BE881094A - Inducteur d'interferon utile comme medicament et procede pour sa preparation - Google Patents

Description

  Inducteur d'interféron utile comme médicament et procédé pour sa préparation. 

  
Inducteur d'interféron utile comme médicament et procédé pour sa préparation..

  
La présente invention concerne un inducteur d'interféron utile comme médicament et un procédé pour sa préparation.

  
 <EMI ID=1.1> 

  
facteur d'inhibition des virus, est une substance capable d'agir sur les cellules animales pour inhiber le développement d'un virus et consiste en une protéine libérée par les cellules en réponse à une infection virale. L'activité antivirale

  
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d'une espèce virale et elle peut varier avec les différentes conditions utilisées pour l'induction de l'interféron. On sait

  
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inhiber de façon très importante le développement de certains virus provoquant des tumeurs animales. Une substance capable d'agir sur les cellules animales pour provoquer la production d'interféron est appelée un inducteur d'interféron (induc-

  
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tion et le traitement de diverses affections humaines et ani=ales provoquées par une infection virale. Cependant, les divers inducteurs d'IF connus n'ont jamais été utilisés en pratique à cet effet par suite de certains défauts graves. Ainsi par exemple le brevet des Etats-Unis d'Amérique No. 3.583.893
(1971) décrit un acide ribonucléique bicaténaire comme étant un inducteur d'IF que l'on produit avec un micro-organisme et ce même brevet indique que l'on connaît dans l'art antérieur de nombreuses substances, y compris des bactéries, des virus, des polysaccharides, des agents mitogènes, des endotoxines etsimilaires qui stimulent la formation d'interféron mais qu'aucune d'elles n'est utile pour l'application courante en raison entre autres de leur toxicité, leur antigênicité et leur infectiosité.

   D'autres inducteurs d'IF connus sont décrits par exemple dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique numéros
3.773.924 et 3.884.845 et la demande de brevet japonais publiée non examinée No. 121919/78. Cependant, ces inducteurs d'IF ne sont pas isolés de végétaux et on sait également que les inducteurs d'IF provenant de micro-organismes sont généralement désavantageux en thérapeutique en raison de leur forte toxicité.

  
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la phytohémagglutinine [Wheelock, Science, 149 : 310 (1965)], l'agent mite-gêne du phytolaque à dix étamines [Friedman et

  
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(1973)] respectivement isolés des tissus du haricot commun, du phytolaque à dix étamines et de la féverole. Cependant, en raison de leur activité d'induction d'IF extrêmement faible, on

  
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animales provoquer par une infection virale.

  
On connaît également d'autres inducteurs d'IF isolés des tissus des végétaux supérieurs. Par exemple Kumazawa,

  
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née No. 32.107/78) ont décrit un inducteur d'IF qui semble être un typo de saccharide hétéropolymère contenant comme constituants principaux un hexose (48 %), une protéine (5 %) et on acide uronique (40 %) ayant un poids moléculaire supérieur à
100.000 que l'on isole de la racine d'Angellica acutiloba Kitagawa (connue au Japon sous le nom de Toki) par extraction par l'eau chaude pour obtenir une solution extraite que l'on dialyse pour obtenir un résidu auquel on ajoute de l'acétone

  
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re, on peut réduire à un volume approprié la solution extraite par concentration sous pression réduite ou avec une membrane Diaflo, suivie d'une dialyse. Ultérieurement Kojima et Tamamura

  
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ont décrit un inducteur d'IF ayant un poids moléculaire supérieur à 20.000 (principalement supérieur à 100.000) et contenant comme constituant principal du glucose à liaison 1-3 (plus de 90 % d'hexose) produit par extraction des pelures de la racine d'un mûrier tel que Morus alba Linne (connu au Japon sous le nom de 'Maguwa) ou de Morus bombycis koizdumi (connu au Japon sous le nom de Yamaguwa) avec de l'eau chaude, addition d'un solvant organique à la solution extraite pour former un précipité, addition d'une petite quantité d'eau au précipité, et dialyse de la solution pour obtenir un résidu que l'on lyophilise. Si on le désire, on peut porter les solutions à un volume approprié après extraction et/ou avant dialyse par concentration sous pression réduite ou par emploi d'une membrane Diaflo. 

  
Ces deux inducteurs d'IF ont une faible toxicité et sont faciles à produire. Cependant, les tissus végétaux peu coûteux et abondants dont dérivent ces inducteurs d'IF peuvent devenir rares par suite de l'emploi continu de ces tissus végétaux depuis de nombreuses années comme source de médicaments traditionnels en Chine et au Japon.

