbone de ce type, on peut mentionner le glucose, le
lactose, le sucrose, le maltose, la dextrine, l'amidon, le glycé-
<EMI ID=24.1>
(par exemple l'huile de soja, l'huile de lard, l'huile de poulet, etc). Les sources d'azote peuvent, par exemple, être un extrait de viande, un extrait de levure, de la levure desséchée, de la farine de soja, de la liqueur de macération de maïs, de la peptone, de la farine de graines de coton, des mélasses usées, de l'urée, des sels d'ammonium (par exemple le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, etc),
Le milieu peut contenir en outre des sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium, etc, des sels de fer, de manganèse, de . zinc, de cobalt, de nickel, etc, des sels d'acide phosphorique , d'acide borique, etc, ainsi que des sels d'acide organique tels que des acétates et des propionates. De plus, le milieu peut contenir, sous la forme de compléments, divers amino-acides (par exemple acide glutamique, acide aspartique, alanine, glycine, lysine, méthionine, proline, etc), des peptides (par exemple dipeptides,
<EMI ID=25.1>
pyrimidine et leurs dérivés), etc. En ce qui concerne l'ajustement du pH du milieu, on peut ajouter un acide inorganique ou organique, un alcali, une substance tampon, etc. Des quantités appropriées d'huiles, de graisses, d'agents tensio-actifs, etc, peuvent également être ajoutées comme antimousses.
La culture peut erre réalisée sous des conditions stationnaires, de secousses ou sous des conditions aérobies immergées, ou bien encore sous l'une quelconque des autres conditions de culture. Pour ce qui est des essais de production à grande échelle, il est préférable d'utiliser une culture aérobie immergée. Bien que les conditions de culture dépendent évidemment de l'état et de la composition du milieu, ainsi que de la souche, de la méthode de culture et d'autres facteurs, il est normalement préférable de réaliser l'incubation à 20-35[deg.]C avec un pH initial d'environ 7,0, ou
<EMI ID=26.1>
re particulièrement appropriée pour un stade de culture intermédiaire, avec un pH initial de 6,5 à 7,5. Bien que la période d'incubation puisse également varier en fonction des mêmes facteurs que ceux qui ont été mentionnés précédemment, il est souhaitable de poursuivre l'incubation jusqu'à ce que le titre de la substance antibiotique désiré soit au maximum. Dans le cas d'une culture à secousses ou d'une culture immergée aérobie en milieu liquide, la période requise est normalement de l'ordre de 48 à 144 heures.
La puissance de l'antibiotique est examinée avec Tetrahymena pyriformis W, à titre de micro-organisme d'essai. C'est ainsi que l'on a fait croître le micro-organisme dont question ci-
<EMI ID=27.1>
1 g d'extrait de levure (Difco), 2 g de glucose, 1000 ml d'eau distillée et 10 ml de tampon phosphate 1M (pH de 7,0)J à 28[deg.]C pendant
44 à 48 heures, et que l'on a déterminé la puissance de l'antibiotique par la méthode de dilution en série avec un contrôle de la turbidité de la croissance et de l'effet sur des cellules tumorales ascitiques, et au moyen d'une chromatographie sur couche mince, qui sera décrite ci-après.
Les nouveaux antibiotiques C-15003 P-3, P-3' et/ou P-4 sont obtenus et s'accumulent dans le bouillon de fermentation résultant, par voie extracellulaire et intracellulaire.
Ces substances ont également été décelées par la chromatographie sur couche mince. C'est ainsi que l'on sépare le
d'
bouillon de fermentation sous forme de cellules et/un filtrat par filtration ou centrifugation et que l'on extrait le filtrat avec le même volume d'acétate d'éthyle. On ajoute aux cellules la même quarttité d'acétone (70%) et d'eau au filtrat et, après une agitation de
1 heure à 20[deg.]C, on filtre la suspension. On sépare l'acétone du filtrat et on extrait le filtrat aqueux résultant avec de l'acétate d'éthyle. Chacun des extraits est concentré à 1/100 de son volume et est soumis à une chromatographie en couche mince sur une plaque de verre avec gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne,,
<EMI ID=28.1>
méthanol: 9/1). On détermine la puissance en fonction de l'intensité des taches décelées par irradiation avec de la lumière ultravio- lette à 2537 Angstroems.
Etant donné que les C-15003 P-3, P-3' et/ou P-4, que
l'on obtient ainsi dans le bouillon de fermentation, sont des substances neutres lipophyles, on peut les récupérer d'une maniè-
<EMI ID=29.1>
que l'on utilise normalement pour la récolte de métabolites microbiens de ce type. Par exemple, on peut utiliser une méthode qui utilise la différence de solubilité entre l'antibiotique et les impuretés, des moyens qui font appel à l'affinité adsorbante de divers adsorbants tels que du carbone activé, des résines non ioni- que s macroporeuses, du gel de silice, de l'alumine, etc., une mé- 'thode pour séparer les impuretés au moyen de résines échangeuses ; d'ions, etc., ces différentes méthodes étant appliquées isolément, !en combinaison et ce de manière appropriée, ou bien à plusieurs reprises.
