CA1157400A - Procede d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires par adhesion a un support solide - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires sur un support solide, caractérisé en ce que l'on traite, préalablement à l'immobilisation, les cellules et/ou le support solide par des solutions contenant des ions métalliques simples et/ou polynucléaires, de telle façon que les ions s'adsorbent sur les cellules et/ou le support ainsi traités.

Description

l 1~74~
I:~ernande de B R E V E T ~' I N V E N T I O N
pour "Procédé d'immobilisation de cellules mîcrobiennes globulaires par _____________ _____ _ ________________. _ ________ _____ adhésion à un support sol;de".
_____________________.____ L'invention a pour objet un procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires SOU5 forme d'une couche régulière sur un support solide, par l'adsorption d'ions métalliques sur le support solide et / ou les cellules microbiennes.
L'invention a également pour objet la couche de cellules microbiennes ainsi obtenues.
On connal~t déjà des procédés d'immobilisation de cellules microbiennes, faisant appel à la fixation sur un support, ~ la formation de flocons ou a l'inclusion dans une matrice. L'immobilisation par fixation,

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également appelée adsorption ou adhesion, sur un support solide présente par rapport aux autres procédés, l'avantage de maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne avec le rnilieu liquide et, en conséquence, de reduire la limitation, par les phénornènes diffu~ionnel~, du transport des substances nutritives ou des substances produites par les microorganismes. Elle présente également l'~vantage de fournir un système dont la géométrie ne peut se modifier au cours de l'utilisation.
Le procédé faisant l'objet du brevet U.S.A. 3.821.086 per-met la formation de flocons de cellules microbiennes sous l'action de poly-électrolytes L,e procédé du brevet belge 804. 502 concerne l'obtention de flocons par la formation de chélates entre les cellules microbiennes et des hydroxydes métalliques.
Ces procédés présentent l'inconvénient de ne pas maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne immobilisée avec le milieu liquide.
Le procédé décrit dans le brevet U.S.A. 4.115.19~, visant principalement l'immobilisation d'enzymes mais mentionnant la possibi-lité d'immobiliser des cellules entières, fait appel à un recouvrement d'un support par précipitation sur ce dernier d'wl oxyde métallique hydraté.
La fixation des substances biologiquement actives est attribuée à la forma-tion de chélates.
Ce procédé présente l'inconvénient de former nécessairement des préci-pités, ce qui exige un contrôle des caractéristiques de ces précipités.
Il est connu également de traiter par des métaux de transition un support organique, ensuiteclele sécher etdele mettre en contact en milieu agité avec les cellules. (~nn. N. ~. Acad.Sci. 1979, 326, 249-54) Ce procédé présente l'inconvénient d'être limité a un support organique, d'exiger un séchage, qui est une opération longue et coûteuse, et de ne pa~
permettre un recouvrement régulier de la surface du support.
Un des objets de la présente invention est de developper un procédé d'immob;lisation des cellules microbiennes globulaires par un procédé simple et efficace ne nécessitant pas de modes opératoires com-pliqué s .
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La présente invention, basée sur ;'adsorption d'ions rnétal-liques sur les cell-lles microbiennes et/ou le support solide, a pour but de fixer une couche cellulaire unique, distribuée régulièrement sur toute la surface du support et y adhérant fortement.
Les cellules immobilisées suivant le procédé de la présente invention présentent un degré de viabilité élevé, c'est-~L-dire qu'une pro-portion élevée d'entre elles conserve la capacité de réaliser notamment des réactions en~ymatiques et de se reproduire dans un Inilieu approprié.
UI1 autre but de l'invention est d'obtenir des complcxes stable~
formés d'une couche cellulaire unique et du support pouvant etre utilisés directement dans des réacteurs, par exemple de fermentation. Par com-plexes stables, on comprend également des complexes de nature di~férente (support et/ou cellule) pouvant par exemple être combinés et utilisés sous forme de couches lamella;res multiples. On peut par exernple superposer sur un meme support des couches cellulaires immobilisées de différents microorganismes, ou superposer une série de complexes constitués chacun d'un support auquel est fi~ée une couche cellulaire, les rnicroorganismes étant de nature identique ou différente d'une couche à l'autre ou au sein de la meme couche. Toutes les combinaisons sont possibles tout en ne sortant pas du cadre de la présente convention.