  
L'invention concerne un inducteur d'IF possédant d'excellentes propriétés et un procédé pour sa préparation. L'invention repose sur la découverte d'une substance que l'on a isolée des tissus de divers végétaux appartenant au genre Artemisia de la famille des Composés et leurs variants présentent une excellente activité d'induction de l'interféron avec une faible toxicité. De plus, on peut isoler facilement et de façon peu coûteuse la substance active des tissus végétaux.

  
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vité 3'inducteur d'IF qui est stable sous forme d'une poudre amorphe blanchâtre et qui, sous une forme pratiquement pure, possède les caractères physico-chimiques suivants : 

  
(1) Analyse élémentaire : 

  

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(2) Poids moléculaire.

  
Environ 100.000 &#65533; environ 3.000.000 (principalement

  
 <EMI ID=14.1> 

  
ultrafiltration avec un ultrafiltre Amicon et des membranes

  
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 <EMI ID=16.1> 

  
(3) Point de fusion ou de décomposition. 

  
Pas de point de fusion déterminé. Carbonisation à envi-

  
 <EMI ID=17.1> 

  
(4) Spectre d'absorption ultraviolet. 

  
Il est illustré par la figure 1 (détermination dans 1 hydroxyde - de sodium Or 1 N) où le pourcentage de transmission est représenté en ordonnées et la longueur d'onde (nm) est représentée en abscisses et il est pratiquement le même dans l'hydroxyde de sodium 1 N ou l'eau.-

  
(5) Spectre d'absorption infrarouge.. 

  
Il est illustré par la figure 2 (méthode au KBr) où le .pourcentage de transmission est représenté en ordonnées et le nombre d'onde (cm ) est représenté en abscisses.

  
(6) Solubilité dans divers.solvants.

  
Soluble dans l'eau, facilement soluble dans les solu,tions aqueuses d'hydroxyde de sodium, d'hydroxyde de potassium et d'hydroxyde d'ammonium et pratiquement insoluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'acétone, le chloroforme et l'éther éthylique. 

  
(7) Réactions colorées.

Réaction à la ninhydrine et réaction de Dittmer posi-tives... 

  
Réaction au réactif de Folin négative et réaction d'Elson-Morgan négative.. 

  
(8) Nature. 

  
Acide.

  
(9) Constituants chimiques principaux.

  

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(b) sucres .: absents. 

  
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 <EMI ID=20.1> 

  
sous vide puis analyse avec l'Amino Acid.Autoanalyzer Technicon Type NC-1 (produit commercialisé par Technicon Corp ..,

  
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ment avec de l'acide sulfurique.0,1 N à 80[deg.]C pendant 20 minutes et avec de l'acide sulfurique 1 N à 100[deg.]C pendant deux heures, puis analyse avec le Sugar Autoanalyzer Technicon' Type N-l (produit commercialisé par Technicon Corp . U.S.A.).

  
(10) Pouvoir rotatoire opticrue. 

  

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dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N) ....

  
Caractéristiques biologiques.

  
1) Activité d'inducteur d'IF.

  
On utilise des échantillons de l'inducteur d'IF de l'invention pour provoquer la production d'IF dans les cellules et le sérum d'animaux de laboratoire et on détermine l'ac-

  
 <EMI ID=23.1> 

  
l'expérience 1. Les résultats qui figurent dans le tableau 1 indiquent que l'activité d'inducteur d'IF est positive.

  
TABLEAU 1 

  

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TABLEAU 2
 <EMI ID=25.1> 
 Le tableau 2 montre les résultats obtenus selon lame-

  
 <EMI ID=26.1> 

  
deux lapins et on voit que l'activité de l'IF atteint son.maxi-  mum deux heures après l'administration. La méthode de l'expérience 1 a également montré que l'inducteur d'IF de l'invention provoque la formation d'IF dans l'organisme des animaux de laboratoire. 

  
 <EMI ID=27.1> 

  
On dissout des échantillons de 1 mg de l'inducteur d'IP de l'invention dans des portions de 1 ml d'eau et on chauffe à 100[deg.]C pendant un temps donné ou à une température donnée pendant une heure. On traite chacun des échantillons comme décrit dans l'expérience 1 (méthode in vitro) pour obte-  nir les résultats qui figurent dans les tableaux 3 et 4 et qui montrent que l'inducteur d'IF de l'invention est très stable vis-â-vis de la chaleur.

