"Procédé d'immobilisation de cellules microbiennes globulaires par
adhésion à un support solide".
Cette invention a été réalisée par Monsieur M. DE BREMAEKER,
Madame M. GENNEN, Messieurs G. J. KAYEM, P.G.ROUXHET,
J. L. VAN HAECHT, de la Faculté des Sciences Agronomiques de l'Université Catholique de Louvain, B-1348 Louvain-la-Neuve (Belgique).
L'invention a pour objet un procédé d'immobilisation de
cellules microbiennes globulaires sous forme d'une couche régulière
sur un support solide, par l'adsorption d'ions métalliques sur le support
solide et /ou les cellules microbiennes.
L'invention a également pour objet la couche de cellules microbiennes
ainsi obtenues.
On connaît déjà des procédés d'immobilisation de cellules
microbiennes, faisant appel à la fixation sur un support, à la formation
de flocons ou à l'inclusion dans une matrice. L'immobilisation par fixation,
/ également appelée adsorption ou adhésion, sur un support solide présente par rapport aux autres procédés, l'avantage de maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne avec le milieu liquide et, en conséquence, de réduire la limitation, par les phénomènes diffusionnels, du transport des substances nutritives ou des substances produites par
les microorganismes. Elle présente également l'avantage de fournir un système dont la géométrie ne peut se modifier au cours de l'utilisation.
Le procédé faisant l'objet du brevet U.S.A. 3.821.086 permet la formation de flocons de cellules microbiennes sous l'action de poly-
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flocons par la formation de chélates entre les cellules microbiennes et des hydroxydes métalliques.
Ces procédés présentent l'inconvénient de ne pas maintenir un contact direct de l'ensemble de la population microbienne immobilisée avec le milieu liquide.
Le procédé décrit dans le brevet U. S. A . 4.115.198, visant principalement l'immobilisation d'enzymes mais mentionnant la possibilité d'immobiliser des cellules entières, fait appel à un recouvrement d'un support par précipitation sur ce dernier d'un oxyde métallique hydraté. La fixation des substances biologiquement actives est attribuée à la formation de chélates.
Ce procédé présente l'inconvénient de former nécessairement des précipités, ce qui exige un contrôle des caractéristiques de ces précipités.
Il est connu également de traiter par des métaux de transition un support organique, ensuite de le sécher et dele mettre en contact en milieu agité avec les cellules. (Ann. N. Y. Acad.Sci. 1979, 326, 249-54). Ce procédé présente l'inconvénient d'être limité à un support organique, d'exiger un séchage, qui est une opération longue et coûteuse, et de ne pas permettre un recouvrement régulier de la surface du support.
Un des objets de la présente invention est de développer un procédé d'immobilisation des cellules microbiennes globulaires par un procédé simple et efficace ne nécessitant pas de modes opératoires compliqué s .
La présente invention, basée sur l'adsorption d'ions métalliques sur les cellules microbiennes et/ou le support solide, a pour but
de fixer une couche cellulaire unique, distribuée régulièrement sur toute la surface du support et y adhérant fortement.
Les cellules immobilisées suivant le procédé de la présente invention présentent un degré de viabilité élevé, c'est-à-dire qu'une proportion élevée d'entre elles conserve la capacité de réaliser notamment des réactions enzymatiques et de se reproduire dans un milieu approprié.
Un autre but de l'invention est d'obtenir des complexes stables formés d'une couche cellulaire unique et du support pouvant être utilisés directement dans des réacteurs, par exemple de fermentation. Par complexes stables, on comprend également des complexes de nature différente
(support et/ou cellule) pouvant par exemple être combinés et utilisés sous forme de couches lamellaires multiples. On peut par exemple superposer sur un même support des couches cellulaires immobilisées de différents microorganismes, ou superposer une série de complexes constitués chacun d'un support auquel est fixée une couche cellulaire, les microorganismes étant de nature identique ou différente d'une couche à l'autre ou au sein de la même couche. Toutes les combinaisons sont possibles tout en ne sortant pas du cadre de la présente convention.
L'invention, telle que caractérisée dans les revendications, consiste à traiter, préalablement à l'immobilisation, les cellules et/ou le support, par des solutions contenant des ions métalliques simples et/ou des ions métalliques polynucléaires formés par association de plusieurs atomes métalliques, d'oxygènc et d'hydrogène. Ces ions simples et/ou polynucléaires s'adsorbent sur les matériaux traités.
