''Procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires par
adhésion à un support solide".
Cette invention a été réalisée par Monsieur M. DE BREMAEKER, Madame M.GENNEN, Messieurs G.J.KAYEM, P.G.ROUXHET, J.L.VAN HAECHT, de la Faculté des Sciences Agronomiques de l'Université Catholique de Louvain, B-1348 Louvain-la-Neuve (Belgique).
L'invention a pour objet un procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires distribuées sous forme d'une couche régulière sur un support solide, sans l'intervention d'un agent externe.
L'invention a également pour objet la couche de cellules microbiennes ainsi obtenues.
On connait déjà des procédés d'immobilisation de cellules microbiennes, faisant appel à la fixation sur un support, à la formation de flocons ou à l'inclusion dans une matrice. L'immobilisation par fixation, également appelée adhésion ou adsorption, sur un support solide présente par rapport aux autres procédés l'avantage de maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne avec le milieu liquide et, en conséquence, de réduire la limitation, par les phénomènes diffusionnels, de la vitesse de transfert des substances nutritives ou des substances produites par les microorganismes.
L'immobilisation par fixation sur un support solide peut se réaliser avec certains organismes, notamment des bactéries, en laissant se développer la population microbienne au contact du support. Toutefois cette technique présente l'inconvénient d'exiger un temps de contact assez long des cellules avec le support, en présence de substances nutritives, et de
ne pas permettre le contrôle de la densité et de la morphologie du film de cellules immobilisées.
Pour fixer des microorganismes sur un support sans développement de la population microbienne, certains procédés font appel à l'usage de réactifs chi- . miques destinés à former un lien entra le support et les cellules; cependant l'addition d'agents chimiques peut être indésirable pour certaines applica-
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tion de réactions chimiques nuisibles.
Dans certains procédés n'utilisant pas d'agents chimiques, on dépose les microorganismes dans des pores ou dans des zones du support protégées du flux direct du liquide ambiant. Ces procédés présentent l'inconvénient de donner une.distribution très hétérogène des microorganismes sur la surface du support; ils ne permettent pas d'obtenir des forces d'adhésion microorganisme-support importantes et contraignent donc l'utilisateur à travailler avec un faible flux de liquide.
Le procédé par adsorption simple présente l'avantage d'une grande simplicité et ne fait pas appel à l'utilisation d'agents externes intervenant pour la liaison entre les cellules et le support. Les procédés par adsorption développés jusqu'à présent n'ont pas permis d'obtenir une couche unique et régulière de cellules adhérant fortement au support.
La présente invention, qui s'applique à l'immobilisation de cellules microbiennes globulaires, remédie à ces divers inconvénients et a pour but de fixer une couche cellulaire unique, distribuée régulièrement sur toute la surface du support, adhérant fortement au support, sans l'intervention d'un agent externe. De plus, les cellules ainsi immobilisées suivant le procédé de la présente invention présentent un degré de viabilité élevé, c'està-dire qu'une proportion élevée d'entre elles conserve la capacité de réali-
p ser notamment des réactions enzymatiques et de se reproduire dans un milieu approprié.
Un des buts de l'invention est de fixer une couche cellulaire unique, distribuée régulièrement sur toute la surface du support, adhérant fortement au support.
Un autre but de l'invention est d'obtenir des complexes stables formés d'une couche cellulaire unique et du support,pouvant être utilisés directement dans des réacteurs, par exemple de fermentation.
L'invention, telle que caractérisée dans les revendications, consiste à conditionner les cellules microbiennes globulaires dans un milieu aqueux,par exemple dans de l'eau pure, et ensuite à les amener en contact avec la surface du support.
Les cellules mises au contact du support sans un tel conditionnement n'y adhèrent pas et sont entraînées dès que le support est placé dans un flux liquide. L'effet de ce conditionnement n'est pas complètement expliqué.