  
TABLEAU 3
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 TABLEAU 4 

  

 <EMI ID=29.1> 


  
3) Toxicité aiguë.

  
On utilise comme animaux d'étude des souris mâles et femelles (souche ddy ; 5 semaines ; poids : 20 + 1 g ; 10 souris par groupe). On administre aux souris, par voie intrapéri-

  
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sodium contenant l'inducteur d'IF de l'invention et on détermi-

  
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de différence significative des résultats entre les souris males et femelles. 

  
4) Activité antitumorale.

  
On utilise comme animaux d'expérience des souris (sou-

  
 <EMI ID=32.1> 

  
On inocule à chaque animal, sous l'aisselle, un échantillon
(2 x 2 x 2 mm) d'une tumeur solide, le Sarcome S-180, ou

  
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heures, on administre par voie'orale, à chaque souris, 0,2 mg d'inducteur d'IF de l'invention dissous dans de l'eau. On effectue l'administration une fois par jour pendant 14 jours. On observe un effet antitumoral significatif.

  
Les caractéristiques ci-dessus montrent que l'inducteur d'IF de l'invention est une substance ayant un poids  <EMI ID=34.1> 

  
ment d'environ 500.000 à 1.000.000) et qui semble être une substance protéique contenant de l'acide phosphorique. Egalement cette substance correspond apparemment à la définition généralement admise des inducteurs d'IF, car elle induit in vivo ou in vitro la production d'IF dans les cellules ou le

  
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heures et, de plus, l'activité de la substance induite est spécifique de l'espèce animale et non spécifique de l'espèce vira* le. La substance de l'invention est donc non seulement un nouvel inducteur d'IF, mais également une nouvelle substance en soi car on n'a précédemment jamais signalé une substance ayant les mêmes caractéristiques physico-chimiques et biologiques que l'inducteur d'IF de l'invention.

  
Par exemple, les agents mitogènes ayant une activité d'inducteur d'IF (par exemple la phytohémagglutinine, l'agent

  
 <EMI ID=36.1> 

  
décrits dans la littérature sont des protéines ayant des poids moléculaires supérieurs à 100.000 qui présentent une activité très faible d'inducteur d'IF qui est inactivée par chauffage à
56[deg.]C pendant 5 heures. Au contraire, l'inducteur d'IF de l'invention a des constituants chimiques différents, une grande

  
 <EMI ID=37.1> 

  
L'inducteur d'IF connu isolé des racines de Toki
(Angellica acutiloba Kitagawa) a également un poids moléculaire élevé (plus de 100.000) et son activité d'inducteur d'IF n'est pas inactivée par chauffage à 100[deg.]C pendant une heure.. Cependant, ses constituants chimiques . (hexose : 48 % ; acide uronique : 40 % ; protéine : 5 %) et son spectre d'absorption infrarouge diffèrent de ceux de l'inducteur d'IF de l'invention. L'inducteur d'IF connu isolé des pelures de racines de mûrier contient comme constituant actif principal un glucose à liaison 1-3 (hexose : 96 %) et a un poids moléculaire supérieur. à 20.000 (principalement supérieur à 60.000) et cet inducteur d'IF diffère donc également de l'inducteur d'IF de l'invention.

   De plus, contrairement aux inducteurs d'IF connus provenant d'une endotoxine bactérienne ou de végétaux supérieurs, l'inducteur d'IF de l'invention n'a qu'une activité. mitogëne très faible.

  
Les divers végétaux appartenant au genre Artemisia qu'on peut utiliser comme matière première pour produire l'inducteur d'IF de l'invention contiennent par exemple de l'ab-

  
de l'artémisétine,

  
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la semicarbazone, du 1-camphre, du sesquiterpène, du cadinène, du caryophyllêne, de l'alcool sesquiterpénique, de la cétone d'artémisia, de la c&#65533;tone d'isoartemisia, de l'a-pinène, du

  
 <EMI ID=39.1> 

  
acétique, de l'acide butyrique; de l'hexanol, de l'alcool benzylique, du butyrate de méthyle, du cuminal, de l'oxyde de

  
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cérylique, de l'acide carnaubique, de l'hentriacontane, du ricosanol, des vitamines A, B, C et D et d'autres substances de bas poids moléculaire qui diffèrent toutes de l'inducteur

  
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physico-chimiques et biologiques et qui n'ont pas d'activité d'inducteur d'IF. 