Le lien entre les cellules et le support s'explique par une résultante favorable des interactions aux interfaces cellule-solution, support-solution et cellule-support. Parmi ces interactions, on peut distinguer les interactions électrostatiques (charge-charge et charge-dipôle), les interactions de Van der Waals, les liaisons hydrogène. Etant donné l'importance des interactions électrostatiques charge-charge, le fait que les ions adsorbés diminuent la charge du support ou de la cellule, ou rendent la charge de l'un de signe contraire à la charge de l'autre est un élément très favorable.
Pour expliquer le comportement des systèmes et le choix des conditions opératoires, il faut également tenir compte des propriétés chimiques de ces ions en fonction du pH.
Les supports solides utilisés suivant la présente invention comprennent des matériaux solides minéraux et organiques. Le support
à utiliser peut être poreux ou non ; pour certaines applications il peut être préférable d'utiliser un support non poreux et ne présentant pas des alvéoles en surface, de manière à ce que toutes les cellules immobilisées puissent être directement exposées au flux d'un liquide. Parmi les composés minéraux, citons l'utilisation de silice, de silicates et d'aluminosilicates, d'oxydes métalliques, de métaux et de leurs alliages, etc... On peut utiliser par exemple le verre, une céramique, le laitier, le sable. Parmi les composés organiques, citons l'utilisation de polymères et/ou copolymères synthétiques, par exemple les polyamides, les polyesters, les polyoléfines, les composés vinyliques.
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et ne sont nullement limitatifs. Pour le choix du support, on tiendra compte à la fois de considérations physiques et mécaniques, économiques et opérationnelles.
Les supports utilisés peuvent se présenter sous des formes très diverses, par exemple de granules, poudre, billes, plaques, tubes, filins, membranes, tissus, tricots, fils, fibres, profilés quelconques.
Par cellules microbiennes globulaires on comprend les
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du type, par exemple, des levures, des bactéries, des microchampignons.
Par couche cellulaire, on comprend une couche cellulaire unique ou monocouche présentant sur la surface du support approximativement une assise cellulaire, qui peut être caractérisée par un nombre
de cellules par unité de surface, designé par le terme densité de cellules immobilisée s.
Les solutions aqueuses contenant des ions métalliques simples ou polynucléaires utilisées suivant la présente invention sont obtenues à partir de sels métalliques, par exemple de chlorure, nitrate, sulfate, de magnésium et d'alcalino-terreux, d'aluminium, de métaux de transitions, notamment Cr, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, ces exemples n'étant pas limitatifs.
Pour obtenir des solutions d'ions métalliques simples, leur concentration doit être assez faible, leur pH assez bas et la température assez basse pour que, dans les conditions opératoires, la réaction des
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formation d'ions polynucléaires ou de précipité.
Les ions métalliques polynucléaires sont formés par association de plusieurs atomes métalliques identiques ou différents, d'oxygène, d'hydrogène et éventuellement d'autres éléments.
Pour obtenir des solutions d'ions métalliques polynucléaires, la concentration, le pH, la température et l'âge des solutions doivent être tels que la réaction des atomes métalliques avec l'oxygène et l'hydroxyle, et d'autres anions éventuellement présents dans la solution, donne lieu à la formation d'ions polynucléaires mais pas de précipité. Suivant les conditions qu'il recherche, l'homme de l'art peut faire varier la nature du
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des ablutions et introduire des réactifs, par exemple des complexants, susceptibles d'agir sur les processus chimiques impliquant les éléments métallique s .
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des ions métalliques simples et polynucléaires.
Suivant une première forme de réalisation de la présente invention, les cellules microbiennes globulaires sont traitées par des solutions aqueuses contenant des ions métalliques simples. Ce traitement
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10 ml d'une suspension de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 500.106 cellulee/ml et 10 ml d'une solution de nitrate d'aluminium de 2 à 200 mg Al./l dans un tube de verre d'une contenance de 30 ml.
Le tube bouché est agité pendant 24 h à 25*C. Le pH des suspensions varie de 3,6 à 3,9 suivant leur composition. Les cellules sont séparées
de la solution par centrifugation et l'aluminium restant dans le surnageant est dosé par absorption atomique, la quantité d'aluminium fixé est déterminée par différence.
Les résultats obtenus indiquent que la quantité d'aluminium
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caractéristiques d'une adsorption spécifique.