Puisque, ainsi qu'on l'a déjà mentionné, les C-15003
<EMI ID=30.1>
cellules, les antibiotiques sont séparés et purifiés au moyen d'un tel adsorbant, si l'on en utilise, soit directement soit après une extraction au solvant dans le cas du filtrat, ou après une extraction au solvant dans le cas de cellules microbiennes. L'extraction au solvant peut être réalisée par l'une ou l'autre des méthodes suivantes, ou bien par d'autres méthodes, comme, par exemple,
(1) une extraction au solvant à partir du bouillon de culture avant la séparation des cellules et (2) une extraction au solvant des cellules et du filtrat obtenus par un procédé de filtration, de centrifugation ou par tout autre procédé. Pour extraire le filtrat et les cellules indépendamment, on peut utiliser avantageusement le procédé suivant.
Les solvants convenant pour l'extraction du filtrat sont des solvants organiques non miscibles dans l'eau, tels que des esters d'acides gras, par exemple l'acétate d'éthyle et l'acétate d'amyle, des alcools, par exemple le butanol, des hydrocarbures halogénés, par exemple le chloroforme, et des cétones, par exemple la méthyl isobutyl cétone. L'extraction est réalisée à un pH proche de la neutralité et, de préférence, on extrait le fluide de culture préalablement ajusté à pH 7 avec de l'acétate d'éthyle.
On lave l'extrait avec de l'eau et on le concentre sous pression réduite. Ensuite, on ajoute un solvant non polaire tel que de l'éther de pétrole ou de l'hexane au concentré et on récupère le
<EMI ID=31.1>
chromatographie sur couche mince, on décèle un certain nombre de taches en plus de l'antibiotique C-15003, on soumet ensuite le produit 1 aux processus de purification suivants. C'est ainsi qu'à titre de processus de purification classique_la chromatographie par adsorption se révèle intéressante et, à ce propos, on peut utiliser l'un des adsorbants ordinaires tels que du gel de silice, de l'alumine, une résine adsorbante non ionique macroporeuse, etc. En ce qui concerne la purification du produit I brut, le gel de silice se révèle le plus intéressant. Le développement peut être réalisé, par exemple en partant avec de l'éther de pétrole et de l'hexane et on réalise l'élution de l'antibiotique C-15003 par l'addition d'un solvant polaire, tel que l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol ou le méthanol.
Un procédé caractéristique consiste en une chromatographie sur colonne dans laquelle on utilise comme support du gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, 0,05-0,2 mm) et dans laquelle on augmente graduellement le rapport hexane/acétate d'éthyle. L'éluat est échantillonné et examiné au moyen d'une chromatographie sur couche mince et les fractions contenant le C-15003 sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Ensuite, on ajoute au concentré de l'éther de pétrole ou de l'hexane, de sorte que l'on obtient le produit
II brut. Puisque ce produit contient encore des impuretés, il est à nouveau purifié de la façon suivante. Par exemple, on peut pu-
<EMI ID=32.1> <EMI ID=33.1> utilisant un système solvant différent. Le système de développement peut, à cet effet, consister en un hydrocarbure halogéné tel que le dichlorométhane ou le chloroforme, avec l'addition d'un solvant polaire tel qu'un alcool, par exemple le méthanol ou l'éthanol, une cétone, par exemple l'acétone ou la méthyl éthyl cétone, etc. De cette manière, on isole l'antibiotique C-15003.
L'ordre des systèmes solvants pour les première et seconde colonnes à base de sel de silice peut être inversé et, de plus, on peut utiliser des solvants organiques ordinaires conjointement aux systèmes précédents, si cela s'avère nécessaire.
Si l'on utilise une résine adsorbante macroporeuse comme moyen de purification pour le produit brut II, on réalise l'élu-tion de l'antibiotique C-15003 avec un mélange d'eau et d'un alcool inférieur, d'une cétone inférieure ou d'un ester. L'alcool inférieur peut, par exemple, être le méthanol, l'éthanol, le propanol ou le butanol, et la cétone inférieure peut, par exemple, être l'acétone ou la méthyl éthyl cétone. L'ester peut, par exemple, être l'acétate d'éthyle. Suivant un processus caractéristique, le produit II brut est dissous dans un mélange de méthanol
(60%) et d'eau et adsorbé sur une colonne de Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K.K.). La colonne est lavée avec un mélange de méthanol (70%) et d'eau et, ensuite, l'élution est réalisée avec un mélange de méthanol (90%) et d'eau. De cette manière, l'antibiotique C-15003 est élué de la colonne.