  
Les caractéristiques physico-chimiques des inducteurs

  
décrits 

  
d'IF connus/dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique numéros
3.773.924 et 3.884.845 et la demande de brevet japonais publiée non examinée No. 121.919/78 diffèrent de celles de l'inducteur d'IF de l'invention.

  
L'inducteur d'IF de l'invention présente un intérêt potentiel comme médicament pour la prévention et le traitement de diverses affections virales provoquées par des virus tels que ceux des tumeurs animales car son activité d'inducteur d'IF est excellente par rapport à celles des inducteurs d'IF . connus isolés des tissus végétaux et en raison de son activité contre les virus des tumeurs animales. De plus sa toxicité  aiguë est très faible lorsqu'on l'administre par voie orale à <EMI ID=43.1> 

  
L'invention concerne également un procédé pour produire une substance ayant une activité d'inducteur d'interféron qui consiste à extraire cette substance active des tissus d'un végétal du genre Artemisia de la famille, des Composées ou d'un variant correspondant contenant cette substance active et a récupérer cette substance active de l'extrait ainsi obtenu.

  
Les végétaux que l'on peut utiliser dans le procède de l'invention sont abondants à l'état sauvage ou cultivés dans divers pays du monde et sont susceptibles de présenter divers variants tels que des mutants et des hybrides naturels

  
 <EMI ID=44.1> 

  
environ 30, 120 et 60 espèces au Japon et en Chine, en Amérique du Nord et en Europe, et certains de ces végétaux sont utilisés depuis de nombreuses années par exemple comme aliments, comme remèdes traditionnels ou comme matières premières pour la préparation de médicaments. Cependant, il ne semble pas que l'on ait précédemment signalé dans l'art qu'une substance ayant une activité d'inducteur d'IF soit présente dans les tissus de ces végétaux.

  
On peut utiliser dans l'invention tous les végétaux

  
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 <EMI ID=46.1> 

  
sont cités qu'à titre purement indicatif. 

  
Artemisia princeps Pamp. ; A. absinthium L. ;

  
A. maritima L. ; A. kurramensis Qaz. ;

  
A. montana Pamp. ; A. feddei Lêv. et Van. ;

  
A. japonica Thun. ; A. keiskeana Miq. ;

  
A. stolonifera Komar. A. monophylla Kitam. ? A. stelleriana Bess. ; A. capillaris Thon. ; 

  
 <EMI ID=47.1> 

  
et leurs variantes. 

  
Les noms botaniques cités dans la présente description corres-

  
 <EMI ID=48.1> 

  
édité par Kariyone et Kimura et publié par Hirokawa Shoten,  <EMI ID=49.1> 

  
"North American Flora", Vol. 34, édité par P. A. Rydberg et publié par The New York Botanical: Garden, New York , (1916) ; "Illustrated Flora of . the Pacific States" , Vol. IV par

  
 <EMI ID=50.1> 

  
les tissus du végétal. Cependant une opération additionnelle peut être nécessaire pour éliminer la terre. Les feuilles et les tiges contiennent pratiquement les mêmes quantités de substance active de l<1> inventions et les teneurs en substance ,active des divers tissus d'un végétal sont pratiquement les mêmes avant et après la période de floraison. Pour obtenir une meilleure conservation et une meilleure extraction, on préfère utiliser la matière sèche bien qu'on puisse utiliser la matière fraîche. On peut choisir librement le mode de séchage (par exemple le séchage naturel; le séchage à l'air chaud, etc.). Si on le désire, on peut laver la matière à l'eau avant l'em-

  
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rature appropriée quelconque, par exemple comprise entre la température ambiante et le point d'ébullition du mélange d'extraction. Comme la substance active de l'invention est parti-

  
 <EMI ID=52.1> 

  
exemple à un pH de, 7 à 10), on préfère avant l'emploi ajuster.  le pH de l'eau par exemple avec une solution tampon appropriée, de l'hydroxyde de sodium, de l'hydroxyde de potassium ou de l'hydroxyde d'ammonium. On peut choisir une durée d'extraction

  
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ordinaire, cette durée pouvant être réduite lorsqu'on élève la température d'extraction. On peut ainsi effectuer l'extraction

  
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tant. Selon l'invention, on peut extraire la majeure partie de la substance active contenue dans la matière de départ (dans certains cas plus de 90 %). Cependant, on doit éviter l'emploi d'une température trop élevée pouvant accroître la quantité

  
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de bas poids moléculaire, etc. présentes .dans l'extrait. On peut également, si on le désire, ajouter un agent antiseptique approprié à l'eau d'extraction. On peut effectuer l'extraction de façon continue ou discontinue et utiliser un rapport approprié quelconque de l'agent d'extraction à la matière première.