Llinvention, telle que caractérisée dans les revendications, consiste à traiter,préalablement à l'immobilisation, les cellules et/ou le support, par des solutions contenant des ions métalliques simples et/ou des ions métalliques polynucléaires formés par association de plusieurs atomes métalliques, d'oxygène et d'hydrogane. Ces ions simples et~ou polynuclé ai r e s s ' ad s or bent s ur le s maté r iaux t ra ité s .
Le lien entre les cellules et le support s'explique par une résultante favorable des interactions aux interfaces cellule-solution, support-solution et cellule-support. Parnni ces interactions, on peut dis-tinguer les interactions électrostatiques (charge-charge et charge-dipôle), les interactions de Van der Waals, les liaisons 'h~drogène. Etant donné
l'importance des interactions électrostatiques charge-charge, le fait que les ions adsorbés diminuent la charge du support ou de la cellule, ou rendent la charge de l'un de signe contraire à la c'harge de l'autre est un élément très favorable.
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Pour expliquer le comportement cles systèmes et le choix des conditions opératoires, il faut également tenir compte des propriétés chimiques de ces ions en fonction du p~.
Les supports solides utilisés suivant la présente invention comprennent ~es matériaux solides minéraux et organiques Le support à utiliser peut etre poreux ou non; pour certaines applications il peut etre préférable d'utiliser un support non poreux et ne présentant pas des alvéoles en surface, de manière à ce que toutes les cellules i~nmobilisées puissent etre directement exposées au fLux d'un liquide. Parmi les com-posés minéraux, citons l'utilisation de silice, de silicates et d'alumino-silicates, d'oxydes rnétalliques, de métaux et de leurs alliages, etc..
On peut utiliser par exemple le verre, une céramique, le laitier, le sable.
Parmi les cornposés organiques, citons l'utili sation de polymères et/ou copolymères synthétiques, par exemple les polyamides, les polyesters, les polyoléfines, les composés vinyliques.
l.es composés minéraux et organiques cités ci-avant ne constituent que des exemples de supports pouvant être utilisés suivant la présente invention et ne sont nullement limitatifs. Pour le choix du support, on tiendra compte à la fois de considérations physiques et mécaniques, économiques et opérationnelles Les supports utilisés peuvent se présenter sous des formes très diverses, par exemple de granules, poudre, billes, plaques, tubes, films, mem-branes, tissus, tricots, fils, fibres, profilés quelconques.
Par cellules microbiennes globulaires on comprend les microorganismes unicellulaires et les assemblages de microorganismes du type, par exernple, des levures, des bactéries, des microchampignons.
Par couche cellulaire, on comprend une couche cellulaire unique ou monocouche présentant sur la surface clu support approximati-vement une assiso cellulaire, qui peut etre caractérisée par un nombre de cellules par unité de surface, designé par le terme densité de cellules immobili s ée s .
Les solutions aqueuses contenant des ions métalliques simples ou polynucléaires utilisées suivant la présente invention sont obtenues à
partir de sels métalliques, par exemple de chlorure, nitrate, sulfate, de magnésium et d'alcalino-terreux, d'aluminium, de métaux de transitions, ' ' . ~ :
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notamment Cr, I; e, Co, Ni, Cu, Zn, ces exemp1es n'étant pas lirnitatifs Pour obtenir des solutions d'ions métalliques simples, leur concentration doit etre assez faible, leur pH assez bas et la ternpérature assez basse pour que, dans les conditions opératoires, la réaction des atomes métalliques avec l'oxygene et l'hydrogene ne donne pas lieu à la formation d'ions polynucléaires ou de précipité.
Les ions métalliques polynucléaires sont formés par association de plu-sieurs atomes métalliques identiques ou différents, d'oxygène, d'hydrogène et éventuellement d'autres éléments.
Pour obtenir des solutions d'ions métalliques polynucléaires, la concentration, le p~T, la température et l'age des solutions doivent e~tre tels que la réaction des atomes métalliques avec l'oxygene et l'hyclroxyle, et d'autres anions éventuellement présents dans la solution, donne lieu à
