BE881595A

BE881595A - Inducteur d'interferon et son procede de fabrication

Info

Publication number: BE881595A
Application number: BE0/199303A
Authority: BE
Inventors: Y Kojima; S Konno; T Hashomoto
Original assignee: Kitasato Inst
Priority date: 1979-02-07
Filing date: 1980-02-07
Publication date: 1980-08-07
Also published as: JPS55115893A; JPS6011892B2; IN152883B

Description


  Inducteur d'interféron et son procédé de fabrication.

  
 <EMI ID=1.1> 

  
ou facteur inhibiteur de virus, est une substance capable

  
d'agir sur les cellules animales pour inhiber la croissance

  
d'un virus et elle est constituée d'un type de protéine libérée par la cellule en réponse à l'infection virale. L'activité

  
 <EMI ID=2.1> 

  
et non spécifique vis-à-vis d'une espèce virale, et elle peut

  
être variable dans les différentes conditions utilisées pour son induction. On sait aussi que la croissance de certains virus du type de tumeurs animales peut être inhibée de façon appréciable

  
par le FI dans certaines conditions.

  
Une substance capable d'agir sur les cellules animales

  
pour induire le FI est dénommée inducteur de FI. Un inducteur

  
de FI présente donc un intérêt potentiel pour la prévention et

  
le traitement de diverses maladies humaines et animales causées

  
par l'infection virale. On n'a toutefois jamais utilisé dans la pratique divers inducteurs connus de FI, en raison de certains inconvénients sérieux. C'est ainsi, par exemple, que le brevet

  
des Etats-Unis d'Amérique No. 3.583.893 décrit, comme inducteur

  
 <EMI ID=3.1> 

  
lisant un microorganisme et mentionne, dans la description de l'art antérieur, qu'un grand nombre de substances, comprenant

  
des bactéries, des virus, des polysaccharides, des agents mitogéniques, l'endotoxine et autres substances semblables, stimulent la formation d'interféron, mais qu'aucune d'entre elles

  
n'est intéressante pour un usage courant à cause, inter alias,

  
de leur toxicité, de leur caractère antigène tique et de leur nature infectieuse. D'autres inducteurs de FI connus sont décrits, par exemple, dans les brevets des Etats-Unis d'Am6rique

  
Non. 3.773.924 et 3.884.845 et dans la demande de brevet japonais Kokai Koho No. 121919/78. Ces inducteurs de FI ne sont toutefois pas isolés a partir de plantes, et il est également connu

  
 <EMI ID=4.1> 

  
général désavantageux pour des applications thérapeutiques, en raison de leur haute toxicité.

  
Des exemples d'agents mitogéniques connus sont donnés  <EMI ID=5.1> 

  
partir des tissus du flageolet, de la phytolaque et de la fèverole. Cependant, en raison de leur activité inductrice de FI

  
 <EMI ID=6.1> 

  
demande de brevet japonais !tokai Koho No. 32107/78, on décrit un inducteur de FI que l'on suppose être une espèce de saccharide hétéropolymère, contenant comme constituants principaux

  
 <EMI ID=7.1> 

  
(40 9), d'un poids moléculaire supérieur à 100.000, qui est

  
 <EMI ID=8.1> 

  
(nom japonais Toki) on l'extrait par l'eau chaude, pour obtenir une solution d'extraction, que l'on soumet à la dialyse pour obtenir un résidu, auquel on ajoute de l'acétone pour obtenir un précipité, que l'on lyophilise. On peut, si on le désire, ajuster la solution d'extraction à une quantité convenable en la concentrant nous pression réduite, ou en utilisant une mem-

  
 <EMI ID=9.1> 

  
un inducteur de FI, d'un poids moléculaire de plue de 20.000
(principalement de plus de 100.000), contenant comme consti-

  
 <EMI ID=10.1> 

  
l'eau chaude, on ajoute un solvant organique a la solution d'extraction pour obtenir un précipité, on ajoute une petite quantité d'eau au précipité, on soumet la solution à la dialyse pour obtenir un résidu et on lyophilise ce dernier. On peut, si