  
On peut sinon extraire la substance active de l'invention des tissus végétaux avec un solvant organique hydrophile tel que par exemple du méthanol, de l'éthanol, du propanol, du butanol, de l'acétone et similaires en une quantité appropriée quelconque (par exemple 20 à 80 %) . On peut choisir de façon appropriée la durée et la température d'extraction (par exem-  ple 4 heures entre 40 et 80[deg.]C), mais cependant l'extraction

  
par l'eau est préférable car elle est plus simple, plus sure

  
et moins coûteuse. On peut effectuer l'extraction avec u&#65533; sol-

  
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tion soit insoluble dans de tels solvants. On peut effectuer l'extraction avec des solvants organiques hyrophiles par exemple lorsque la solution extraite contient un mélange ou un complexe de substances telles que des acides gras, des stéroldes, des protéines, des mono- ou polysaccharides et similaires. Sans se lier pour cela à des considérations théoriques, il semble que l'extraction au moyen de tels solvants organiques soit possible par suite d'un effet tampon.

  
On sépare de façon appropriée quelconque le résidu du végétal de la solution extraite, par exemple par filtration, pressage, centrifugation et similaires. Ensuite on élimine les impuretés indésirables telles que les pigments et les substances de bas poids moléculaires du surnageant obtenu pour permettre la récupération de la fraction active. Des exemples des procédés que l'on préfère à cet effet figurent ci-après.

  
A) On fractionne le surnageant par ultrafiltration, par exemple avec une membrane appropriée, pour retenir les substan- <EMI ID=57.1> 

  
tance active de l'invention est présente dans les fractions  ayant un poids moléculaire d'.environ 100.000 à environ 3.000.000 (principalement d'environ 500.000 à environ 1.000.000). On peut effectuer l'ultrafiltration sous une pression appropriée (par exemple 0,1 à 5 bars) avec une membrane capable de retenir les substances ayant un poids moléculaire supérieur à
100.000 ou 200.000. On recueille les fractions actives et on les combine puis on lyophilise les fractions combinées pour obtenir une poudre brune. B) On concentre le surnageant, si.on le désire, sous pression réduite et on le traite avec un solvant organique hydrophile (par exemple du méthanol, de l'ëthanol, du propanol,  <EMI ID=58.1> 

  
propriée (par exemple de 40-70 % p/v) pour former un précipité contenant la substance active puis on lyophilise pour obtenir une poudre brune. 

  
C) Au lieu de solvants organiques, on peut ajouter au surnageant un sel d'ammonium (par exemple le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le bromure de cétylméthylammonium et similaires) ou un sel minéral métallique (par exemple le chlorure de zinc, le chlorure de cuivre et similaires) à une concentration appropriée (par exemple 20 à 50 % p/v) pour former un précipité, on dessale le précipité par exemple avec une membrane.de dialyse ou un ultrafiltre capable de retenir les substances ayant un poids moléculaire de 5.000 à 10.000 et on lyophilise le précipité pour obtenir une poudre brune.

  
On peut éliminer la majeure partie de la substance active contenue dans la matière de départ (dans certains cas plus de 90 %). Cependant la quantité d'impuretés contenues dans les poudres brunes brutes est moindre dans le cas du procédé
(A) et également ce procédé est plus simple. De plus on a con- <EMI ID=59.1> 

  
taux. du genre Artemisia sont utilisés depuis de nombreuses années comme aliments -et; comme remèdes traditionnels au Japon et en Chine. 

  
Si on le désire, on peut soumettre la poudre brute .  ainsi obtenue à une purification complémentaire; par exemple par chromatographie sur colonne avec un agent convenant à la filtration sur gel ou un échangeur d'ions. Dans le premier cas,

  
 <EMI ID=60.1> 

  
utiliser une solution tampon appropriée. Dans le second cas, on peut effectuer l'élution avec une solution tampon appropriée. Les agents que l'on préfère pour la filtration sur gel

  
 <EMI ID=61.1> 

  
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P-300, le Bio-Gel A (produits commerciaux de Bio-Bad Labora-

  
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vac Laboratories Ltd. , U.K.) et similaires, et on peut citer "l'  comme agent préféré pour le traitement par échange d'ions les