la formation d'ions polynucl~aires mais pas de précipité. Sllivant les con-ditions qu'il recherche, l'homme de l'art peut faire varier la nature du métal, la nature de l'anion, la concentration, le p~T, la température, l'âge des solutions et introduire des réactifs, par exemple des cornplexants, susceptibles d'agir sur les processus chimiques impliquant les éléments métallique s .
Il n'est pas exclu d'utiliser des solutions contenant à la fois des ions métalliques simples et polynucléaires, Suivant une première forme de réalisation de la présente invention, les cellules microbiennes globulaires sont traitées par des solutions aqueuses contenant des ions métalliques simples. Ce traitement est obtenu par exemple de la manière suivante: On introduit simultanément 10 ml d'une suspension de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 500.106 cellules/ml et lO ml d'une solution de nitrate d'aluminium de 2 à ZOO mg Al,/l dans un tube de verre d'une contenance de 30 ml.
Le tube bouché est agité pendant 24 h à 25~C, Le pH des suspensions varie de 3, 6 à 3, 9 suivant leur composition. Les cellules sont séparées de la solution par centrifugation et l'aluminium restant dans le surnageant est dosé par absorption atomique, la quantité d'aluminium fixé est déter-minée par différence.
Les résultats obtenus indiquent que la quantité d'aluminium fixé par les cellules augmente jusqu'à l, 5.108 ions Al par cellule, lorsque :; , :: :
- 6 - 1 ~ 5 ~ ~ f) 1) la concentration en aluminium dans le surnagear-t augmente de 0 à 2 mg/l.
La quantité d'aluminium fixé reste égale à 1,5 108 ions Al par ce]lule, lorsque la concentration en aluminium dans le surnageant varie de 2 a 100 mg/l. La fixation de l'aluminium par les cellules répond donc aux caractéristiques d'une adsorption spéc;~ique Su;vant une var;ante cle realisation du procédé, les supports solides sont traités par des solutions contenant des ions métalliques sirnples.
Ce traitement est réalisé par exemple en immergeant le support solide dans une solution aqueuse contenant les ions; le volume et la concentration de la solution sont choisis de maniare à absorber une quantité suffisante d'ions à la surface du support Suivant une autre variante, on traite à la fois les cellules et le support par des solutions contenant des ions métalliques simples. Dans ce cas, on opère comme ci-dessus pour chacun des traitements et on effectue ensuite l'immobilisation des cellules sur le support.
Suivant une deuxième forme de réalisation de la présente invention, les cellules microbiennes globulaires et/ou le support solide sont traités par des solutions d'ions métalliques polynucléaires, Le tra;tement est en principe similaire à celui appliqué pour la lbre forme de réalisation comme indiqué ci-avant .
n n'est pas exclu d'envisager le traîtement des cellules par des solutions contenant des ions métalliques simples et du support solide par des solutions contenant des ions métalliques polynucléaires et inver-sément. Toutes les formes de combinaison sont possibles sans sortir du cadre de la présente invention.
Suivant cette invention, il n'est pas nécessaire que le support possade des groupements organiques capables de former des chélates avec les ions, Il n'est pas nécessaire de sécher le ~upport apras son traitement par les ions, Moyennant une formulation correcte on peut se contenter de traiter les cellules par les ions, Les avantages obtenus grâce à cette invention sont l'obtention d'une assise unique de cellules toutes fixées au support, d'une quantité
élevée de cellules immobilisées par unité de surface du support, d'une dis-tribution régulièr,e des cellules sur la surface du support, d'une forte adhé-sion des cellules au support. L'immobilisation de cellules en une assise ''. ' ' ''~ ' '.
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un;que et réguli~re adhérant fortement au s~lpport présente l'avantage d'kli-miner la dif~usion ~ travers un lit de cellules des sub~;tances nutrit;ves et des métabolites produits à proximité de celles-ci, de perrnettre l'utili-sat;on d'un flux élevé de l;quide au contact des cellules et donc une diminu-tion des limitations diffusionnelles, de perrnettre une régénération homo-gène de toute la population immob;l;sée, de permettre l'utilisation des cel-lules immobilisées sur support aussi bien en lit agité qu'en lit fixe.