Il est cependant démontré, dans le cas du conditionnement de Saccharomyces cerevisiae par conservation dans l'eau pure, qu'au cours du conditionnement la cellule. relâche des substances chimiques dans le milieu ambiant, que la surface de la paroi cellulaire subit des modifications, que le conditionnement diminue la composante électrostatique répulsive entre la cellule et le verre, que le conditionnement en milieu oxygéné est plus efficace qu'un conditionnement en milieu anaérobie. Il a également été démontré qu'un lavage de la cellule à l'eau après le conditionnement diminue les effets bénéfiques de celui-ci.. De préférence c'est dans le milieu de conditionnement que les cellules sont mises au contact de la surface du support.
Les supports solides utilisés suivant la présente invention comprennent des matériaux solides minéraux et organiques. Le support à utiliser peut être poreux ou non; pour certaines applications il peut être préférable d'utiliser un support non poreux et ne présentant pas des alvéoles en surface, de manière à ce que toutes les cellules immobilisées puissent être directement exposées au flux d'un liquide.
Parmi les composés minéraux, citons l'utilisation de silice, de silicates et d'aluminosilicates, d'oxydes métalliques, de métaux et de leurs alliages etc.. On peut utiliser par exemple le verre, une céramique, le laitier, le sable.
Parmi les composés organiques, citons l'utilisation de polymères et/ou copolymères synthétiques, par exemple les polyamides, les polyesters, les po-
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cités ci-avant ne constituent que des exemples de supports pouvant être utilisés suivant la présente invention et ne sont nullement limitatifs. Pour le choix du support, on tiendra compte à la fois de considérations physiques et mécaniques, économiques et opérationnelles.
Les supports utilisés peuvent se présenter sous des formes très diverses,par exemple de granules, poudre, billes, plaques, tubes, films, membranes, tissus, tricots, fils, fibres, profilés quelconques.
Par cellules microbiennes globulaires on comprend les microorganismes unicellulaires et les assemblages de microorganismes du type, par exemple, des levures, des bactéries, des microchampignons.
, Par couche cellulaire on comprend une couche cellulaire unique ou monocouche présentant sur la surface du support approximativement une assise cellulaire, qui peut être caractérisée par un nombre de cellules par unité �e surface, désigné par le terme densité de cellules immobilisées.
Le milieu aqueux de conditionnement est de préférence l'eau pure qui est le milieu le plus simple du point de vue chimique et économique. Il n'est pas exclu d'utiliser des solutions aqueuses de composés minéraux et/ou organiques. L'homme de l'art pourra faire choix de ces composés suivant les besoins et les objectifs à atteindre.
Il a été également découvert que.le moment de la récolte des cellules agit
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procédé de la présente invention. Cet effet bénéfique peut éventuellement s'additionner à celui obtenu par le conditionnement des cellules avant fixation sur le support solide.
Pour les cultures de Saccharomyces cerevisiae effectuées en milieu glucose, on obtient les meilleurs résultats en effectuant la récolte soit dans la phase où le glucose est consommé et l'éthanol produit, soit dans la phase stationnaire finale, plutôt que dans la phase stationnaire intermédiaire, qui sépare la phase où la levure produit l'éthanol et la phase où la cellule consomme l'éthanol produit antérieurement.
Pour mieux illustrer cet effet du moment de la récolte des cellules, on a effectué une culture de Saccharomyces cerevisiae dans le milieu suivant : 50 g/1 glucose, 20 g/1 yeast extract, 2 g/1 KH2PO4, 2g/l
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peuvent être situés sur la figure 1 donnant la concentration cellulaire de la culture en fonction du temps. Sur cette courbe la première phase de croissance exponentielle ABC correspond à la production d'éthanol à partir de glucose; après une phase stationnaire intermédiaire CD apparait une nouvelle phase de croissance exponentielle DE, pendant laquelle l'éthanol produit antérieurement est consommé par la levure.