  
 <EMI ID=11.1> 

  
un volume convenable par concentration août pression réduite ou  <EMI ID=12.1> 

  
Ces deux inducteurs de FI présentent une faible toxicité et sont d'une production aisée.-Toutefois, les sources abondantes et peu coûteuses des tissus de plantes dont on les extrait peuvent venir à manquer, par suite de l'usage continuel qui en est fait depuis plusieurs années, comme sources de médi-

  
 <EMI ID=13.1> 

  
de propriétés excellentes, ainsi que leur procédé de fabrication. L'invention est basée sur la découverte qu'une substance, isolée des tissus de diverses plantes appartenant au genre

  
 <EMI ID=14.1> 

  
présente une excellente activité inductrice de FI et une faible

  
 <EMI ID=15.1> 

  
dea tissus de plantes, facilement et IL bon marché. 

  
Selon un mode de réalisation de l'invention, on obtient une substance présentant une activité inductrice de FI, qui est stable sous forme d'une poudre blanchâtre amorphe et qui, sous une forme sensiblement pure, présente les caractéristiques physicochimiques suivantes.

  
(1) Analyse élémentaire.

  
 <EMI ID=16.1> 

  
Roshi K.K., et par filtration sur gel, en utilisant le produit de dénomination commerciale Sephadex G-200, vendu par la Société dite Pharmacia Fine Chemical AB).

  
(3) Point de fusion ou de décomposition.

  
 <EMI ID=17.1> 

  
Tel que représenté à la figure 1, décrite ci-après  <EMI ID=18.1> 

  
(5) Spectre d'absorption IR.

  
Tel que représenté à la figure 2, décrite ci-après (par la méthode au KBr).

  
(6) Solubilité dans divers solvants.

  
Soluble dans l'eau et les solutions aqueuses de soude, potasse et ammoniaque pratiquement insoluble dans les solvants méthanol, éthanol, propanol, butanol, acétone, chloroforme et éther éthylique.

  
(7) Réactions colorées.

  
Positive dans les réactions de Ninhydrine, de phénol/

  
 <EMI ID=19.1> 

  
négative dans la réaction d'Elson-Morgan.

  
(8) Nature acide. 

  
(9) Principaux constituants chimiques.

  

 <EMI ID=20.1> 


  
On mesure les amino-acides présents, par hydrolyse par

  
 <EMI ID=21.1>  en utilisant l'auto-analyseur d'amino-acides, vendu sous la dénomination commerciale de Technicon type NC-1, et on mesure

  
 <EMI ID=22.1> 

  
par la Société dite Technicon Corp.).

  
(10) Rotation optique.

  
 <EMI ID=23.1> 

  
(c - 0,49 % dans NaOH O,1N).

  
Caractéristiques biologiques.

  
1) Activité inductrice de FI.

  
On utilise des échantillons de l'inducteur de FI de l'invention pour l'induction du FI dans les cellules et le sérum d'animaux d'essai et on mesure l'activité du FI obtenu, suivant la méthode décrite ci-après dans l'essai 1. Les résultats sont indiqués aux tableaux I et II qui montrent l'activité inductrice de FI positive.

  
 <EMI ID=24.1> 

  

 <EMI ID=25.1> 


  
 <EMI ID=26.1> 

  

 <EMI ID=27.1> 


  
Le tableau II, donnant les résultats obtenue suivant la méthode décrite ci-après dans l'essai 1, utilisant deux lapins,  <EMI ID=28.1>  est induit dans le corps de l'animal d'essai par l'action de l'inducteur de FI de la présente invention.

  
2) Stabilité de l'activité inductrice de FI.