  
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se d'anions ou de cations appropriés. Le produit ainsi obtenu peut contenir certaines impuretés bien que son activité d'in-

  
 <EMI ID=65.1>  .peut réduire encore les teneurs en impuretés par combinaison de ces traitements.. '  <EMI ID=66.1> 

  
ceutique contenant comme ingrédient actif une substance de .  l'invention comme précédemment définie en association avec un support ou un excipient pharmaceutique. La composition peut être présentée sous une forme convenant à l'administration 

  
 <EMI ID=67.1> 

  
pour l'administration orale peut être solide ou liquide et  être sous forme de granulés, de comprimés, de comprimés enro-

  
 <EMI ID=68.1> 

  
gouttes, cette composition contenant des supports ou "Ci- <EMI ID=69.1>  lactose, l'amidon de pommes de terre, l'amidon soluble et le stéarate de magnésium sont des excipients convenant à la préparation de comprimés.

  
Pour l'administration parentérale, le support peut être un liquide stérile convenant à ce mode d'administration tel que de l'eau stérile ou une huile telle que l'huile d'arachide, conditionné en ampoules. Les compositions pour l'administration rectale peuvent être sous forme de suppositoires, le support étant une base pour suppositoires. De façon avantageuse, la composition peut être sous forme de doses unitaires permettant chacune l'apport d'une quantité déterminée d'ingrédient actif. On peut citer comme exemples de formes unitaires appropriées, les comprimés, les comprimés enrobés, les capsules, les suppositoires et les ampoules.

  
L'invention concerne également un médicament constitué par l'inducteur d'IF précédemment défini.

  
Les exemples non limitatifs suivants illustrent les modes de réalisation préférés de l'invention.

  
EXEMPLE 1

  
Dans un premier stade on lave 1 kg de feuilles sèches d'Artemisia princeps Pamp. avec de l'eau et on les laisse séjourner dans 20 litres d'eau à la température ordinaire pendant

  
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6.000 tours/minute pendant 20 minutes pour éliminer le résidu que l'on lave avec deux portions de 5 litres d'eau. On combine le liquide de lavage au surnageant extrait. Les solutions combinées contiennent 138,735 g de matières solides sèches. On fractionne les solutions combinées par ultrafiltration avec un ultrafiltre (modèle UD-6, produit commercial de Bio Enginee- <EMI ID=71.1> 

  
cial de Toyo Roshi K.K., Tokyo) retenant les substances ayant un poids moléculaire supérieur à 200.000 sous une pression de

  
3 bars pour obtenir un résidu que l'on lyophilise pour,obtenir
19,676 g d'une poudre brune. A titre comparatif, on effectue un traitement semblabe à celui précédemment décrit avec une membrane XM 100A retenant les substances ayant un poids molécu-

  
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brune. 

  
Dans le second stade (purification), on dissout 1,5 g de la première poudre brute dans 5 ml d'eau et on verse la solution sur une colonne (4,5 x 70 cm) garnie de Sephadex G-200
(agent de filtration sur gel). On élue avec 600 ml d'eau et on divise l'effluent en fractions de 3 ml. On recueille les frac-

  
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nir 220 mg d'une poudre blanchâtre.

  
Dans le troisième stade (purification complémentaire), on dissout 100 mg de cette poudre dans 5 ml d'une solution tam-

  
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sur une colonne (2,5 x 70 cm) garnie de DEAE-Sephadex A-50 (échangeur d'ions). On utilise.pour l'élution 300 ml d'une so-

  
 <EMI ID=75.1> 

  
divise l'effluent en fractions de 3 ml. On recueille les fractions No. 15 à 30 et on les combine puis on lyophilise pour obtenir 62,7 mg d'une poudre amorphe blanchâtre ayant des teneurs moindres en impuretés et dont l'activité d'inducteur d'IF est pratiquement la même que celle de la première poudre blanchâtre. Le produit final a les caractéristiques physicochimiques précédemment indiquées et sa grande pureté est confirmée par l'ultracentrifugation et l'électrophorèse.

  
A titre comparatif, on détermine les activités d'inducteur d'IF des substances obtenues dans les divers stades du présent exemple comme décrit dans l'expérience 1 (méthode in vitro) et on obtient les résultats suivants.