Dans chacun des procédés décrits précédemment, les fractions contenant l'antibiotique C-15003 sont rassemblées et concen-
<EMI ID=34.1>
mes d'acétate d'éthyle et on laisse le mélange au repos, de sorte que des cristaux d'antibiotique C-15003 se séparent. Ces cristaux
<EMI ID=35.1>
te séparés l'un de l'autre au moyen d'un adsorbant, tel qu'un de ceux mentionnés précédemment. C'est ainsi qu'en utilisant du gel de silice ou une résine adsorbante non ionique macroporeuse et les solvants précédents, les composés désirés peuvent être élués par fractions. Si, par exemple, on utilise du gel de silice, on réalise le développement avec de l'hexane, de l'acétate d'éthyle ou un mélange de chloroforme et de méthanol, de sorte que les C-15003 P-4, P-3' et P-3 émergent dans cet ordre. Après détection au moyen d'une chromatographie sur couche mince, les fractions cor-
<EMI ID=36.1>
vement sous pression réduite et l'on ajoute de l'acétate d'éthyle aux concentrés. De cette manière, on peut obtenir les différents composés sous la forme de cristaux. Si l'on utilise une résine ad-sorbante non ionique macroporeuse, on peut utiliser une élution
en gradient avec un rapport variable d'alcool, de cétone ou d'ester/eau. Par exemple, au moyen de la méthode d'élution en gradient impliquant l'utilisation d'un mélange de méthanol (60%) et d'eau et d'un mélange de méthanol (95%) et d'eau, auxquels on a ajouté 5% de chlorure de sodium, les C-15003 P-3, P-3' et P-4 émergent dans l'ordre mentionné. Après l'échantillonnage et la détection par chromatographie sur couche mince . chaque groupe de fractions actives est concentré sous pression réduite et cristallisé dans de l'acétate d'éthyle.
Les cristaux isolés comprennent* l'acétate d'éthyle comme solvant de cristallisation et, après un séchage sur du pentoxyde de phosphore à 70[deg.]C pendant 8 heures, ces cristaux montrent les propriétés physiques et chimiques suivantes (tableau IV)
<EMI ID=37.1>
<EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
En se basant sur la formule moléculaire précédente indiquée ci-dessus et sur les résultats de l'activité antimicrobienne et antitumorale données ci-après, on compare l'antibiotique de l'invention à des groupes connus d'antibiotiques. Une recherche dans la littérature n'a pas permis de localiser un groupe distinct similaire à l'antibiotique C-15003.
Toutefois, une recherche des substances qui pourraient donner des absorptions ultraviolettes similaires à celles de l'antibiotique de la présente invention parmi les constituants des plantes et parmi les autres composés organiques d'origine naturelle a mené aux groupes de la maytanacine et, en se basant tout particulièrement sur les formules moléculaires impliquées, on a constaté que l'antibiotique de l'invention appartenait au groupe de composés du type de la maytanacine contenant deux atomes d'azote. La maytanacine a été obtenue comme constituant d'une plante et a été rapportée dans le "Journal of American Chemical Society"97, 5294 (1975). Le spectre de masse de la maytanacine est le suivant :
<EMI ID=40.1>
La présence de m/e=485,470 et 450 pour les C-15003 P-3, P-3' et P-4 est une preuve que ces composés ont un squelette identique à celui de la maytanacine, ces composés ne se différenciant de la maytanacine que dans le type du groupe acyle en position 3. Il est donc clair que l'antibiotique C-15003 est un nouveau composé. Lorsque l'on dégrade chacun des C-15003 P-3, P-3' et P-4 avec un alcali et qu'on les analyse au moyen d'une Chromatographie en phase gazeuse pour déterminer les acides carboxyliques qui s'en libèrent, on a constaté que de l'acide isobutyrique, de l'acide butyrique et de l'acide isovalérique pouvaient être obtenus respective-'ment à partir du C-15003 P-3, du C-15003 P-3' et du C-15003 P-4.
On donne ci-après les structures basées sur les résultats précédents, des antibiotiques C-15003 P-3, P-3' et P-4.
<EMI ID=41.1>
L'antibiotique C-15003 est doué d'une activité prolongeant le temps de survie des êtres humains et des animaux à sang chaud présentant une ou plusieurs tumeurs (par exemple leucémie, sarcome, mastocytome, mélanome ou cancer).
L'antibiotique C-15003 a également un effet régressif sur la croissance des tumeurs solides par voie sous-cutanée, intramusculaire, ainsi que dans d'autres organes.
Comme exemple d'animaux à sang chaud, on peut citer les mammifères.
Dans un essai de toxicité aiguë utilisant des souris comme animaux d'essai, qui implique des injections intrapéritonéales d'antibiotique C-15003 P-3, P-3' et P-4, tous ces antibiotiques mon-
<EMI ID=42.1>
Pour ce qui est de la méthode d'administration aux êtres humains et aux animaux à sang chaud présentant une ou plusieurs tumeurs, on utilise généralement l'antibiotique C-15003 sous la forme d'injection. L'injection peut être réalisée par voie intramusculaire, intrathoracique, intra-abdominale, intra-utérine, intra-dura� le, intra-artérielle, sous-cutanée ou intraveineuse.