  
On dissout des échantillons (chacun de. 1 mg) de l'in-

  
 <EMI ID=29.1> 

  
 <EMI ID=30.1> 

  
température donnée pendant 1 heure. On traite ensuite chaque échantillon suivant la méthode de l'essai 1 (méthode in vitro) pour obtenir les résultats donnés aux tableaux III et IV, qui montrent que l'inducteur de FI de l'invention présente une haute stabilité a la chaleur.

TABLEAU III

  

 <EMI ID=31.1> 
 

  
 <EMI ID=32.1> 

TABLEAU IV 

  

 <EMI ID=33.1> 


  
3) Toxicité aiguë.

  
On utilise comme animaux d'essai des souris maies et

  
 <EMI ID=34.1> 

  
groupes constitués chacun de 10 souris),. On administre aux souris une solution physiologique de chlorure de sodium, contenant

  
 <EMI ID=35.1> 

  
ment) . On n'observe aucune différence appréciable entre les souris miles et femelles.

  
4) Activité anti-tumorale.

  
On utilise comme animaux d'essai des souris de même race,

  
 <EMI ID=36.1> 

  
 <EMI ID=37.1> 

  
de 8-180 Sarcoma (2x2x2 2 mm) ou de tumeur ascitique d'Ehrlich (2,5 x 10 cellules). Après 24 heures, on administre oralement a chaque souris, l'inducteur de FI de l'invention
(0,2 mg) dissous dans l'eau. On effectue une administration par jour, qu'on poursuit pendant 14 jours. On observe un effet anti-tumoral appréciable.

  
D'après les caractéristiques précédemment indiquées, on

  
 <EMI ID=38.1> 

  
de protéines et de sucres, contenant de l'acide phosphorique,  <EMI ID=39.1> 

  
cipalement d'environ 500.000 à 1.000.000). Cette substance est également conforme a la définition généralement admise pour tout inducteur de PI, car elle induit le FI dans les cellule* ou le sérum de l'animal, in vivo ou in vitro, elle est inacti-

  
 <EMI ID=40.1> 

  
espèces animales et non spécifiques vis-à-vis des espèces virales. On suppose donc que la substance de l'invention constitue non seulement un nouvel inducteur de FI, mais aussi une substance nouvelle per se, car elle présente des caractéristiques

  
 <EMI ID=41.1> 

  
jour.

  
 <EMI ID=42.1> 

  
une activité inductrice de FI (comme la phytohémagglutinine, le mitogëne de phytolaque et la concanavaline A) sont des types

  
de protéines de poids moléculaires supérieurs a 100.000 et . d'une fret faible activité inductrice de FI, qui est désactivée par chauffage à 56[deg.]C pendant 5 heures. Au contraire, l'inducteur de FI de l'invention a des constituants chimiques différents, il est thermiquement stable mime à 100"C pendant plusieurs heures et son activité inductrice de FI est excellente. L'inducteur de FI connu, isolé dans la racine de Angellica acutiloba Kitagawa a aussi un haut poids moléculaire (supérieur

  
 <EMI ID=43.1> 

  
vée par chauffage à 100[deg.]C pendant 1 heure. Toutefois, ses cons-

  
 <EMI ID=44.1> 

  
5 %) et son spectre d'absorption IR sont différents de ceux de l'inducteur de l'invention. L'inducteur connu, isolé dans les pelures de racines du mûrier contient, comme constituant prin-

  
 <EMI ID=45.1> 

  
laire est supérieur à 20.000 (principalement supérieur à
60.000) il diffère donc également de l'inducteur de FI de l'invention. De plus, l'activité mitogénique rencontrée dans des inducteurs connus de FI, provenant de l'endotoxine bactérienne et des plantes supérieures, est très faible dans l'inducteur de FI de l'invention.

  
Diverses plantes, appartenant au genre Carthamus, qui  <EMI ID=46.1> 

  
teur de FI de l'invention en ce qui concerne leur* caractéristiques physico-chimiques et biologiques et ne présentent. pas

  
 <EMI ID=47.1> 

  
différentes de celles de l'inducteur de FI de l'invention.