Ces avantages sont particulierement précieux pour certaines utilisatiorls de ces cellules imrnobilisées, telles que l'assimi lation ou la productiorl de substances de poids moléculaire élevé, la réalisation d'un dispositif d'en-semencement en continu ou la réalisation dlun dispositif permettant de récolter des cellules de prernière génération n'ayant pa~ donné de cellules filles. Le fait de ne pas introduire d'agent chirnique autre qwe le support au contact des cellules et d'utiliser un support chimiquement inerte est un avantage appréciable pour certaines applications des cellules irnmobilisées.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ncn limitatifs ci-après.
Exemple 1.
On introduit simultanément 10 rnl d'une suspension de Saccha-ro~nyces cerevisiae à la concentration d'environ 500.106 cellules/ml et 10 ml d'une solution aqueuse de nitrate d'aluminium d'une concentration de 2 à 50 mg Al/l dans un tuba de verre d'une contenance de 30 rnl. Le tube bouché est agité pendant lS minute3 à 2$~C. Le pH de la suspension est inférieur ~ 3, 9; les ions aluminium dissous dans la suspension sont donc des ions simples, Ensuite, on verse la suspension dans un récipient clans lequel se trouve une plaque de verre. l,a hauteur de la suspension est de 0. 5 cm aù-dessu3 du niveau de la plaque. Après environ S minute~, la plaque de verre est soumise à un lavage durant 20 minutes par un flux laminaire d1eau d'ëpaisseur de 4 mm et de vitesse moyenne de 8 cm/sec.
Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immo-bili ~ é e s s ont c om pté e s .
Les cellules immobilisées.sont distribuées de manière régu-lière, formant une couche cellulaire homogène d'ur~e densité de 40 000 cel-lules/mm2. Le test au bleu de méthylène indique que 90 à 99 ~u des cellules immobilisées garclent la capacité de réduire spontanémentce colorant.
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_ 8 ~ S740 0 Un essai comparatiE a été réal;sé dans les mêmes conditions que ci-dessus mais sans traitement du support e~ des cellules par ~es ions alu-minium; les résultats montrent que la densité de cellules immobilisées est ;nférieure à 600 cellules/~1m2. Les cellules sont distribuées de rnanière irrégulière et ne forment pas une couche cellulaire homo~ène Exemple 2 On procède comme décrit dans l'exemple 1 sauf que le s~lpport en verre est remplacé par un support en polycarbonate~
On obtient également une couche cellulaire régulière de cel-lules adhérant au support et résistant aux conditions de lavage décrites dans l'exemple 1, avec une densité d'environ 40 ~00 cellules/mm2.
Exem ple 3 .
On procède comme décrit dans l'exemple 1, sauf que la sus-pension de cellules dans la solution aqueuse de nitrate d'aluminium est centrifugée à 2000 g durant 5 minutes et que les cellules sont res~ises en suspension dans l'eau, cette suspension étant versée sur la plaque de verre.
On obtient également une couche cellulaire réguliare de cellule9 adhérant au support et résistant aux conditions de lavage décrites dans l'exemple 1, avec une densité d'environ 40 000 cellules/mm2.
Exemple 4, On mélange dans des récipi ents en matière plastique, par exemple du polypropylène, 20 ml d'une suspensi on de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 400.106 cellules/ml et 20 ml d'une solution aqueuse fraîcher~ent préparée de nitrate ferrique à une concentra-tion de 50 à 200 mg Fe/l.
Le pH est soit laissé tel quel, soit ajusté à 3 par HNO3.
Les récipients sont fermés et agités pendant 1 h. à température ambiante;
à ce stade les ions ferriques dissous sont des ions simples. Ensuite les suspensions cellulaires, contenant un excès d'ions, sont versées dans un récipient dans lequel se trouvent des plaques de verre. La hauteur de la solution est de 1 cm au-dessus de la surface du verre. Après 4 h, ~noment auquel la solution contient à la fois des ions simples et des ions polynu-cléaires, les plaques sont lavees durant 30 rrlinutes par un flux d'eau d'une épaisseur de 4 mm et d'une vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaque3 sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
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~ahleau 1: R~ult~ts d'irnmot)ilisatit)n sur le verre de cell-lle~3 cle Saccha-ronlyces cerevisiae par traitement de celles-ci et CiU SllppOrt par des solutions contenarlt cles ions ferriques.
Composition du mélange de la suspensiorl Densité de cellules cellulaire et de la solution ferrique. immobilisées Concentration totale 2 pH(cellules/mn~ ).
en Fe (mg/l) ___ ___ ___ ___