  
TABLEAU 5
 <EMI ID=76.1> 
 EXEMPLE 2

  
On effectue un traitement semblable à celui décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on extrait des feuilles d'Artemisia capillaris Thun. que l'on laisse séjourner dans l'eau à la température ordinaire pendant 2 heures avec addi-

  
 <EMI ID=77.1> 

  
8,5, puis que l'on soumet à une extraction complémentaire à
65[deg.]C pendant 2 heures. Les caractéristiques physico-chimiques du produit final (60,2 mg) sont pratiquement les mêmes que celles du produit final obtenu dans l'exemple 1.

  
EXEMPLES 3 à 2 6

  
On traite indépendamment les feuilles, les tiges et les graines des végétaux séchés indiqués dans le tableau suivant selon un mode opératoire semblable à celui décrit dans l'exemple 1. On traite indépendamment Ies produits obtenus dans le second stade de tous les exemples, selon un mode opératoire semblable à celui décrit ci-après dans l'expérience 1
(méthode in vitro) pour déterminer leur activité d'inducteur

  
 <EMI ID=78.1> 

  
caractéristiques physico-chimiques des produits finaux obtenus dans les exemples 3 à 26 sont pratiquement les mêmes que celles du produit final de l'exemple 1. 

  
TABLEAU 6

  
A : graines ; B : tiges ; C : feuilles.

  

 <EMI ID=79.1> 
 

  
TABLEAU 6 (suite 1)
 <EMI ID=80.1> 
  <EMI ID=81.1> 

  
TABLEAU 6 (suite 2)
 <EMI ID=82.1> 
  <EMI ID=83.1> 

  
EXPERIENCE 1

  
Détermination de l'induction d'IF par l'inducteur d'IF et titrage de l'IF [Référence : mémoire de Y. Kojima dans Kitasato

  
 <EMI ID=84.1> 

  
(a) Induction d'IF (in vitro).

  
On sacrifie par ponction cardiaque un lapin blanc néozélandais pesant environ 1 kg, sans germes pathogènes spécifiques et on recueille.sa rate, sa moelle osseuse et ses ganglions lymphatiques que l'on combine pour préparer une suspension cellulaire contenant 107 cellules mélangées que l'on divi-

  
 <EMI ID=85.1> 

  
 <EMI ID=86.1> 

  
dant 24 heures puis on centrifuge pour obtenir des surnageants que l'on utilise comme échantillons pour la détermination de l'induction de l'interféron.

  
(b) Induction d'IF (in vivo). 

  
On dissout 1 mg du produit final de l'exemple 1 dans

  
2 ml d'eau et on injecte la solution dans la veine de l'oreille d'un lapin blanc néo-zélandais pesant environ-1 kg sans germes pathogènes spécifiques et 1, 2, 4 et 6 heures après l'administration on prélève un échantillon de 2 ml de sang dont on isole le sérum que l'on emploie comme échantillon pour déterminer l'activité de l'IF induit.

  
(c) Détermination de l'activité de l'IF.

  
Dans les deux méthodes (a) et (b), on utilise le virus de la stomatite vésiculaire pour déterminer l'activité de l'IF induit de la façon suivante. On réalise dans des boites des

  
 <EMI ID=87.1> 

  
pin et on ajoute une quantité prédéterminée d'échantillon de

  
 <EMI ID=88.1> 

  
pendant une nuit avec addition du virus de la stomatite vésiculaire comme virus d'épreuve. On détermine l'activité d'IF par le taux de diminution des plages. On' exprime l'unité d'activité d'IF par l'inverse de la dilution maximale de l'échan-  tillon réduisant de 50 % le nombre des plages. 

  
EXPERIENCE 2

  
 <EMI ID=89.1>  

  
On a confirmé que les échantillons préparés selon les procédés (a) et (b) inhibent le développement du virus de la stomatite vésiculaire et du virus de la vaccine dans.les cellules de lignée RK-13 provenant d'un lapin; c'est-à-dire de la même espèce animale, tandis qu'ils n'inhibent pas le développement du virus de la stomatite vésiculaire et le virus de la vaccine dans les cellules L provenant de souris, c'est-à-dire d'une espèce animale différente. De plus,.leurs activités d'inducteur d'IF sont inactivées lorsqu'on les traite avec de la trypsine à 0,08 % à 37[deg.]C pendant 2 heures. Ces faits montrent que la substance active de l'invention est.un inducteur d'IF. 

  
EXPERIENCE 3

  
Dans l'exemple 1, on effectue l'électrophorèse à 4[deg.]C de façon habituelle avec un dispositif du commerce (modèle AE-2, produit commercial de Toyo Kagaku Sangyo K.K., Tokyo), une plaque de gel de polyacrylamide (épaisseur 3 mm) et une

  
 <EMI ID=90.1> 

  
que produite montre que le produit final étudié est très pur.