Suivant une variante de réalisation du procédé, les supports solides sont traités par des solutions contenant des ions métalliques simples. Ce traitement est réalisé par exemple en immergeant le support solide dans une solution aqueuse contenant les ions ; le volume et la concentration de la solution sont choisis de manière à absorber une quantité suffisante d'ions à la surface du support.
Suivant une autre variante, on traite à la fois les cellules et
le support par des solutions contenant des ions métalliques simples. Dans ce cas, on opère comme ci-dessus pour chacun des traitements et on effectue ensuite l'immobilisation des cellules sur le support.
Suivant une deuxième forme de réalisation de la présente
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de réalisation comme indiqué ci-avant.
Il n'est pas exclu d'envisager le traitement des cellules par des solutions contenant des ions métalliques simples et du support solide par des solutions contenant des ions métalliques polynucléaires et inversément. Toutes les formes de combinaison sont possibles sans sortir du cadre de la présente invention.
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possède des groupements organiques capables de former des chélates avec les ions. n n'est pas nécessaire de sécher le support après son traitement par les ions. Moyennant une formulation correcte on peut se contenter de traiter les cellules par les ions.
Les avantages obtenus grâce à cette invention sont l'obtention d'une assise unique de cellules toutes fixées au support, d'une quantité élevée de cellules immobilisées par unité de surface du support, d'une distribution régulière des cellules sur la surface du support, d'une forte adhésion des cellules au support. L'immobilisation de cellules en une assise unique et régulière adhérant fortement au support présente l'avantage d'éli-
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et des métabolites produits à proximité de celles-ci, de permettre l'utili- sati on d'un. flux élevé de liquide au contact de cellules et donc une diminution des limitations diffusionnelles, de permettre une régénération homogène de toute la population immobilisée, de permettre l'utilisation des cellules immobilisées sur support aussi bien en lit agité qu'en lit fixe.
Ces avantages sont particulièrement précieux pour certaines utilisations
de ces cellules immobilisées, telles que l'assimilation ou la production de substances de poids moléculaire élevé, la réalisation d'un dispositif d'ensemencement en continu ou la réalisation d'un dispositif permettant de récolter des cellules de première génération n'ayant pas donné de cellules filles. Le fait de ne pas introduire d'agent chimique autre que le support au contact des cellules et d'utiliser un support chimiquement inerte est un avantage appréciable pour certaines applications des cellules immobilisées.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs ci-après.
Exemple 1.
On introduit simultanément 10 ml d'une suspension de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 500.106 cellules/ml et
10 ml d'une solution aqueuse de nitrate d'aluminium d'une concentration de
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des ions simples. Ensuite, on verse la suspension dans un récipient dans lequel se trouve "ne plaque de verre. La hauteur de la suspension est de
0. 5 cm au-dessus du niveau de la plaque. Après environ 5 minutes, la plaque de verre est soumise à un lavage durant 20 minutes par un flux laminaire d'eau d'épaisseur de 4 mm et de vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
Les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène d'une densité de 40 000 cel-
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immobilisées gardent la capacité de réduire spontanément ce colorant.
r Un essai comparatif a été réalisé dans les mêmes conditions
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irrégulière et ne forment pas une couche cellulaire homogène.
Exemple 2.
On procède comme décrit dans l'exemple 1 sauf que le support
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On obtient également une couche cellulaire régulière de cellules adhérant au support et résistant aux conditions de lavage décrites
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Exemple 3.
On procède comme décrit dans l'exemple 1, sauf que la suspension de cellules dans la solution aqueuse de nitrate d'aluminium est centrifugée à 2000 g durant 5 minutes et que les cellules sont remises en suspension dans l'eau, cette suspension étant versée sur la plaque de verre.
On obtient également une couche cellulaire régulière de cellules adhérant au support et résistant aux.conditions de lavage décrites
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Exemple 4.
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Le pH est soit laissé tel quel, soit ajusté à 3 par HN03.
Les récipients sont fermés et agités pendant 1 h. à température ambiante;
à ce stade les ions ferriques dissous sont des ions simples. Ensuite les suspensions cellulaires, contenant un excès d'ions, sont versées dans un récipient dans lequel se trouvent des plaques de verre. La hauteur de la solution est de 1 cm au-dessus de la surface du verre. Après 4 h , moment auquel la solution contient à la fois des ions simples et des ions polynucléaires, les plaques sont lavées durant 30 minutes par un flux d'eau d'une épaisseur de 4 mm et d'une vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
Tableau 1 : Résultats d'immobilisation sur le verre de cellules de Saccharomyces cerevisiae par traitement de celles-ci et du support par des solutions contenant des ions ferriques.