  
L'inducteur de FI de l'invention présente un intérêt potentiel comme médicament pour la prévention et le traitement de diverses maladies virales chez l'homme et l'animal, telles que celles causées par les virus du type des virus des tumeurs animales, car son activité inductrice de FI est excellente,

  
 <EMI ID=48.1> 

  
 <EMI ID=49.1> 

  
des virua du type de ceux des tumeurs animale*. De plus, sa toxicité est très faible lorsqu'on l'administre oralement à

  
 <EMI ID=50.1> 

  
L'invention a encore pour objet un procédé de fabrication d'une substance présentant une activité inductrice d'interféron, selon lequel on extrait ladite substance d'une plante du genre Carthamus, de la famille de Compositae, ou de ses variantes contenant ladite substance, et on récupère la substance dans l'extrait obtenu.

  
Les plantes convenant au procédé de l'invention croissent en abondance, a l'état sauvage ou cultivé, dans un grand nombre de paya, ces plantes étant susceptibles de former diverses variantes, mutantes et hybrides, de façon naturelle ou arti-

  
 <EMI ID=51.1> 

  
est cultivé et utilisé depuis longtemps pour ses pigments jaunes et rouges et, à présent, on le cultive principalement dans divers pays, pour l'huile dans les akènes. Sa fleur a aussi été longtemps utilisée pour la fabrication de boissons sino-japonai-

  
 <EMI ID=52.1> 

  
tant une activité inductrice de FI était inconnue jusqu'à présent. 

  
On peut utiliser l'une quelconque des plantée du genre

  
 <EMI ID=53.1> 

  
tion. Des exemples de telles plantes convenant' l'invention

  
 <EMI ID=54.1> 

  
 <EMI ID=55.1> 

  
Press, CA. (1965).

  
En générale parmi les tissus d'une plante, c'est la fleur qui est riche de la substance active de l'invention.

  
Pour une meilleure conservation et extraction, il est préférable d'utiliser la plante séchée, bien qu'on puisse aussi

  
 <EMI ID=56.1> 

  
chage est quelconque (séchage naturel, par l'air chaud, etc.) et on peut, si on le désire, laver la matière à l'eau avant de l'utiliser.

  
 <EMI ID=57.1> 

  
ture convenable, par exemple entre la température ambiante et le point d'ébullition du mélange d'extraction. Etant donné que la substance active de l'invention est particulièrement soluble dans l'eau dans des conditions alcalines (par exemple, . pH

  
 <EMI ID=58.1> 

  
avant l'emploi, par exemple avec une solution tampon convenable, ou de la soude, de la potasse ou de l'ammoniaque. La durée

  
 <EMI ID=59.1> 

  
à température ambiante, durée qui peut être diminuée si on élève la température de l'extraction. C'est ainsi que l'on peut

  
 <EMI ID=60.1> 

  
 <EMI ID=61.1> 

  
d'extraire une portion prépondérante de la substance active contenue dans le produit de départ (dans certains cas, plus de  <EMI ID=62.1> 

  
d'extraction excessivement élevée, car la quantité d'impuretés indésirables, telles que des pigments, des substances de bas poids moléculaire, etc., apparaissant dans l'extrait peut alors augmenter. On peut aussi ajouter, si on le désire, un agent

  
 <EMI ID=63.1> 

  
l'extraction en continu ou de façon intermittente, et on peut utiliser tout rapport commode de l'eau d'extraction a la substance brute.

  
Selon une variante, on peut extraire la substance acti-

  
 <EMI ID=64.1> 

  
organique hydrophile (tel que méthanol, éthanol, propanol, butanol, acétone, etc.), en toutes proportions convenables, de

  
 <EMI ID=65.1> 

  
 <EMI ID=66.1> 

  
des solvants organiques hydrophiles, malgré l'insolubilité du produit pur de l'invention dans de tels solvants, lorsque la solution extraite contient un mélange ou un complexe de substances coma les acides grau, les stéroldes, les protéines, la saponine, les mono- ou poly-saccharides et analogues. On suppose que l'extraction avec de tels solvants est rendue possible par effet tampon.