  
Bien entendu l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits et représentés, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela de l'esprit de l'invention.

Claims (1)

1. REVENDICATIONS

   1. Substance ayant une activité d'inducteur d'interféron qui est stable sous forme d'une poudre amorphe blanchâtre

   et qui est caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes :

   (1) analyse élémentaire : <EMI ID=91.1>

   (2) poids moléculaire :

   environ 100.000 à environ 3.000.000 (principalement environ <EMI ID=92.1>

   ultrafiltration et filtration sur gel

   (3) point de fusion ou point de décomposition :

   pas de point de fusion défini, carbonisation à environ 220[deg.]C;

   (4) spectre d'absorption ultraviolet :

   comme illustré par la figure 1 (déterminé dans de l'hydroxyde

   <EMI ID=93.1>

   (5) spectre d'absorption infrarouge :

   <EMI ID=94.1>

   (6) solubilité dans divers solvants :

   soluble dans l'eau, facilement soluble dans les solutions

   aqueuses alcalines d'hydroxyde de sodium, d'hydroxyde de potassium et d'hydroxyde d'ammonium et pratiquement insoluble dans

   le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, l'acétone, le chloroforme et l'éther éthylique :

   (7) réaction colorée :

   réaction à la ninhydrine et réaction de Dittmer positives et réaction au réactif de Folin et réaction d'Elsori-Morgan négatives ;

   (8) nature :

   acide ;

   (9) constituants chimiques principaux : <EMI ID=95.1>

   <EMI ID=96.1> <EMI ID=97.1> (b) absence de sucre ;

   déterminé par emploi de l'Amino Acid Autoanalyzer Technicon

   <EMI ID=98.1>

   (10) pouvoir rotatoire optique :

   <EMI ID=99.1>

   l'hydroxyde de sodium 0,1 N).

   <EMI ID=100.1>

   ce qu'elle est sous forme pratiquement pure.

   3. Procédé pour préparer une substance ayant une activité d'inducteur d'interféron, caractérisé en ce qu'on extrait ladite substance active d'un végétal choisi parmi ceux du genre Artemisia et leurs variants contenant ladite substance active et on récupère ladite substance active de l'extrait ainsi obtenu.

   4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on choisit le végétal parmi Artemisia princeps Pamp. ; Artemisia absinthium L. ; Artemisia maritima L. ; Artemisia kurramensis Qaz ; Artemisia montana Pamp. ; Artemisia feddei Lèv et Van. ; Artemisia japonica Thun. ; Artemisia keiskeana

   <EMI ID=101.1>

   Kitam. ; Artemisia stelleriana Bess. ; Artemisia capillaris Thun. ; Artemisia vulgaris L. ; Artemi'sia abrotanum L. ;

   <EMI ID=102.1>

   Artemisia ludoviciana Nutt. ; Artemisia arbuscula Nutt. ;

   <EMI ID=103.1>

   Artemisia frigida Willd. Artemisia biennis Willd. ;

   Artemisia campestris L. Artemisia molinieri Quéz et leurs variants.

   <EMI ID=104.1>

   ce qu'on effectue l'extraction par l'eau.

   6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on effectue l'extraction à un pH de 7 à 10.

   7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue l'extraction avec ur solvant organique hydrophile pratiquement incapable de dissoudre ladite substance active.

   8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue la récupération en formant un surnageant que l'on fractionne par ultrafiltration pour obtenir des fractions contenant ladite substance active.

   9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que, pour effectuer l'ultrafiltration, on utilise un ultra- filtre capable de retenir les substances ayant un poids mol&#65533;culaire supérieur à 100.000.

   10. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que, pour effectuer la récupération, on forme un surnageant et on lui ajoute un solvant organique hydrophile pratiquement incapable de dissoudre ladite substance active pour obtenir des fractions contenant ladite substance active..

   11. Substance ayant une activité d'inducteur d'interféron, caractérisée en ce qu'on l'a préparée selon le procédé de l'une quelconque des revendications 3 à 10.

   <EMI ID=105.1>

   vention et le traitement de diverses affections virales de l'homme et des animaux, caractérisés en ce qu'ils comportent une substance selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 11.

   13. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment comme ingrédient actif un médicament selon la revendication 12 en association avec un support ou excipient pharmaceutique.