Le conditionnement appliqué aux cellules récoltées est le suivant: 3 lavages à l'eau, remise en suspension dans l'eau à une concentration d'environ
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La suspension est versée dans un récipient au fond duquel se trouve une plaque de verre. On laisse sédimenter 24 heures; ensuite on lave la plaque durant 20 minutes par un flux laminaire d'eau de 4 mm d'épaisseur de vitesse moyenne de 8 cm/sec.
Les plaques sont examinées en microscopie optique; toutes les cellules immobilisées adhèrent au verre; leur densité est déterminée par comptage.
La figure 2 présente la quantité de cellules fixées par unité de surface du support en fonction du moment de la récolte.
Dans les cas les moins favorables le conditionnement a encore un effet bénéfique. En effet, si les cellules n'avaient été conditionnées de la manière décrite, la densité de cellules immobilisées serait extrêmement faible, inférieure à 600 cellules/mm<2>, et les cellules seraient distribuées de manière irrégulière.
La figure 3 présente l'évolution de la quantité de cellules fixées sur le polycarbonate suivant le moment de la récolte. On procède comme ci-dessus mais la plaque de verre est remplacée par une plaque de polycarbonate. Les résultats obtenus montrent l'effet bénéfique du choix du moment de la récolte combiné avec le conditionnement des cellules avant adhésion à un support solide. Si ce choix est à conseiller pour des raisons d'efficacité, il n'est pas absolument nécessaire de l'effectuer pour l'application du procédé faisant l'objet de la présente invention.
Le procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires par adhésion à un support solide est caractérisé en ce que les cellules microbiennes globulaires sont. conditionnées dans un milieu aqueux, de préférence dans de l'eau pure et ensuite sont mises en contact avec le support solide. Le contact a lieu sur toute ou une partie de la surface du support. Suivant une réalisation préférentielle de l'invention, le3 cellules sont mises au contact de la surface du support dans le milieu aqueux de conditionnement, par exemple par introduction du support dans le milieu de conditionnement des cellules. La durée du conditionnement des cellules doit être suffisante pour l'obtention des effets recherchés. Elle est en général d'au moins 5 heures et de préférence d'au moins 10 heures.
Des durées plus courtes ou plus longues peuvent être choisies en fonction du type de cellule et du matériau constituant le support, des modes opératoires et des conditions adoptées pour le conditionnement des cellules.
La température du milieu de conditionnement doit être choisie de manière à atteindre l'objectif recherché sans perte appréciable de la viabilité..des
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est en général d'environ 30[deg.]C.
Suivant une variante du procédé faisant l'objet de la présente invention, les cellules microbiennes sont récoltées dans les zones de temps de culture donnant les quantités élevées de cellules fixées et ensuite conditionnées dans un milieu aqueux comme décrit ci-avant.
Dans le cas de cultures de Saccharomyces cerevisiae la récolte a lieu soit à la fin de la phase exponentielle de croissance où le glucose est consommé et l'éthanol produit, représentée à la figure 1 par la courbe BC, soit dans la phase stationnaire finale, représentée par la courbe EF, où la cellule consomme l'éthanol produit, antérieurement. La récolte des cellules microbiennes dans la zone CD, correspondant à la première phase stationnaire est à déconseiller pour des raisons d'efficacité. On constate en effet que dans cette zone, les quantités de cellules fixées sont les plus faibles.
Dans le cas d'autres cellules microbiennes, il suffira,pour déterminer le moment de la récolte le plus favorable, de tracer les courbes donnant la densité de cellules immobilisées en fonction du moment de la récolte.
Les avantages obtenus grâce à cette invention sont l'obtention d'une assise unique de cellules toutes fixées au support, d'une quantité élevée de cellules immobilisées par unité de surface du support,d'une distribution régulière des cellules sur la surface du support, d'une forte adhésion des cellules au support.