Une telle injection peut être préparée d'une manière connue en soi, c'est-à-dire que l'antibiotique C-15003 est dissous ou mis en suspension dans un milieu liquide aqueux contenant un so-lubilisant ordinaire, tel qu'un alcool (par exemple l'éthanol), un polyalcool (par exemple le propylène glycol, le polyéthylène glycol 200-300), un agent tensio actif non ionique, ou une solution saline et isotonique physiologique.
Des exemples caractéristiques de milieu liquide sont constitués par 1% d'éthanol et 0,85% de solution saline physiologique, 2,5% de méthanol et 0,85% de solution saline physiologique, ainsi que par 1% de Tween 80 et 0,85% de solution saline physiologique.
La concentration de l'antibiotique C-15003 dans le liquide se situe entre 0,5 mcg/ml et 500 mcg/ml.
Les injections peuvent être stérilisées et/ou contenir des substances auxiliaires, telles que des agents de conservation, des stabilisants, des agents mouillants et des agents émulsifiants.
L'antibiotique C-15003 est administré à un être humain ou à un animal à sang chaud présentant des tumeurs à raison d'environ 0,8 à 50 mcg/kg/jour.
L'antibiotique C-15003 comprend, ainsi qu'on l'a mentionné précédemment, les antibiotiques C-15003 P-3, P-3' et P-4,
et l'on peut utiliser dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention, uniquement l'antibiotique C-15003 P-3, C-15003 P-3' ou C-15003 P-4, ou bien on peut utiliser un mélange d'un ou de plusieurs de ces antibiotiques (c'est-à-dire un mélange des antibiotiques C-15003 P-3 et P-4, un mélange des antibiotiques C-15003 P-3' et P-4, un mélange des antibiotiques C-15003 P-3 et P-3', ou un mélange des antibiotiques C-15003 P-3, P-3' et P-4). En pratique, il est préférable d'utiliser un mélange des antibiotiques C-
15003 P-3, P-3' et P-4.
Chaque composant ou le mélange de composants n'est pas nécessairement purifié.
Les exemples suivants illustrent plus en détail la préparation et l'utilisation de l'antibiotique C-15003, mais ne constituent en aucun cas une limitation à l'invention; dans ces exemples, les parties sont en poids sauf indications contraires et la relation existant entre les parties et les parties en volume est une relation entre grammes et millilitres, et les pourcentages sont en poids/volume, sauf indications contraires.
On notera que dans le cadre de la présente invention,
<EMI ID=43.1>
lisés de façon interchangeable.
Toutes les expériences suivantes relatives à l'activité antitumorale de l'antibiotique C-15003 ont été essayées suivant le protocole d'examen et les méthodes d'estimation des agents antitumoraux décrits par le National Cancer Institute, National Institute of Health, Etats-Unis d'Amérique (protocoles NCI) [voir Cancer Chemotherapy Reports (partie 3), vol. 3, n[deg.] 2, 1972, pages
1 à 103].
Un mélanome B 16 et une leucémie L 1210 obtenus du National Cancer Institute, U.S.A., en 1971 ont été maintenus respectivement sur des souris C57BL/6 et DBA/2 [ Cancer Chemotherapy Reports (partie 1) vol. 50, n[deg.] 5, 1975; pages 919-928]. Une leucé-
<EMI ID=44.1>
en 1975 a été maintenue sur des souris DBA/2. On a également utilisé un mastocytome P815 sur des souris DBA/2, un carcinome d'Ehrlich et un sarcome 180 sur des souris JCR-JCL. On a utilisé dans chacun des exemples, pour chaque tumeur, des souris appropriées, mâles et femelles, âgées de 5 à 7 semaines.
Exemple de référence 1 <EMI ID=45.1>
On utilise Nocardia n[deg.] C-15003 (IFO 13726 ; FERM 3992 ATCC 31281), que l'on a fait croître sur un milieu à base d'agar à l'extrait de levure-extrait de malt, pour inoculer un fermenteur d'une capacité de 200 parties en volume.contenant 40 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement (2% de glucose, 3% d'amidon soluble, 1% de farine de soja brute, 1% de liqueur de macération de mats, 0,5% de polypeptone, 0,3% de NaCl, 0,5%
<EMI ID=46.1>
rature de 28[deg.]C pendant 48 heures de manière à obtenir un inoculum. Une portion de 0,5 partie en volume de l'inoculum ainsi obtenu est transférée dans un fermenteur d'une capacité de 200 parties en volume contenant 40 parties en volume d'un milieu de fermentation composé de 5% de dextrine, de 3% de liqueur de macération de mats,
<EMI ID=47.1>
nir un inoculum (culture d'ensemencement).
Au moyen de la méthode de dilution en série en utilisant Tetrahymena pyriformis W à titre de micro-organisme d'essai et l'antibiotique C-15003 P-3 à titre d'échantillon standard, on trouve que la culture précédente a un titre de 25 �g/ml.