  
On sépare le résidu du tissu de la plante, de la solution extraite, selon les moyens usuels, par exemple par filtration, pressage, centrifugation, etc. On élimine ensuite les Impuretés indésirables, telles que pigments et substances de bas poids moléculaire, de la liqueur surnageante, afin de permettre la récupération de la fraction active. Des exemples des méthodes préférées utilisées dans ce but sont donnés ci-après.

  
A) On fractionne la liqueur surnageante par ultrafiltration, par exemple 1 l'aide d'une membrane convenable pour frac- <EMI ID=67.1> 

  
100.000, car la substance active de l'invention est présente sous forme de fractions de poids moléculaires d'environ 100.000 à 3.000.000 (principalement d'environ 500.000 a 1.000.000) . On peut effectuer l'ultrafiltration sous une pression convenable,  <EMI ID=68.1> 

  
100.000 ou 200.000. On recueille alors les fractions actives qu'on combine, puis lyophilise, pour obtenir des- poudres brunes.

  
B) On concentre, si nécessaire, la liqueur surnageante, sous pression réduite, puis on la traite par un solvant organique hydrophile (par exemple méthanol, éthanol, propanol, nbutanol, acétone, etc.) à des concentrations convenables (comme <EMI ID=69.1> 

  
tenant la substance active, puis lyophiliser les précipités pour obtenir des poudres brunes.

  
C) Au lieu du solvant organique, on peut ajouter à la liqueur surnageante un sel d'ammonium (comme du chlorure ou du <EMI ID=70.1> 

  
logues) , ou un sel minéral métallique (comme le chlorure de zinc

  
 <EMI ID=71.1> 

  
 <EMI ID=72.1> 

  
précipité est ensuite soumis au dessalage en utilisant une membrane de dialyse ou un ultrafiltre capable de retenir les subs-

  
 <EMI ID=73.1> 

  
lyophilise pour obtenir une poudre brune.

  
Il est possible de récupérer la majeure partie de la substance active contenue dans le produit de départ (dans cer-

  
 <EMI ID=74.1> 

  
contenues dans la poudre brute est la plus faible dans le cas

  
 <EMI ID=75.1> 

  
plus, on constate que l'on peut éviter tout effet secondaire

  
 <EMI ID=76.1> 

  
l'animal une grande quantité de cette poudre brute obtenue .suivant la méthode (A) ; on peut donc utiliser cette poudre brute, sans purification ultérieure, pour l'administration orale. A ce.sujet, on remarque que l'on a utilisé par exemple le Safranum (Carthamus tictorius L.) pendant de nombreuses années dans le monde comme boisson populaire sino- japonaise et comme matière première pour la préparation de rouge et d'huile comestible.

  
On peut, si on la détire, purifier encore la poudre brute obtenue, par exemple par chromatographie sur colonne, en utilisant un agent convenable pour'la filtration sur gel, ou

  
 <EMI ID=77.1> 

  
l'eau, bien qu'il soit possible d'utiliser une solution tampon convenable. Dans le second cas. on peut éluer avec une solution tampon convenable. Des exemples d'agents préférés pour la filtration sur gel sont donnée par ceux vendue sous les dénomina-

  
 <EMI ID=78.1> 

  
 <EMI ID=79.1> 

  
Bio-Rad Laboratories Ltd. et par celui vendu sous la dénomination commerciale de Sagavac par la Société dite Seravac Laboratories Ltd. des agents préférés pour le traitement par échange d'ions sont, par exemple, ceux *vendue sous les d6nomi-

  
 <EMI ID=80.1> 

  
par la Société Pharmacia Fine Chemicals AB. On peut aussi utiliser pour la purification une cellulose convenable, échangeuse d'anions ou de cations. Le produit ainsi obtenu peut contenir certaines impuretés, bien que son activité inductrice de FI soit suffisante pour son application pratique. On peut, si on le désire, diminuer encore ces impuretés en combinant ces traitements.