L'immobilisation de cellules en une assise unique et régulière adhérant fortement au support présente l'avantage d'éliminer la diffusion, à travers un lit de cellules, des substances nutritives et.des métabolites produits, de permettre l'utilisation d'un flux élevé de liquide au contact des cellules et donc une diminution des limitations diffusionnelles à proximité de celles-ci, de permettre une regénération homogène de toute la population immobilisée, de permettre l'utilisation des cellules immobilisées sur support aussi bien en lit agité qu'en lit fixe.
Ces avantages sont particulièrement précieux pour certaines utilisations de ces cellules immobilisées, telles que l'assimilation ou la production de substances de poids moléculaire élevé, la réalisation d'un dispositif d'ensemencement en continu ou la réalisation d'un dispositif permettant de récolter des cellules de première génération n'ayant pas donné de cellules filles.
Le fait de ne pas introduire d'agent chimique autre que le support au contact des cellules et d'utiliser un support chimiquement inerte est un avantage appréciable pour certaines applications des cellules immobilisées.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs ci-après.
Exemple.1
On effectue une culture de Saccharomyces cerevisiae dans le milieu suivant : 30 g/1 glucose, 7 g/1 yeast nitrogen base, 20 mg/1 histidine pH 5.4. On effectue la récolte après 24 heures soit, pour les conditions de culture utilisées,en début de la phase stationnaire. Le traitement appliqué aux cellules récolcées est le suivant: 3 lavages à l'eau, remise en suspension dans l'eau à une concentration d'environ 250.106 cellules/ml, agitation de la suspension à 30[deg.]C pendant 24 heures dans un erlenmeyer bouché par un tampon d'ouate. Cette suspension est versée dans un récipient au fond duquel se trouve une plaque de verre préalablement nettoyée; le niveau de la suspension est de 7 mm au-dessus de la surface du verre.
On laisse sédimenter 24 heures; ensuite on lave la plaque durant 20 minutes par un flux laminaire d'eau de 4 mm d'épaisseur et de vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique; toutes les cellules immobilisées adhèrent au verre; leur densité est déterminée par comptage.
(. Pour un essai effectué, la densité des cellules en différents points d'une même plaque a les valeurs suivantes: 19000, 19600, 18300,
17000, 18500 cellules/mm<2>.
Pour un essai effectué à partir d'une autre culture, la densité des cellules en différents points d'une même plaque a les valeurs suivantes: 25600, 25400, 26300, 28600, 28300, 28400, 24400, 24200, 26800,
21300, 21000, 23300, 24600, 28300 cellules/mm<2>.
Les cellules immobilisées sont donc distribuées de manière régulière, formant une couche homogène. Le traitement des cellules ainsi im-
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gardent la capacité de réduire spontanément le bleu de méthylène.
Un essai comparatif a été réalisé dans les mêmes conditions que ci-dessus mais sans conditionnement des cellules microbiennes. Les résultats montrent que la densité de cellules immobilisées est inférieure à 600 cellules/mm<2>. Les cellules sont distribuées de manière irrégulière et ne forment pas une couche cellulaire homogène.
Exemple.2
On effectue une culture de Saccharomyces cerevisiae dans le milieu suivant: 50 g/1 glucose, 20 g/1 yeast extract, 2 g/1 KH2SO4, 2 g/1
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naire.
Le conditionnement appliqué aux cellules récoltées et le mode de mise en contact des cellules avec le support sont les mêmes que ceux décrits à l'exemple 1, mais la plaque de verre est remplacée par une plaque de polycarbonate. Les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche homogène dont la densité est de 6000 à 8000 cellules/mm2.
Le test au bleu de méthylène donne les mêmes résultats que pour l'exemple
1. Les cellules ainsi immobilisées gardent la capacité de se multiplier.
REVENDICATIONS.
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res par adhésion à un support solide, caractérisé en ce que les cellules microbiennes globulaires sont conditionnées dans un milieu aqueux et ensuite sont mises en contact avec le support solide.