Exemple de référence 2
Une portion de 10 parties en volume de l'inoculum (en-
de référence
semencement) obtenu dans l'exemple/1, est transférée dans un fermenteur d'une capacité de 2000 parties en volume contenant 500 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement (le même que ci-dessus) et incubée à 28[deg.]C pendant 4 8 heures. Une portion de 500 parties en volume de la culture résultante est transférée dans un réservoir en acier inoxydable d'une capacité de 50000 parties en volume contenant 30000 parties en volume du milieu de culture d'ensemencement et cultivée à 28[deg.]C, sous une aération de 30000 parties en volume/minute, une agitation à 280 tours par mi- nute (1/2DT) et une pression interne de 1 kg/cm , de manière à obtenir une culture d'ensemencement. On utilise cette culture pour ensemencer un réservoir en acier inoxydable d'une capacité de
<EMI ID=48.1>
milieu de fermentation similaire à celui utilisé dans l'exemple 1, à un taux d'inoculation de 10%. Le milieu inoculé est incubé à
28[deg.]C, sous une aération de 100.000 parties en volume/minute, une agitation à 200 tours par minute (1/2 DT) et une pression interne de 1 kg/cm<2> pendant 90 heures. En utilisant le même processus que celui décrit dans l'exemple 1, on trouve que la culture obtenue a un titre de 25 �g/ml.
Exemple ''de référence 3
On ajoute à 95.000 parties en volume de la culture ob-
de référence
tenue dans l'exemple/2, 2000 parties d'Hyflo-supercel (Johnes and Manville Products, Etats-Unis d'Amérique) et, après un mélange intense, on filtre le mélange sur un filtre sous pression pour obtenir 85000 parties en volume de filtrat et 32000 parties de cellules humides. Les 85000 parties en volume du filtrat sont agitées et extraites avec 30000 parties en volume d'acétate d'éthyle. On répète encore une fois ce processus. Les couches à l'acétate d'éthyle sont rassemblées, lavées deux fois avec 30000 parties en volume d'eau, séchées par addition de 500 parties de sulfate de sodium anhydre et concentrées sous pression réduite à 200 parties en volume. On ajoute de l'éther de pétrole au concentré et on récupère le précipité résultant par filtration (52 parties).
On agite ce produit brut I avec 100 parties en volume d'acétate d'éthyle et on sépare par filtration les matières insolubles. Le filtrat est agité avec 10 parties de gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, 0,05-0,2 mm) et on sépare l'acétate d'éthyle sous pression réduite. Le résidu est introduit au sommet d'une colonne de gel de silice (400 parties en volume). On réalise l'élution avec 500 parties en volume d'hexane, 500 parties en volume d'un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle (3/1), 500 parties en volume d'un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle (1/1) ,
500 parties en volume d'un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle
(1/3), 500 parties en volume d'acétate d'éthyle et 1000 parties en volume d'un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol (50/1),
<EMI ID=49.1>
en volume.
Une portion d'une partie en volume de chacune des fractions est concentrée à sec, et l'on, ajoute 0,1 partie en volume d'acétate d'éthyle au concentré de manière à obtenir un mélange. Le mélange est réparti sous la forme de gouttes à 2,5 cm du bord inférieur d'une plaque de verre à base de gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, 60 F 254' 0,25 mm, 20 x 20) et développé sur une distance d'environ 17 cm avec un système solvant formé d'acétate d'éthyle et de méthanol (19/1). Après le développement, on réalise la détection au moyen de lumière ultraviolette (2537A).
Les fractions actives n[deg.] 23 à 28 avec un Rf de 0,6 à 0,65 sont recueillies et concentrées sous pression réduite jusqu'à environ 20 parties en volume. On ajoute à ce concentré
150 parties en volume d'éther de pétrole de manière à obtenir 15 parties d'un produit brut II.
Exemple de référence 4
On extrait, tout en agitant, 32.000 parties des cellules
de référence
humides obtenues dans l'exemple /3, avec 50.000 parties en volume
<EMI ID=50.1>
on filtre sur un filtre sous pression. On répète à nouveau l'extraction avec 50.000 parties en volume d'un mélange d'acétone (70%) et d'eau et la filtration ultérieure. Les filtrats sont rassem-blés et on sépare l'acétone par concentration sous pression réduite. On fait passer le système aqueux résultant dans une colonne formée de 5.000 parties en volume de Diaion HP-10 (Mitsubishi
<EMI ID=51.1>
d'eau et de méthanol aqueux à 50%, cette opération étant suivie par une élution avec 15.000 parties en volume d'un mélange de méthanol (90%) et d'eau. L'éluat est concentré sous pression réduite à 3.000 parties en volume et secoué avec 3.000 parties en volume d'eau et 3.000 parties en volume d'acétate d'éthyle. On répète le processus ci-dessus. Les couches à l'acétate d'éthyle sont combinées, lavées avec de l'eau, séchées par l'addition de sulfate de sodium anhydre et concentrées sous pression réduite à
200 parties en volume. Après l'addition d'éther de pétrole, on récupère le précipité par filtration (28 parties). On purifie
le produit ci-dessus au moyen d'une colonne de gel de silice et on récupère 8,0 parties de produit brut II.