  
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique comprenant comme ingrédient actif la substance de l'invention, telle que précédemment définie, en association avec une substance porteuse ou un excipient pharmaceutiques.

  
La composition peut être sous une forme convenable pour son administration orale, rectale ou parentérale. Les compositions pour l'administration orale peuvent être solides ou liquides, nous forme de granules, de comprimés, enrobés ou non, de capsules, de sirops, d'émulsions, de suspensions ou de gouttes, de telles compositions contenant des substances porteuses ou des excipients pharmaceutiquement acceptables. Des excipients conve-

  
 <EMI ID=81.1> 

  
du lactose, des amidons de pomme de terre, des amidons solubles et du stéarate de Magnésium.. 

  
 <EMI ID=82.1> 

  
comme l'eau stérilisée, ou une huile, comme l'huile d'arachide, contenu en ampoules. Pour l'administration rectale, nous forme de suppositoires, la substance porteuse comprend une base

  
pour suppositoires.

  
On peut avantageusement formuler la composition sous forme de doses unitaires, dont chacune fournit une.dose fixe de l'ingrédient actif. Les comprimés, enroba. ou non, les capsules, les suppositoires et les ampoules constituent des exemples de formes convenables de doses unitaires.

  
L'invention a également pour objet la substance telle que précédemment définie, utilisée comme médicament.

  
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la

  
 <EMI ID=83.1> 

  
dessins annexés, qui représentent plusieurs modes de réalisation suivant l'invention. Sur ces dessins, les figures 1 et 2 représentent, respectivement, les spectres d'absorption dans l'ultraviolet et dans l'infrarouge de la substance active de l'invention.

  
EXEMPLE 1

  
Dans une première opération, on lave à l'eau des fleurs

  
 <EMI ID=84.1> 

  
reposer dans l'eau (40 litres) à température ambiante pendant

  
3 jours, pour effectuer l'extraction, 'suivie de centrifugation
(6.000 tours/minute) pendant 20 minutes pour séparer le résidu, que l'on lave deux fois à l'eau (10 litres chaque fois). On réunit le liquide de lavage avec la liqueur surnageante.. La teneur totale en solides des solutions réunies est de 562,037 grammes (en poids sec). On fractionne les solutions réunies, par ultrafiltration avec un ultrafiltre vendu sous la dénomination commerciale de "Model UD-6 par la Société dite Bio Engineering K.K., et une membrane, vendue sous la dénomination

  
 <EMI ID=85.1> 

  
pour retenir les substances de poids moléculaire supérieur à
200.000, sous une pression de 3 kg/cm2 , et obtenir un résidu qui est alors lyophilisé en donnant une poudre brune (89,46 g). 

  
 <EMI ID=86.1> 

  
A titre de comparaison, on effectue un traitement semblable en utilisant la membrane vendue sous la dénomination commerciale

  
 <EMI ID=87.1> 

  
 <EMI ID=88.1> 

  
nir une poudre brune (93,50 grammes) .

  
Dans une seconde opération, on dissout La première poudre brune (2 grammes) dans l'eau (5 ml) et on transfère la solution dans une colonne (4,5 x 70 cm) garnie de Sephadex G-

  
 <EMI ID=89.1> 

  
divise l'effluent en fractions (chacune de 3 ml) . On recueille les fractions No. 25 à 55, qu'on réunit et lyophilise pour obtenir une poudre blanchâtre (155,04 mg).

  
Dans une troisième opération, pour purifier davantage, on dissout cette poudre (100 mg) dans une solution tampon de

  
 <EMI ID=90.1> 

  
lution dans une colonne (2,5 x 70 cm) garnie de DEAE-Sephadex A-50 (échangeur d'ions), ; on élue avec une solution tampon de

  
 <EMI ID=91.1> 

  
divise l'effluent en fractions, chacune de 3 ml. On recueille

  
 <EMI ID=92.1> 

  
obtenir une poudre amorphe blanchâtre (72,3 mg) contenant moins d'impuretés et présentant une activité inductrice de FI pratiquement semblable à celle de la première poudre blanchâtre. Le produit final a les caractéristiques physicochimiques telles

  
que précédemment décrites et sa haute pureté est confirmée par ultracentrifugation et électrophorèse. 