3,4 40 000 3,3 39 600 100 3,1 39 000 ajusté à 3, 0 38 000 Dans tous les cas, les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène dont la densité esi donnée au tableau 1.
n faut souligner qu'aucun précipité d'un composé du fer ne se forme dans ces condition~ opératoires.
Le test au bleu de méthylène ;ndique que 90 à 99 % des cel-lules immobilisées gardent la capacite de réduire spontan~ment le colorant.
Les cellules imrnobilisées gardent la capacité de se multiplier.
Exemple 5 On mélange dans des récipients en plastique ~0 ml d'une sus-pension de ~accharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 400.106 cellules/ml et 20 ml d'une solution fraîchement pr~parée de nitrate fer-rique à une concentration de 200 mg Fe/l. Le pH est ajusté à 3 par HNO3.
Les récipients sont fermé~ et agités durant 15 h. à température ambiante.
Ensuite la suspension cellulaire est centrifugée à 2000 g durant 5 minutes;
le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans l'eau. Cette suspension est versée sur des plaques de verre comme décrit dans l'exemple 4; les plaques sont lavées et examinées comme décrit dans l'exemple 1.
On obtient une couche réguliare unique de cellules adhérant au support, avec une densité de 35 000 cellules/mm2.
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I.es conditions phy~;ico-chirlliques (concerltration, p~l, ;ige) de la sol-ltion ~erriqlle au contact des cellllles sont telles qu'elle contient des (ions) polynucléaires~ De plus, elle ne contient aucun précipité d'un cornposé du fer, ce qui présente l'avanta~e d'obtenir un dépôt très régulier adhérant fortelnent au support.
Exemple 6.
Des plaques de verre sont immergées pendant un temps donné dans des solutions aqueuses fral~chernent préparées de nitrate ferrique à lOO mg Fe/l et de pH variable. La durée de l'immersion et le pH de la solution sont donnés au tableau 2; dans tous les cas les con-ditions physico-chimiques (concentration, pH, age) de la solution en fin de traitement so~t telles qu'elle contient des ions polynucléaires; elle ne contient aucun précipité d'un composé du fer Les plaques ainsi traitées sont rincées à l'eau et placées dans un récipient dans lequel on verse 50 ml d'une suspension cellulaire de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ ~SO.106 cellules/
ml. Après 4 h les plaques sont lavées durant 30 minutes par un flux laminaire d'eau d'une épaisseur de 4 mm et d'une vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées~
Dans tous les cas, les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène dont la dens i té e s t pré s enté e au ta bleau 2 .
Les résultats du test au bleu de méthylène et du test de multiplication cellulaire sont les mêmes que pour l'exemple 4.
Tableau 2: Résultats d'immobilisation de cellules de saccharomyces cerevisiae sur le verre par traitement préalable du support par une solution contenant des ions ferriques.
_ Temps de contact ~uantité fixée .
pH de la solution ve~ oi ~cl~ (cellules/mm2) 2.9 à 2~7 48 h 40 000 ajusté à 4 17 h 38 500 ajusté à 4 1 h 38 300 ajusté à 4 1 min 37 000 ajusté ~ 3, 85 40 min 39 000 ,~ ' ., ~ . ~ .
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ExeTnple 7 On melallge 20 ml d'une suspension de Saccharomyces cere-v;siae avec 20 ml d'une solution agueuse frai~chement préparée de nitrate ferrique. Les concentrations finales sont de 200 106 cellules par ml et de 100 mg/l en fer. Ce mélange est a~ité pendant une heure ,i température ambiante, les cellules sont alors séparées de la solutiorl par centrifwgation à 2 000 g pendant 5 minutes, et remises en suspension dans 40 ml d'eau ou d'une solution de HNO3 à pH 3.
Des plaques de verre sont imInergées dans une solution agueuse frai'chement préparée de nitrate ferrique à la concentration de 100 mg Fe/l.
La durée du trempage est soit de une heure, soit de deux jours. Ensuite les plaques sont rincées à l'eau.
Les plagues de verrehumides, ainsi traitées par les ions métalliques, sont placées dans un récipient dans lequel on verse la sus-pension cellulaire dont les cellules ont été traitées par des ions métalliques.
On met ainsi en présence:
- soit les plaques maintenues 2 jours au contact de la solution ferrique et les cellules traitées et remises en suspension dans l'eau - soit les plaques maintenues 2 jours au contact de la solution ferrique et les cellules traitées et remises en suspension à pH 3.
- soit les plaques maintenues 1 heure au contact de la solution ferrique et les cellules traitées et remises en suspension dans l'eau.
On laisse reposer durant~4 h; ensuite on lave les plaques durant 20 min par un flu~ laminaire d'eau de 4 mm d'épaisseur et de vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont e~aminées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
Dans tous les cas les cellules immobilisées sont distribuées de maniare réguliare, formant une couche cellulaire homogène dont la densité est d'environ 40 000 cellule~;/mm2.
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Claims (9)