Exemple de référence 5
On dissout 1,5 partie du produit brut II obtenu dans de référence
l'exemple/3 dans 10 parties en volume d'acétate d'éthyle et on agite à fond la solution avec 4 parties de gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, 0,05-0,2 mm). L'acétate d'éthyle est séparé sous pression réduite. On applique le résidu au sommet d'une colonne formée de 300 parties en volume de gel de silice et on lave d'abord la colonne avec 500 parties en volume de chloroforme et on l'élue ensuite avec 500 parties en volume de chloroforme-méthanol (50/1), 500 parties en volume de chloroforme-méthanol (20/1) et 500 parties en volume de chloroforme-méthanol
(10/1). L'éluat est recueilli sous la forme de fractions de 25 parties en volume.
Une portion de 0,5 partie en volume de chacune des fractions est concentrée sous pression réduite. On ajoute au concen-tré 0,05 partie en volume d'acétate d'éthyle, et on soumet le mélange à titre d'échantillon à une chromatographie sur couche mince avec gel de silice (système de développement : chloroforme-méthanol-9/1).
o
Les fractions Nos 39 et 40 absorbant à 2537A dans la zone de Rf de 0,50-0,60 sont recueillies et concentrées à sec
sous pression réduite. On ajoute au résidu 2 parties en volume d'acétate d'éthyle et on laisse le mélange au repos, de sorte que l'on obtient 0,150 patie de cristaux d'antibiotique C-15003.
Les cristaux d'antibiotique C-15003 dont question cidessus (0,150 partie) sont dissous dans 15 parties en volume de méthanol, cette opération étant suivie d'une addition de 0,300 partie de chlorure de sodium et de 15 parties en volume d'eau. Une colonne est garnie avec 200 parties en volume de Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K.K.) et est calibrée avec 600 parties en volume d'un mélange de méthanol (50%) et d'eau contenant 5% de NaCl. On fait ensuite passer la solution d'échantillonnage préparée ci-dessus dans la colonne, et on réalise une élution en gradient en utilisant 1.500 parties en volume d'un mélange de méthanol (60%) et d'eau contenant 5% de NaCl et 1.500 parties en volume d'un mélange de méthanol (95%) et d'eau. On recueille l'éluat sous la forme
de fractions de 15 parties en volume et on examine chacune des fractions au moyen d'une chromatographie sur couche mince avec
gel de silice. Les fractions 145 à 153 contiennent du C-15003 P-3, les fractions 167 à 180 contiennent du C-15003 P-3' et du C-15003 P-4, et les fractions 185 à 190 contiennent du C-15003 P-4.
Chaque groupe de fractions est concentré et dissous
par l'addition de 50 parties en volume d'eau et de 100 parties
en volume d'acétate d'éthyle. La solution est secouée dans un entonnoir à décantation, la couche aqueuse est séparée et, après un lavage avec 2 portions d'eau de 50 parties en volume, la couche à l'acétate d'éthyle est séchée sur sulfate de sodium anhydre, concentrée et laissée au repos. On obtient de cette manière des cristaux à partir de chaque groupe de fractions. Les cristaux sont recueillis par filtration et séchés.
<EMI ID=52.1>
de
<EMI ID=53.1>
(0,018 partie) sont dissous dans 0,3 partie en volume d'acétate d'éthyle et répartis sous la forme de gouttes en une ligne à une distance de 2,5 cm du bord inférieur d'une plaque de verre à base de gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, Keisel-
<EMI ID=54.1>
développement au moyen d'un mélange d'acétate d'éthyle et de mé- thanol (19/1). Après un développement jusqu'à environ une dis- tance de 18 cm, les bandes d'absorption à Rf 0.68 (P-4) et Rf 0,65
(P-3') sont enlevées par grattage et chacune d'entre elles est extraite indépendamment deux fois avec de l'acétate d'éthyle contenant une petite quantité d'eau. �L'extrait à l'acétate d'éthyle résultant est lavé avac de l'eau, séché sur sulfate de sodium an- hydre, concentré sous pression réduite et laissé au repos.
On obtient respectivement 0,010 partie de cristaux de C-15003 P-4 et 0,003 partie de cristaux de C-15003 P-3' à partir des fractions dont le Rf est de 0,68 et le Rf de 0,65.
Exemple de. référence 6
de référence
1.000 parties en volume de la culture de l'exemple/2 sont inoculées dans un réservoir d'acier inoxydable d'une capacité de 200.000 parties en volume contenant 100.000 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement et on incube le milieu ino-
<EMI ID=55.1>
en volume/minute) et une agitation (200 tours par minute) pendant 48 heures de manière à obtenir une culture d'ensemencement. Cette culture d'ensemencement est transférée dans un réservoir d'acier inoxydable d'une capacité de 2.000.000 de parties en volume contenant 1.000.000 de parties en volume d'un milieu de fermentation similaire à celui utilisé dans l'exemple 1, à un taux de transfert
<EMI ID=56.1>
pendant 90 heures. On constate, en utilisant le processus décrit
de référence
<EMI ID=57.1>
ml.