  
A titre de comparaison, on mesure les activités inductrices de FI des substances obtenues dans les opérations respectives de cet exemple, suivant la méthode décrite ci-après dans l'essai 1 (in vitro), pour obtenir les résultats suivants. 

  
 <EMI ID=93.1> 

  

 <EMI ID=94.1> 


  
EXEMPLE 2

  
On effectue le môme traitement que celui décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on extrait Carthamus lanatus Linne en laissant les fleurs reposer dans l'eau à température ambiante pendant 2 heures, puis on extrait encore à 100[deg.]C pendant 2 lieu-

  
 <EMI ID=95.1> 

  
(70,3 mg) sont pratiquement les mêmes que celles du produit final de l'exemple 1.

  
ESSAI 1 - Mesure de l'activité inductrice de FI : 

  
[Référence : Y. Kojima, Kitasato Arch. Exp.

  
Med., 43:35 (1970)].

  
(a) Induction de FI in vitro.

  
On sacrifie un lapin blanc (SPF de Nouvelle-Zélande poids d'environ 1 kg) par piqûre cardiaque, on recueille les cellules de sa rate, de sa moelle épinière et de sa lymphe nodale, qu'on réunit pour préparer une solution contenant les cellules mixtes (10 cellules), qu'on divise en échantillons de 1 ml chacun. On ajoute indépendamment à quatre échantillons, 10,

  
 <EMI ID=96.1> 

  
trifuge pour obtenir des liqueurs surnageantes, dont chacune est utilisée comme échantillon pour la mesure de l'activité inductrice de FI.

  
(b) Induction de FI in vitro.

  
On dissout dans 2 ml d'eau le produit final de l'exemple  <EMI ID=97.1> 

  
de chaque échantillon et l'utilise comme échantillon pour mesurer l'activité inductrice de FI.

  
(c) Mesure de l'activité FI.

  
Dans les deux méthodes (a) et (b) , on utilise comme virus d'attaque le virus Vesicular Stomatitis, pour la mesure de l'activité du FI induit, de la manière suivante. On place une culture monocouche des cellules doublées de RK-13 de lapin, dans un récipient et on lui ajoute une quantité prédéterminée de l'échantillon de solution obtenu en (a) ou (b) ci-dessus. On incube la culture.. 37[deg.]C pendant la nuit, avec addition du virus Vesicular stomatitis comme virus d'attaque. On mesure l'activité FI en fonction du taux de réduction des plaques.

  
On exprime l'unité d'activité FI selon le nombre Inverse de la plus grande dilution d'échantillon requise pour réduire le nom-

  
 <EMI ID=98.1> 

  
ESSAI 2 - Définition de l'inducteur de FI.

  
On constate que les échantillons préparée suivant les

  
 <EMI ID=99.1> 

  
stomatitis et du virus Vaccinia dans les cellules doublées de RK-13, provenant de lapins de la même espèce, alors qu'ils n'inhibent pas la croissance du virus Vaccinia dans 

  
les cellules L provenant de souris, d'une espèce animale différente. De plus leurs activités de FI sont désactivées lorsqu'on

  
selon un processus usuel, en utilisant l'appareil vendu sous la dénomination commerciale de Model AE-2 par la Société dite Toyo Xagaku Sangyo K.R.,, avec une plaque de gel de polyacrylamide (épaisseur 3 mm) et un tampon d'acide borique 0,3M (pH 8,4). La bande unique formée indique que l'échantillon essayé est d'une haute pureté. 

  
 <EMI ID=100.1> 

  
Ces constatations confirment que la substance active de la présente invention représente un inducteur de FI.

  
ESSAI 3.