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé d'immobilisation de cellules globu-laires sur un support solide, caractérisé en ce que l'on traite, préalablement à l'immobilisation, les cellules et/
ou le support solide par des solutions contenant des ions métalliques simples et/ou polynucléaires de telle façon que lesdits ions s'adsorbent sur les cellules et/ou le support ainsi traités.

2. Procédé suivant la revendication 1, caracté-risé en ce que les solutions contenant des ions métalli-ques simples ou polynucléaires proviennent de la mise en solution d'un ou plusieurs sels métalliques.

3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les sels métalliques donnant naissan-ce aux ions métalliques simples sont choisis parmi les chlorure, sulfate, nitrate, de magnésium et d'alcalino-terreux, d'aluminium, de métaux de transition.

4. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les sels métalliques donnant naissan-ce aux ions métalliques polynucléaires sont choisis parmi les chlorure, sulfate, nitrate, d'aluminium et de métaux de transition.

5. Procédé suivant la revendication 1, caracté-risé en ce que le support solide est choisi parmi les composes minéraux et organiques

6. Procédé suivant la revendication 1 ou 5, caractérisé en ce que le support solide est un solide silicieux ou un polymère synthétique.

7. Procédé suivant la revendication 1, caracté-risé en ce que les cellules microbiennes globulaires proviennent de cellules de Saccharomyces cerevisiae.

8. Cellules microbiennes globulaires, immobili-sées à l'aide d'ions métalliques simples et/ou polynuclé-aires, reparties régulièrement sous forme d'une assise unique à la surface d'un support solide.

9. Complexes stables formes de couches lamellai-res multiples de cellules microbiennes globulaires immobi-lisées à l'aide d'ions métalliques simples et/ou polynuclé-aires, réparties régulièrement sous forme d'une assise unique à la surface d'un support solide.