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de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène dont la densité est donnée au tableau 1.
Il faut souligner qu'aucun précipité d'un composé du fer ne ! se forme dans ces conditions opératoires.
Le test au bleu de méthylène indique que 90 à 99 % des cellules immobilisées gardent la capacité de réduire spontanément le colorant, Les cellules immobilisées gardent la capacité de se multiplier.
Exemple 5.
On mélange dans des récipients en plastique 20 ml d'une suspension de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 400.106 cellules/ml et 20 ml d'une solution fraîchement préparée de nitrate fer-
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Les récipients sont fermés et agités durant 15 h. à température ambiante. Ensuite la suspension cellulaire est centrifugée à 2000 g durant 5 minutes ; le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans l'eau. Cette suspension est versée sur des plaques de verre comme décrit dans l'exemple 4 ; les plaques sont lavées et examinées comme décrit dans l'exemple 1.
On obtient une couche régulière unique de cellules adhérant
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Les conditions physico-chimiques (concentration, pH, Sge) de la solution ferrique au contact des cellules sont telles qu'elle contient des (ions) polynucléaires. De plus, elle ne contient aucun précipité d'un composé du fer, ce qui présente l'avantage d'obtenir un dépôt très régulier adhérant fortement au support.
Exemple 6.
Des plaques de verre sont immergées pendant un temps donné dans des solutions aqueuses fraîchement préparées de nitrate
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de traitement sont telles qu'elle contient des ions polynucléaires ; elle
ne contient aucun précipité d'un composé du fer.
Les plaques ainsi traitées sont rincées à l'eau et placées dans un récipient dans lequel on verse 50 ml d'une suspension cellulaire de Saccharomyces cerevisiae à la concentration d'environ 250.106 cellules/ ml. Après 4 h les plaques sont lavées durant 30 minutes par un flux laminaire d'eau d'une épaisseur de 4 mm et d'une vitesse moyenne de
8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
Dans tous les cas, les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène dont la densité est présentée au tableau 2.
Les résultats du test au bleu de méthylène et du test de multiplication cellulaire sont les mêmes que pour l'exemple 4.
Tableau 2 : Résultats d'immobilisation de cellules de saccharomyces
cerevisiae sur le verre par traitement préalable du support par une solution contenant des ions ferriques.
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Exemple 7.
On mélange 20 ml d'une suspension de Saccharomyces cerevisiae avec 20 ml d'une solution agueuse fraîchement préparée, de nitrate
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ambiante, les cellules sont alors séparées de la solution par centrifugation à 2 000 g pendant 5 minutes, et remises en suspension dans 40 ml d'eau ou d'une solution de HN03 à pH 3.
Des plaques de verre sont immergées dans une solution aqueuse
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La durée du trempage est soit de une heure, soit de deux jours. Ensuite
les plaques sont rincées à l'eau.
Les plaques de verre humides, ainsi traitées par les ions métalliques, sont placées dans un récipient dans lequel on verse la suspension cellulaire dont les cellules ont été traitées par des ions métalliques. On met ainsi en présence :
- soit les plaques maintenues 2 jours au contact de la solution ferrique et les cellules traitées et remises en suspension dans l'eau
- soit les plaque? maintenues 2 jours au contact de la solution ferrique et les cellules traitées et remises en suspension à pH 3.
- soit les plaques maintenues 1 heure au contact de la solution ferrique et les cellules traitées et remises en suspension dans l'eau.
On laisse reposer durant 4 h ; ensuite on lave les plaques durant 20 min par un flux laminaire d'eau de 4 mm d'épaisseur et de vitesse moyenne de 8 cm/sec. Les plaques sont examinées en microscopie optique et les cellules immobilisées sont comptées.
Dans tous les cas les cellules immobilisées sont distribuées de manière régulière, formant une couche cellulaire homogène dont la
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REVENDICATIONS.
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un support solide, caractésisé en ce que l'on traite, préalablement
à l'immobilisation les cellules et/ou le support solide par des solution! contenant des ions métalliques simples et/ou polynucléaires.