  
 <EMI ID=101.1> 

  
 <EMI ID=102.1> 

  
Bien entendu, l'invention n'eet nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variante!  accessibles a l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans s'écarter pour cela du cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

(1) analyse élémentaire

<EMI ID=104.1>

<EMI ID=105.1>

ment environ 500.000 à 1.000.000) (mesuré par ultracentrigugation, ultrafiltration et filtration sur gel)

1. Substance présentant une activité inductrice d'interféron, qui est stable sous la forme d'une poudre amorphe blanchâtre, caractérisée par les propriétés physicochimiques suivan- <EMI ID=103.1>
2. Substance selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est sous forme effectivement pure.
3. Procédé de production d'une substance présentant une activité inductrice d'interféron, caractérisé en ce qu'on extrait ladite substance active d'une plante appartenant au groupe de plantes du genre Carthamus et de leurs variantes, contenant ladite substance active et que l'on récupère la substance dans l'extrait.

(3) point de fusion ou de décomposition : point de fusion indéfini, carbonise à environ 220[deg.]C
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la plante appartient au groupe Carthamus tinctorlus Linne et de ses variantes.

(4) spectre d'absorption dans l'ultraviolet tel que représenté

<EMI ID=106.1>
5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la plante appartient au groupe de Carthamus lanatus Linne, Carthamus arborescens Liane, Carthamus baeticus Nyman et de leurs variantes.
6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue l'extraction avec de l'eau.

(6) solubilité dans divers solvants soluble dans l'eau, facilement soluble dans les solutions aqueuses de soude, potasse et ammoniaque, pratiquement insoluble dans les solvants méthanol, éthanol, propanol, butanol, acétone, chloroforme et éther éthylique
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on effectue l'extraction à un pH de 7 à 10.

(7) réactions colorées positive dans les réactions de Nin-

hydrine, de phénol/acide sulfurique, dans le réactif de Folin et dans la réaction de Dittmer négative dans la réaction de Elson-Morgan ;
8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue l'extraction avec un solvant hydrophile effectivement incapable de dissoudre la substance active.

(8) nature acide
9. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue la récupération en formant une liqueur surnageante, qu'on fractionne par ultrafiltration pour former des fractions contenant la substance active.

(9) principaux constituants chimiques :

<EMI ID=107.1> <EMI ID=108.1>

<EMI ID=109.1>

<EMI ID=110.1>
10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue l'ultrafiltration en utilisant un ultrafiltre capable de retenir la substance d'un poids moléculaire supérieur a 100.000. <EMI ID=111.1>
11. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue la récupération en formant une liqueur sur-

<EMI ID=112.1>

effectivement incapable de dissoudre la substance active, pour obtenir des fractions contenant la substance active.
12. Substance présentent une activité d'interféron, caractérisée en ce qu'elle est produite par un procédé selon les revendications 3 à 11.
13. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, comme ingrédient actif, un inducteur d'interféron selon l'une des revendications 1 à 11, en association

<EMI ID=113.1>

acceptables. Messieurs,

La présente a pour but de rectifier une erreur matérielle commise dans l'exécution de la spécification du'brevet sous rubrique.

Au tableau IV, page Si dans la première colonne, sous le titre

"Durée de chauffage (heure)

a la suite d'une erreur de dactylographie, il a été re-

<EMI ID=114.1>

le titre 'Température de chauffage (OC)".

Bn fait, la première colonne du tableau IV devrait se lire :

<EMI ID=115.1>

<EMI ID=116.1>

la atone déposant" , et relatives au mima secteur techni-

<EMI ID=117.1>

demandes de brevets, des tableaux 4 analogues, analysant le mime genre de résultats, mentionnent correctement des temps de chauffage suivant le libellé cidessus. <EMI ID=118.1>

pas en tout ou en partie, en vertu de la législation actuellament en vigueur.

<EMI ID=119.1>

<EMI ID=120.1>

<EMI ID=121.1>