On ajoute à 900.000 parties en volume de la culture précédente, 900.000 parties en volume d'acétone et, après une agitation dé 1 heure, 20.000 parties d'Hyflo-Supercel (Johnes and Manville, Etats-Unis d'Amérique). Le mélange est à nouveau agité et filtré sur un filtre sous pression.
On ajoute 500.000 parties en volume d'eau à 1.700.000 parties en volume du filtrat résultant et on extrait le mélange au moyen d'un appareil Podbielniak (Podbielniak, Inc.) avec
1.000.000 de parties en volume d'acétate d'éthyle. La couche à l'acétate d'éthyle est lavée avec de l'eau, séchée par l'addition de sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite.
On ajoute de l'éther de pétrole au concentré, on récupère le précipité résultant par filtration et on le sèche. On obtient au moyen du procédé ci-dessus 68 parties de produit brut I. Ensuite, comme dans les exemples 3, 4 et 5, on purifie le produit brut pour obtenir 9,5 parties de C-15003 P-3, 0,300 partie de C-15003 P-3' et 2,5 parties de C-15003 P-4.
Exemple 1
Effet du C-15003 (un mélange de C-15003 P-3, C-15003 P-3' et C-15003 P-4) sur le temps de survie de souris porteuses d'une leucémie P388
Des souris (C57BL/6 x DBA/2)F1 (BDF1)(groupe de
3 à 5 souris).,pesant de 18 à 22 g, sont inoculées par voie intrapéritonéale avec 1 x 106 cellules de leucémie P388 au jour 0.
De l'antibiotique C-15003 [un mélange de C-15003 P-3
(60 à 65% en poids/poids), de C-15003 P-4 (30 à 35% en poids/poids) et de C-15003 P-3' ] est mis en suspension dans un mélange de Tween 80 (1%) et d'une solution saline physiologique (0,85%), et
on administre la suspension par voie intrapéritonéale aux animaux inoculés par les cellules leucémiques (0,2 ml par souris) une fois par jour pendant 9 jours 24 heures après l'inoculation de la tumeur.
Pour estimer l'activité antitumorale de l'antibioti-
le
que C-15003, on calcule/T/C en pour-cent, qui est le rapport x
100 du temps de survie moyen des souris porteuses de cellules leucémiques P388 traitées (T) avec l'antibiotique C-15003 à
celui de souris témoins (C) non traitées. On considère, suivant les normes NCI, qu'un rapport T/C de plus de 125% représente une activité antitumorale positive.
TABLEAU 5
<EMI ID=58.1>
Ainsi que les résultats le montrent au Tableau 5,
1 l'administration de doses intrapéritonéales journalières de 1,6 à
25 mcg/kg de l'antibiotique pendant 9 jours prolonge le temps de survie des souries traitées d'une façon significative.
En particulier, le prolongement le plus significatif du temps de survie des souris traitées est observé à une dose de
25 mcg/kg (dose optimale) (pourcentage de T/C de 227).
Exemple 2
Effets des C-15003 P-3 et C-15003 P-4 sur le temps
de survie de souris porteuses de cellules leucémiques P388
Des souris BDF1 (5 souris par groupe d'essai), pesant de 18 à 22 g, sont inoculées par voie intrapéritonéale avec
1 x 106 cellules de leucémie P388 au jour 0. Chaque antibiotique est dissous dans du méthanol (2,5%) et une solution saline physiologique (0,85%) et la solution est administrée par voie intrapéritonéalé à des souris (0,2 ml pour chaque souris) une fois par jour pendant 9 jours en commençant 24 heures après l'inoculation de la tumeur.
Comme décrit dans l'Exemple 1, on considère, suivant les normes NCI, qu'un rapport T/C de plus de 125% représente une activité antitumorale positive. Comme résumé au Tableau 6, l'ad-
<EMI ID=59.1>
nalières de 1,6 à 25 mcg/kg ou celle: de C-15003 P-4 avec des doses
temps intrapéritonéales journalières de 0,8 à 50 mcg/kg prolongent le/ de survie des souris traitées d'une façon significative. On constate un effet maximum à une dose journalière de 25 mcg/kg de chacun des agents essayés.
TABLEAU 6
<EMI ID=60.1>
Exemple 3
Effet de l'antibiotique C-15003 (un mélange de C-
15003 P-3, de C-15003 P-3' et de C-15003 P-4) sur le temps de survie de souris porteuses de mélanome
B 16
On homogénéise un gramme de la tumeur avec 10 ml d'une solution saline physiologique à 0,85% froide et on inocule 0,5 ml de ce produit d'homogénéisation tumoral par voie intrapé-
<EMI ID=61.1>
décrit dans les protocoles du NCI.
<EMI ID=62.1>
P-3 (60 à 65% en poids/poids), de C-15003 P-4 (30 à 35% en poids/ poids) et de C-15003 P-3'] est mis en suspension dans un mélange de Tween (1%) et de solution saline physiologique (0,85%) et la
<EMI ID=63.1>
une fois par jour pendant 9 jours, en commençant 24 heures après l'inoculation de la tumeur (5 souris dans chaque groupe et 15 souris par groupe témoin).
Le rapport T/C en % sur base du temps de survie moyen est calculé comme décrit dans l'Exemple 1, et un rapport T/C de plus de 125% est considéré comme correspondant à une activité antitùmorale positive.
Comme indiqué au Tableau 7, le temps de survie des souris traitées avec l'antibiotique C-15003 est sensiblement supérieur à celui des souris non traitées.
TABLEAU 7
<EMI ID=64.1>
Exemple 4
Effets des C-15003 P-3 et C-15003 P-4 sur le temps de survie de souris porteuses de mélanome B 16 Des souris BDFl (5 animaux par groupe d'essai) sont inoculées par voie intrapéritonéalé avec une suspension de mélanome B 16 suivant la même méthode que celle décrite dans l'Exemple 3.
Chaque antibiotique est dissous -3ans un mélange de méthanol (2,5%) et de solution saline physiologique (0,85%) et la solution est administrée par voie intrapéritonéale- à des souris
(0,2 ml par souris) une fois par jour pendant 9 jours, en commençant
24 heures après l'inoculation de la tumeur.
Comme indiqué au Tableau 8, l'administration de C-
15003 P-3 ou de C-15003 P-4 avec des doses journalières de 1,6 à
50 mcg/kg prolonge d'une façon significative le temps de survie des souris traitées.
TABLEAU 8
<EMI ID=65.1>
Exemple 5
Effets des antibiotiques C-15003 (un mélange de C-
15003 P-3, de C-15003 P-3' et de C-15003 P-4), et C-
15003 P-3 sur le temps de survie de souris porteuses de cellules leucémiques L1210
On inocule par voie intrapéritonéale des souris
<EMI ID=66.1>
ques L1210 au jour 0.
Les antibiotiques C-15003 [un mélange de C-15003 P-3
(60 à 65% en poids/poids), de C-15003 P-4 (30 à 35% en poids/poids) et de C-15003 P-3'], et C-15003 P-3 sont dissous respectivement
dans un mélange de méthanol (2,5%) et de solution saline physiologique (0,85%) et chacune des solutions est administrée par voie intrapéritonéale aux souris inoculées par une tumeur (0,2 ml par sou-ris) une fois par jour pendant 9 jours, en commençant 24 heures
après l'inoculation de la tumeur.
Pour évaluer l'activité antitumorale des agents d'essai, on calcule le T/C en %, qui est le rapport x 100 du temps de survie moyen des souris porteuses de cellules leucémiques L1210 traitées avec les agents à celui de souris non traitées (un
groupe de 25 souris), comme décrit dans les protocoles NCI. On con- ' sidère qu'un rapport T/C de 120% correspond à une activité antitu- morale minimum des agents.
Comme indiqué au Tableau 9, le mélange de C-15003
de
P-3, de C-15003 P-3' et/C-15003 P-4, ainsi que le C-15003 P-3 se révèlent comme étant légèrement efficaces dans le prolongement du
temps de survie des souris porteuses de cellules leucémiques L1210.
TABLEAU 9
<EMI ID=67.1>
Exemple 6
Effets des C-15003 P-3 et C-15003 P-4 sur le temps.de survie de souris porteuses de sarcome 180
Des souris ICR-JCL (fournies par la Japan Clea, Tokyo, 5 animaux par groupe d'essai) sont inoculées par voie intrapéritonéalle avec 4 x 106 cellules de sarcome 180 au jour 0.
Chaque antibiotique est dissous dans un mélange de méthanol (2,5%) et de solution physiologique saline (0,85%) et on administre la solution par voie intrapéritonéa� à des souris inoculées par une tumeur (0,2 ml par souris) chaque jour pendant 7 jours, en commençant 24 heures après l'inoculation de la tumeur.
On calcule le pourcentage du rapport T/C, en temps de survie moyen, comme décrit dans l'Exemple 1.
Comme indiqué au Tableau 10, les deux agents se révèlent particulièrement efficaces dans le prolongement du temps de survie des animaux porteurs d'un sarcome 180.
TABLEAU 10
<EMI ID=68.1>
Exemple 7
Effets des C-15003 P-3 et C-15003 P-4 sur le temps de survie de souris porteuses de carcinome d'Ehrlich Des souris ICR-JCL (5 animaux par groupe d'essai) sont inoculées par voie intrapéritonéale avec 4 x 106 cellules de carcinome d'Ehrlich au jour 0.
Chaque antibiotique est dissous dans un mélange de méthanol (2,5%) et de solution saline physiologique (0,85%) et la solution est administrée par voie intrapéritonéale- à des souris (0,2 ml par souris) une fois par jour pendant 7 jours, en commençant 24 heures après l'inoculation de la tumeur.
On calcule le pourcentage du rapport T/C, en temps de survie moyen, comme décrit dans l'Exemple 1.
Comme indiqué au Tableau 11, les deux agents se révèlent particulièrement efficaces dans le prolongement du temps de survie des souris porteuses de carcinome d'Ehrlich.